用於癌症診斷的自身抗體檢測的製作方法

2023-11-30 05:46:16

專利名稱：用於癌症診斷的自身抗體檢測的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於在生物樣品中檢測抗-ECPKA自身抗體的組合物和方法，以及這些組合物和方法在人和非人哺乳動物中診斷癌症的應用。
背景技術：
用惡性細胞合成腫瘤標記並將其釋放入血液。這些標記也可以通過宿主組織對侵入的應答而生成，或者是作為腫瘤誘導的代謝變化的結果而生成。腫瘤標記在血液或者組織液中的水平對於診斷，篩查，和監測腫瘤進展或者消退是有幫助的。理想的腫瘤標記允許簡單的血液測試來檢測出癌症，而且其水平與腫瘤進展的階段相關。然而，由於缺少敏感性和特異性，至今尚未在一般健康人群或者最高危人群中建立單一的標記。腫瘤標記在癌症診斷中的使用已經被很好地描述在(Sluss，P.M et al。「ESTABLISHMENT OF A CENTRAL LABORATORY SERUM TUMORMARKER SERVICE ON A CONSOLIDATED IMMUNODIAGNOSTICPLATFORMDEVELOPMENT OF PRACTICE STANDARS，SERVICEIMPROVEMENTS，AND OPERATIONAL EFFICIENCY」Clin LeadershManag Rev.18[1]25-31；Gion，M.「SERUM TUMOUR MARKERSFROM QUALITY CONTROL To TOTAL QUALITY MANAGEMENT，」Breast 9[6]306-11；Wiesner，A「DETECTION OF TUMORMARKERS WITH PROTEINCHIPTECHNOLOGY，Curr PharmBiotechnol.Feb；5[1]45-67；Crawford，NP.et al.「TUMOR MARKERSAND COLORECTAL CANCERUTILITY IN MANACEMENT，」J SurgOncol.84[4]239-48；Agnantis，N.J.et al.「TUMOR MARKERS.ANUPDATE APPROACH FOR THEIR PROGNOSTIC SIGNIFICANCE.PARTI.IN VIVO，」17[6]609-18；Riley，R.D.et al.「A SYSTEMATICREVIEW OF MOLECULAR AND BIOLOGICAL TUMOR MARKERS INNEUROBLASTOMA，」Clin Cancer Res.10[1 Pt 1]4-12；Given，M.et al.「THE PREDICTIVE OF TUMOUR MARKERS CA 15-3，TPS ANDCEA IN BREAST CANCER RECURRENCE，」Breast.9[5]277-80)。
目前可用的癌症標記測定癌症抗原。例如前列腺癌可以通過測量前列腺特異性抗原(PSA)癌症標記來診斷(Gretzer，M.B.et al.「PSAMARKERS IN PROSTATE CANCER DETECTION，」Urol Clin North Am.30[4]677-86)。已經發現癌胚抗原(CEA)標記在評價結腸直腸癌中具有診斷用途。(Crawford，NP.et al.「TUMOR MARKERS ANDCOLORECTAL CANCERUTILITY IN MANAGEMENT.J.Surg Oncol.84[4]239-48)。癌症抗原CA15-3，已經與乳腺癌相關聯(Cheung，K.L.et al.「OBJECTIVE MEASUREMENT OF REMISSION ANDPROGRES SION IN METASTATIC BREAST CANCER BY THE USE OFSERUM TUMOUR MARKERS，」Minerva Chir.Jun；58[3]297-303)。癌症抗原CA 19-9已經被使用來診斷胃腸癌(Grotowski，M.「ANTIGENS[CEA AND CA 19-9]IN DIGNOS IS AND PRGNOSIS COLORECTALCANCER，」Pol Merkuriusz Lek.12[67]77-80；Trompetas，V.et al.「GIANT BENIGN TRUE CYST OF THE SPLEEN WITH HIGH SERUMLEVERL OF CA19-9，」Eur J Gastroenterol Hepatol.14[1]85-8)。癌症抗原CA125已經被用於診斷卵巢癌(Anderiesz，C.et al.「SCREEING FOROVARIAN CANCER，」Med J Aust 178[12]655-6)。
多數實體腫瘤顯示由細胞分裂過程中的染色體分離畸變引起的染色體不穩定性。幾種酶激酶參與保持正常的染色體分離並調控細胞周期進展。cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)是一種這樣的激酶，其似乎在細胞信號傳導、代謝和增殖的多個方面具有功能性作用(Matyakhina L et al.「PROTEIN KINASE A AND CHROMOSOMAL STABILITY，」Ann NYAcad Sci.968139-47；Tortora，G.et al.「PROTEIN KINASE A ASTARGET FOR NOVEL INTEGRATED STRATEGIES OF CANCERTHERAPY，』Ann NY Acad Sci.968139-47)。
哺乳動物細胞具有兩種類型的cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)種類(Krebs，E.G.et al.「PHOSPHORYLATION-DEPHOSPHORYLATION OF ENZYMES，」Annu Rev Biochem.48923-39)。這些蛋白激酶被指定為類型I(PKA-I)和類型II(PKA-II)；其通過不同的調節亞基(R亞基)RI和RII來區分，而且其分享一個共同的催化亞基(C亞基)(Beebe.S.J.et al.「CYCLIC NUCLEOTIDE-DEPENDENTPROTEIN KINASES，」InThe EnzymesControl by Phosphorylation；E.G.Krebs et al.[Eds]Academic PressOrlando and London.pp.43-111)。
傳統上，蛋白激酶的酶活性通過追蹤從(γ-32P)ATP傳遞到適當蛋白或者肽底物的殘基上的放射性磷酸基團而測定(參見例如Witt，J.J.et al.Anal Biochem.66253-8；Casnellie.J.E.Methods Enzymol.200115-20；美國專利號6,498,005)。PKA酶測定已有描述(Cohen，C.B.et al.「A MICROCHIP-BASED ENZYME ASSAY FOR PROTEINKINASE A，」Anal Chem.27339-97；Cho，Y.S.et al.「EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A AS A CANCERBIOMARKERITS EXPRESSION BY TUMOR CELLS AND REVERSALBY A MYRISTATE-LACKING CALPMAAND RIIBETASUBUNITOVEREXPRESSION，」Proc Natl Acad Sci USA.97[2]835-40)。
通過生化研究和基因克隆，已鑑別出四個同種型的R亞基，RIα，RIβ，RIIα，和RIIβ(Amieux，P.S.et al.「THE ESSENTIAL ROLE OF RIALPHA IN THE MAINTENANCE OF REGULATED PKA ACTIVITY，」Ann NY Acad Sci.96875-95；McKnight，G.S.et al.「ANALYSIS OFcAMP-DEPENDENT PROTEIN KINASE SYSTEM USING MOLECULARGENETIC APFROACHES，」Recent Prog Honn Res.44307-35；Levy，F.O.etal.「MOLECULAR CLONING，COMPLEMENTARYDEOXYRIBONUCLEIC ACID STRUCTURE AND PREDICTEDFULL-LENGTH AMINO ACID SEQUENCE OF THEHORMONE-INDUCIBLE REGULATORY SUBUNIT OF 3』，5』-CYCLICADENOSINE MONOPHOSPHATE-DEPENDENT PROTEIN KINASEFROM HUMAN TESTIS」Mol Endocrinol 21364-73)。
重要地，PKA-I與PKA-II的比率可以在細胞發育，分化和轉化過程中發生顯著變化(Lohmann，S.M.et al.「REGULATION OF THECELLULAR AND SUB CELLULAR CONCENTRATIONS ANDDISTRIBUTION OF CYCLIC NUCLEOTIDE-DEPENDENT PROTEINKINASES，」InAdvances in CYclic Nucleotide and Protein PhosphorylationResearch，P.『Greengard et al.[Eds]Raven PressNew York.pp 63-117；Cho-Chung，Y.S.「ROLE OF CYCLIC AMP RECEPTOR PROTEINSIN GROWTH，DIFFERENTIATION，AND SUPPRESSION OFMALIGNANCYNEW APPROACHES TO THERAPY，」Cancer Res.507093-100；Cho-Chung，Y.S.「cAMP SIGNALING IN CANCERGENESIS AND TREATMENT」Cancer Treat Res.115123-43)。
cAMP信號傳導途徑已在淋巴樣惡性腫瘤中被提出作為治療靶目標(Lerner，A.et al.「THE cAMP SIGNALING PATHWAY As ATHERAPEUTIC TARGET IN LYMPHOID MALIGNANCIES，」LeukLymphoma.37[1-2]39-51；Cho-Chung，Y.S.et al.「cAMP-DEPENDENT PROTEIN KINASE；ROLE IN NORMAL ANDMALIGNANT GROWTH，」Crit Rev Oncol Hematol.21[1-3]33-61；Cho-Chung，Y.S.et al.「THE REGULATORY SUBUNIT OFcAMP-DEPENDENT PROTEIN KINASE AS A TARGET FORCHEMOTHERAPY OF CANCER AND OTHER CELLULARDYSFUNCTIONAL-RELATED DISEASES，」Pharmacol Ther.60[2]265-88)。在被化學物質或者病毒致癌劑和Ki-ras原癌基因或轉化生長因子α轉化後的細胞中，和當用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子或者佛波酯進行細胞生長刺激時(Cho-Chung，Y.S.「ROLE OF CYCLIC AMPRECEPTOR PROTEINS IN GROWTH，DIFFERENTIATION.ANDSUPPRESSION OF MALIGNANCYNEW APPROACHES TOTHERAPY，」Cancer Res.507093-100；Cho-Chung，Y.S.et al.「DISSECTING THE CIRCUITRY OF PROTEIN KINASE A AND cAMPSIGNALING IN CANCER GENESISANTISENS E.MICROARRAY，GENEOVEREXPRESSION，AND TRANSCRIPTION FACTOR DECOY，」Ann NYAcad Sci.96822-36)，相比於正常對應物，增加表達的RIα/PKA-I已經出現在人癌細胞系和原發腫瘤(Cho-Chung，Y.S.「ROLE OF CYCLICAMP RECEPTOR PROTEINS IN GROWTH，DIFFERENTIATION.ANDSUPPRESSION OF MALIGNANCYNEW APPROACHES TOTHERAPY，」Cancer Res.507093-100；Miller，W.R.et al.「TYPESOF CYCLIC AMP BINDING PROTEINS IN HUMAN BREASTCANCERS，」Eur J Cancer.29A989-91)。相反，RIα/PKA-I表達的降低與位點選擇性的cAMP類似物和反義寡核苷酸誘導的生長抑制相關聯，所述的反義寡核苷酸在裸鼠內靶向廣譜的人癌細胞系和人腫瘤生長中PKA的RIα亞基。(Cho-Chung，Y.S.et al.「SITE-SELECTIVE CYCLIC AMPANALOGS AS NEW BIOLOGICAL TooLs IN GROWTH CONTROL，DIFFERENTIATION AND PROTO-ONCOGENE REGULATION，」CancerInv.7161-77；Cho-Chung，Y.S.et al.「ANTISENSE DNA--TARGETING PROTEIN KINASE A-RIα SUBUNITA NOVELAPPROACH TO CANCER TREATMENT，」Front Biosci 4D898-D907)。
先前已經證明多種類型癌細胞將PKA分泌到條件培養基中(Cho，Y.S.et al.「EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A As A CANCERBIOMARKERITS EXPRESSION BY TUMOR CELLS AND REVERSALBY A MYRISTATE-LACKING CALPHA和RIIBETASUBUNITOVEREXPRESSION，」Proc Natl Acad Sci USA.97[2]835-40)。該細胞外蛋白激酶A(ECPKA)以活性、游離的催化亞基(C亞基)形式存在(「PKACα」)，而且其活性被PKA抑制蛋白PKI特異抑制。PKA的Cα或者RIα亞基基因在表達載體中的過表達(其上調細胞內PKA-I)顯著地上調ECPKA表達。與此對比，RIIβ亞基的過表達—其消除PKA-I，上調PKA-II，並恢復轉化的表型—下調ECPKA。在Cα基因中防止十四烷基化的突變允許細胞內PKA上調並且阻斷ECPKA增加，暗示ECPKA表達需要Cα的NH2-端肉豆蔻基。與正常血清相比，在癌症患者的血清中，ECPKA表達被顯著上調。(Cho，Y.S.et al.「EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A As ACANCER BIOMARKERITS EXPRESSION BY TUMOR CELLS ANDREVERSAL BY A MYRISTATE-LACKING CALPHAAND RIIBETASUBUNIT OVEREXPRESSION，」Proc Natl Acad Sci USA.97[2]835-40)。
單克隆抗體的發展已導致鑑定了在惡性腫瘤患者的血清和組織中許多腫瘤相關抗原。原癌基因和腫瘤抑制基因的蛋白產物可以在細胞外流體中被探測出來並且其被作為體內癌發生的潛在標記。這些生長因子中的一些由原癌基因編碼。例如，更高水平的p21-ras蛋白由在患者血液中發現的ras原癌基因編碼。對p53腫瘤抑制蛋白的循環抗體已經在乳腺癌和肺癌患者以及患有B-淋巴瘤的兒童的血清中被發現。(Winter，S.F.et al.「DEVELOPMENT OF ANTIB ODIES AGAINST p53 IN LUNG CANCERPATENTS APPEARS TO BE DEPENDENT ON THE TYPE OF p53MUTATION.」Cancer Res.524168-74；Lubin，R..et al.「ANALYSISOf p53 ANTIBODIES IN PATIENTS WITH VARIOUS CANCERS DEFINEB-CELL EPITOPES OF HUMAN p53DISTRIBUTION ON PRIMARYSTRUCTURE AND EXPOSURE ON PROTEIN SURFACE Cancer Res.535872-6；Crawford，L.V.et al.「DETECTION OF ANTIBODIESAGAINST THE CELLULAR PROTEIN p53 IN SERA FROM PATIENTSWITH BREAST CANCER.」Int.J.Cancer.30403-8)。對原癌基因如c-myc和c-myb的抗體也已經在患有結腸直腸腫瘤和乳腺腫瘤患者的血清中被發現(Sorokine.L，K.et al.「PRESENCE OF CIRCULATINGANTI-C-MYB ONCOGENE PRODUCT ANTIBODIES IN HUMAN SERA.」Int.J.Cancer.47665-9；Ben-Mahrez，K，，et.al.「DETECTION OFCIRCULATING ANTIBODIES AGAINST C-MYC PROTEIN IN CANCERPATIENT SERA.」Br J Cancer.57529-34；Ben-Mahrez，K.，et al.「CIRCULATING ANTIBODIES AGAINST C-MYC ONCOGENEPRODUCT IN SERA OF COLORECTAL CANCER PATIENTS.」Int JCancer，4635-8)。
除了上述提及的新標記外，其它蛋白質、激素和酶已經被用作標記30年了。其中著名的有癌胚抗原(CEA)，甲種胎兒球蛋白(AFP)，人絨毛膜促性腺激素(HCG)，和前列腺酸性磷酸酶(PAP)。但是，這些標記多數缺乏特異性。這些水平在良性條件下和在妊娠過程中也增加。所有這些標記均基於抗原確定方法；這些標記缺乏特異性和敏感性。因此急需發現新型的生物標記並將其轉入常規臨床應用。本發明就是為了解決這樣的需要。
發明概述本發明涉及一種高度敏感的測量細胞外蛋白激酶A(ECPKA)的IgG抗體的酶免疫測定法(EIA)。對來自295個患有各種類型癌症的患者和100個無癌症的人的血清進行測試。結果發現癌症患者中抗-ECPKA IgG抗體的頻率(92％)要明顯高於那些沒有患癌症的人(14％)。在由EIA測量的抗-ECPKA IgG抗體和通過PKA酶測定所測量的ECPKA抗原之間沒有明顯的關聯，而且抗ECPKA IgG抗體-EIA方法比ECPKA酶測定得到了更高的敏感性和特異性。這些結果證明自身抗體分析的方法，而不是傳統抗原分析，提供了用於癌症診斷的有用方法。
詳細地說，本發明提供了一種在哺乳動物的生物樣品中測量抗-ECPKA自身抗體的存在或者濃度的免疫測定法，其中免疫測定法包含下列步驟a)將生物樣品與特異於抗-ECPKA自身抗體的抗原接觸，所述接觸是在足以允許抗-ECPKA自身抗體在一旦存在於樣品中的情況下，與抗原結合併形成抗原-抗-ECPKA自身抗體複合物的條件下進行；b)將形成的抗原-抗-ECPKA自身抗體複合物與抗-ECPKA自身抗體結合分子接觸，所述接觸是在足以允許抗-ECPKA自身抗體結合分子結合到形成的抗原-抗-ECPKA自身抗體複合物的抗-ECPKA自身抗體上並且形成延伸的複合物的條件下進行；和c)通過確定形成的延伸的複合物的存在或者濃度來確定抗-ECPKA自身抗體在所述生物樣品中的存在或者濃度。
本發明還涉及上述免疫測定法的實施方案，其中特異於抗-ECPKA自身抗體的抗原是細胞外PKA蛋白。
本發明還涉及上述免疫測定法的實施方案，其中抗-ECPKA自身抗體是哺乳動物類的抗體，其與哺乳動物的抗體不同並且特異於由哺乳動物產生的抗體。
本發明還涉及上述免疫測定法的實施方案，其中哺乳動物是人而且抗-ECPKA自身抗體是人IgG抗體。本發明還涉及上述免疫測定法的實施方案，其中抗-ECPKA自身抗體結合分子被可檢測地標記(特別是用化學或者酶標記)。
本發明還涉及上述免疫測定法的實施方案，其中在步驟(a)中，特異於抗-ECPKA自身抗體的抗原在與生物樣品發生接觸前被固定到固體支持物上。
本發明還涉及上述免疫測定法的實施方案，其中在步驟(a)中，特異於抗-ECPKA自身抗體的抗原在與生物樣品發生接觸後被固定到固體支持物上。
本發明還涉及上述免疫測定法的實施方案，其中的免疫測定法是免疫色譜免疫測定法，其中在步驟(a)中，生物樣品被放置與第一多孔載體接觸，第一多孔載體含有非固定的、特異於抗-ECPKA自身抗體的標記的抗原；在步驟(b)中，形成的抗原-抗-ECPKA自身抗體複合物被放置與第二多孔載體接觸，第二多孔載體與第一多孔載體連通，並且含有固定的抗-ECPKA自身抗體結合分子；和在步驟(c)中，通過檢測在第二多孔載體中特異於抗-ECPKA自身抗體的標記的抗原的存在來確定抗-ECPKA自身抗體在生物樣品中的存在或者濃度。
本發明提供了一種免疫學複合物，其含有結合到抗-ECPKA自身抗體的特異於抗-ECPKA自身抗體的抗原，其中抗-ECPKA自身抗體還另外地結合到抗-ECPKA自身抗體結合分子上。
本發明還涉及上述免疫學複合物的實施方案，其中特異於抗-ECPKA自身抗體的抗原是細胞外PKA蛋白。
本發明還涉及上述免疫學複合物的實施方案，其中抗-ECPKA自身抗體結合分子被可檢測地標記(特別是用化學或者酶標記)。
本發明還涉及上述免疫學複合物的實施方案，其中抗-ECPKA自身抗體結合分子是免疫學分子。本發明還涉及上述免疫學複合物的實施方案，其中抗-ECPKA自身抗體是人自身抗體，而且抗-ECPKA自身抗體結合分子是人IgG抗體。
本發明還涉及一種試劑盒，其用於測定哺乳動物的生物樣品中測量抗-ECPKA自身抗體的存在或者濃度，其中試劑盒含有包含多層濾過系統的中空的外殼，和第一及第二多孔載體，其中第二多孔載體與第一多孔載體相通，而且第一多孔載體與多層濾過系統相通，其一部分可以從外殼到達，其中第一多孔載體含有非固定的、標記的PKA Cα或者Cα片段；和第二多孔載體含有固定的、未標記的、結合到人IgG的抗體。
本發明還涉及上述試劑盒的實施方案，其中標記的PKA Cα是ECPKA(特別是用化學或者酶標記)。
本發明還涉及上述試劑盒的實施方案，其中試劑盒檢測人抗-ECPKA自身抗體，而且結合人IgG的抗體是非人哺乳動物的抗體。


圖1顯示了使用本發明優選的免疫測定形式對正常個體和癌症患者中獲得的數值。患者的頻率和平均滴度(頻率＝92％，平均滴度2.2)均明顯高於正常對照的那些(頻率＝14％，平均滴度0.6)。數值超過1.0(虛線上)為陽性。
圖2顯示了抗ECPKA自身抗體ELISA(圖1)的接受器工作特徵(ROC)曲線。在交匯點，ELISA測定的截止值為1.0滴度，而且敏感性和特異性分別為90％和89％。
圖3顯示了對癌症患者血清中抗ECPKA自身抗體的蛋白印跡分析結果。用考馬斯藍染色含有M(mw標記)和Cα(1μg)的泳道；條帶1用Santa Cruz Ab抗Cα抗體印跡(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)；條帶2-7用癌症患者血清印跡(10,000倍稀釋)；條帶8-12用正常人血清印跡(10,000倍稀釋)；條帶1-12含有純化的PKA Cα(每個1μg)。
圖4顯示了通過將ECPKA酶測定作為本發明免疫檢測形式的敏感性和辨別能力的對照而獲得的數值。該圖顯示了從正常個體和癌症患者獲得的數值(癌症患者，頻率＝83％，平均值＝130mU/ml；正常個體對照，頻率＝21％，平均值＝60mU/ml)，其顯示缺少敏感性和特異性。大於75mU/ml(虛線上)的數值為陽性。
圖5顯示了來自癌症患者和健康人的血清的抗-ECPKA抗體滴度和ECPKA酶活性之間的相關研究的結果。0.003的癌症患者係數和0.001的健康人係數在統計學上無意義。
圖6顯示了將HCT-15Z腫瘤提取物用作癌症抗原的來源，來自癌症患者和健康人的血清的抗癌抗原抗體的滴度。數值大於1.5(虛線)是陽性。
圖7顯示了來自患有不同類型癌症(肺，腎，胰腺的，卵巢的，結腸，肝，胃，膀胱，和宮頸癌，黑色素瘤，肉瘤，和平滑肌瘤)的癌症患者的血清中觀測到的抗原抗體的滴度。
優選實施方式的描述本發明涉及用於在生物樣品中檢測抗-ECPKA自身抗體的組合物和方法，以及這些組合物和方法在人和非人哺乳動物(特別是犬科，貓科，牛科，羊科(ovine)，豬科，和馬科哺乳動物)中診斷癌症中的應用。
細胞外形式的PKA(ECPKA)從癌細胞中分泌出來(Cho，Y.S et al. 「EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A As A CANCERBIOMARKERITS EXPRES SION BY TUMOR CELLS AND REVERSALBy A MYRISTATE-LACKING CALPHAAND RIIBETASUBUNITOVEREXPRESCTON，」Proc Natl Acad Sci USA.97[2]835-40)。本發明的動機部分來自這樣的認識，ECPKA分泌激發血清自身抗體的形成，而且這種自身抗體的存在和/或濃度可以作為癌症診斷和預測的標記。如本文所述，本發明提供了在懷疑的或者被證實癌症患者的生物樣品中測量抗-ECPKA自身抗體(特別是抗ECPKA IgG抗體)濃度和/存在的高度靈敏的免疫測定法。此基於自身抗體的免疫測定法提供了用於檢測各種類型癌細胞的常規診斷程序。
本發明涉及抗原與抗體的結合。如此處所用，「表位」是被識別並特異結合於抗體的抗原的2或者3維區域。如此處所用，如果其能夠免疫學特異的相互結合，則可以說抗原和抗體相互「特異」，或者相互「識別」，或者相互「結合」。
任何廣泛類型的測定模式均可依照本發明的方法使用。這些模式可以是異質的或者同質的，連續的或者同時的，競爭性的或者非競爭性的。美國專利號5,563,036；5,627,,080；5,633,141；5,679,525；5,691,147；5,698,411；5,747,352；5,811,526；5,851,778；和5,976,822舉例說明了幾種不同的測試模式和應用。這樣的測試可以被模式化為定量的以測量抗-ECPKA自身抗體的濃度或量，或者其可以被模式化為定性的以測量抗-ECPKA自身抗體的存在或者缺少。
異質的免疫測定技術典型地涉及使用反應產物將與其結合的固相材料，但是也適合於涉及非固定的抗原與抗體的結合(即，溶液相免疫測定)。通過將固相從反應混合物中移除(例如通過清洗)，反應產物從過量樣品，測試試劑，和其它物質中分離。一種可以依照本發明使用的固相免疫測定類型是夾心免疫測定法。在夾心測定中，樣品中的分析物越多，固相上存在的標記量越多。通常優選這種類型的測定模式，特別是用於肉眼檢測低濃度的分析物，這是因為出現在固相的標記更容易被檢測到。
依照本發明的優選實施方案，特異地與抗ECPKA自身抗體反應的抗原被結合到固體支持物上(即固定)並與被用來測試抗-ECPKA IgG抗體存在的生物樣品接觸溫育。如將被理解，可以將抗原與生物樣品以未結合狀態一起溫育，並隨後將其結合到固體支持物上(即可固定的)。隨後優選將支持物徹底地進行處理(例如通過清洗等等)以基本上移除可能存在但是沒有結合到結合抗原的非ECPKA IgG抗體。這樣處理的結果是在抗原和抗ECPKA IgG抗體之間形成免疫複合物。
優選隨後添加可檢測的標記的第二抗體並且將支持物置於在足以使得第二抗體結合到任何可能存在的抗-ECPKA IgG抗體的條件下溫育。隨後優選將支持物徹底地進行處理(例如通過清洗等等)以基本上移除任何沒有結合的第二抗體。如果在測試樣品中存在抗-ECPKA IgG抗體，那麼兩種抗體將與分析物形成免疫複合物(即第二抗體/抗-ECPKA IgG抗體/抗原夾心)。在這樣的測試中，測定到結合到支持物的第二抗體表明被測試流體中抗-ECPKA IgG抗體的存在。夾心測定模式被描述在Schuurs et al.美國專利號3,791,932和4,016,043中，以及Pankratz et al.美國專利號5,876,935中。第二抗體可以是從非人靈長動物中分離出來的天然免疫球蛋白(例如抗人IgG鼠抗體，抗人IgG羊抗體，等等)，或者可以經過重組或者合成產生。其可以是完整的免疫球蛋白，或者免疫球蛋白片段(例如Fab，F[Ab]2，等)。如果需要，可以使用其它的結合分子(能夠結合抗-ECPKA自身抗體)協調或者代替這類第二抗體。例如，抗-ECPKA自身抗體可以是生物素化的而且可以用標記的抗生素蛋白或者鏈黴抗生物素來代替第二抗體。
為了消除未結合的分離步驟並減少化學結合測定所需的時間和設備，也可以選擇性地使用同質測定模式。在這樣的測試中，結合對的一種組分可以仍然是被固定的；但是，不用未結合分離來測定結合對的第二組分的存在。同質的光學方法的實例是Syva，Inc.(Sunnyvale，CA)的EMIT方法，其通過測定螢光猝滅來操作；Behringwerke(Marburg，Germany)的雷射比濁膠乳顆粒凝集法，其通過測定光散射的變化來操作；Mitsubishi ChemicalIndustries(Tokyo，Japan)的LPIA膠乳顆粒凝集法；Abbott Laboratories(Abbott Park，IL)的TDX螢光去極化法；Cis Bio Intemational(Paris，France)的螢光能量轉移法。任何這些測定法都可以被改變以適用於本發明的目的。
本發明的結合測定可以被設定成競爭性測定。在競爭性測定中，測試樣品中存在的抗-ECPKA IgG抗體越多，固相上存在的標記量越少。
以類似於夾心測定法的方式，競爭性測定可以通過提供定量的標記的抗-ECPKA IgG抗體並確定被測試流體是否含有將與標記抗體競爭結合支持物的抗-ECPKA IgG抗體來進行。在這樣的競爭性測定中，所捕集的標記抗體量與存在於測試樣品中的分析物量成反比。Smith(美國專利號4,401,764)描述了備選的競爭性測定模式，其使用混合的可以結合分析物或者標記分析物的結合複合物，但是其中的分析物和標記分析物不能同時與複合物結合。Clagett(美國專利號4,746,631)描述了使用反應室的免疫測定法，在反應室中，分析物/配體/標記綴合物在測試樣品分析物存在的情況下被從反應表面取代，而且被取代的分析物/配體/標記綴合物被固定在第二反應位點。綴合物包括生物素，牛血清白蛋白，和作為綴合物的配體組分的合成肽，和酶，化學發光材料，酶抑制劑，和作為綴合物的標記組分的放射性核苷酸。Li(美國專利號4,661,444)描述了使用抗獨特型抗體和第二抗體的綴合物的競爭性免疫測定法，其特異於可檢測的標記，其中可檢測的應答與樣品中分析物的存在呈反比相關。Allen(歐洲專利申請號177,191)描述了涉及配體類似物和第二試劑如螢光素的綴合物的結合測定，其中綴合物與分析物(配體)競爭結合到標記的特異於配體的結合配偶體上，而且其中所得到的標記的綴合物隨後通過攜帶第二試劑結合配偶體的固相被從反應混合物中分離。這種結合測定模式將競爭性結合技術的使用和反向夾心測定構型相結合；即通過將綴合物結合到固相，在綴合物與混合物分離前將綴合物結合到標記的結合部件。但是，這種測定結果被確定為在傳統的競爭性測定中，其中結合到固相的標記的量與測試樣品中分析物的量成反比。Chieregatt et al.(GB專利號2,084,317)描述了類似的測定模式，其使用特異於分析物的間接標記結合配偶體。Mochida et al.(美國專利號4,185,084)還描述了使用雙抗原的綴合物，其與抗原分析物競爭結合到固定的抗體上並隨後被標記。該方法還導致檢測在固相上的標記，其中標記的量與測試樣品中分析物的量成反比。Sadeh et al.(美國專利號4,243,749)描述了類似的酶免疫測定，其中半抗原綴合物與分析物競爭結合固定在固相上的抗體。任何這些測定法的變體都適用於依照本發明使用。
在所有這些測定模式中，優選標記測定試劑的至少一種成分，或者在其他情況下通過光的發出或者熄滅來檢測。這種組分可以是第二抗體，抗-ECPKA IgG抗體，或者結合到抗-ECPKA IgG抗體的抗原，這依賴於所使用的免疫測定模式。放射性同位素結合測試模式(例如放射性免疫測試法等等)使用放射性同位素作為這種標記；在螢光或者螢光部分的存在下，通過光的發出來測定信號(見Lucas et al.[美國專利號5,698,411]和Landrumet al.[美國專利號5,976,822])。酶結合測定模式(例如ELISA等等)使用酶作為標記；在生色團或者螢光部分的存在下，通過顏色或者光的發出來測定信號。其它標記，例如順磁標記，用作著色顆粒的材料，膠乳顆粒，膠體金屬如硒和金，和染料顆粒(見美國專利號4,313,734；4,373,932，和5,501,985)也可以被使用。優選使用酶(特別是鹼性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，辣根過氧化物酶，或者脲酶)作為可檢測標記(即酶免疫測定或者EIA)。
酶標記的存在可以通過使用應答於酶標記催化的發色底物(包括發出或者吸收螢光、UV，可見光等等的那些)來檢測。更優選的，可以使用化學標記(例如膠體金，膠乳珠標記等等)。可以通過使用多個探測器，多程濾器(multipass filter)，光柵，或者光譜不同的螢光材料來實現標記檢測(見美國專利5,759,781)等。特別優選使用過氧化物酶作為酶標記，特別是與發色底物3，3』，5，5』-四甲基聯苯胺(TMB)相協同。在用過氧化物酶作為酶來標記抗體的過程中，可以使用高碘酸鹽技術(Nakane，P.K.et al. 「PEROXIDASE-LABELED ANTIBODY.A NEW METEOD OFCONJUGATION，」J Histochem Cytochem.221084-90)或者已報導的方法，其中的配偶體與雜雙官能團試劑連接(Ishikawa，E.et al. 「ENZYME-LABLELING OF ANTIBODIES AND THEIR FRAGMENTSFOR ENZYME IMMUNOAS SAY AND IMMUNOHISTOCHEMICALSTAINING，」J.Immunoassay.4[3]209-327)。
在本發明免疫測定中可以使用多種支持物的任何一種。固體支持物的合適的材料是合成材料例如聚苯乙烯，聚氯乙烯，聚醯胺，或者其它合成聚合物，天然聚合物例如纖維素，以及衍生的天然聚合物如乙酸纖維素或者硝基纖維素和玻璃，特別是玻璃纖維。支持物的形式可以是球狀，杆狀，管狀，和微測定或者微量滴定板。片狀結構例如紙條，小板，和膜也同樣適用。對於水溶液，載體表面可以是可滲透的或者不可滲透的。
儘管前面的描述涉及生物樣品中抗-ECPKA自身抗體存在的測定，所述生物樣品是流體(例如血清，血液，尿，唾液，胰液，腦脊液，精液等)，但是應該理解任何流體性生物樣品(例如組織或者活檢提取物，糞便的提取物、痰等等)都可以同樣地使用在本發明的測定法中。最優選地，被檢測的生物樣品是血清。
理想地，用於本發明測定中的材料適用於製備試劑盒。這樣的試劑盒可以含有被區室化從而以封閉形式接受的載體裝置，一個或者多個容器裝置瓶，管等；每一個容器裝置含有在方法中使用的一個分離的元素。例如，一個容器裝置可以含有結合到固體支持物的合適的抗原(例如ECPKA(PKA Cα或者Cα片段))或者一種或者多種不同類型癌症細胞和腫瘤的提取物)。第二容器可以含有可溶的、可以檢測的標記的第二抗體，優選以凍幹的形式，或者在溶液中。此外，試劑盒還可以含有一個或者多個容器，每個容器含有(不同的)預定量的ECPKA(PKA Cα或者Cα片段)或者抗-ECPKA(PKA Cα)自身抗體。這些後種容器可以被用於製備標準曲線，曲線可以插入從含有未知量針對ECPKA的自身抗體的樣品中所得到的結果。
在使用試劑盒的時候，使用者所需作的全部就是將預測量的樣品加入到容器中，所述的樣品懷疑含有可測量但是未知量的針對ECPKA的自身抗體，在第一容器中存在的預測量的支持物結合抗原，和在第二容器中存在的預測量的可檢測的標記的第二抗體。在溫育適當的時間後，免疫組合物形成並從上清液流體中分離，通過放射性計數，加入酶底物，和顏色顯色，或者通過併入化學標記(例如膠體金，膠乳珠等等)來檢測免疫複合物或者上清液流體。
本發明特別涉及使用免疫色譜測定模式來檢測抗-ECPKA自身抗體。在優選的免疫色譜測定模式中，使用兩種接觸但是空間不同的多孔載體。第一種這樣的載體將含有不固定的、標記的PKA Cα或者Cα片段(ECPKA[Cα]或者蛋白酶消化物或者Cα)，而且第二種這樣的載體將含有固定的但是未標記的抗體，該抗體與IgG結合(例如，其中人抗-ECPKA自身抗體被測定時，未標記的抗體可以是抗人IgG抗體)。
優選地，裝置將含有中空的外殼，其由例如塑料材料等製造，其中第一載體與外殼的內部通過可以從裝置到達的多層濾器系統不直接地相通(例如通過從其伸出或者被裝置不完全覆蓋)，這樣，血清，血漿，或者全血測試樣品可以被直接應用到濾器系統並從其滲透入第一多孔載體。在這樣的裝置中，含有抗-ECPKA自身抗體的流體的滲透將會引起第一載體的非固定的標記的PKA Cα或者Cα片段結合到遷移的抗體上，並隨後滲透入第二載體。因為第二載體含有固定的結合人IgG的抗體，任何進入第二載體的標記的PKA Cα或者Cα片段將被捕獲其中。
含有固定的未標記抗體的載體中的標記的PKA Cα或者Cα片段的檢測因此表明抗-ECPKA自身抗體在被評價的樣品中存在。通過測定結合在第二多孔載體中的標記PKA Cα或者Cα片段的量可以使得該測定成為定量的測定。
已經一般性地描述了本發明之後，可以通過參考下面的實施例更進一步理解本發明，這些實施例是通過舉例說明的方式提供的，除非另外指出，其不能被認為限制了本發明。
實施例實施例1人癌症診斷中抗-ECPKA自身抗體免疫檢測和PKA酶檢測的對比評價材料與方法受試者血清樣品從295個具有不同類型癌細胞的人患者和100個未患癌症的人中取得。
酶聯免疫吸附測定(ELISA)通過固相ELISA測定法測量癌症患者和健康個體血清中抗-ECPKA IgG自身抗體。為了進行這樣的測定，用100μl的稀釋的(50μg/ml濃度，用PBS)純化重組人PKA Cα抗原包被圓底聚氯乙烯微孔滴定板(Thermolab System，Helsinki，Finland)。將這些板在室溫下溫育1小時，而後用清洗緩衝液(20mM Hepes，0.9％NaCl，30mM蔗糖-0.1％牛血清白清蛋白[BSA]，pH 7.0)清洗一次，每個孔用100μl的Blockace(Serotec，http://www.serotec.com)水溶液(4g/400ml)在室溫下封閉2小時，而後用檸檬酸鈉洗液(50mM檸檬酸鈉，0.15M NaCl，0.1％聚氧化乙烯山梨糖醇酐單月桂酸脂吐溫20，pH 5.0-5.2)將板清洗2次。用樣品稀釋緩衝液(PBS pH 7.4，0.25％BSA[不含脂肪酸級VI]，0.05％吐溫20)將血清樣品稀釋到25,000倍，將100μl稀釋的樣品加入到每個孔中，隨後37℃下溫育1小時。在用檸檬酸鈉洗液清洗3次後，將100μl 20,000倍PBS稀釋的抗人IgG-HRP抗體-酶綴合物(Jackson ImmunoResearchLaboratories，West Grove，PA)(1％BSA)加入到孔中，而後，將板在室溫下溫育1小時。在用檸檬酸鈉洗液清洗板5次後，加入100μl的TMB底物。用100μl的0.45M硫酸試劑終止反應，而後在ELISA讀出器(BioRad[Hercules，CA]micropiate reader benchmark)上記錄在450nm的吸收。通過同時在血清樣品進行抑制測試來證實ELISA的特異性，其中血清樣品已經在室溫下用終濃度為1mg/ml的上述抗原溫育了1小時。PKA Cα的純化將來自OT1529-Cα質粒(Cho，Y.S.et al. 「EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A As A CANCER BIOMAKERITS EXPRESSION By TUMOR CELLS AND REVERSAL BY AMYRISTATE-LACKING CALPHAAND RIIBETASUBUNITOVEREXPRESSION，」Proc Natl Acad Sci USA.97[2]835-40)的重組人PKACα(1.1kb)注入(infuse)pQE31 DNA從而產生pQE-Cα(Hong，S.H.SeoulNational University，韓國，未發表)。pQE-Cα質粒在大腸桿菌中表達並且實現了天然PKA Cα蛋白的純化(Paragon，Baltimore MD)。PKA測定PKA酶活性的測量通過Rohlff C.(1993)等的方法(「8-Cl-cAMPINDUCES TRUNCATION AND DOWN-REGULATION OF THE RIALPHA SUBUNIT AND UP-REGULATION OF THE RII BETA SUBUNITOF CAMP-DEPENDENT PROTEIN KINASE LEADING TO TYPE IIHOLOENZYME-DEPENDENT GROWTH INHIBITION ANDDIFFERENTIATION OF HL-60 LEUKEMIA CELLS，」J Biol Chem，2685774-82)。為了測定血清ECPKA活性，將測定(總體積50μl)在37℃下在反應混合物(含有50mM Tris HCI[pH 7.5]，1mMDTT，10mM MgCl2，5μM肯普肽(Kemptide)[一種PKA的合成底物；GIBCO/BRL]，1.2μM[γ-32P]ATP[25Ci/mmol；ICN]，有或者沒有5μM cAMP和5μM PKI)和10μl血清中進行20分鐘。在溫育後，將反應混合物點塗到磷酸纖維素板(disk)(GLBCO/BRL)上並用0.5％的磷酸清洗三次。將濾器風乾並用液體閃爍計數儀計數。一個單位的PKA活性被定義為在37℃的標準測定系統中在一分鐘的時間內將1pmol32P從(γ-32P)ATP轉移到回收蛋白的酶的量。LDH活性通過商用試劑盒(Sigma)來測定。
結果使用上述ELISA來測定人患者和正常對照個體的血清，將抗-ECPKA自身抗體滴度任意表達為對正常對照血清的平均吸收度的比率。相比於正常對照的抗-ECPKA自身抗體滴度，大於1.0的比率被認為是陽性。
測定是可重複的，其流程內(within-run)和流程間(between-run)的CV分別為＜8.8％和＜9.0％。圖1顯示了癌症患者血清中抗-ECPKA自身抗體的數值。患者的頻率和平均滴度(頻率＝92％，平均滴度2.2)均顯著高於正常對照(頻率＝14％，平均滴度0.60)。
接收器工作特性(ROC)曲線(圖2)用圖解表示了在不同截止值計算的ELISA測定的靈敏性和特異性。在交匯點，抗-ECPKA自身抗體滴度的截止值為1.0(圖1)，而且ELISA測定的敏感性和特異性分別為90％和89％。
免疫印跡在癌症患者的血清中鑑別出抗-ECPKA自身抗體(圖3)。隨機選擇的患者血清顯示了對純化PKA Cα蛋白(40kDa)的免疫交叉反應性(圖3，條帶2-7)，然而在正常血清中沒有觀察到對Cα蛋白的這種免疫交叉反應性(圖3，條帶8-12)。
ECPKA酶測定(其測量抗原濃度)在癌症患者(n＝66)和正常對照(n＝66)間的頻率和平均數值得到了顯著的重疊(患者，頻率＝83％，平均數值＝130mU/ml；正常對照，頻率＝21％；平均數值＝60mU/ml)，表明缺少敏感性和特異性(圖4)。
通過ELISA獲得的個體抗-ECPKA自身抗體滴度與通過PKA酶測定測量的ECPKA之間的比較見圖5。通過ELISA獲得的抗-ECPKA IgG抗體滴度和通過酶測定測量的ECPKA滴度(ECPKA抗原測量)之間沒有關聯。
實施例2關於抗-ECPKA自身抗體免疫測定及其在人癌症中的用途的結論本發明證實指向ECPKA的自身抗體在血清中的存在與癌症高度相關。為抗-ECPKA自身抗體而開發的ELISA是高度敏感和特異的，其在癌症患者中顯示了非常高(平均滴度2.2，頻率92％)的抗-ECPKA自身抗體滴度，而在正常個體對照中顯示低的或者負的滴度和頻率(14％)。由ELISA檢測的頻率與由酶測定檢測的頻率之間的比較顯示，與測量抗原活性的酶測定相比，檢測ECPKA自身抗體的ELISA是高度敏感和特異的。
為了檢查是否本發明的自身抗體檢測方法可以延伸到其它癌症抗原(細胞外分泌的)，進行下面的實驗將HCT-15腫瘤(裸鼠上生長的多藥抗性人結腸癌)用作癌症抗原源。將腫瘤在緩衝液#10(20mM Tris-HClpH7.4，100mMNaCl，0.5％脫氧膽酸鈉，5mM MgCl2，蛋白酶抑制劑雞尾酒組合I[Calbiochem])中勻漿(1∶3)，1份腫瘤(重量)，3份緩衝液(體積)。將勻漿在10,000rpm下離心10分鐘，並收集上清液(提取物)。將提取物與蛋白A瓊脂糖(3∶1)溫育，在4℃下旋轉1小時，將製劑以6,000rpm離心2分鐘。收集上清液並在4℃在PBS中透析過夜。透析後，提取物已經可備用於在ELISA中包被微量滴定板。圖6顯示了來自癌症患者(n＝36)和健康人(n＝25)血清中抗癌抗原抗體的滴度。數值大於1.5(虛線)是陽性。圖7顯示了來自患有不同類型癌症(肺，腎，黑色素瘤，胰腺的，卵巢的，結腸，肝，胃，膀胱，和宮頸癌，和肉瘤，和平滑肌瘤)的患者的血清中觀測到的抗原抗體的滴度。患者血清(n＝36)和正常血清(n＝25)與圖6中的那些相同。
這些結果證明使用本發明自身抗體檢測方法來檢測人和動物中的癌症抗原是可能的。所得到的結果顯示用ELISA來檢測自身抗體，而不是檢測ECPKA的抗原和其它癌症抗原，提供了在人和動物中診斷癌症的新途徑。
所有在說明書中提及的出版物和專利都作為參考結合於此，如同每個單獨的出版物或專利申請都已經被特殊地和各自地結合作為參考一樣。
雖然結合其具體實施方案已對本發明進行了描述，應該理解它是可被進一步修改的，並且本申請意欲涵蓋通常遵循本發明的原則，並且包括例如偏離本發明的公開內容但是卻在本發明所屬領域已知的或者慣例範圍內並且適用於在上文中闡明的必要特徵的本發明的各種變體，用途，和改變。
權利要求
1.一種在哺乳動物的生物樣品中測量抗-ECPKA自身抗體的存在或者濃度的免疫測定法，其中所述的免疫測定法包含下列步驟(a)將所述的生物樣品與特異於抗-ECPKA自身抗體的抗原接觸，所述接觸是在足以允許抗-ECPKA自身抗體在一旦存在於所述樣品中的情況下，與所述的抗原結合併形成抗原-抗-ECPKA自身抗體複合物的條件下進行；(b)將所述的形成的抗原-抗-ECPKA自身抗體複合物與抗-ECPKA自身抗體結合分子接觸，所述的接觸是在足以允許所述的抗-ECPKA自身抗體結合分子結合到所述形成的抗原-抗-ECPKA自身抗體複合物的抗-ECPKA自身抗體並且形成延伸的複合物的條件下進行；和(c)通過確定所述形成的延伸的複合物的存在或者濃度來確定所述抗-ECPKA自身抗體在所述生物樣品中的存在或者濃度。
2.權利要求1的免疫測定法，其中所述的特異於抗-ECPKA自身抗體的抗原是細胞外PKA蛋白。
3.權利要求1的免疫測定法，其中所述的抗-ECPKA自身抗體是哺乳動物物種的抗體，其與所述哺乳動物的抗體不同並且特異於由所述哺乳動物產生的抗體。
4.權利要求3的免疫測定法，其中所述的哺乳動物是人而且所述的抗-ECPKA自身抗體是人IgG抗體。
5.權利要求1的免疫測定法，其中所述的抗-ECPKA自身抗體結合分子被可檢測地標記。
6.權利要求5的免疫測定法，其中所述的可檢測的標記是化學標記。
7.權利要求1的免疫測定法，其中在所述的步驟(a)中，所述的特異於抗-ECPKA自身抗體的抗原在與所述的生物樣品發生所述的接觸前被固定到固體支持物上。
8.權利要求1的免疫測定法，其中在所述的步驟(a)中，所述的特異於抗-ECPKA自身抗體的抗原在與所述的生物樣品發生所述的接觸後被固定到固體支持物上。
9.權利要求1的免疫測定法，其中的免疫測定法是免疫色譜免疫測定法，其中在所述步驟(a)中，所述生物樣品被放置與第一多孔載體接觸，所述的第一多孔載體含有非固定的、特異於抗-ECPKA自身抗體的標記的抗原；在所述步驟(b)中，所述形成的抗原-抗-ECPKA自身抗體複合物被放置與第二多孔載體接觸，所述的第二多孔載體與所述的第一多孔載體相通，並且含有固定的抗-ECPKA自身抗體結合分子；和在所述步驟(c)中，通過檢測在所述第二多孔載體中所述的特異於抗-ECPKA自身抗體的所述標記的抗原的存在來確定所述抗-ECPKA自身抗體在所述生物樣品中的存在或者濃度。
10.一種免疫複合物，其含有結合到抗-ECPKA自身抗體的特異於抗-ECPKA自身抗體的抗原，其中所述的抗-ECPKA自身抗體還另外地結合到抗-ECPKA自身抗體結合分子上。
11.權利要求10的免疫複合物，其中所述的特異於抗-ECPKA自身抗體的抗原是細胞外PKA蛋白。
12.權利要求10的免疫複合物，其中所述的抗-ECPKA自身抗體結合分子被可檢測地標記。
13.權利要求12的免疫複合物，其中所述的可檢測的標記是化學標記。
14.權利要求10的免疫複合物，其中所述的抗-ECPKA自身抗體結合分子是免疫分子。
15.權利要求14的免疫複合物，其中所述的抗-ECPKA自身抗體是人自身抗體，而且所述的抗-ECPKA自身抗體結合分子是抗人IgG抗體。
16.一種試劑盒，其用於測定哺乳動物的生物樣品中抗-ECPKA自身抗體的存在或者濃度，其中所述的試劑盒含有包含多層濾過系統的中空的外殼，和第一及第二多孔載體，其中所述的第二多孔載體與所述第一多孔載體相通，而且所述的第一多孔載體與所述的多層濾過系統相通，其一部分可以從所述的外殼達到，其中所述的第一多孔載體含有非固定的、標記的PKACα或者Cα片段；和所述的第二多孔載體含有固定的、未標記的結合到人IgG的抗體。
17.權利要求16的試劑盒，其中所述的PKA Cα是ECPKA。
18.權利要求16的試劑盒，其中所述的標記的PKA Cα的所述標記是化學標記。
19.權利要求16的試劑盒，其中所述的試劑盒檢測人抗-ECPKA自身抗體，而且所述的結合人IgG的抗體是非人哺乳動物的抗體。
20.利用權利要求10-15中任何一項的免疫複合物來診斷非人哺乳動物的癌症的方法。
21.利用權利要求16-19中任何一項的試劑盒來診斷非人哺乳動物的癌症的方法。
全文摘要
本發明公開了用於在生物樣品中檢測抗－ECPKA自身抗體的組合物和方法，以及這些組合物和方法在人和非人哺乳動物中癌症診斷的應用。
文檔編號G01N33/53GK101042402SQ200610071748
公開日2007年9月26日 申請日期2006年3月24日 優先權日2005年3月24日
發明者尹S·調正 申請人:生物哲麥克斯公司