糖苷水解酶61家族蛋白在纖維素加工中的用途的製作方法

2023-11-01 03:45:32

專利名稱：糖苷水解酶61家族蛋白在纖維素加工中的用途的製作方法
技術領域：
本發明總體涉及糖酵解酶及其用途的領域。更具體地，本發明提供來自嗜熱毀絲黴(Myceliophthora thermophila)的GH61蛋白、和所述蛋白在從纖維素生物質產生可發酵糖類和乙醇中的用途。直量纖維素生物質是用於生成可發酵糖類的重要的可再生資源。這些糖類可用作發酵和其他代謝工藝的基質以產生生物燃料、化學化合物和其他有商業價值的終產物。雖然將糖類諸如單糖發酵為乙醇相對直接，但將纖維素生物質有效轉化為可發酵的糖類是有挑戰的。Ladisch 等人，1983, Enzyme Microb.Technol.5:82。纖維素生物質向可發酵糖類的轉化可以開始於化學、機械、酶促或其他預處理以提高纖維素對水解的敏感性。這種預處理之後可以是使用分解纖維素的酶進行的纖維素向纖維二糖、纖維寡糖、葡萄糖和其他糖類與糖聚合物的酶促轉化。這些酶總稱為「纖維素酶」，並包括內切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶和纖維二糖水解酶。發明概述在一個方面，本發明提供從嗜熱毀絲黴獲得的重組糖苷水解酶61家族(GH61)蛋白和編碼所述蛋白的核酸。本發明`還提供來自嗜熱毀絲黴培養物肉湯的分離和純化的GH61蛋白。這些蛋白可用於增加含纖維素的基質經歷被纖維素酶諸如內切葡聚糖酶、β_葡糖苷酶和纖維二糖水解酶之一或其組合糖化的反應的產物的產量。重組或分離的GH61蛋白的加入或存在可增加纖維素酶的產物的產量，例如，至少20%、30%、50%、70%、2倍、3倍或更多。本發明的一個實施方案是包含分離的或重組的GH61蛋白的組合物和用於製備這樣的組合物的方法。蛋白可從嗜熱毀絲黴分離，或可通過重組產生來獲得。提供了二十四種全長嗜熱毀絲黴GH61蛋白的胺基酸序列。本發明的GH61蛋白包括包含與所列的蛋白(SEQID NO:1-30)的任一種或其生物活性片段至少約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%相同的胺基酸序列的蛋白。示例性的GH61蛋白是GH61a(SEQ ID NO:2)。其他示例性GH61蛋白包括GH61o、GH61v、GH61x、GH61b 和 GH61e(SEQ IDNO:6、13、15、16、19、30)。其他示例性的 GH61 蛋白包括 GH61f、GH61v、GH61p、GH61g 和 GH61i(SEQ ID NO:7、13、20、21、23、26)。在一個方面，根據本發明的方法製備的組合物包括分離的或重組的GH61蛋白和本公開文件中列出的一種或多種纖維素酶，包括但不限於選自內切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的纖維素酶。GH61蛋白和纖維素酶可從相同或不同的宿主細胞類型獲得。
本發明的另一實施方案是從纖維素基質產生可發酵糖類的方法。將包含基質的漿料與包含GH61蛋白的組合物接觸，從而從基質產生可發酵糖類諸如葡萄糖和木糖。組合物還可包含選自纖維素酶蛋白(內切葡聚糖酶、葡糖苷酶、I型纖維二糖水解酶和2型纖維二糖水解酶)、酯酶、木聚糖酶、半纖維素酶、脂酶、蛋白酶、澱粉酶和葡糖澱粉酶的一種或多種酶。基質可獲取自，例如，小麥、麥杆、高粱、玉米、大米、大麥、甘蔗渣、草、柳枝稷、玉米粒、玉米芯、玉米纖維、或其組合，以預處理的麥杆示例。可發酵糖類可被回收並用於產生終產物諸如醇(諸如乙醇或丁醇)、糖醇(諸如山梨醇)、有機酸(諸如乳酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、穀氨酸、檸檬酸或丙酸)、胺基酸(諸如甘氨酸、賴氨酸或天冬氨酸)、有機酸、烷、烯、二醇或甘油。本發明的另一實施方案是在用一種或多種纖維素酶的糖化反應中，通過在上述GH61蛋白的存在下進行反應來增加可發酵糖類的產量的方法。在另一個方面，本發明提供水解纖維素基質的方法。將基質與包含一種或多種重組GH61蛋白、一種或多種β-葡糖苷酶(BGL)以及一種或多種纖維二糖水解酶(CBH)的組合物接觸。在一些實施方案中，酶組合物基本上無內切葡聚糖酶(EG)。水解可導致葡萄糖產量比在所述GH61蛋白不存在時進行的相同反應的產量多至少20%、30%、50%、70%、2倍、3倍或更多。本發明的另一實施方案是從纖維素基質產生終產物的方法。在藉以產生可發酵糖類的條件下將基質與包含上述GH61蛋白的組合物接觸。然後在發酵中將可發酵糖類與微生物接觸以產生終產物，諸如以上列出的那些。該方法適於製備醇，尤其是乙醇，其中微生物是酵母。 本發明的其他實施方案包括:a)上述重組GH61蛋白，任選地被產生為帶有異源信號肽山)編碼GH61蛋白的核酸序列，其可以可操作地連接於異源啟動子；c)產生所述重組GH61蛋白的宿主細胞，以嗜熱毀絲黴、酵母、毛殼屬(Chaetomium)、梭孢殼屬(Thielavia)、支頂抱屬(Acremonium)、毀絲黴屬(Myceliophthora)、麴黴屬(Aspergillus)或木黴屬(Trichoderma)宿主細胞示例。本發明還包括重組產生的GH61蛋白在產生乙醇中的用途。GH61蛋白包括與所列的蛋白的任一種、或其具有GH61活性的片段至少60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約92 %、約93 %、約94 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %相同的胺基酸序列。在一個相關的方面，本發明提供編碼GH61蛋白的核酸。本發明還提供包含編碼本發明的蛋白序列(SEQ ID NO:1至30)、可操作地連接於異源啟動子的重組核酸序列的細胞。宿主細胞可以是(例如)嗜熱毀絲黴細胞或酵母細胞。在一個實施方案中，重組核酸序列包括SEQ ID NO:31 ;或SEQID NO:32至59的任一種。該細胞還可表達選自內切葡聚糖酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)、和/或2型纖維二糖水解酶(CBH2)的至少一種重組纖維素酶蛋白。在一個實施方案中，該細胞表達GH61蛋白和選自內切葡聚糖酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGLl)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)、和/或2型纖維二糖水解酶(CBH2)、和/或所述纖維素酶蛋白的變體的至少一種、至少兩種、或至少三種重組纖維素酶蛋白。在一個方面，本發明提供包含GH61蛋白(例如，SEQ ID Ν0:2)、內切葡聚糖酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的組合物，其中GH61蛋白、EG、BGL、CBH1和CBH2的組合質量是組合物中總的無細胞的蛋白的至少約20%、40%、60%、70%、80%、90%、95%、或基本上全部。組合物中可存在的CBH1、CBH2、EG和BGL酶的一種、兩種、三種、或所有四種可以是衍生自天然存在的纖維素酶蛋白的變體。組合物還可以是包含纖維素酶蛋白的細胞培養物肉湯。在一個方面，本發明提供包含SEQ ID NO:3至30的任一種的GH61蛋白或其分泌片段。任選地，該蛋白包含分泌片段和相應的信號肽序列，如果存在信號肽序列的話。在一個相關的方面中，本發明提供與本文提供的多肽或生物片段具有至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91 %、至少約92 %、至少約93 %、至少約94%、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %序列同一性的GH61蛋白變體。在一個方面，本發明提供編碼上述蛋白的重組核酸序列，其可具有天然存在的基因或其片段的序列。在一個實施方案中，核酸的蛋白編碼序列可操作地連接於異源信號序列。通常，該重組核酸序列可操作地連接於異源啟動子。在一個方面，本發明提供包含本發明的重組核酸的宿主細胞。該細胞可 表達選自內切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)U型纖維二糖水解酶(CBHl)、和/或2型纖維二糖水解酶(CBH2)的至少一種、兩種、三種或四種重組纖維素酶蛋白。在一個方面，本發明提供包含包括選自SEQ ID NO:1至30、和或其至少一種生物活性片段的分泌部分的序列的至少一種分離的蛋白的組合物。在一個實施方案中，該組合物還包含至少一種內切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)、和/或2型纖維二糖水解酶(CBH2)，其中GH61蛋白、EG、BGL、CBHl和/或CBH2的組合質量是組合物中總的無細胞的蛋白的至少約70%。在一個方面，本發明提供用於糖化的方法:(a)在至少一種GH61蛋白被分泌進入培養物肉湯的條件下培養本發明的細胞，和(b)在發生糖化的條件下混合所述肉湯與纖維素生物質，其中(a)可在(b)之前發生或與(b)同時發生。在一個方面，本發明提供水解澱粉的方法，包括將澱粉與包含一種或多種重組GH61蛋白和一種或多種澱粉酶的組合物接觸。本發明的其他實施方案將由以下說明變得明顯。


圖1取自使用來自嗜熱毀絲黴的重組產生的GH61a蛋白的實驗。使用來自嗜熱毀絲黴的培養物肉湯的纖維素酶試驗了該蛋白的纖維素酶增強活性。圖1(A)顯示與在GH61a不存在時的糖化反應相比，在GH61a存在下進行的相同反應的產量改進的百分比。在圖1(B)中，將數據繪圖來顯示總的葡萄糖產量。圖2取自使用從嗜熱毀絲黴的培養物肉湯分離的包含GH61的級分(斤action)的實驗。將GH61蛋白GH61f、GH61p、和/或GH61a與CBHla和CBH2b混合。這些結果證明，包含這些組分的酶混合物具有將纖維素基質轉化為葡萄糖的足夠的酶活性。圖3顯示GH61a蛋白對纖維素生物質的粘度的影響。詳沭1.引言
已確定，絲狀真菌嗜熱毀絲黴產生GH61蛋白。當含纖維素的基質經歷被一種或多種纖維素酶糖化時，GH61蛋白增加可發酵糖類的產量。除了其他用途以外，由糖化產生的可發酵糖類可用在發酵反應中以產生終產物，諸如但不限於乙醇。GH61蛋白可從嗜熱毀絲黴細胞分離。GH61蛋白還可通過表達編碼本公開文件中提供的GH61蛋白序列的任一種的核酸來重組地產生，本公開文件中提供的GH61蛋白序列包括野生型序列以及野生型序列的變體和片段。本發明的GH61蛋白和組合物的製備和用途在以下部分更詳細地描述。II定義本文提到的所有專利和出版物，包括在這些專利和出版物中公開的所有序列均通過引用明確地併入本文。除非另外指明，否則本發明的實施涉及在分子生物學領域、發酵領域、微生物學領域和相關領域中通常使用的常規技術，這些技術是所屬領域普通技術人員已知的。除非在本文中另外定義，否則本文使用的所有技術術語和科學術語均具有本發明所屬領域的普通技術人員所通常理解的含義。儘管在本發明的實施或試驗中可使用與本文所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，但描述了一些優選的方法和材料。實際上，意圖在於本發明不限於本文所述的特定方法學、方案和試劑，因為這些可隨使用它們的背景而改變。本文提供的標題不是對本發明的多個方面或實施方案的限制。儘管如此，為了促進對本發明的理解，以下定義了若干術語。數值範圍包括限定範圍的數字。這樣，本文公開的每個數值範圍旨在包括落在這種較寬的數值範圍內的每個較窄的數值範圍，如同這種較窄的數值範圍全部被明確寫在本文一樣。意圖還在於本文公開的每個最大(或最小)的數值限制(numerical limitation)包括每個較低(或較高)的數值限制，如同這種較低(或較高)的數值限制被明確地寫在本文一樣。如本文所用，術語「包括」及其同源詞以其包含的意義使用(即，等同於術語「包含」及其對應的同源詞)。如在此處和在所附權利要求中所用，除非上下文另外清楚地表示，否則單數「一(a)」、「一(an)」和「該(the) 」包括複數指代。因此，例如，提到「宿主細胞」包括多個此類
宿主細胞。除非另外指明，否則分別以5'至3'方向從左到右書寫核酸；以氨基到羧基方向從左到右書寫胺基酸序列。本文提供的標題不是對可通過參照作為整體的說明書而具有的本發明的多個方面或實施方案的限制。據此，通過參照作為整體的說明書更完全地定義以下所定義的術語。如本文所用，「GH61蛋白」是具有GH61(或「纖維素酶增強」)活性的蛋白。「GH61蛋白」或GH61多肽可具有天然存在的(野生型)蛋白的序列，或可包括相對於野生型蛋白的變異。如本文所用，表I和表2所示的GH61蛋白序列(SEQ ID NO:1_30)被認為是野生型序列。如果當蛋白被包括在糖化反應(例如，使用內切葡聚糖酶、葡糖苷酶、以及I型和2型纖維二糖水解酶進行)中時比在GH61蛋白不存在時在相同條件下進行的糖化反應導致更大量(即，更大產量)的一種或多種可溶性糖類(例如，葡萄糖)，則該蛋白具有「GH61活性」或「纖維素酶增強活性」或是「生物活性」的。「生物活性變體」是保留野生型蛋白的GH61活性的至少一些(例如，至少10% )的變體或片段。如本文所用，「變體」GH61蛋白(或編碼GH61蛋白的多核苷酸)是包含相對於野生型GH61 (或編碼GH61的野生型多核苷酸)的一種或多種修飾的GH61蛋白。修飾包括一個或多個胺基酸殘基(或多核苷酸中的一個或多個核苷酸或密碼子)的取代、插入、缺失、和/或氨基或羧基截短。包含相對於野生型蛋白的缺失的變體可稱為「片段」。如本文所用，GH61蛋白的「片段」是(a)具有野生型序列但包含相對於SEQ ID NO:1-30的缺失的多肽或(b)包含相對於多肽SEQ ID NO:1_30的缺失的GH61變體。蛋白序列中的胺基酸「取代」是該序列中的單個胺基酸被另一種胺基酸代替。胺基酸取代可以是「保守的」取代，在這種情況中取代胺基酸與其代替的胺基酸共有一種或多種化學特性。共有的特性包括以下:鹼性胺基酸:精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H);酸性胺基酸:穀氨酸(E)和天冬氨酸(D);不帶電荷的極性胺基酸:穀氨醯胺(Q)和天冬醯胺(N);疏水胺基酸:亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V);芳族胺基酸:苯丙氨酸
(F)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y);含硫胺基酸:半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M);小胺基酸:甘氨酸
(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、脯氨酸(P)、半胱氨酸(C)和甲硫氨酸(M)。術語「前蛋白」具有其在本領域中的標準含義，是指包括附加的氨基末端信號肽(或前導序列)區域的多肽。隨著蛋白的分泌，信號肽酶將信號肽從前蛋白上切割。蛋白的分泌部分可稱為「成熟的」或「分泌的」蛋白。因此，前蛋白的胺基酸序列，該序列包括信號肽部分和分泌的(成熟)部分。 如本文所用，術語「信號肽」具有其在本領域中的通常含義，是指與多肽的氨基末端連接的胺基酸序列，指導編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。「糖化」是指酶催化的反應，導致複雜碳水化合物水解為可發酵糖類(例如，單糖類諸如葡萄糖或木糖)。該酶可以是纖維素酶，諸如內切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶、I型和/或2型纖維二糖水解酶、和這些纖維素酶的組合。該纖維素酶可來自產生纖維素酶的野生型或纖維素酶-工程化的生物體(例如，真菌諸如嗜熱毀絲黴或酵母)的培養物肉湯。當相鄰單糖的至少一些之間的糖苷鍵被水解，從而將此前鍵合的單體對彼此分開時，「水解」纖維素或另一種多糖(例如，澱粉)發生。當在反應期間存在的特定組分(諸如GH61蛋白)導致與在相同條件下以相同的基質和其他代用品、但不存在目標組分時進行的反應相比產生更多產物時，出現「增加」反應產物(諸如可發酵糖類)的產量。術語「改進的」或「改進的特性」在描述GH61變體的特性的語境中使用時，是指與野生型GH61(例如，SEQ ID NO:2)或指定參考多肽相比表現出一種或多種特性的改進的GH61變體多肽。改進的特性可包括但不限於，增加的蛋白表達、增加的熱活性、增加的熱穩定性、增加的PH活性、增加的穩定性(例如，增加的pH穩定性)、增加的產物特異性、增加的比活性、增加的底物特異性、增加的對底物或終產物抑制的抗性、增加的化學穩定性、減少的被葡萄糖抑制、增加的對抑制劑(例如，乙酸、凝集素、鞣酸和苯酚化合物)的抗性、和改變的PH/溫度曲線。術語「纖維素酶(cellulase) 」(或「纖維素酶(cellulose enzyme)，，)寬泛地是指催化纖維素β_1，4-糖苷鍵水解為更短的纖維素鏈、寡糖、纖維二糖和/或葡萄糖的酶，例如，內切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶和纖維二糖水解酶。
如本文所用，術語「多核苷酸」是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物、及其互補物。如本文所用，「基因」是編碼蛋白的核酸序列。該核酸可具有或不具有任何內含子，可以是或不是重組的，並可還包括或不包括影響轉錄或翻譯的元件。為了本說明書的目的，編碼蛋白的cDNA序列有時可稱為「基因」。術語「重組核酸」具有其常規含義。重組核酸或等義地「多核苷酸」，是被插入到異源位置，以使其不與自然界發現的正常情況下在該核酸兩側的核苷酸序列締合的核酸(例如，被插入到載體中或異源生物體的基因組中的核酸)。同樣，不在自然界出現的核酸序列例如天然存在的基因的變體是重組的。包含重組核酸或從重組核酸體外或體內表達的蛋白的細胞也是「重組的」。重組核酸的實例包括(i)可操作地連接於異源啟動子和/或(ii)編碼帶有蛋白序列和異源信號肽序列的融合多肽的編碼蛋白的DNA序列:。當核酸締合，通常在溶液中締合時，它們「雜交」。核酸雜交是由於各種被很好表徵的物理-化學力，諸如氫鍵鍵合、溶劑排斥(solvent exclusion)、鹼基堆積等。如本文所用，在核酸雜交實驗諸如Southern雜交或Northern雜交的背景下術語「嚴格的雜交洗滌條件」是序列依賴性的，並且在不同環境參數下是不同的。有關核酸雜交的深入指導見於 Ti jssen, 1993, 「Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes,，，Part I, Chapter2(Elsevier, NewYork)，其通過引用併入本文。對於至少100個核苷酸長度的多核苷酸而言，對低嚴格條件到極高嚴格條件限定如下:在標準的DNA印跡程序後，在42°C在5XSSPE，0.3% SDS,200 μ g/ml剪切和變性的鮭魚精DNA，以及對於低嚴格性的25%甲醯胺，對於中等和中-高嚴格性的35%甲醯胺，或對於高嚴格性和極高嚴格性的50%甲醯胺中預雜交和雜交。對於至少100個核苷酸長度的多核苷酸，使用2XSSC，0.2% SDS在50°C (低嚴格性)、在550C (中等嚴格性)、在60°C (中-高嚴格性)、在65°C (高嚴格性)或在70°C (極高嚴格性)將載體材料(carrier material)最終洗漆三次,每次15分鐘。術語「表達載體」是指包括編碼本發明的多肽的區段，並且所述區段可操作地連接於提供其轉錄的另外區段(例如，啟`動子、轉錄終止序列、增強子)和任選地選擇性標記的線性或環狀的DNA分子。為了本公開的目的，如果啟動子在自然界不與基因序列締合時，該啟動子對該基因是「異源的」。當信號肽序列在自然界不與蛋白序列締合時，該信號肽對該蛋白是「異源的」。關於調節序列(例如，啟動子)，術語「可操作地連接」是指如下配置:在該配置中調節序列被安放在相對於多肽編碼序列的位置以使得該調節序列影響多肽的表達。關於信號序列，術語「可操作地連接」是指如下配置:在該配置中信號序列編碼與多肽融合的氨基末端信號肽，以使該基因的表達產生前蛋白。 如本文所用，術語「肽」、「多肽」和「蛋白」在本文可互換地使用，是指胺基酸殘基的聚合物。如本文所用，術語「胺基酸」是指天然存在的和合成的胺基酸、以及胺基酸類似物。術語「生物質」、「生物質基質」、「纖維素生物質」、「纖維素原料」、「木質纖維素原料」和「纖維素基質」都是指包含纖維素的材料。為了簡化，本文使用的術語「纖維素基質」是指通常在預處理後，能夠被纖維素酶(任選地存在GH61蛋白)作用來產生可發酵糖類的包含纖維素的材料。纖維素基質的實例包括但不限於，生物質諸如木頭、木紙漿、紙漿、玉米纖維、玉米粒、玉米芯、穀物殘渣諸如玉米皮、玉米秸杆、草、小麥、麥杆、大麥、大麥杆、乾草、稻草、柳枝稷、廢紙、紙和紙漿加工廢料、木質或草本植物、果漿或蔬菜漿、酒糟、稻殼、棉、大麻、亞麻、劍麻、甘鹿S、高粱、大豆、碾磨穀物、樹、樹枝、根、葉、木片、鋸末、灌木叢、蔬菜、果實、和花獲得的組分、及其混合物。在一些實施方案中，使用本領域已知的方法「預處理」或處理纖維素材料，諸如化學預處理(例如，氨預處理、稀酸預處理、稀鹼預處理、或溶劑暴露)、物理預處理(例如，蒸汽爆破或輻照)、機械預處理(例如，研磨或碾磨)和生物預處理(例如，施加增溶木質素的微生物)和其組合，以增加纖維素對水解的敏感性。纖維素基質及其加工在以下更詳細地描述。纖維素基質通過包括以下的方法「獲取自」特定來源(諸如玉米或小麥):獲得該來源或該來源的實體部分(諸如玉米芯或麥杆)，然後任選地預處理該來源或部分。纖維素酶蛋白序列(即，纖維素變體)當通過使用體外誘變或分子進化方法向野生型序列引入變異來產生時，「衍生自」野生型纖維素酶序列。通常蛋白序列將與野生型序列至少 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91 %、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%相同。纖維素基質已經通過一些物理和/或化學手段加工來幫助糖化時，被稱為是「預處理的」。「可發酵糖類」意為簡單糖類(simple sugars)(單糖、二糖和短寡糖)，諸如但不限於葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和蔗糖。可發酵糖類是微生物能夠利用或發酵的任何糖。術語「轉化(transform) 」或「轉化(transformation) 」在提到細胞使用時，表示細胞具有整合入其基因組或作為經過多代被維持的附加體(例如，質粒)的非天然核酸序列。

術語「引入」在將核酸序列插入細胞的語境中使用時表示被接合、轉染、轉導或轉化(統稱為「轉化」)或以其他方式併入到細胞的基因組中或作為附加體被保持在細胞內。「纖維素酶工程化的」細胞是包含編碼纖維素酶或纖維素酶變體的至少一種、至少兩種、至少三種、或至少四種重組序列且其中纖維素酶或纖維素酶變體的表達相對於野生型形式已被修飾的細胞。當非天然存在的纖維素酶變體被表達或當天然存在的纖維素酶被過表達時，纖維素酶的表達是「被修飾的」。過表達纖維素酶的一種方式是可操作地連接強(任選地組成型)啟動子於纖維素酶編碼序列。過表達纖維素酶的另一種方式是增加異源的、變異的、或內源的纖維素酶基因的拷貝數。纖維素酶工程化的細胞可以是真菌細胞，諸如酵母細胞或絲狀真菌細胞(例如，解纖維素熱酸菌(Acidothermus cellulolyticus)、Thermobifida fusca、灰腐質黴(Humicolagrisea)、嗜熱毀絲黴、嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)、枝頂孢屬、梭孢殼屬、裡氏木黴(Trichoderma reesei)、麴黴屬)。在一些實施方案中，纖維素酶工程化的細胞是嗜熱毀絲黴細胞。術語「培養」是指在液體或固體培養基中使微生物(例如真菌)細胞的群體生長。一些培養的細胞表達和分泌蛋白，諸如例如，GH61蛋白或纖維素酶蛋白。當細胞在液體培養基中生長時，蛋白可能被分泌到培養基中，該培養基被稱為多種術語，包括細胞培養培養基、細胞培養上清液和細胞肉湯。如本文所用，術語「回收」是指從細胞肉湯或可選地從固體培養基收穫、分離、收集或離析蛋白、糖、細胞或終產物(例如，醇)。如本文所用，術語「分離的」是指從與之在自然界中通常締合的組分(諸如其他蛋白、核酸或細胞)中部分地或完全地分開的核酸、多肽、或其他組分。已經被「純化」的產物是已經從獲得其的來源富集至少10倍、任選地至少100倍、或至少1000倍的產物。例如，從其佔總蛋白0.1%的培養物肉湯獲得的蛋白可被純化，使得其為製品中蛋白的 1%、2.5%、10%、25%、50%、80%、95%或 100% (wt/wt)。「部分純化的」產物已經從產生其的來源富集至少2倍、或至少5倍，但仍包含至少50%、有時至少90% (wt/wt)的溶劑以外的不相關組分。「分級(fractionating) 」液體產物諸如培養物肉湯表示施加分離工藝(諸如鹽沉澱、柱色譜、尺寸排阻、和過濾)或所述工藝的組合，從而獲得一種溶液，其中期望蛋白(諸如GH61蛋白、纖維素酶、或其組合)在該溶液中為比在最初液體產物中佔總蛋白的百分比更大的百分比。「漿料」是其中分散一種或多種固體組分諸如纖維素基質的水溶液。如本文所用，包含一種或多種蛋白的「組合物」可以是，例如，包含蛋白的無細胞組合物、細胞溶解產物、包含例如以分泌形式的蛋白的細胞肉湯；包含蛋白的細胞，諸如表達蛋白的重組細胞；表達不同蛋白的兩種或多種細胞群體的混合物(例如，表達重組GH61蛋白的一種細胞和表達纖維素酶蛋白的第二細胞)。術語「無細胞組合物」是指其中已經去除了細胞和細胞碎片的包含蛋白的組合物，諸如純化的纖維素酶混合物或包含分泌的蛋白的、已經從其去除了細胞和不溶性物質的細胞培養物肉湯。術語「同一性百分比」、同一性」、「百分比相同」和相同」在本文可互換地使用，是指兩條最佳地對齊的序列跨比較窗的比較。為了優化比較，比較窗可在任一條序列中包括添加或缺失。同一性百分比是序列之間相同的位置數目除以比較窗中位置的總數(包括其中一條序列具有缺口的位置)。例如，具有在310個位置與序列GH61a(其分泌形式具有323個胺基酸)匹配的胺基酸序列的蛋白，將與該參考序列具有310/323 = 95.9%同一性。類似地，具有300個殘基(S卩，小於全長)並在280個位置與參考序列匹配的蛋白變體將具有280/300 = 93.3%同一性。儘管最佳比對和評分可手動完成，但通過使用計算機執行的比對算法可促進該過程。實例是BLAST和BLAST2.0算法，描述在Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215:403-410 和 Altschul 等，1977，NucleicAcids Res.3389-3402 中。可選地，兩條胺基酸序列之間的同一性程度可使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.48:443-53)確定，該算法已經在EMBOSS軟體包的Needle程序中實現(EMBOS S:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice等，2000,Trendsin Geneticsl6:276-77)，優選地以3.0.0或後來的版本。使用的任選參數是:缺口開放罰分10、缺口延伸罰分0.5、和EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。Needle的標為「最長同一性」的輸出值(使用nobrief選項獲得的)用作同一性百分比，並如下計算:(相同殘基X 100) + (比對的 長度-比對中的缺口總數)。HI:GH61某閔的鑑定
如實施例1所述，鑑定了對嗜熱毀絲黴內源的二十四種GH61蛋白。參見下表I和表2。如實施例2和3所示，名稱為GH61a的特定嗜熱毀絲黴GH61蛋白(SEQ ID NO:2)顯示為在纖維素酶存在時增強糖化反應。類似地，本發明的其他GH61蛋白(SEQ ID NO:3至
30)可用於增強纖維素酶活性。表I提供GH61前蛋白的序列(SEQ ID NO:1),以加下劃線顯示預測的天然信號肽，和預測的分泌的(成熟)形式(SEQ ID NO:2)。序列ID NO: 2的長度是323個胺基酸。預期本發明的某些GH61a蛋白變體包括SEQ IDNO:2的殘基11-323 (包括但不限於，氨基末端截短的片段)，或與SEQ IDNO:2的殘基11-323具有至少:約70%、約75%、約80%、約85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%、或約99%的序列同一性。在一些實施方案中，GH61s蛋白變體與SEQ IDNO:2的殘基11-323具有至少90%的同一性並長至少315個殘基。表2提供28種GH61前蛋白序列，預測的天然信號肽加下劃線。預測GH61t和GH61n不具有信號肽。除了另外指明或從上下文清楚的情況以外，提及表2中所列的一種或多種序列意為涵蓋前蛋白形式和分泌形式(即，包含完整序列的蛋白、和不包括加下劃線的序列的蛋白)的一種或兩種。還預期本發明的某些GH61蛋白包括表2所示的序列的殘基11至C末端(包括但不限於，氨基末端截短的片段)，或與這些序列的殘基11至C末端具有至少:約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91 %、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約96%、約97%、約98%、或約99%的序列同一性。在表2中可使用以下名稱:B =全長蛋白(包括信號肽)的SEQ ID N0.;C=信號肽(加下劃線的)；D=成熟蛋白(不加下劃線的)；E = D的開始於分泌部分的殘基11的部分(即，在最後一個缺口與C末端之間，亦即氨基末端截短部分)。表I和表2中的信號肽邊界是基於對基本序列的分析來預測的。實際的裂解位點與預測的位點差達數個殘基(例如，1-10個，例如，達1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)是有可能的。異源信號肽的存在也可以影響裂解位點。信號肽裂解位點可通過表達全長序列，並鑑定分泌的GH61蛋白的氨基末端殘基來確定。預計在成熟蛋白氨基末端添加或缺失數個殘基可以對分泌的蛋白的活性影響很小或無影響。M I
糖苷水解酶61蛋白GH61a
權利要求
1.一種製造組合物的方法，包括組合以下: a)來自嗜熱毀絲黴(Myceliophthorathermophila)的分離或重組的GH61蛋白；和 b)選自內切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的一種或多種纖維素酶。
2.一種製造組合物的方法，包括組合以下: a)來自嗜熱毀絲黴的分離或重組的GH61蛋白；和 b)選自內切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的一種或多種纖維素酶； 其中在纖維素經歷被包含EG、BGL、CBHl和CBH2的酶組合糖化的反應中，與所述GH61蛋白不存在時的相同糖化反應相比，所述GH61蛋白增加葡萄糖的產量至少20%。
3.如權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述GH61蛋白是重組的。
4.如權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述GH61蛋白通過從嗜熱毀絲黴培養物分離GH61蛋白活性而獲得。
5.如權利要求1-4任一項所述的方法，其中所述GH61蛋白增加所述反應中的葡萄糖的產量至少約50%。
6.如權利要求5任一項所述的方法，其中所述GH61蛋白增加葡萄糖的產量至少約2 倍。
7.一種製造組合物的方法，包括組合以下: a)包含與SEQID NO:1至30的任一種至少約80%、約85%、約90%、約95%、約97%或約99%相同的胺基酸序列的重組產生的GH61蛋白；和 b)選自內切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的一種或多種纖維素酶。
8.一種組合物，包含: a)包含與選自由SEQID NO:1至30和SEQ ID NO:1至30的任一種的具有GH61活性的片段組成的組的序列至少約70 %、約75 %、約80 %、約85 %、約90 %、約95 %、約97 %或約99%相同的胺基酸序列的重組產生的GH61蛋白；和 b)選自內切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的一種或多種纖維素酶， 其中在纖維素經歷被包含EG、BGL、CBHl和CBH2的酶組合糖化的反應中，與所述GH61蛋白不存在時的相同反應相比，所述GH61蛋白增加葡萄糖的產量至少20%。
9.如權利要求8所述的組合物，其中所述GH61蛋白包含與SEQID NO:2、或其具有GH61活性的片段至少95%相同的胺基酸序列。
10.如權利要求8所述的組合物，其中所述GH61蛋白包括與GH61o、GH61v、GH61x、GH61b和GH61e(SEQ ID NO:6、13、15、16、19、30)的任一種；或其具有GH61活性的片段至少95%相同的胺基酸序列。
11.如權利要求8所述的組合物，其中所述GH61蛋白包括與GH61f、GH61v、GH61p、GH61g和GH61i(SEQ ID NO:7、13、20、21、23、26)的任一種；或其具有GH61活性的片段至少95%相同的胺基酸序列。
12.如權利要求8所述的組合物，其中所述GH61蛋白包括SEQID NO:1至30的任一種；或其具有GH61活性的片段。
13.如權利要求8至12任一項所述的組合物，包含兩種、三種、或多於三種纖維素酶。
14.如權利要求8至13任一項所述的組合物，其中所述纖維素酶是重組的。
15.如權利要求8至14任一項所述的組合物，其中所述纖維素酶是真菌酶類。
16.如權利要求8至15任一項所述的組合物，其中所述纖維素酶來自嗜熱毀絲黴。
17.如權利要求8至16任一項所述的組合物，包括在一種宿主細胞群體中表達編碼所述GH61蛋白的基因，和在另一種宿主細胞群體中表達編碼纖維素酶的至少一種基因。
18.如權利要求8至16任一項所述的組合物，包括在相同宿主細胞類型中表達編碼所述GH61蛋白的基因和編碼纖維素酶的至少一種基因。
19.如權利要求17或18所述的組合物，其中所述基因編碼包含異源信號肽的GH61蛋白。
20.一種從纖維素基質產生可發酵糖類的方法，包括將包含所述基質的漿料與包含GH61蛋白的組合物接觸，從而從所述基質產生可發酵糖類， 其中所述GH61蛋白包括與SEQ ID NO:1至30的任一種至少約80%、約85%、約90%、約93 %、約95 %、約97 %或約99 %相同的胺基酸序列。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述GH61蛋白包括與SEQID NO:1至30的任一種的分泌部分100%相同的胺基酸序列。
22.如權利要求20或21所述的方法，其中在所述接觸之前，將所述基質預處理。
23.如權利要求20至22任一項所述的方法，其中所述GH61蛋白與SEQID NO:2至少95%相同。
24.如權利要求20至23任一項所述的方法，其中所述組合物包含選自酯酶、木聚糖酶、半纖維素酶、脂酶、蛋白酶、澱粉酶、葡糖澱粉酶和其組合的一種或多種酶。
25.如權利要求20至24任一項所述的方法，其中所述組合物包含選自EG、BGL、CBHl和CBH2的一種或多種纖維素酶。
26.如權利要求20至25任一項所述的方法，其中所述基質獲取自小麥、麥杆、高粱、玉米、大米、大麥、甘蔗渣、草、柳枝稷、玉米粒、玉米芯、玉米纖維、或其組合。
27.如權利要求20至26任一項所述的方法，其中所述基質獲取自麥杆。
28.如權利要求20至27任一項所述的方法，其中所述可發酵糖類包括葡萄糖。
29.如權利要求20至28任一項所述的方法，還包括回收所述可發酵糖類。
30.如權利要求20至29任一項所述的方法，還包括從所述可發酵糖類產生終產物， 其中所述終產物包括醇(諸如乙醇或丁醇)、糖醇(諸如山梨醇)、有機酸(諸如乳酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、穀氨酸、檸檬酸或丙酸)、胺基酸(諸如甘氨酸、賴氨酸或天冬氨酸)、有機酸、烷、烯、二醇或甘油。
31.如權利要求30所述的方法，其中所述醇是乙醇。
32.—種用於在含纖維素的基質經歷被一種或多種纖維素酶糖化的反應中增加可發酵糖類的產量的方法，包括在包括與SEQ ID NO:1至30的任一種；或SEQ ID NO:1至30的任一種的具有GH61活性的片段至少80%相同的胺基酸序列的GH61蛋白存在下進行所述反應。
33.如權利要求32所述的方法，其中所述GH61蛋白包括與SEQID NO:2、或其片段至少95%相同的胺基酸序列。
34.如權利要求32所述的方法，其中所述GH61蛋白包括與GH61o、GH61v、GH61x、GH61b和GH61e(SEQ ID NO:6、13、15、16、19、30)的任一種;或所述序列的任一種的片段至少95%相同的胺基酸序列。
35.如權利要求32所述的方法，其中所述GH61蛋白包括與GH61f、GH61v、GH61p、GH61g和GH61i(SEQ ID NO:7、13、20、21、23、26)的任一種;或所述序列的任一種的片段至少95%相同的胺基酸序列。
36.如權利要求32所述的方法，其中所述GH61蛋白包括SEQID N0:1至30的任一種；或其片段。
37.如權利要求32至36任一項所述的方法，其中所述纖維素酶包括內切葡聚糖酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的組合。
38.一種水解纖維素基質的方法，包括將所述基質與包含一種或多種重組GH61蛋白、一種或多種葡糖苷酶(BGL)、和一種或多種纖維二糖水解酶(CBH)的組合物接觸，其中所述酶組合物基本上無內切葡聚糖酶(EG)。
39.如權利要求38所述的方法，其中所述組合物包含I型纖維二糖水解酶和2型纖維二糖水解酶二者。
40.如權利要求38或39任一項所述的方法，其中所述GH61蛋白是來自嗜熱毀絲黴的分離或重組的GH61蛋白。
41.如權利要求38至40任一項所述的方法，其中所述GH61蛋白與SEQID NO:2或其具有GH61活性的片段至少80%相同。
42.如權利要求38至41任一項所述的方法，其中所述水解導致葡萄糖產量是在所述GH61蛋白不存在時以BGL酶和CBH酶水解所述纖維素基質獲得的葡萄糖產量的約1.5倍聞。
43.一種從纖維素基質產生終產物的方法，包括: a)將所述纖維素基質與根據權利要求8至16任一項的組合物或根據權利要求1-7任一項的方法獲得的組合物接觸，藉以從所述基質產生可發酵糖類；和 b)在發酵中將所述可發酵糖類 與微生物接觸以產生終產物。
44.如權利要求43所述的方法，所述方法是同時糖化和發酵的工藝。
45.如權利要求43所述的方法，其中所述纖維素基質的糖化與所述發酵連續地發生。
46.一種從纖維素基質產生終產物的方法，包括: a)獲得根據權利要求20至42任一項的方法產生的可發酵糖類；和 b)在發酵中將所述可發酵糖類與微生物接觸以產生終產物。
47.如權利要求43至46任一項所述的方法，其中所述終產物是醇。
48.如權利要求47所述的方法，其中所述醇是乙醇。
49.如權利要求43至48任一項所述的方法，其中所述微生物是酵母。
50.一種重組GH61蛋白，包括與SEQ ID NO:1至30的任一種、或其具有GH61活性的片段至少約80%相同的胺基酸序列。
51.如權利要求50所述的重組GH61蛋白，其中在纖維素經歷被來自絲狀真菌的培養物肉湯中包含的纖維素酶糖化的反應中，所述GH61蛋白增加葡萄糖的產量。
52.如權利要求51所述的重組GH61蛋白，其中所述細胞是嗜熱毀絲黴細胞。
53.如權利要求51或52所述的GH61蛋白，其中所述GH61蛋白包括與SEQID NO:6、16、19和23的任一種；或其具有GH61活性的片段至少95%相同的胺基酸序列。
54.如權利要求51或52所述的GH61蛋白，包括與GH61f、GH61v、GH61p、GH61g和GH61i(SEQ ID NO:7、13、20、21、23、26)的任一種；或其具有GH61活性的片段至少約95%相同的胺基酸序列。
55.如權利要求51至54任一項所述的GH61蛋白，包括SEQID NO:1至30的任一種；或其具有GH61活性的片段。
56.—種重組多核苷酸,包括編碼權利要求51至55任一項的GH61蛋白的核酸序列。
57.如權利要求56所述的重組多核苷酸，包括SEQID NO:31、或其編碼具有GH61活性的多肽的片段。
58.如權利要求56所述的重組多核苷酸，包括SEQID NO:32至59的任一種、或其編碼具有GH61活性的多肽的片段。
59.如權利要求56至58任一項所述的重組多核苷酸，其中所述GH61蛋白具有異源信號肽。
60.如權利要求56至59 任一項所述的重組多核苷酸,其是表達載體。
61.如權利要求60所述的表達載體，其中編碼所述GH61蛋白的所述核酸序列可操作地連接於異源啟動子。
62.—種宿主細胞,包含權利要求56至61任一項的重組多核苷酸。
63.如權利要求62所述的宿主細胞，還包含各編碼一種纖維素酶的一種或多種基因。
64.如權利要求63所述的宿主細胞，其中所述纖維素酶選自內切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)。
65.如權利要求63或64所述的宿主細胞，其中所述纖維素酶編碼基因的至少一種是重組多核苷酸。
66.如權利要求62至65任一項所述的宿主細胞，其中編碼所述GH61蛋白的所述核酸序列可操作地連接於異源啟動子。
67.如權利要求62至66任一項所述的宿主細胞，其是絲狀真菌細胞。
68.如權利要求62至66任一項所述的宿主細胞，其是毛殼屬(Chaetomium)、梭抱殼屬(Thielavia)、支頂抱屬(Acremonium)、毀絲黴屬(Myceliophthora)、麴黴屬(Aspergillus)或木黴屬(Trichoderma)宿主細胞。
69.如權利要求68所述的宿主細胞，其是嗜熱毀絲黴細胞。
70.如權利要求62至66任一項所述的宿主細胞，其是酵母細胞。
71.—種組合物，所述組合物由包括以下的方法製備:培養根據權利要求62至70任一項的宿主細胞，從所述培養獲得肉湯，和任選地分級所述肉湯。
72.重組產生的GH61蛋白在產生乙醇中的用途， 其中所述GH61蛋白包括與選自SEQ ID NO:1至30的序列；或所述選擇的序列的具有GH61活性的片段至少約80 %、約85 %、約90 %、約95 %、約97 %或約99 %相同的胺基酸序列；其中在纖維素經歷被來自嗜熱毀絲黴細胞的培養物肉湯中包含的纖維素酶糖化的反應中，所述GH61蛋白增加葡萄糖的產量。
73.如權利要求72所述的用途，其中所述GH61蛋白包括與SEQID NO:2 ;或其片段至少約95 %相同的胺基酸序列。
74.如權利要求72所述的用途，其中所述GH61蛋白包括與GH61o、GH61v、GH61x、GH61b和GH61e(SEQ ID NO:6、13、15、16、19、30)的任一種；或其片段至少95%相同的胺基酸序列。
75.如權利要求72所述的用途，其中所述GH61蛋白包括與GH61f、GH61v、GH61p、GH61g和GH61i(SEQ ID NO:7、13、20、21、23、26)的任一種；或其片段至少95%相同的胺基酸序列。
76.如權利要 求72至75任一項所述的用途，其中所述GH61蛋白包括SEQID NO:1至30的任一種；或其片段。
77.一種重組核酸，編碼如以上描述的GH61蛋白。
78.—種分離的或重組產生的如以上描述的GH61蛋白。
79.—種組合物，包含如以上描述的GH61蛋白和纖維素酶。
80.GH61蛋白在如 以上描述的水解纖維素基質或產生乙醇中的用途。
全文摘要
本發明提供從嗜熱毀絲黴(Myceliophthora thermophila)獲得的重組GH61蛋白、和編碼所述蛋白的核酸。本發明還提供從嗜熱毀絲黴上清液分離的、具有GH61蛋白活性的蛋白級分。這些製品可用於增加含纖維素的基質經歷被一種或多種纖維素酶諸如內切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶或纖維二糖水解酶糖化的反應中產物的產量。在乙醇生產中GH61蛋白與纖維素酶的組合可用於分解纖維素生物質為可發酵糖類。
文檔編號C12N9/24GK103080306SQ201180040308
公開日2013年5月1日 申請日期2011年8月22日 優先權日2010年8月20日
發明者蒂普納斯·貝德亞洛伊, 路易斯·克拉克, 奧諾拉託·坎波皮亞諾, 克麗帕·拉奧, 洛蘭·紹博, 亞諾什·託羅克, 楊劼 申請人:科德克希思公司