一種羧基端蛋白水解酶及其基因的製作方法

2023-11-01 03:57:22

專利名稱：一種羧基端蛋白水解酶及其基因的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，涉及一種羧基端蛋白水解酶及其基因序列。
背景技術：
羧基端蛋白水解酶(carboxyl-terminal proteases, Ctps)是一類新型的絲氨酸蛋白水解酶，在構成蛋白質的多肽鏈的羧基端Ala-Ala、Ala_Leu、Ala_Lys、Ala-Ser>Ala-Val, Ala_Cys、Ala-Phe或Val-Ser等處水解胺基酸殘基之間的肽鍵，對常規的蛋白酶抑制劑具有抗性。迄今為止,對光合細菌藍藻(Synechocystis sp. 6803)中的羧基端蛋白水解酶(CtpA)的研究較為詳細。蛋白質分子量為34kDa的CtpA存在於藍藻類囊體中，催化光合系統II中重要蛋白Dl前體的水解，從其羧基端切除16個胺基酸殘基而形成活性的Dl蛋白，以維持光合系統II反應中心構象的穩定，以及最初的光能吸收、傳遞和光化學反應。對鼻疽假單胞菌(Burkholderiamallei)中ctpA基因的缺失突變體的研究發現,該酶與細胞被膜完整性的維持相關。大腸桿菌(E. coli)中最初鑑定為末端特異性蛋白水解酶Tsp(tail-specific protease)具有與Ctps相似的保守核心序列。研究發現76kDa的Tsp是細胞內因環境應激(environmental stress)而產生的帶有羧基端水解標籤的異常蛋白的通用降解酶。此外，至今已從布魯氏桿菌(Brucella melitensis)、伯氏疏螺旋體菌(Borreliaburgdorferi)> 綠藻(green alga)、集胞藻(Synechocystis sp. PCC6803)、高等植物，以及動物胰臟中克隆到ctps基因。Ctps含有由80-100個胺基酸殘基組成的稱為roz(Post-synaptic density protein-95>Discs large、Zonula occludens I)的保守結構域，在蛋白定位、信號轉導和蛋白質複合體的組裝等方面發揮著重要作用。Ctps可應用於傳統的蛋白質多肽鏈的水解、蛋白質或多肽的修飾，以及疾病的診斷和治療。目前越來越多的應用於基因工程領域，例如，重組人胰島素的生產、腫瘤抗體導向酶-前體藥物治療(antibody-directed enzyme prodrugtherapy, ADEPT),以及急性膜腺炎診斷的血清標記等。蛋白水解酶佔據全球酶製劑市場的60%，其中微生物是商品化蛋白水解酶的主要來源。然而，至今從微生物中克隆獲得的Ctps仍然較少，難以滿足化工、以及醫藥和基因工程等領域快速發展的需求；此外，國外對微生物中新型Ctps的研究有23篇研究論文報導(NCBI PUBMID資料庫檢索)，國內至今未見研究報導(中國知網資料庫檢索)。本發明運用基因克隆技術，成功克隆到一種羧基端蛋白水解酶基因，命名為ctpP，並獲得了其全長基因序列。

發明內容
本發明旨在提供一種羧基端蛋白水解酶及編碼該羧基端蛋白水解酶的基因。一種羧基端蛋白水解酶，其胺基酸序列包括SEQ ID No. I所示的序列，更優選的，其胺基酸序列如SEQ ID No. I所示，含447個胺基酸。一種羧基端蛋白水解酶基因，是編碼SEQ ID No. I所示羧基端蛋白水解酶蛋白的核苷酸序列，優選的，其核苷酸序列包括SEQ ID No. 2所示的序列，更優選的，其核苷酸序列是SEQ ID No. 2所示的序列，長度為1344bp，編碼SEQID No. I所示羧基端蛋白水解酶蛋白的447個胺基酸(不包括I個終止密碼子)。本發明還提供了含有上述羧基端蛋白水解酶基因的重組載體及宿主細胞。本發明提取類芽孢桿菌Paenibacillus sp.基因組DNA，利用基因克隆技術，從中成功克隆到具有酪蛋白水解活性和羧基端蛋白水解酶活性的ctp基因，命名為ctpP，並獲得了其全長基因序列。該基因編碼的蛋白是一種羧基端蛋白酶(命名為ctpP)，由447個胺基酸構成，具有酪蛋白水解酶活性和羧基端蛋白水解酶活性。與NCBI GenBank資料庫中已知功能的微生物Ctps胺基酸序列的相似性為34-80%，該酶含有PDZ保守結構域，屬於新型羧基端蛋白 水解酶。本發明填補了我國在該領域研究的空白，為我國酶製劑的發展及其在化工工業、以及醫藥和基因工程領域的應用提供了新基因資源。


圖I 為實施例中 E. coli BL21 (pET_28a_ctpP)在選擇性 Skim Milk Agar(SMA) -Kanamycin (Kan) (30 μ g/ml)瓊脂平板上的表型。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步詳細、完整地說明。本發明所用主要試劑Trypton、YeastExtract、NaCl> Skim Milk、瓊脂糖(Agrose)、50XTris-acetate-EDTA(TAE)buffer、BicinChoninic Acid(BCA)Protein AssayKit (上海生工生物工程技術服務有限公司)；酪蛋白(Casein)(上海寶曼生物科技有限公司)；ADNA/HindIII DNA marker、X_gal、IPTG(天根生物工程北京有限公司)；限制性內切酶 EcoRI 和 XhoI (Promega,美國)；T4 DNA Ligase、Premix Ex Taq Version 2. 0> TakaraMiniBEST GenomePurification Kit Ver. 2· O (TaKaRa大連寶生物工程有限公司)；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒[愛思進生物技術(杭州)有限公司]。寡核苷酸引物、寡肽合成(上海生工生物工程技術服務有限公司)。本發明所用菌株、載體和培養基E. coli BL21(天根生物工程北京有限公司)；pET-28a(Novagen,美國)；LB 培養基(含 l%Trypton、0. 5%Yeast Extract,O. 5%NaCl, pH
7.2)，SMA 選擇性培養基(含 2%Skim Milk,3. 5%Trypton、0. 2%Yeast Extract,0. 5%NaCl，pH
7.2)，固體培養基含I. 5%agar。本發明所用主要儀器設備Mili-Q超純水儀(Millipore Billerica,美國)，酶標儀 BioTek Synergy 2 (BioTek Instruments,美國)，超聲波細胞粉碎儀(YJ92-IIN,寧波新芝生物科技股份有限公司)，SMA4000UV-Spectrophotometer (Merinton技術有限公司，北京)，核酸電泳儀(JY-SPBT,北京)、凝膠成像系統(Bio-RAD Molecular Imager GELDoctmXR+) (Bio-RAD,美國)，PCR 儀(Mastercycler, Eppendorf,德國)。離心機(5810R,Eppendorf 德國)。實施例I採用無菌水系列梯度稀釋法，將含有類芽孢桿菌的菌懸液塗布於SM選擇性培養基，塗布100 μ I/瓊脂平板(90_直徑)，塗布後的平板倒置於37°C培養箱24h。挑取SMA選擇性培養基上有較大透明圈的菌落，於SMA選擇性培養基純化兩次後，加入終濃度為20%的甘油後置於_40°C保存。酶活性測定酪蛋白(Casein)轉化為酪氨酸配製lmg/ml酪蛋白水溶液作為底物溶液；配製反應溶液含5ml底物溶液、5mlIOOmM MgCl2,90ml 50mM Tris-HCl (pH9. O)。接種分離菌株於 5mlLB 液體培養基，37 °C，160rpm震蕩培養16_18h，5，OOOg離心lOmin，取上清液50 μ I加入150 μ I上述反應液中，30°C反應條件下用酶標儀測定562nm處吸光值，測定時間為30min，記錄反應前後吸光值變 化；製備酪氨酸標準曲線，將Img羧基端蛋白酶Imin釋放Iyg酪氨酸的量定義為一個酶活單位(Beneova M. , et al. 1996);採用BCA蛋白質定量檢測試劑盒測定培養基上清液的總蛋白含量。實施例2分離菌株16S rRNA基因的PCR擴增、序列測定和分析基因組DNA的提取接種分離實施例I得到的菌株於5ml LB液體培養基，37°C、160rpm震蕩培養16_18h, 12000g離心Imin收集菌體,吸棄上清。採用TaKaRa細菌基因組DNA提取試劑盒，提取基因組DNA，根據試劑盒說明書步驟進行操作。採用O. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA，採用SMA4000UV-Spectrophotometer測定DNA濃度。提取的基因組DNA模板置於_20°C備用。16S rRNA基因的PCR擴增PCR反應體系(20 μ I)無菌水8 μ I ;2 X Premix Ex Taq (Version 2. 0) 10 μ I ；弓丨物 27F (5 μ mol/L，引物序列:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)0· 5 μ I ;引物 1492R(5 μ mol/L,引物序列5，-TACCTTGTTACGACTT-3，)0· 5 μ I ;模板 I μ I。PCR反應循環參數如下95°C預變性5min ；30個循環，每個循環包括94°C，30s，59°C, 30s, 72°C,90s ;最後72°C延伸5min ;4°C保存。採用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。PCR產物DNA序列的測定與分析PCR產物的DNA序列由國家人類基因組南方中心測定。米用 BioEdit (Version 7. 0. 9, http://www. mbio. ncsu. edu/BioEdit)軟體進行DNA原始數據的處理和正反雙向序列的拼接，拼接的Contig序列長為1344bp，序列如SEQID NO. 2 所不。以 Fasta 格式與 GenBank 資料庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)中序列進行BLASTN比對分析，發現與類芽抱桿菌Paenibacillus. Y412MC10 (AccessionNo. CP001793. I) 16S rRNA序列具有99%的核苷酸序列相似性。實施例3竣基端蛋白酶基因的克隆基因組DNA中羧基端蛋白酶基因的擴增基於NCBI蛋白資料庫中Geobacillussp. Y412MC10的羧基端蛋白水解酶基因，設計引物，進行PCR擴增；採用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收DNA，根據試劑盒說明書步驟進行操作。羧基端蛋白水解酶基因與載體的連接採用限制性內切酶EcoRI和XhoI (Promega,美國)對上述回收的DNA和載體pET_28a (Novagen,美國)進行雙酶切,根據試劑盒說明書步驟進行操作。連接反應體系(總體系25 μ I):無菌水 17 μ I ；10XT4DNA Ligase Buffer2. 5 μ I ；DNA 2. 5μ I ;載體 DNA I. 5μ I ；T4DNA Ligase (350U/μ I) I. 5 μ 1，16°C 反應過夜。重組載體的轉化和陽性重組子的篩選DNA連接液3μ 1，加入含有100 μ IE. coliBL21感受態細胞[天根生物工程(北京)有限公司]離心管中，冰浴30min，根據試劑盒說明書步驟進行操作。取100μ I轉化細胞培養液塗布於含有脫脂牛奶(Skim Milk)的LB-Kan (30 μ g/ml)瓊脂平板，37°C培養18h，通過菌落PCR篩選陽性克隆子(降解酪蛋白形成的透明圈)，命名為E. coli BL21(pET-28a-ctpP)，如圖I。實施例4陽性重組子DNA克隆片段的序列測定及分析
接種陽性克隆E. coli BL21(pET-28-Ctp)於5ml LB-Kan液體培養基，37°C震蕩培養過夜，於10，OOOg離心IOmin,收集菌體,吸棄上清。採用質粒抽提試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]，抽提重組質粒pET-28-Ctp DNA，根據試劑盒說明書進行操作。採用0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA。採用基因步行法，對重組質粒pET-28-Ctp上外源DNA插入片段的全長DNA序列進行了測定，獲得了插入片段全長DNA序列，即SEQ ID No.2所示核苷酸序列。採用BLASTX軟體與GenBank資料庫中的序列進行了比對分析，發現其中1344bp(即SEQ ID No. 2所示核苷酸序列)與NCBI GenBank資料庫中已知功能的微生物羧基端蛋白水解酶的胺基酸序列的相似性為34-80%，該酶含有PDZ保守結構域，是一種新型的羧基端蛋白酶。實施例5羧基端蛋白水解酶酶活性鑑定採用與實施例3同樣的鑑定方法，陽性重組子E. coli (pET-28-Ctp)在SMA-Kan選擇性瓊脂平板上具有透明水解圈。製備E. coli BL21 (pET-28a_ctpP)過夜培養液，IOOOOg 離心 IOmin 收集菌體，加入5倍菌體溼重的BugBuster Master Mix (pH 8. 0，Novagen, USA),採用超聲法破碎細胞,於4°C、16000g離心20min，棄沉澱，取4ml上清液上樣鎳-樹脂純化柱[Ni-NTAHis Bind resin (Novagen, USA)]，根據試劑盒說明書進行操作，獲得純化的重組蛋白，採用常規的聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定，該重組蛋白的分子量為51. 28KDa。經羧基端蛋白酶酶活性測定，E. coliBL21 (pET-28a-ctpP)羧基端蛋白水解酶酶活為1053. 8U/mg純化蛋白，具有較高的酶活性。羧基端蛋白水解酶活性分析33 μ I酶反應體系含300 μ M合成寡肽(24個胺基酸)；25mM H印es (羥乙基哌嗪乙磺酸)KOH buffer (pH 7.7) ;6 μ I純化的羧基端蛋白水解酶；25°C反應90min，採用HPLC進行反應前後物質檢測，結果表明羧基端合成寡肽被水解為2個短肽。採用與實施例3同樣的方法，在SMA選擇性瓊脂平板上篩選到有透明圈的陽性克隆。取過夜培養液，獲得純化的重組蛋白，經羧基端蛋白酶酶活性測定，所得羧基端蛋白水解酶酶活為980 1050U/mg純化蛋白，具有較高的酶活性；並且羧基端合成寡肽被水解為2個短肽。從實施例5可知，具有SEQ ID No. 2序列的DNA片段，可編碼如SEQ ID No. I所示具有447個胺基酸殘基的羧基端蛋白水解酶，所編碼的蛋白可將酪蛋白水解為酪氨酸，將羧基端合成寡肽(24個胺基酸)再裂解為2個短肽，說明該羧基端蛋白水解酶不僅具有酪蛋白水解酶活性，同時還具有羧基端蛋白水解酶活性。
權利要求
1.一種羧基端蛋白水解酶，其特徵在於，其胺基酸序列包括SEQ ID No. I所示的序列。
2.權利要求I所述羧基端蛋白水解酶，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQIDNo. I所示。
3.一種羧基端蛋白水解酶基因，其特徵在於，是編碼權利要求I或2所述羧基端蛋白水解酶的基因。
4.權利要求3所述羧基端蛋白水解酶基因，其特徵在於，其核苷酸序列包括SEQIDNo. 2所示的序列。
5.權利要求3或4所述一種羧基端蛋白水解酶基因，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQID No. 2 所示。
6.一種重組載體，其特徵在於，含有權利要求3 5任一項所述的羧基端蛋白水解酶基因。
7.一種宿主細胞，其特徵在於，含有權利要求3 5任一項所述的羧基端蛋白水解酶基因。
全文摘要
本發明涉及分子生物學領域，提取類芽孢桿菌基因組DNA，利用基因克隆技術，提供了一種羧基端蛋白水解酶基因，其核苷酸序列包括SEQ ID No.2所示的序列；其編碼的蛋白是一種羧基端蛋白水解酶，具有從羧基端水解多肽鏈的活性，同時具有酪蛋白水解酶的活性，其胺基酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列。本發明填補了我國在該領域研究的空白，為我國酶製劑的發展及其在化工工業、以及醫藥和基因工程領域的應用提供了新基因資源。
文檔編號C12N1/15GK102936589SQ201210516718
公開日2013年2月20日 申請日期2012年12月5日 優先權日2012年12月5日
發明者陳蘭明, 李雲霞, 李柏林, 潘迎捷 申請人:上海海洋大學