一種抗菌毛冬青三萜總皂苷及其應用的製作方法

2023-10-31 21:57:22 2

專利名稱：一種抗菌毛冬青三萜總皂苷及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種毛冬青三萜總皂苷及其應用，具體涉及ー種具有較佳抗菌效果的毛冬青三萜總皂苷。
背景技術：
牙周病和齲病都是以細菌感染為主的多因素影響下的進行性、破壞性疾病。與牙周病和齲病發生發展密切相關的細菌被稱為牙周致病菌和致齲菌。牙菌斑中絕大多數細菌為口腔正常菌叢，僅少數細菌與牙周病的發生、發展密切相關。在各型牙周病的病損區，常可分離出ー種或幾種優勢菌，它們具有顯著的毒力或致病性，能通過多種機制幹擾宿主防禦能力，具有引發牙周破壞的潛能，稱之為牙周致病菌。重要的牙周致病菌包括:伴放線放線桿菌(Aa)、牙齦卟啉單胞菌(Pg)、福賽坦氏菌(Tf)、具核梭桿菌(Fn)、中間普氏菌(Pi)和變黑普氏菌(Pn)、黏放線菌(Av)以及齒垢密螺旋體(Td)。其中具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum ATCC 25175,以下簡稱Fn)，是一種專性厭氧桿菌，常可在眼上、下的菌斑、牙周病灶以及感染根管、尖周病灶中檢測到，近年來對Fn的研究逐漸深入，一些現象也得到了解釋，同時也漸漸顯露出它在尖周病、尤其是牙周病中的重要性。過去一直把該菌視為人體的正常菌群之一，近年來，由於從臨床標本中不斷分離出該菌，引起國內外學者的關注，被視為臨床上不可忽視的細菌。大量研究證實該菌為條件致病菌，且具有較強的致病力，在口腔乃至全身感染性疾病中檢出率極高，廣泛存在於感染的牙髓、牙周和其他炎症性病灶中。作為優勢菌種，與臨床厭氧菌感染的關係十分密切。而齲病是世界衛生組織提出的人類應重點防治的三大非傳染性疾病之一。導致齲病與齲齒的細菌為致齲菌。細菌在齲齒發生和發展過程中起著主導作用。近年來國際上公認的致齲菌種類很多，最主要的 是某些變形鏈球菌和乳酸桿菌。多年的研究已經證實，變形鏈球菌(S.SMZtefl1SATCC 25175,以下簡稱Sm),是人類頻病的始發因素，是目前公認的最重要的致齲菌，其在唾液和菌斑中的水平與齲的發生有高度的正相關關係。變形鏈球菌是牙菌斑早期定植菌，因能快 速發酵大多數碳水化合物，產生以乳酸為主的酸性產物，且可以產生葡萄糖基轉移酶，合成不溶性葡聚糖，與其表面的脂磷壁酸等構成牙菌斑的骨架，有利於其他附著力低的細菌在牙面的定植，在實驗動物變型鏈球菌能誘發齲齒，目前被公認為齲病的主要致病菌。毛冬青為冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬植物i7<9jrHook, et Am.,別名烏尾丁、六月霜、細葉冬青、山冬青、毛披樹、水火藥、火烙木等。生於山野坡地、丘陵等灌木叢中。主產廣東、廣西、福建、江西等地。毛冬青作為中藥使用歷史悠久，曾收載於1977年版《中國藥典》。毛冬青的製劑毛冬青注射劑和毛冬青片劑曾被收載於中藥部頒標準，為心血管疾病用藥，有擴張血管及抗菌消炎作用。用於冠狀動脈硬化性心臟病，血栓閉塞性脈管炎，並用於中心性視網膜炎，小兒肺炎。目前尚未有對其進行口腔抗菌方面的研究
發明內容
本發明的目的是為了尋求抑制口腔細菌的新藥物。為了達到上述目的，本發明提供了一種毛冬青三萜總皂苷，該毛冬青三萜總皂苷由原料毛冬青根莖或葉製備，含有冬青素的重量百分含量為20% 50%。通過以下步驟製備:
(1)提取:取毛冬青根莖或葉，採用50% 70%こ醇提取，過濾，取濾液；
(2)沉澱:取步驟(I)中製得的濾液，回收20% 80%的溶剤，靜置沉澱，過濾，得沉澱A和濾液B備用；
(3)粗製:取步驟(2)中的沉澱A即為所述毛冬青三萜總皂苷；或取步驟(2)中的濾液B採用大孔吸附樹脂洗脫，洗脫劑分別採用20% 30%こ醇溶液、50% 90%こ醇溶液進行梯度洗脫(優選洗脫梯度為30%こ醇和70%こ醇)，收集50% 90%こ醇溶液，濃縮乾燥得粗提物C即為所述毛冬青三萜總皂苷。或將步驟(3)中的沉澱A和粗提物C混合，即得所述毛冬青三萜總皂苷。或將步驟(3)中的沉澱A和粗提物C混合，進行矽膠柱層祈，洗脫劑分別採用體積比為30:1 20:1的氯仿-甲醇混合液、10:1 5:1的氯仿-甲醇混合液進行梯度洗脫(優選洗脫梯度為30:1的氯仿-甲醇混合液和10:1的氯仿-甲醇混合液)，收集體積比為10:1 5:1的氯仿-甲醇混合液，濃縮乾燥即為所述毛冬青三萜總皂苷。其中，步驟(I)中提取時こ醇與毛冬青根莖或葉的體積重量比為I 10L/kg，提取溫度為50 81°C，提取時間為I 5h。本發明還提供了上述毛冬青三萜總皂苷在製備治療口腔疾病藥物方面的應用 本發明相比現有技術具有以下優點:通過對毛冬青三萜總皂苷進行適當純化，能夠有
效提高其對口腔細菌的抑制效果。本`發明通過較少的精製步驟，提高了具有抑菌作用的有效成分的含量，在儘可能節省成本的同時，增強了抑菌效果。本發明毛冬青三萜總皂苷製備過程簡單，製得的產品抑菌效果好，可以作為治療口腔疾病藥物的組要成分進行進一歩研究。


圖1所示為待測活性物質添加和梯度稀釋的流程圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。對比實施例一
取毛冬青根莖1kg，採用50%こ醇I L在50°C下提取lh，過濾；取濾液，濃縮乾燥，得毛冬青總皂苷300g，其中含冬青素重量百分含量為10%。實施例一
(I)提取和沉澱:取毛冬青根莖1kg，採用70%こ醇3 L保持微沸熱回流提取3h，過濾；取濾液，回收80%溶剤，靜置沉澱，過濾，沉澱為粗提物A，濾液B備用；粗提物A的重量為255g，其中含冬青素重量百分含量為20%。(2)大孔樹脂粗製:將步驟(I)中的濾液B採用大孔吸附樹脂洗脫，洗脫劑分別採用30%こ醇溶液、70%こ醇溶液進行梯度洗脫，收集70%こ醇洗脫液，濃縮乾燥得粗提物C ；粗提物C的重量為158g，其中含冬青素重量百分含量為30%。(3)矽膠柱層析精製:將步驟(I)中製備的粗提物A和步驟(2)中製備的粗提物C混合，進行矽膠柱層析，洗脫劑分別採用體積比為30:1的氯仿-甲醇混合液和10:1的氯仿-甲醇混合液進行梯度洗脫，收集體積比為10:1的氯仿-甲醇混合液，濃縮乾燥即得毛冬青三萜總皂苷196.Sg，其中冬青素的含量(w/w)為50%。實施例ニ
(1)提取:取毛冬青根莖1kg，採用60%こ醇IOL在60°C下提取5h，過濾；取濾液，回收20%溶剤，靜置沉澱，過濾，沉澱為粗提物A，濾液B備用；
(2)大孔樹脂粗製:將步驟(I)中的濾液B採用大孔吸附樹脂洗脫，洗脫劑分別採用20%こ醇溶液、50%こ醇溶液進行梯度洗脫，收集50%こ醇洗脫液，濃縮乾燥得粗提物C ；
(3)矽膠柱層析精製:將步驟(I)中製備的粗提物A和步驟(2)中製備的粗提物C混合，進行矽膠柱層析，洗脫劑分別採用體積比為20:1的氯仿-甲醇混合液、5:1的氯仿-甲醇混合液進行梯度洗脫，收集體積比為5:1的氯仿-甲醇混合液，濃縮乾燥即得毛冬青三萜總皂苷211g，其中冬青素的含量(w/w)為41%。對比實施例ニ
取毛冬青葉1kg，採用50%こ醇I L在50°C下提取lh，過濾；取濾液，濃縮乾燥，得毛冬青總阜苷172g,其中含冬青素重量百分含量為5.3%。實施例三
(I)提取和沉澱:取毛冬青葉1kg，採用70%こ醇3 L保持微沸熱回流提取3h，過濾；取濾液，回收80%溶剤，靜置沉澱，過濾，沉澱為粗提物A，濾液B備用。(2)大孔樹脂粗製:將步驟(I)中的濾液B採用大孔吸附樹脂洗脫，洗脫劑分別採用30%こ醇溶液、70%こ醇溶液進行梯度洗脫，收集70%こ醇洗脫液，濃縮乾燥得粗提物C。(3)矽膠柱層析精製:將步驟(I)中製備的粗提物A和步驟(2)中製備的粗提物C混合，進行矽膠柱層析，洗脫劑分別採用體積比為30:1的氯仿-甲醇混合液和10:1的氯仿-甲醇混合液進行梯度洗脫，收集體積比為10:1的氯仿-甲醇混合液，濃縮乾燥即得毛冬青三萜總皂苷193g，其中冬青素的含量(w/w)為37%。實施例四
(1)提取和沉澱:取毛冬青葉1kg，採用60%こ醇IOL在60°C下提取5h，過濾；取濾液，回收50%溶剤，靜置沉澱，過濾，沉澱為粗提物A，濾液B備用；
(2)大孔樹脂粗製:將步驟(I)中的濾液B採用大孔吸附樹脂洗脫，洗脫劑分別採用20%こ醇溶液、50%こ醇溶液進行梯度洗脫，收集50%こ醇洗脫液，濃縮乾燥得粗提物C ；
(3)矽膠柱層析精製:將步驟(I)中製備的粗提物A和步驟(2)中製備的粗提物C混合，進行矽膠柱層析，洗脫劑分別採用體積比為20:1的氯仿-甲醇混合液、5:1的氯仿-甲醇混合液進行梯度洗脫，收集體積比為5:1的氯仿-甲醇混合液，濃縮乾燥即得毛冬青三萜總皂苷148g，其中冬青素的含量(w/w)為32%。應用實施例
分別取實施例一至四、 對比實施例一和ニ中的製備的毛冬青三萜總皂苷和實施例一中的粗提物A、C進行抗菌測試，受試菌採用5: mu tans ATCC 25175 (以下簡稱Sm)和F.nuc leatum ATCC 10953 (以下簡稱Fn)，實驗流程依據《RDP-07-003:活性物質最低抗菌濃度測定操作作業指導書》。1、待測藥物的配製、添加和2倍梯度稀釋
1.1按照圖1中的指示用多通道的移液器將已經滅菌處理的生長培養基添加至已滅菌或消毒的96孔平底板中，每個孔添加100 u L培養基。1.2以DMSO (ニ甲基亞碸)作為溶劑(Solvent)配製1% (w/v)的待測活性物質溶液(Active solution),以1%的玉潔純(Triclosan)的DMSO(ニ甲基亞碸)溶液作為試驗的陽性對照(Positive control)o1.3用已經滅菌處理的相應的生長培養基稀釋每ー個待測的活性物質溶液、陽性對照和用於配製待測活性物質的溶劑(溶劑作為試驗的陰性對照-Negative control)。1.4第I和第8行的第I個(Al & Hl)孔分別添加160 UL經過稀釋的陽性和陰性對照溶液；經過稀釋的活性物質則按照標記好的順序添加40 y L到B1&G1孔中；在第2列到第12列的孔中，每孔添加IOOii L的相應培養基。1.5經步驟1.4後,在第I列的姆個孔中均已有200li L的溶液,用一支8通道移液器緩慢地吸打溶液，以混勻第I列中每ー個孔中的溶液，混勻後(反覆吸打5-6次)，用8通道移液器從第I列的孔中轉移100 u L溶液到第2列的孔中，然後繼續用8通道移液器混勻第2列孔中的溶液，混勻後，再轉移100 u L到第3列孔中，這個操作需不斷重複直至全部12列孔中的溶液都混勻，這樣第12列的孔中有200 u L溶液，最後用8通道移液器從第12列的孔中轉移出100 UL溶液並棄棹。得到了一系列經2倍稀釋含不同濃度的活性物質溶液和陰陽性對照溶液。
2、待測菌液的準備和添加
2.1將經過培養的細菌用相應的已經高溫高壓滅菌的液體培養基稀釋，將細菌的菌液密度調節到1.0XlO8 CFU/mL，在本實驗室中，是用ELx808酶標儀檢測調節的結果。吸取300 u L經過調節的菌懸液到潔淨的96孔平底板中，然後置於ELx808酶標儀中於630nm波長處檢測，當菌液的吸光值(A)約為0.5時則表明菌液濃度達到1.0X IO8 CFU/mL。2.2用12通道移液器將調節好濃度的菌懸液添加到已經添加了待測活性物質溶液的96孔板中，陰性對照溶液和陽性對照溶液的96孔板中，每孔均添加100 u L調節好濃度的菌懸液。此時96孔板中的每個孔中應均有200 u L溶液。然後將96孔板置於合適的培養箱中培養，S.mu tans是兼性厭氧菌置於CO2培養箱中培養，F.是專性厭氧菌則需置於厭氧培養箱或厭氧培養盒中培養。培養溫度均為37°C,培養24h。3、讀取實驗結果
3.1通常培養24小時後，就可以比較明顯地觀察到細菌的生長/沒生長的情況。如果憑肉眼都可以觀察到有無生長的區別，則就可以將96孔板從培養箱中取出，置於室溫中平衡一段時間讓其回復到室溫(以防冷凝水聚集在96孔板的底部影響實驗結果的讀取)。3.2將96孔板置於ELx808酶標儀酶標儀中，蓋上酶標儀蓋子後，啟動ELx808酶標儀，讀取96孔板上的數據，結果如下表2和下表3所示。表2各活性物質對Sm的最低抑菌濃度(MIC，ppm)
權利要求
1.ー種抗菌毛冬青三萜總皂苷，所述毛冬青三萜總皂苷由原料毛冬青根莖或葉製備；其特徵在於:所述毛冬青三萜總皂苷中冬青素的重量百分含量為20% 50%。
2.根據權利要求1所述的毛冬青三萜總皂苷，其特徵在於:所述毛冬青三萜總皂苷通過以下步驟製備: (1)提取:取毛冬青根莖或葉，採用50% 70%こ醇提取，過濾，取濾液； (2)沉澱:取步驟(I)中製得的濾液，回收20% 80%的溶剤，靜置沉澱，過濾，得沉澱A和濾液B備用； (3)粗製:取步驟(2)中的沉澱A即為所述毛冬青三萜總皂苷；或取步驟(2)中的濾液B採用大孔吸附樹脂洗脫，洗脫劑分別採用20% 30%こ醇溶液、50% 90%こ醇溶液進行梯度洗脫，收集50% 90%こ醇溶液，濃縮乾燥得粗提物C即為所述毛冬青三萜總皂苷。
3.根據權利要求2所述的毛冬青三萜總皂苷，其特徵在於:所述步驟(3)中大孔吸附樹脂洗脫的洗脫劑分別採用30%こ醇溶液和70%こ醇溶液進行梯度洗脫。
4.根據權利要求2或3所述的毛冬青三萜總皂苷，其特徵在於:將步驟(3)中的沉澱A和粗提物C混合，即得所述毛冬青三萜總皂苷。
5.根據權利要求4所述的毛冬青三萜總皂苷，其特徵在於:將步驟(3)中的沉澱A和粗提物C混合，進行矽膠柱層祈，洗脫劑分別採用體積比為30:1 20:1的氯仿-甲醇混合液、10:1 5:1的氯仿-甲醇混合液進行梯度洗脫，收集體積比為10:1 5:1的氯仿-甲醇混合液，濃縮乾燥即為所述毛冬青三萜總皂苷。
6.根據權利要求5所述的 毛冬青三萜總皂苷，其特徵在於:所述矽膠柱層析的洗脫劑分別採用30:1的氯仿-甲醇混合液和10:1的氯仿-甲醇混合液進行梯度洗脫。
7.權利要求1至6任一所述的毛冬青三萜總皂苷在製備治療口腔疾病藥物方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗菌毛冬青三萜總皂苷及其在製備治療口腔疾病藥物方面的應用。該毛冬青三萜總皂苷由原料毛冬青根莖或葉製備，含有冬青素的重量百分含量為20%～50%。本發明毛冬青三萜總皂苷製備過程簡單，製得的產品抑菌效果好，可以作為治療口腔疾病藥物的組要成分進行進一步研究。
文檔編號A61K125/00GK103110673SQ201310028968
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者林麗萍, 梁敬鈺 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所