來源於側孢芽孢桿菌菌株的殺蟲毒素與基因的製作方法
2023-12-03 17:42:06
專利名稱:來源於側孢芽孢桿菌菌株的殺蟲毒素與基因的製作方法
背景技術:
昆蟲和其它害蟲使農民每年在作物損失與防治這些害蟲的花費中損失數十億美元。農業生產環境中由蟲害引起的損失包括作物產量的降低、作物質量的降低和收穫成本的提高。
玉米根蟲(一種鞘翅目害蟲)是一種嚴重的植物害蟲。由於玉米根蟲(星葉甲屬(Diabrotica)的種)幼蟲攝食根,美國玉米作物每年遭受重大損失。據估計,每年約有930萬英畝美國玉米遭受玉米根蟲綜合物種的侵害。玉米根蟲綜合物種包括西方玉米根蟲(玉米根葉甲(Diabrotica virgifera virgifera))、北方玉米根蟲(Diabrotica barberi)和南方玉米根蟲(黃瓜十一星葉甲食根亞種(Diabroticaundecimpunctata howardi))。
星葉甲屬的每個種的生活周期類似。玉米根蟲的卵沉積於土壤中。新孵化的幼蟲(初齡蟲)滯留於土壤中,以較小的分支玉米根為食。西方及北方玉米根蟲的晚齡蟲侵入向植物運送水和礦物元素的內根組織。在大多數情況中,幼蟲遷移,以最新生長的根為食。幼蟲向根中鑽孔引起可表現為根表面的棕色細長疤痕、根內蛀孔或不同程度切斷的損害。根被切斷的植物通常在伴隨大雨和強風的風暴後被拔出。南方玉米根蟲的幼蟲以與西方及北方玉米根蟲幼蟲類似的方式攝食根。南方玉米根蟲幼蟲也可攝食仍接近土壤線的莖的生長點,這可使植物枯死。
攝食約3周後,玉米根蟲幼蟲離開根,並在土壤中化蛹。甲蟲成蟲從土壤中出現,並可攝食玉米花粉及其它許多類型的花粉及玉米穗絲。攝食綠色穗絲能降低傳粉水平,導致穀粒結粒不良和產量降低。西方玉米根蟲成蟲也攝食玉米葉,這能減緩植物的生長,在較少見的情況中能殺死某些玉米品種的植物。
這些星葉甲屬的種的土壤幼蟲以玉米植物的根為食,引起倒伏。倒伏最終降低玉米產量,並且通常導致植物死亡。通過攝食玉米穗絲,甲蟲成蟲可減少傳粉,因此不利地影響每株植物的玉米產量。另外,星葉甲屬的成蟲和幼蟲侵害用於商業生產的葫蘆作物(黃瓜、甜瓜、南瓜等)和許多蔬菜作物及大田作物,以及家庭花園中生長的植物。
據估計,在美國每年用來防治玉米根蟲的殺蟲劑的年度花費和玉米根蟲損害引起的作物損失總計超過10億美元(Meycalf,R.L.《星葉甲屬害蟲研究方法》,Drysan,J.L.和T.A.Miller[編],Springer-Verlag,紐約,NY,ⅶ-ⅹⅴ頁)。在美國每年用價值約2.5億美元的殺蟲劑防治玉米根蟲。在中西部地區,1990年在愛荷華州和內布拉斯加州分別施用了價值6千萬美元和4千萬美元的殺蟲劑。儘管使用殺蟲劑,根蟲每年仍導致約7.5億美元的作物損失,使之成為中西部地區最嚴重的玉米害蟲。
利用栽培方法,如輪作和應用高水平氮刺激不定根系統的生長,已部分地進行了玉米根蟲的防治。但是,保證希望水平的防治最主要地是依靠化學殺蟲劑。殺蟲劑或者結合於或者摻入土壤中。對農田利用的經濟要求限制了輪作的應用。另外,在某些地區出現的北方玉米根蟲的兩年滯育(或越冬)性狀影響了輪作。
殺蟲劑防治玉米根蟲的用途也有幾個缺點。殺蟲劑的連續使用使得產生抗性昆蟲。如極大量的幼蟲群、大雨和殺蟲劑施用裝置的不準確刻度等情況均能導致較差的防治。殺蟲劑的應用常引發對環境的關注,如土壤和地表及地下供水的汙染。公眾也擔心可在食物中發現的殘餘化學藥品的量。工作中接觸殺蟲劑也可造成對施用它們的人員的危害。因此,合成化學殺蟲劑現正就其潛在的毒性環境後果受到越來越嚴格的審查,而正應如此。廣泛使用的合成化學殺蟲劑的實例包括有機氯殺蟲劑類,如DDT、滅蟻靈、十氯酮、林丹、艾氏劑、氯丹、涕滅威和狄氏劑;有機磷酸酯類,如毒死蜱、對硫磷、馬拉硫磷和二嗪磷;和氨基甲酸酯類。對使用殺蟲劑的新的嚴格限制和市場上某些有效殺蟲劑的撤除都能限制對防治害蟲的經濟、有效的選擇。
由於與使用有機合成化學殺蟲劑有關的問題,確實需要限制這些藥劑的使用,並需要確定備擇的防治藥劑。合成化學殺蟲劑的替換或這些藥劑與生物殺蟲劑的結合能降低環境中有毒化學藥品的水平。
越來越普及的一種生物殺蟲劑是土壤微生物蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)(B.t.)。土壤微生物蘇雲金芽孢桿菌(B.t.)是一種革蘭陽性的產芽孢細菌。大多數蘇雲金芽孢桿菌菌株不表現殺蟲活性。某些蘇雲金芽孢桿菌菌株產生且其特徵為伴胞晶體蛋白質內含物。這些一般具有特異殺蟲活性的「δ-內毒素」不同於具有非特異性宿主範圍的外毒素。這些內含物通常在顯微鏡下顯示為特徵性形狀的晶體。這些蛋白質可能對害蟲非常有毒,並且其毒性特異。已經分離並測序了某些蘇雲金芽孢桿菌毒素基因。蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白基因在大腸桿菌中的克隆與表達早在15年前就已在公開文獻中描述(Schnepf,H.E.,H.R.Whiteley美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78:2893-2897)。另外,利用遺傳工程技術,正研究向農業環境中施放蘇雲金芽孢桿菌毒素的新方法,包括使用以蘇雲金芽孢桿菌毒素基因遺傳改造的植物用於昆蟲抗性,和使用穩定的完整微生物細胞作為蘇雲金芽孢桿菌毒素輸送載體(Gaertner,F.H.,L.KimTIBTECH 6:S4-S7)。因此,分離的蘇雲金芽孢桿菌內毒素基因是有商業價值的。
到最近15年,蘇雲金芽孢桿菌殺蟲劑的商業應用主要限於鱗翅目(毛蟲)害蟲的較小範圍。蘇雲金芽孢桿菌庫爾斯塔克(kurstaki)亞種的芽孢和晶體製劑作為鱗翅目害蟲的商品殺蟲劑已使用多年。例如,蘇雲金芽孢桿菌庫爾斯塔克HD-1變種產生一種對多種鱗翅目昆蟲的幼蟲有毒的晶體δ-內毒素。
然而最近幾年,研究人員發現了對更多的害蟲有特異性的蘇雲金芽孢桿菌殺蟲劑。例如,蘇雲金芽孢桿菌的其它種即以色列(israelensis)和莫氏(morrisoni)(a.k.a.tenebrionis,a.k.a.B.t.M-7)已分別商業用於防治雙翅目和鞘翅目的昆蟲(Gaertner,F.H.「殺蟲蛋白質的細胞輸送系統活與死微生物」,《作物保護劑的受控施放》,R.M.Wilkins編,Taylor和Francis,紐約和倫敦,1990,245-255頁)。參見Couch,T.L.(1980)「蘇雲金芽孢桿菌以色列變種的蚊子致病性」,工業微生物發展(Developments in Industrial Microbiology)22:61-67;Beegle,C.C.(1978)「昆蟲體寄生菌在農業生態系統中的應用」工業微生物發展20:97-104。Krieg,A.,A.M.Huger,G.A.Langenbruch,W.Schnetter(1983)Z.ang.Ent.96:500-508描述了據報導對鞘翅目的兩種甲蟲有活性的蘇雲金芽孢桿菌粉蟲(tenebrionis)變種。它們是科羅拉多馬鈴薯甲蟲--馬鈴薯葉甲(Leptinotarsa decemlineata)和楊樹瑩葉甲(Agelastica alni)。
最近,已鑑定了新的蘇雲金芽孢桿菌亞種,並分離了活性δ-內毒素蛋白的基因(Hofte,H.,H.R.Whiteley微生物學綜述(Microbiological Reviews)52(2):242-255)。Hofte和Whiteley將蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白基因分類為4個主要類別。這些類別是CryⅠ(鱗翅目特異的)、CryⅡ(鱗翅目和雙翅目特異的)、CryⅢ(鞘翅目特異的)和CryⅣ(雙翅目特異的)。已經報導發現了對其它害蟲特別有毒的菌株(Feitelson J.S.,J.Payne,L.Kim生物技術(Bio/Technology)10:271-275)。已建議用CryⅤ代表一類線蟲特異的毒素基因。Lambert等人(Lambert B.,L.Buysse,C.Decock,S.Jansens,C.Piens,B.Saey,J.Seurinek,K.van Audenhove,J.van Rie,A.van Vliet,M,Peferoen應用與環境微生物(Appl.Environ.Microbiol.)62(1):80-86)和Shevelev等人(FEBS Lett.336:79-82)描述了對鱗翅目有活性的Cry9毒素的表徵。公開的PCT申請WO94/05771和WO94/24264也描述了對鱗翅目害蟲有活性的蘇雲金芽孢桿菌分離株。Gleave等人(JGM138:55-62)和Smulevitch等人(FEBS Lett.293:25-26)也描述了蘇雲金芽孢桿菌毒素。現在也已鑑定了大量其它種類的蘇雲金芽孢桿菌基因。
Hofte和Whiteley對晶體蛋白的1989命名與分類方案是基於毒素的推斷胺基酸序列和宿主範圍。該系統適於覆蓋14個不同種類的毒素基因,它們被分為5個主要類別。被測序的蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白基因的數量目前超過50個。也提出了一種只基於胺基酸同一性的修訂的命名方案(Crickmore等人無脊椎動物病理學協會(Societyfor Invertebrate Pathology),第29屆年會,第3次國際蘇雲金芽孢桿菌討論會,科多巴大學,科多巴,西班牙,1996年9月1-6日,摘要)。對除cytA和cytB之外的所有毒素基因保留了命名「cry」,即這是一種單獨的類別。在第一級中用羅馬數字替換阿拉伯數字,並去掉第三級中的括號。雖然有許多被重新分類,但除提及的之外仍保留了許多原來的名稱。參見「蘇雲金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白命名法的修訂」,N.Crickmore,D.R.Zeigler,J.Feitelson,E.Schnepf,J.Van Rie,D.Lereclus,J.Baurn和D.H.Dean,微生物學與分子生物學綜述(Microbiology and Molecular Biology reviews)(1998)62卷807-813;Crickmore,Zeigler,Feitelson,Schnepf,Van Rie,Lereclus,Baum和Dean,「蘇雲金芽孢桿菌毒素命名法」(1999)http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index.html。該系統使用可自由獲得的軟體應用程式CLUSTAL W和PHYLIP。PHYLIP程序包中的NEIGHBOR應用程式使用一種算術平均(UPGMA)算法。
由於對資源的廣泛研究和投資,已授權了關於新蘇雲金芽孢桿菌分離株與蘇雲金芽孢桿菌分離株的新用途的其它專利。參見Feitelson等人,同上,綜述。然而,新蘇雲金芽孢桿菌分離株的發現和已知蘇雲金芽孢桿菌分離株的新用途仍是一種根據經驗的、不可預測的技術。
Favret和Yousten(無脊椎動物病理學雜誌(J.Invert.Path.)45:195-203)檢測了側孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus)菌株的殺蟲活性,但結論是,這些菌株所顯示的低水平毒性表明這些菌株不是生物防治劑的潛在候選者。Montaldi和Roth(172細菌學雜誌(J.Bac.)4;1990年4月;2168-2171頁)對側孢芽孢桿菌孢子囊的類芽孢體進行了電子顯微鏡檢查。Bone等人(美國專利號5,045,314)報導所選側孢芽孢桿菌菌株的芽孢抑制動物寄生線蟲卵的孵化和/或幼蟲的發育。Aronson等人(美國專利號5,055,293)描述了一種被稱為P5的產芽孢的側孢芽孢桿菌(ATCC53694)。在此用側孢芽孢桿菌NRS-590作為陰性對照。Aronson等人假定側孢芽孢桿菌P5能侵襲極幼的玉米根蟲幼蟲,造成立即或稍後的損害,或者能阻斷玉米根蟲對將其向根引導的信號的接收或應答。WO94/21795或WO96/10083描述了據說對某些害蟲有活性的毒素。WO98/18932描述了對多種昆蟲有活性的許多新的微生物毒素類型。在此也公開了多種探針和引物。Orlova等人(64應用與環境微生物學1998年7月7日,2723-2725頁)報導,某些側孢芽孢桿菌菌株的晶體內含物可潛在地用作防治蚊子的候選物。
蘇雲金芽孢桿菌毒素的成功農業應用的障礙包括昆蟲對蘇雲金芽孢桿菌毒素抗性的發生。另外,某些昆蟲難以用蘇雲金芽孢桿菌的作用防治。後者包括如棉鈴象鼻蟲和小地老虎的昆蟲,及迄今已證明對蘇雲金芽孢桿菌δ-內毒素無明顯敏感性的大多數種的成蟲。儘管蘇雲金芽孢桿菌轉基因植物技術中採用的抗性操作策略是十分有意義的,但仍極其需要發現能在植物中以適當水平成功表達,從而有效防治多種昆蟲的基因。
發明概述本發明涉及在非哺乳動物害蟲,尤其是植物害蟲的防治中有用的材料與方法。在一個實施方案中,本發明提供可從側孢芽孢桿菌分離株中獲得的新型殺蟲毒素和毒素編碼基因。在一個優選的實施方案中,靶害蟲是玉米根蟲。本發明的毒素包括能從所述側孢芽孢桿菌菌株培養上清液中獲得的熱不穩定的可溶性毒素。本發明的毒素也包括可從這些菌株中獲得的較小的熱不穩定毒素。
本發明還提供編碼本發明的毒素的核苷酸序列。本發明的核苷酸序列編碼不同於以前所述毒素的毒素。本發明的核苷酸序列也能用於編碼殺蟲毒素的基因的鑑定與表徵。
在本發明的一個實施方案中,能在引起微生物大量增殖的條件下培養所述芽孢桿菌分離株。處理微生物得到單鏈基因組核酸後,用根據本發明的核苷酸序列表徵該DNA。用該方法擴增毒素編碼基因的特徵片段,從而確定毒素編碼基因的存在。
在一個優選的實施方案中,本發明涉及植物和植物細胞,其被轉化後產生至少一種本發明的殺蟲毒素,使得被轉化的植物細胞在靶害蟲所攝食的組織中表達殺蟲毒素。另外,根據本發明也能使用毒素的混合物和/或組合。
用此處公開的遺傳構建體對植物的轉化能通過本領域技術人員所周知的技術實現,一般包括基因的修飾以優化毒素在植物中的表達。
序列簡述SEQ ID NO.1是一種MIS探針。
SEQ ID NO.2是一種WAR探針。
SEQ ID NO.3是一種MIS正向引物。
SEQ ID NO.4是一種MIS反向引物。
SEQ ID NO.5是來源於側孢芽孢桿菌MB438菌株的MIS毒素基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO.6是來源於側孢芽孢桿菌MB438菌株的MIS毒素基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO.7是來源於側孢芽孢桿菌MB438菌株的MIS毒素的多肽序列。
SEQ ID NO.8是來源於側孢芽孢桿菌MB438菌株的WAR毒素基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO.9是來源於側孢芽孢桿菌MB438菌株的WAR毒素的多肽序列。
SEQ ID NO.10是來源於側孢芽孢桿菌MB439菌株的MIS毒素的核苷酸序列。
發明詳述本發明涉及在非哺乳動物害蟲,尤其是植物害蟲的防治中有用的材料與方法。在一個實施方案中,本發明提供可從側孢芽孢桿菌分離株中獲得的新型殺蟲毒素和毒素編碼基因。在一個優選的實施方案中,靶害蟲是玉米根蟲。本發明的毒素包括能從所述側孢芽孢桿菌菌株培養上清液中獲得的熱不穩定的可溶性毒素。下面詳述了可從這些菌株中獲得的MIS型和WAR型毒素。本發明的毒素也包括可從這些菌株中獲得的較小的熱不穩定毒素。
本發明還提供編碼本發明的毒素的核苷酸序列。本發明的核苷酸序列編碼不同於以前所述毒素的毒素。本發明的其它核苷酸序列也能在本領域中眾所周知的診斷與分析方法中使用。例如,能用探針、引物和部分序列鑑定與表徵編碼殺蟲毒素的基因。
在本發明的一個實施方案中,能在引起微生物大量增殖的條件下培養所述芽孢桿菌分離株。處理微生物得到單鏈基因組核酸後,用根據本發明的核苷酸序列表徵該DNA。用該方法擴增毒素編碼基因的特徵片段,從而確定毒素編碼基因的存在。
在一個優選的實施方案中,本發明涉及植物細胞,其被轉化後產生至少一種本發明的殺蟲毒素,使得被轉化的植物細胞在靶害蟲所攝食的組織中表達殺蟲毒素。另外,根據本發明也能使用毒素的混合物和/或組合。在某些優選的實施方案中,MIS毒素與WAR毒素一起使用。
用此處公開的遺傳構建體對植物的轉化能通過本領域技術人員所周知的技術實現,一般包括基因的修飾以優化毒素在植物中的表達。
根據本發明有用的分離株將保藏於農業研究機構保藏中心(NRRL)的永久保藏所,北方研究中心,1815North University Street,Peoria,Illinois61604,美國。培養物保藏號如下
因本專利申請而保藏的培養物保藏於以下條件下,即,可確保依37CFR1.14和35U.S.C.122授權的專利商標局官員指定的人員在本專利申請未決期間能獲得這些培養物。當提交本申請書的相應文本或其後續文本的國家的專利法需要時,這些保藏物應是可獲得的。然而,應當理解,保藏物的可獲得性不構成在政府機關承認的專利權失效後實施本發明的許可。
另外,所述培養保藏物應按照布達佩斯微生物保藏條約的規定貯存,且可為公眾所獲得,即,它們應貯存於使其在最近請求提供保藏樣品後至少5年內,及在任何情況下,在保藏日期後至少30年內,或可公開培養物的任何專利的有效期內存活且不受汙染所必需的條件下。保藏者應承認在保藏所因保藏條件而在請求時不能提供樣品時替換保藏物的義務。對培養保藏物公開獲得性的所有限制在公開它們的專利獲準後不能撤回。
此處所指的分離株的突變體能通過本領域中眾所周知的方法製備。例如,通過分離株的甲基磺酸乙酯(EMS)誘變能獲得不產芽孢突變體。能通過本領域眾所周知的方法用紫外線和亞硝基胍製備突變體。
在一個實施方案中,本發明涉及材料與方法,包括用於分離、表徵和鑑定編碼對非哺乳動物害蟲有活性的蛋白質毒素的芽孢桿菌基因的核苷酸引物和探針。此處所述的核苷酸序列也能用來鑑定新的殺蟲性芽孢桿菌分離株。本發明還涉及用此處公開的方法與材料鑑定的基因、分離株和毒素。
此處提供的新的毒素和多核苷酸序列根據幾個參數來定義。此處所述的毒素的一個特徵是殺蟲活性。在一個具體實施方案中,這些毒素具有針對西方玉米根蟲的活性。本發明的毒素和基因能按照胺基酸和核苷酸序列進一步定義。根據與例舉的某些序列的同源性,以及根據與例舉的某些探針和引物雜交的能力,或被其擴增的能力,能定義這些分子的序列。
在一個優選的實施方案中,本發明的MIS型毒素分子量為約70~約100kDa,最優選地這些毒素大小為約80kDa。一般而言,這些毒素是可溶的,並能如此處所述從芽孢桿菌培養上清液中獲得。這些毒素對非哺乳動物害蟲有毒性。在一個優選的實施方案中,這些毒素對西方玉米根蟲有活性。MIS蛋白由於其在細胞中成孔的能力是尤其有用的。這些蛋白質能與第二種物質包括如其它蛋白質一起使用。當與第二種物質一起使用時,MIS蛋白可利於第二種物質向靶細胞中的進入。在一個優選的實施方案中,MIS蛋白與MIS受體在靶細胞中相互作用,導致靶細胞中孔的形成。這第二種物質可以是毒素或希望其進入細胞中的另一種分子。
本發明還涉及大小約為30-50kDa,最典型地大小約40kDa的WAR型毒素。一般而言,這些毒素是可溶的,並能如此處所述從芽孢桿菌培養上清液中獲得。
能用此處所述的引物鑑定本發明的MIS型和WAR型毒素。
另一種特殊類型的毒素被確定為由本發明的芽孢桿菌菌株產生。這些毒素比本發明的MIS型和WAR型毒素更小。這些毒素,象MIS型WAR型毒素,是熱不穩定的。但是,這些毒素的大致大小為約10kDa~約1kDa。這些毒素也是可溶的,並能如此處所述從芽孢桿菌培養上清液中獲得。
根據此處所述,本領域技術人員應能容易地產生並應用此處所述的多種毒素和多核苷酸序列。
基因與毒素。如在此使用,術語「野生型毒素」和「野生型基因」是指所述分離株(MB438和MB439)自然產生的基因和毒素。本發明的基因和毒素不僅包括全長的野生型序列,而且包括這些序列的片段、變體、突變體和融合蛋白,它們保留了此處特別例舉的毒素的特有殺蟲活性。例如,美國專利號5,605,793描述了在隨機斷裂後利用DNA重裝配產生其它分子多樣性的方法。而且,能對此處特別例舉的基因和毒素進行內部缺失,只要修飾毒素保留有殺蟲活性。根據本發明的教導也可使用由超過一種芽孢桿菌毒素或基因的組合部分產生的嵌合基因和毒素。如在此使用,術語基因的「變體」或「變異」是指編碼相同毒素或編碼具有殺蟲活性的相當毒素的核苷酸序列。如在此使用,術語「相當毒素」是指對靶害蟲有與例舉的毒素相同或基本相同的生物活性的毒素。
本領域技術人員應當明白,可通過幾種方法鑑定並獲得編碼活性毒素的基因。此處例舉的特異基因可從如上所述保藏於培養物保藏中心的分離株中獲得。這些基因,或其部分或變體,也可用合成方法構建,例如,利用基因合成儀構建。利用產生點突變的標準技術可容易地構建基因的變異。也能按照標準方法用可商品獲得的外切核酸酶或內切核酸酶製備這些基因的片段。例如,能用如Bal31的酶或定點誘變從這些基因的末端系統地切除核苷酸。編碼活性片段的基因也可用多種限制酶獲得。可用蛋白酶直接獲得這些毒素的活性片段。
根據此處所述能由芽孢桿菌分離株和/或DNA文庫產生相當毒素和/或編碼這些相當毒素的基因。有大量方法可獲得本發明的殺蟲毒素。例如,此處公開並要求保護的殺蟲毒素的抗體能用來從蛋白質混合物中鑑別並分離毒素。特別可製備針對最恆定且最不同於其它芽孢桿菌毒素的毒素部分的抗體。然後能用這些抗體通過免疫沉澱、酶聯免疫吸附測定(ELISA)或Western印跡特異性鑑定具有特定活性的相當毒素。針對此處公開的毒素或相當毒素或這些毒素的片段的抗體能用本領域的標準方法容易地製備。然後能從微生物中獲得編碼這些毒素的基因。
保留了所例舉毒素的殺蟲活性的片段和相當物屬於本發明的範圍。由於遺傳密碼的豐餘性,多種不同的DNA序列也能編碼此處公開的胺基酸序列。本領域技術人員能較好地製備這些編碼相同或基本相同毒素的DNA序列。這些變體DNA序列屬於本發明的範圍。如在此使用,「基本相同的」序列是指含有不顯著影響殺蟲活性的胺基酸置換、缺失、添加或插入的序列。該定義中也包括保留殺蟲活性的片段。
鑑定本發明的毒素和基因的另一種方法是利用寡核苷酸探針。這些探針是可檢測的核苷酸序列。探針提供一種鑑定本發明的毒素編碼基因的快速方法。用作本發明的探針的核苷酸片段能用DNA合成儀和標準方法合成。
在此已具體例舉了本發明的某些毒素。由於這些毒素只是本發明的毒素的典型,所以應當明白,本發明包括具有與例舉的毒素相同或相似殺蟲活性的變體或相當毒素(和編碼相當毒素的核苷酸序列)。相當毒素應與例舉的毒素有胺基酸同源性。該胺基酸同一性一般大於60%,優選地大於75%,更優選地大於80%,更優選地大於90%,並能大於95%。這些同一性用標準對比技術測定,優選地如本說明書背景部分所述用Crickmore等人所用的技術測定。在決定生物活性或與決定最終影響生物活性的三維構型有關的毒素重要區域中,胺基酸同源性最高。就此而言,某些胺基酸置換是可接受的且可能是希望的,只要這些置換位於對於活性而言不重要的區域中,或是不影響分子三維構型的保守胺基酸置換。例如,胺基酸可屬於下列類別非極性、不帶電荷極性、鹼性和酸性。一種胺基酸被替換為相同類型的另一種胺基酸的保守置換屬於本發明的範圍,只要該置換基本上不顯著改變化合物的生物活性。下面表1中列出的是分屬每一類別的胺基酸的實例。
在某些情況中,也能進行非保守置換。關鍵因素在於這些置換必須不能明顯降低毒素的生物活性。
如在此使用,「分離的」多核苷酸和/或「純化的」毒素是指不與天然發現時所結合的其它分子相結合的這些分子。因此,「分離和純化的」表示與如此處所述的「人工」有關。嵌合毒素和基因也與「人工」有關。
重組宿主。本發明的毒素編碼基因能被引入多種微生物或植物宿主中。毒素基因的表達直接或間接地導致殺蟲劑的產生和維持。優選植物宿主的轉化。攝食表達毒素的重組植物的害蟲由此接觸毒素。通過合適的微生物宿主,如假單胞菌(Pseudomonas),微生物能加到害蟲所處位置,在此增殖並被攝食。利用任何不同方法,結果都將是害蟲的防治。另外,在可延長毒素活性和穩定細胞的條件下,帶有毒素基因的微生物能被殺死及處理。然後可將保留毒素活性的被處理細胞施用於靶害蟲環境。通過經適當載體向微生物宿主中引入一種基因,然後將該宿主以存活狀態應用於環境,也能應用芽孢桿菌毒素。
有多種方法可用於在能夠穩定保持並表達基因的條件下向宿主中引入編碼毒素的芽孢桿菌基因。這些方法為本領域技術人員所周知,如在美國專利號5,135,867中有述,其在此引用作為參考。
也能用功能上與本發明的毒素相當的合成基因轉化宿主。例如,在美國專利號5,380,831中能找到產生合成基因的方法。在優選的實施方案中,為在植物中表達而優化本發明的基因。
細胞的處理。如上所述,能處理表達芽孢桿菌毒素的芽孢桿菌或重組細胞,以延長毒素活性並穩定細胞。形成的殺蟲劑微囊體在一種細胞結構內包含芽孢桿菌毒素,當應用於靶害蟲環境時它可穩定並保護毒素。合適的宿主細胞可包括原核生物或真核生物。作為宿主,特別有意義的是原核生物和低等真核生物,如真菌。當處理時,細胞通常是完整的,且基本上為增殖形式,而不是芽孢形式。
微生物細胞如含芽孢桿菌毒素基因的微生物細胞能通過化學或物理方法處理,或通過化學和/或物理方法的組合處理,只要該技術不能不利地影響毒素的性質,也不降低細胞保護毒素的能力。在美國專利號4,695,455和4,695,462中公開了微生物細胞的處理方法,在此引用作為參考。
防治害蟲的方法與製劑。利用本發明的毒素和基因對害蟲的防治能通過本領域技術人員周知的方法來實現。這些方法包括,例如,對害蟲(或其位置)施用芽孢桿菌分離株,對害蟲(或其位置)施用重組微生物,用編碼本發明的殺蟲毒素的基因轉化植物。本領域技術人員能用標準技術進行轉化。這些轉化所必需的材料在此公開,或易於為技術人員所獲得。
配製的含有引誘劑和芽孢桿菌分離株毒素的餌料顆粒,或含有可從此處公開的芽孢桿菌分離株中獲得的基因的重組微生物,能施用於土壤。配製的產品也能用於種子包被或根處理或在種植周期後期時整個植物的處理。芽孢桿菌細胞的植物和土壤處理可通過與不同惰性材料如無機礦物質(頁矽酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等)或植物性材料(粉狀玉米穗軸、稻殼、核桃殼等)混合,用作可溼性粉末、顆粒或粉劑。該製劑可包含粘展劑、穩定劑、其它殺蟲添加劑或表面活性劑。液體製劑可以是水性的或非水性的,並可用作泡沫、凝膠、懸液、濃縮乳劑等。成份可包括流變劑、表面活性劑、乳劑、分散劑或聚合物。
本領域技術人員應當理解,殺蟲濃度將隨特定製劑的性質尤其因它是一種濃縮物還是直接使用而大大不同。殺蟲劑至少為1%重量,並可達100%重量。幹製劑為約1-95%殺蟲劑重量,而液體製劑在液相時通常為約1-60%固體重量。含有細胞的製劑通常為約102~約104細胞/mg。這些製劑可以以每公頃約50mg(液體或幹)~1kg或更多的量施用。
能通過噴霧、撒粉、噴灑等將這些製劑施用於害蟲環境,如土壤和樹葉。
多核苷酸探針。眾所周知,DNA具有稱為鹼基互補的基本性質。實際上,DNA通常以反平行鏈對的形式存在,每條鏈上的鹼基從該鏈向相對的鏈伸出。一條鏈上的鹼基腺嘌呤(A)總是對應於另一條鏈上的鹼基胸腺嘧啶(T),而鹼基鳥嘌呤對應於鹼基胞嘧啶(C)。鹼基由於其以這種特殊方式氫鍵鍵合的能力而保持並列。儘管每一單個鍵相對較弱,但許多相鄰氫鍵鍵合鹼基的淨效應與鹼基堆積效應一起可穩定連接兩條互補鏈。這些鍵能被如高pH或高溫的處理所打破,這些條件導致兩條鏈的解離或「變性」。如果之後將DNA置於使鹼基熱力學上趨於氫鍵鍵合的條件下,則DNA鏈將退火,或「雜交」,並重新形成原來的雙鏈DNA。如果在適當條件下進行,該雜交可能是高度特異的。即,只有高度鹼基互補的鏈才能形成穩定的雙鏈結構。雜交特異性與反應條件的關係眾所周知。因此,可用雜交檢測兩種DNA鹼基序列是否互補。該雜交機理利於用本發明的探針方便地檢測和表徵目的DNA序列。
探針可以是RNA、DNA或PNA(肽核酸)。探針通常有至少約10個鹼基,更通常至少約17個鹼基,並可有高達約100個鹼基或更多。能方便地使用更長的探針,例如這些探針長度可為幾千個鹼基。探針序列設計為至少基本上互補於編碼目的毒素的基因的一部分。探針不需要與雜交序列完全互補。探針可用本領域技術人員所周知的技術標記。
本發明使用探針的一種方法需要首先通過對芽孢桿菌分離株基因庫的Southern印跡分析,鑑定與公開的核苷酸序列同源的所有DNA片段。因此,不藉助於生物學分析,也能預先了解多種新芽孢桿菌分離株和特定芽孢桿菌分離株表達的個別基因產物的可能活性。這種探針分析提供了一種快速方法,用於在多種芽孢桿菌亞種中鑑定具有潛在商業價值的殺蟲毒素基因。
根據本發明有用的一種雜交方法一般包括最初的分離目的DNA樣品並化學純化的步驟。能使用裂解的細菌或從細菌中分離的總分級分離核酸。能用已知技術處理細胞以釋放其DNA(和/或RNA)。用合適的限制酶能將DNA樣品切為片段。通過凝膠電泳通常為瓊脂糖或丙烯醯胺電泳能按大小分離這些片段。並將目的片段轉移到固定的膜上。
特定的雜交技術不是本發明的關鍵。由於雜交技術的改進,能容易地使用這些方法。
然後能在雜交緩衝溶液中使探針與樣品結合,並在適當溫度下保持直到發生退火。之後,洗滌該膜使之不含外源物質,一般通過放射自顯影和/或液體閃爍計數檢測,並定量樣品和結合的探針分子。本領域中眾所周知,如果探針分子和核酸樣品通過在兩種分子間形成強烈的非共價鍵而雜交,則可以合理地假定探針和樣品基本上相同。探針的可檢測標記提供了一種以已知方法確定是否發生雜交的方法。
在使用核苷酸片段作為探針時,用本領域技術人員周知的任何適當標記物,包括放射性和非放射性標記物,標記特定探針。典型的放射性標記包括32P、35S等。非放射性標記包括,例如,配體如生物素或甲狀腺素,以及酶如水解酶或過氧化物酶,或不同的化學發光劑如螢光素,或螢光化合物如螢光素及其衍生物。如國際申請號WO93/16094所述可使探針固有螢光。
能使用不同程度的雜交嚴格性。條件越嚴格,雙鏈體形成所需的互補性越強。通過溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間等能控制嚴格性。優選地,如Keller,G.H.,M.M.Manak(1987)《DNA探針》,Stockton出版社,紐約,NY,169-170頁所述,用本領域眾所周知的技術在中等到高度嚴格條件下進行雜交。該信息在此引用作為參考。
如在此使用,雜交的「中等到高度嚴格」條件是指達到與本申請人所用條件相同或大致相同程度的雜交特異性的條件。此處提供了中等到高度嚴格條件的實例。特別用標準方法(Maniatis等人)進行Southern印跡中固定DNA與32P標記基因特異性探針的雜交。通常在中等到高度嚴格條件下進行雜交和隨後的洗滌,該條件使得可檢測與例舉的毒素基因有同源性的靶序列。對於雙鏈DNA基因探針,在比DNA雜合體的解鏈溫度(Tm)低20-25℃的溫度下,在6×SSPE、5×Denhardt’s溶液、0.1%SDS、0.1mg/ml變性DNA中雜交過夜。解鏈溫度以下列通式表述(Beltz,G.A.,K.A.Jacobs,T.H.Eickbush,P.T.Cherbas和F.C.Kafatos《酶學方法》,R.Wu,L.Grossman和K.Moldave[編],學院出版社,紐約100:266-285)。
Tm=81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(%G+C)-0.61(%甲醯胺)-600/鹼基對中雙鏈體的長度。
洗滌一般如下進行(1)用1×SSPE、0.1%SDS室溫洗兩次15分鐘(低嚴格性洗滌)。
(2)用0.2×SSPE、0.1%SDS在Tm-20℃下洗一次15分鐘(中等嚴格性洗滌)。
對於寡核苷酸探針,在比雜合體的解鏈溫度(Tm)低10-20℃的溫度下,在6×SSPE、5×Denhardt’s溶液、0.1%SDS、0.1mg/ml變性DNA中雜交過夜。寡核苷酸探針的Tm由下列通式確定Tm(℃)=12(T/A鹼基對數)+4(G/C鹼基對數)(Suggs,S.V.,T.Miyake,E.H.Kawashime,M.J.Johnson,K.Itakura和R.B.WallaceICN-UCLA symp.dev.Biol.Using Purified Genes,D.D.Brown[編],學院出版社,紐約,23:683-693)。
洗滌一般如下進行(1)用1×SSPE、0.1%SDS室溫洗兩次15分鐘(低嚴格性洗滌)。
(2)用1×SSPE、0.1%SDS在雜交溫度下洗一次15分鐘(中等嚴格性洗滌)。
通常,能改變鹽和/或溫度從而改變嚴格性。標記的DNA片段長度>70個左右鹼基時,能用下列條件低1或2×SSPE,室溫低1或2×SSPE,42℃中0.2×或1×SSPE,65℃高0.1×SSPE,65℃。
雙鏈體形成和穩定性取決於雜合體兩條鏈之間的基本互補性,並且如上所述,能允許某種程度的錯配。因此,本發明的探針序列包括希望序列的突變(單和多)、缺失、插入,及其組合,其中該突變、插入和缺失使得能與目的多核苷酸形成穩定的雜合體。能用多種方法在特定多核苷酸序列中產生突變、插入和缺失,這些方法為技術人員所公知。其它方法在將來也可成為公知的。
因此,利用本領域技術人員周知的方法能容易地製備公開的核苷酸序列的突變、插入和缺失變體。這些變體能以與例舉的引物序列相同的方法使用,只要這些變體與原始序列有基本的序列同源性。如在此使用,基本序列同源性是指足以使變異探針以與原始探針相同的能力起作用的同源性。優選地,這種同源性大於50%,更優選地,該同源性大於75%,最優選地,該同源性大於90%。變體以預期能力起作用所需的同源性或同一性的程度取決於序列的預期用途。本領域技術人員能進行突變、插入和缺失突變,用來提高序列的功能,或另外提供方法優點。
PCR技術。聚合酶鏈反應(PCR)是一種重複、酶促、引發的核酸序列合成。該方法眾所周知,並且為本領域技術人員所常用(見Mullis,美國專利號4,683,195、4,683,202、4,800,159;Saiki,Randall K.,Stephen Scharf,Fred Faloona,Kary B.,Mullis,Glenn T. Horn,HenryA.Erlich,Norman Arnheim「β-珠蛋白基因組序列的酶促擴增和限制位點分析,用於診斷鐮狀細胞貧血」,科學230:1350-1354)。PCR基於側翼為兩條可與靶序列相對鏈雜交的寡核苷酸引物的目的DNA片段的酶促擴增。引物用彼此指向的3』末端定向。模板熱變性、引物與其互補序列的退火和用DNA聚合酶使退火引物延伸的重複循環,導致PCR引物5』端所限定的片段的擴增。由於每條引物的延伸產物能用作另一條引物的模板,所以每一循環基本上使前一循環產生的DNA片段的量加倍。這導致特異靶片段的指數積累,在幾個小時後可達幾百萬倍。利用熱穩定DNA聚合酶如從嗜熱菌棲熱水生菌(Thermusaquaticus)中獲得的Taq聚合酶,擴增過程能完全自動化。可使用的其它酶為本領域技術人員所周知。
本發明的DNA序列能用作PCR擴增的引物。在進行PCR擴增時,可允許引物與模板之間的某種程度的錯配。因此,所例舉的引物的突變、缺失和插入(特別是核苷酸向5』端的添加)屬於本發明的範圍。利用技術人員周知的方法能在特定引物中產生突變、插入和缺失。
此處引用的所有參考文獻均在此引入作為參考。
下面是說明實施本發明的方法的實施例。這些實施例不應看作是限制。除非另外指明,否則所有百分數都是重量百分數,所有溶劑混合比例均為體積比。
實施例1-根據本發明有用的側孢芽孢桿菌分離株的培養天然側孢芽孢桿菌菌株和表達側孢芽孢桿菌MIS和WAR毒素的蘇雲金芽孢桿菌重組體在30℃和300轉/分下在TB(+甘油)液體培養基中培養25小時。離心沉澱細胞,傾析出上清液(「SN」)並保存。加入EDTA至1mM,樣品貯存於-20℃。在收穫的同一天用新鮮樣品進行生物測定。於4℃融解冷凍樣品,離心沉澱並去除任何固體,然後用於生物測定或分級分離。實施例2-基因組DNA的製備和Southern印跡分析從在Luria Bertani(LB)培養液中生長至600nm可見光下的光密度為0.5-0.8的不同側孢芽孢桿菌菌株中製備總細胞DNA。根據針對革蘭氏陽性菌的方法(Qiagen Inc.;Valencia,CA)用QiagenGenomic-tip 500/G試劑盒或Genomic-tip 20/G和基因組DNA緩衝液組提取DNA。製備的總基因組DNA用不同限制酶消化,經0.8%瓊脂糖凝膠電泳,用標準方法固定於支持尼龍膜上(Maniatis,T.,E.F.Fritsch,J.Sambrook《分子克隆實驗室指南》,冷泉港實驗室,冷泉港,NY)。用32p標記探針經標準Southern雜交或通過利用DIG核酸標記和檢測系統的非放射性方法檢測新型毒素基因(BoehringerMannheim;Indianapolis,IN)。
SEQ ID NO.1顯示約2.6kbp的MIS探針。SEQ ID NO.2顯示約1.3kbp的WAR探針。這些探針能用多種方法包括利用「基因機」製備,或者能從蘇雲金芽孢桿菌分離株PS177CB克隆,並用與各自基因的5』和3』端同源的引物PCR擴增。在後一情況中,凝膠純化DNA片段,用32p隨機標記約25ng的每種DNA片段進行放射性檢測。用DIGHigh Prime試劑盒隨機標記約300ng的每種DNA片段進行非放射性檢測。固定DNA與隨機32p標記的探針的雜交在標準的甲醯胺條件下進行50%甲醯胺、5×SSPE、5×Denhardt’s溶液、2%SDS、0.1mg/ml,42℃過夜。在低嚴格性下用2×SSC、0.1%SDS 42℃洗滌印跡,並對膠片曝光。
以下表2所示的是側孢芽孢桿菌菌株MB438和MB439的總細胞DNA的限制片段長度多態性(RFLP)結果,其如述通過以MIS或WAR探針探查的Southern印跡分析測定。這些條帶至少含有目的MIS樣或WAR樣操縱子的一個片段。
表2
實施例3-毒素基因克隆由大小為9-20kb的部分消化、大小分離的DNA製備側孢芽孢桿菌菌株MB439或MB438的總基因組DNA的λ文庫。確定使用1:10稀釋的NdeⅡ酶(約0.5單位)的特異消化時間,以優化希望大小的消化DNA。DNA消化適當時間,然後經0.7%瓊脂糖凝膠分級分離。用溴化乙錠染色顯示DNA,從凝膠上切下大小為9-20kb的DNA。將凝膠片段與2ml 10mM Tris-HCl、1mM EDTA緩衝液pH8.0(TE)一起置入透析管中(12-14000MW界值)。在大約30mA下用0.1×TAE緩衝液從該凝膠片段上電洗脫DNA1小時。從管中移出溶於TE緩衝液的DNA,並用Elutip柱及方案(Schleicher和Schuell;Keene,NH)純化。乙醇沉澱純化的DNA,重懸浮於10μl TE中。
按照方案將純化、分級分離的DNA與λ-GEM-11BamHI消化的臂(Promega Corp.,Madison,WI)連接。然後按照方案用GigapackⅢGold包裝提取物(Stratagene Corp.,La Jolla,CA)將連接的DNA包裝於λ噬菌體中。用包裝提取物感染大腸桿菌菌株KW251,並平板接種於LB平板的LB頂層瓊脂中。噬斑轉移到硝酸纖維素膜上,並準備用標準方法雜交(Maniatis等人,同上)。製備32P標記的探針(見上),如上所述雜交並洗滌濾膜。通過將濾膜暴露於Kodak XAR-5膠片顯示含有希望克隆的噬斑。從平板上分離噬斑,將噬菌體從瓊脂中重懸浮於轉移到SM緩衝液中。用LambdaSorb噬菌體吸收劑(Promega,Madison,WI)製備噬菌體的DNA。用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4作為引物對噬菌體DNA進行PCR,以證實其含有靶操縱子。兩個DNA樣品的PCR反應都產生一條1kb的帶,再次證實這些克隆含有mis型基因。為了鑑定之後能被亞克隆到細菌載體中進一步分析並表達的含有目的操縱子的較小片段,用不同酶消化噬菌體DNA,經1%瓊脂糖凝膠分級分離,並進行Southern印跡分析。Southern分析如上所述進行。對MB438鑑定大小約為10kb的HincⅡ片段。凝膠純化該片段,並克隆到pBluescriptⅡ(SK+)的EcoRⅤ位點;產生的質粒被命名為pMYC2608,含有該質粒的重組大腸桿菌菌株被命名為MR957。實施例4-MB438 MIS和WAR基因的測序對PCR擴增的DNA片段測定MB438mis基因的部分DNA序列。用MIS引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)對MB438和MB439的總細胞基因組DNA進行PCR。MB438產生一條大約1kbp的DNA片段,隨後如廠商(Invitrogen,San Diego,CA)所述將其克隆到PCRDNATA克隆質粒載體pCR2.1中。從MB438PCR的重組克隆中分離質粒,用質粒載體引物T3和T7經PCR檢測約1kbp插入片段的存在與否。如廠商所述用QIAGEN(Santa Clarita,CA)miniprep試劑盒分離含有該插入片段的質粒,用作測序模板。用PE Applied Biosystems的染料終止循環測序快速反應試劑盒進行測序反應。在ABI PRISM377自動測序儀上進行測序反應。用PE ABI的ABI PRISM377收集、製作、自動組接軟體收集、編輯、組接序列數據。MB438mis型基因的部分核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
通過組接pMYC2608的隨機限制片段的序列數據並通過引物步移pMYC2608中的DNA插入片段確定MB438MIS和WAR基因的完整序列。通過用多接頭限制酶NotⅠ和ApaⅠ從載體上酶切分離質粒pMYC2608的插入DNA,經0.7%瓊脂糖凝膠分級分離,並用QiaexⅡ試劑盒(Qiagen Inc.;Valencia,CA)從瓊脂糖凝膠中純化。然後用限制酶AluⅠ、MseⅠ和RsaⅠ消化凝膠純化的插入DNA,經1%瓊脂糖凝膠分級分離。從凝膠上切下0.5-1.5kb的DNA片段,用QiaexⅡ試劑盒純化。回收的片段與EcoRⅤ消化的pBluescriptⅡ連接,並轉化XL10Gold細胞。從隨機選擇的轉化子中製備miniprep DNA,用NotⅠ和ApaⅠ消化以證實插入片段並用於測序。用dRhodamine測序試劑盒(ABI Prism/Perkein Elmer Applied Biosystems)進行測序反應。按照手冊(ABI Prism)在測序凝膠上電泳序列,用製作與自動組接程序(ABI Prism)分析。MB438mis基因的完整核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示;推斷的MB438MIS肽序列如SEQ ID NO.7所示。MB438war基因的完整核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;推斷的MB438WAR肽序列如SEQ ID NO.9所示。
由PCR擴增的DNA片段測定MB439mis基因的部分DNA序列。使用引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4對MB439的總細胞基因組DNA進行PCR。獲得約1kbp的DNA片段,隨後如廠商(Invitrogen,San Diego,CA)所述將其克隆到PCR DNA TA克隆質粒載體pCR-TOPO中。從MB439PCR的重組克隆中分離質粒,用質粒載體引物T3和T7經PCR確定約1kbp的插入片段的存在與否。然後如廠商所述用QIAGEN(Santa Clarita,CA)miniprep試劑盒分離含有該插入片段的質粒用作測序模板。應用PE Applied Biosystems的染料終止循環測序快速反應試劑盒進行測序反應。在ABI PRISM377自動測序儀上進行測序反應。用PE ABI的ABI PRISM377收集、製作、自動組接軟體收集、編輯、組接序列數據。MB439mis型基因的部分核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。實施例5-亞克隆MB438MIS和WAR毒素以在蘇雲金芽孢桿菌中表達通過將克隆的pMYC2608的基因組DNA片段亞克隆到能在大腸桿菌和蘇雲金芽孢桿菌宿主中複製的高拷貝數穿梭載體中,實現MB438MIS和WAR毒素在蘇雲金芽孢桿菌中的表達。穿梭載體pMYC2614是pHT370(O.Arantes和D.Lereclus,1991,基因108:115-119)的一種修飾形式,其含有pBluescriptⅡ(Stratagene)的多克隆位點區。用NotⅠ和ApaⅠ限制酶從pMYC2608上切下含有war和mis基因的基因組DNA插入片段,凝膠純化,連接於pMYC2614的NotⅠ和ApaⅠ位點。產生的蘇雲金芽孢桿菌穿梭質粒被命名為pMYC2609。
為了檢測蘇雲金芽孢桿菌中MB438毒素基因的表達,經電穿孔用pMYC2609轉化不結晶的(Cry-)蘇雲金芽孢桿菌宿主CryB(A.Aronson,Purdue University,West Lafayette,IN)。將該重組菌株命名為MR557。通過用針對PS177C8 WAR毒素的抗體免疫印跡,證明WAR毒素的表達。如以下實施例8所述對西方玉米根蟲測定MR557的培養上清液和細胞沉澱製品。實施例6-MB438和MB439的西方玉米根蟲生物測定以215μl/1.36cm2的速度將如實施例1所述製備的上清液樣品施加於人造食物中。然後用新生的西方玉米根蟲感染這些製品,並在暗處於25℃下保持4天。除非另外指明,否則在感染後第4天測定樣品的死亡率。
表3涉及MB438和MB439的時程。MB438和MB439顯示在22-30小時(MB438)和24-39小時(MB439)左右出現活性。所有菌株都在TBG培養基上生長。未加熱處理這些樣品中的任一個。
表3
表4報告的結果表明,加熱消除了24小時和48小時培養的MB438和MB439的新鮮、未加熱樣品所表現的大部分或全部活性。
表4
表5報告的結果表明,MB438和MB439的活性是劑量反應性的。所有菌株都在TBG培養基上生長。未加熱處理這些樣品中的任一個。所有樣品均為24小時培養物。
表5
實施例7-分級分離的樣品的西方玉米根蟲生物測定對於透析的樣品,將培養上清液等份轉移至纖維素透析管中,並在4℃攪拌過夜下對25mM NaPO4、1mM EDTA,pH7透析。這可除去小於透析膜標稱分子量界值的上清液的任何自由流動成分。孔大小為6-8kD和50kD,對這些樣品檢查保留於透析膜內的成分的活性,其可稱為高分子量」。
在4℃下以氮氣壓通過1、3或10kD孔大小的膜進行超濾(「UF」),產生低分子量級分。該方法產生含有小於超濾膜標稱分子量界值的上清液成分的溶液。這些溶液被稱為透過物」。
表6報告的結果表明,MB438和MB439的低於10kD的成分顯示活性。所有樣品都在TBG培養基上生長。未加熱處理任一種樣品。所有樣品均為24小時培養物。
表6
表7報告的結果表明,MB438和MB439的<10kD成分顯示可被高熱降低的活性,而透析後低分子量成分的去除不能降低活性。所有樣品均為在TBG培養基上生長的24小時培養物。
表7
表8報告的結果表明,MB438和MB439在不能通過1kD超濾膜的低於10kD的成分中具有活性。所有樣品均為在TBG培養基上生長的24小時培養物。
表8
實施例8-MR957和MR557的生物活性MR957培養物在16×150mm帶蓋塑料管中的5.0ml培養基(DifcoTB預混合物;4g/升甘油)中生長。培養物於37℃下在滾筒上搖動24小時。離心沉澱細胞,傾析出上清液並保存。加入EDTA至1mM,樣品貯存於20℃。為進行細胞密度的測定,振蕩樣品,並將100μl每種培養液轉移到Falcon管(14mL;17×100mm)中。向每一管中加入4.9mL蒸餾水進行1∶50稀釋,並再次振蕩。用分光光度計在600nm下進行OD讀取。如實施例1所述培養重組蘇雲金芽孢桿菌菌株。
用基本同實施例6所述的實驗設計對大腸桿菌克隆MR957和蘇雲金芽孢桿菌克隆MR557(每種均含有MB438mis和war基因)進行西方玉米根蟲生物測定。MR948和MR539是含有無毒素基因插入片段的克隆載體的陰性對照菌株。為測定大腸桿菌菌株,以215μl/1.36cm2的劑量將上清液或整個培養樣品加於食物表面,而細胞沉澱樣品濃縮5倍,並以50ul/1.36cm2的劑量加於食物表面(表9)。為測定蘇雲金芽孢桿菌菌株,以215μl/1.36cm2的劑量將上清液樣品加於食物表面,而細胞沉澱樣品濃縮5倍,並以不同的速度加於食物上(表10)。待樣品蒸發後立即向食物上轉移約6-8個幼蟲。使用釘板熨鬥用聚酯薄膜密封生物測定平板,並在每個孔上打一針眼以利於氣體交換。包埋4天後測定死亡率。
這兩個實驗的結果證明了可歸因於克隆的MB438mis和war基因的較高CRW死亡率。表9顯示了大腸桿菌培養物粗製品中克隆的MB438毒素對西方玉米根蟲的定性活性。
表9
表10顯示蘇雲金芽孢桿菌培養物粗製品中克隆的MB438毒素對西方玉米根蟲的劑量依賴的活性。在表9和表10中,下劃線的數字是百分死亡率;括號中的數字是指試驗中死亡的幼蟲除以總幼蟲數。
表10
實施例9-毒素基因向植物中的插入本發明的一個方面是用編碼本發明的殺蟲毒素的基因對植物的轉化。被轉化的植物可耐受靶害蟲的侵害。
能用本領域中眾所周知的多種技術將如此處公開的編碼殺蟲毒素的基因插入植物細胞中。這些技術包括用根瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或毛根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為轉化體用T-DNA轉化、融合、注射、biolistic(微粒轟擊)或電穿孔及其它可能的方法。
如果用農桿菌轉化,則必須將欲插入的DNA克隆到特定質粒中,即中間載體或二元載體中。通過與T-DNA序列同源的序列的同源重組,能將中間載體整合到Ti或Ri質粒中。Ti或Ri質粒也含有T-DNA轉移所需的vir區。中間載體本身不能在農桿菌中複製。利用輔助質粒(接合)能將中間載體轉移到根瘤農桿菌中。二元載體本身能在大腸桿菌和農桿菌中複製。它們含有處於左右T-DNA邊界區之間的一種選擇性標記基因和一種接頭或多接頭。它們可被直接轉化到農桿菌中(Holsters等人分子與普通遺傳學163:181-187)。用作宿主細胞的農桿菌應含有一種攜帶vir區的質粒。vir區是向植物細胞中轉移T-DNA所必需的。也可含有其它T-DNA。這樣轉化的農桿菌用於植物細胞的轉化。為了向植物細胞中轉移DNA,能方便地將植物外植體與根瘤農桿菌或毛根農桿菌一起培養。然後在可含有用於篩選的抗生素或殺生物劑的適當培養基中,由被感染的植物材料(例如葉切片、莖切片、根,以及原生質體,或懸浮培養細胞)再生為完整的植物。然後可檢測這樣得到的植物是否存在插入的DNA。
在注射和電穿孔中對質粒沒有特殊要求。能使用普通質粒,如pUC衍生物。在biolistie轉化中,能使用質粒DNA或線性DNA。
含有大腸桿菌複製系統和允許篩選轉化細胞的標記的多種克隆載體可用於準備向高等植物中插入外源基因。這些載體包括,例如,pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此,能將編碼芽孢桿菌毒素的序列插入載體的適當限制酶切位點處。用產生的質粒轉化大腸桿菌。大腸桿菌細胞在適當的營養培養基中培養,然後收穫並裂解。回收該質粒。通常採用序列分析、限制酶切分析、電泳和其它生物化學-分子生物學方法作為分析方法。每一操作後,能酶切使用的DNA序列,並與下一個DNA序列連接。每種質粒序列都能被克隆到同一或其它質粒中。根據向植物細胞中插入希望的基因的方法,其它DNA序列可能是必需的。例如,如果用Ti或Ri質粒轉化植物細胞,則Ti或Ri質粒T-DNA的至少右邊界,但通常是左右邊界必須作為欲插入基因的側翼區連接。
T-DNA在植物細胞轉化中的應用已進行了大量研究,描述於EP120 516;Hoekema(1985),《二元植物載體系統》OffsetdrukkerijKanters B.V.,Alblasserdam,第5章;Fraley等人,植物科學評述(Crit.Rev.Plant Sci.)4:1-46;和An等人(1985)EMBO J.4:277-287。
插入的DNA整合到基因組中後,相對穩定於此,並且通常不再移出。其通常含有一種選擇性標記,該選擇性標記賦予被轉化的植物細胞對殺生物劑或抗生素尤其如卡那黴素、G418、博來黴素、潮黴素或膦絲菌素的抗性。因此單個使用的標記應使得能篩選出除不含插入DNA的細胞之外的轉化細胞。
轉化細胞以常規方式再生為形態學正常的植物。如果轉化事件涉及種系細胞,則插入的DNA和相應的表型性狀將遺傳給子代植物。這些植物能以正常的方式生長,並與具有相同轉化遺傳因子或其它遺傳因子的植物雜交。產生的雜種個體具有相應的表型特性。
在本發明的一個優選實施方案中,能用已為植物優化了密碼子選擇的基因轉化植物。參見,例如,美國專利號5,380,831。
應當理解,此處所述的實施例和實施方案只是用於說明目的,可為本領域技術人員建議根據它們的多種修改或改變,其包括於本說明書和以下權利要求書的精神和範圍之內。
序列表110申請人姓名MYCOGEN公司街道地址5501Oberlin Drive城市San Diego州/省加利福尼亞國家美國郵政編碼92121電話(800)745-7475傳真(619)453-0142120來自側孢芽孢桿菌的殺蟲毒素和基因130MA-719XC214014115060/095,9551511998-08-1015060/138,2511511999-06-0816010170PatentIn Ver.2.021012112645212DNA212側孢芽孢桿菌4001atgaagaaga agttagcaag tgttgtaacg tgtacgttat tagctcctat gtttttgaat 60ggaaatgtga atgctgttta cgcagacagc aaaacaaatc aaatttctac aacacagaaa 120aatcaacaga aagagatgga ccgaaaagga ttacttgggt attatttcaa aggaaaagat 180tttagtaatc ttactatgtt tgcaccgaca cgtgatagta ctcttattta tgatcaacaa 240acagcaaata aactattaga taaaaaacaa caagaatatc agtctattcg ttggattggt 300ttgattcaga gtaaagaaac gggagatttc acatttaact tatctgagga tgaacaggca 360attatagaaa tcaatgggaa aattatttct aataaaggga aagaaaagca agttgtccat 420ttagaaaaag gaaaattagt tccaatcaaa atagagtatc aatcagatac aaaatttaat 480attgacagta aaacatttaa agaacttaaa ttatttaaaa tagatagtca aaaccaaccc 540cagcaagtcc agcaagatga actgagaaat cctgaattta acaagaaaga atcacaggaa 600ttcttagcga aaccatcgaa aataaatctt ttcactcaaa aaatgaaaag ggaaattgat 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1.編碼一種毒素的分離的多核苷酸,其中該野生型毒素由選自MB438和MB439的側孢芽孢桿菌菌株產生。
2.權利要求1的多核苷酸,其中所述毒素是熱不穩定的。
3.權利要求1的多核苷酸,其中所述毒素能從所述側孢芽孢桿菌菌株的培養上清液中獲得。
4.權利要求1的多核苷酸,其中所述毒素的分子量為約1kDa~約10kDa。
5.權利要求1的多核苷酸,其中所述毒素與第二種蛋白質一起對玉米根蟲有毒,其中第二種蛋白質由選自MB438和MB439的側孢芽孢桿菌菌株產生。
6.權利要求1的多核苷酸,其中所述毒素是一種MIS毒素。
7.權利要求1的多核苷酸,其中所述毒素是一種WAR毒素。
8.權利要求1的多核苷酸,其中所述菌株是MB438。
9.權利要求1的多核苷酸,其中所述菌株是MB439。
10.權利要求1的多核苷酸,其編碼一種選自SEQ ID NO:7、SEQID NO:9、SEQ ID NO:7的殺虫部分和SEQ ID NO:9的殺虫部分的胺基酸序列。
11.權利要求1的多核苷酸,其中所述毒素包含SEQ ID NO:7的胺基酸序列或其活性部分。
12.權利要求1的多核苷酸,其中所述毒素包含SEQ ID NO:7的胺基酸序列。
13.權利要求1的多核苷酸,其中所述毒素包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列或其活性部分。
14.權利要求1的多核苷酸,其中所述毒素包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列。
15.權利要求1的多核苷酸,其中用SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4的引物經聚合酶鏈反應擴增該多核苷酸的一部分。
16.權利要求1的多核苷酸,其中編碼所述毒素的核苷酸序列,或該核苷酸序列的互補序列,在嚴格條件下可與第二種核苷酸序列雜交,此第二種核苷酸序列選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、足以編碼一種殺蟲活性蛋白質的SEQ ID NO:6的一部分和足以編碼一種殺蟲活性蛋白質的SEQ ID NO:8的一部分。
17.權利要求16的多核苷酸,其中所述第二種核苷酸序列是SEQID NO:1。
18.權利要求16的多核苷酸,其中所述第二種核苷酸序列是SEQID NO:2。
19.權利要求16的多核苷酸,其中所述第二種核苷酸序列是SEQID NO:5。
20.權利要求16的多核苷酸,其中所述第二種核苷酸序列是SEQID NO:6。
21.權利要求16的多核苷酸,其中所述第二種核苷酸序列是SEQID NO:8。
22.權利要求16的多核苷酸,其中所述第二種核苷酸序列是SEQID NO:10。
23.權利要求16的多核苷酸,其中所述第二種核苷酸序列包含足以編碼一種殺蟲活性蛋白質的SEQ ID NO:6的一部分。
24.權利要求16的多核苷酸,其中所述第二種核苷酸序列包含足以編碼一種殺蟲活性蛋白質的SEQ ID NO:8的一部分。
25.權利要求16的多核苷酸,其中該多核苷酸包含一種序列,該序列選自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、足以編碼一種殺蟲活性蛋白質的SEQ ID NO:6的一部分和足以編碼一種殺蟲活性蛋白質的SEQ ID NO:8的一部分。
26.權利要求16的多核苷酸,其中該多核苷酸序列包含SEQ IDNO:5的序列。
27.權利要求16的多核苷酸,其中該多核苷酸序列包含SEQ IDNO:6的序列。
28.權利要求16的多核苷酸,其中該多核苷酸序列包含SEQ IDNO:8的序列。
29.權利要求16的多核苷酸,其中該多核苷酸序列包含SEQ IDNO:10的序列。
30.權利要求16的多核苷酸,其中該多核苷酸序列包含足以編碼一種殺蟲活性蛋白質的SEQ ID NO:6的一部分。
31.權利要求16的多核苷酸,其中該多核苷酸序列包含足以編碼一種殺蟲活性蛋白質的SEQ ID NO:8的一部分。
32.一種分離的毒素,其中該野生型毒素由選自MB438和MB439的側孢芽孢桿菌菌株產生。
33.權利要求32的毒素,其中該毒素是熱不穩定的。
34.權利要求32的毒素,其中該毒素能從所述側孢芽孢桿菌菌株的培養上清液中獲得。
35.權利要求32的毒素,其中該毒素的分子量為約1kDa~約10kDa。
36.權利要求32的毒素,它與第二種蛋白質一起對玉米根蟲有毒,其中該第二種蛋白質由選自MB438和MB439的側孢芽孢桿菌菌株產生。
37.權利要求32的毒素,其中該毒素是一種MIS毒素。
38.權利要求32的毒素,其中該毒素是一種WAR毒素。
39.權利要求32的毒素,其中所述菌株是MB438。
40.權利要求32的毒素,其中所述菌株是MB439。
41.權利要求32的毒素,其中該毒素包含SEQ ID NO:7的胺基酸序列或其活性部分。
42.權利要求32的毒素,其中該毒素包含SEQ ID NO:7的胺基酸序列。
43.權利要求32的毒素,其中該毒素包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。
44.權利要求32的毒素,其中該毒素包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。
45.權利要求32的毒素,其中該毒素包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列或其活性部分。
46.權利要求32的毒素,其中該毒素包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列。
47.一種重組宿主,其包含編碼一種毒素的多核苷酸,其中該野生型毒素由選自MB438和MB439的側孢芽孢桿菌菌株產生。
48.權利要求47的宿主,其中該宿主是一種細菌細胞。
49.權利要求47的宿主,其中該宿主是一種植物細胞。
50.權利要求47的宿主,其中該宿主是一種植物。
51.權利要求47的宿主,其中該宿主是一種玉米細胞。
52.權利要求47的宿主,其中該宿主是一種玉米植物。
53.一種防治非哺乳動物害蟲的方法,其中該方法包括使該害蟲接觸一種分離的毒素,其中該野生型毒素由選自MB438和MB439的側孢芽孢桿菌菌株產生。
54.權利要求53的方法,其中所述害蟲是一種鞘翅目昆蟲。
55.權利要求53的方法,其中所述害蟲是一種玉米根蟲。
56.權利要求53的方法,其中該方法還包括使所述害蟲接觸由選自MB438和MB439的側孢芽孢桿菌菌株產生的第二種蛋白質。
57.選自MB438和MB439的側孢芽孢桿菌菌株的生物純培養物。
58.權利要求36的培養物,其中所述菌株是MB438。
59.權利要求36的培養物,其中所述菌株是MB439。
全文摘要
公開了可從此處公開的側孢芽孢桿菌(Bacilluslaterosporus)分離株中獲得的新型毒素和基因,並申請專利。在優選的實施方案中,此基因及毒素用於防治西方玉米根蟲。
文檔編號C12N15/31GK1319138SQ99810679
公開日2001年10月24日 申請日期1999年8月10日 優先權日1998年8月10日
發明者H·E·施奈佩, K·E·納瓦, B·A·斯託克霍夫, S·芬斯塔得李, M·沃爾茲, B·斯特吉斯 申請人:麥考根公司