4碳醇的發酵生產的製作方法

2023-12-04 03:20:16 3

專利名稱：4碳醇的發酵生產的製作方法
與相關申請的交叉參考
本申請根據35 U.S.C.§119要求於2005年9月29日提交的美國臨時申請系列號60/721677，和2006年6月16日提交的美國臨時申請系列號60/814470的優先權。
發明領域 本發明涉及工業微生物學和醇生產領域。更具體而言，1-丁醇經由重組微生物的工業發酵來生產。

背景技術：
丁醇是重要的工業化學藥品，用作燃料添加劑、塑料工業中的原料化學藥品、以及食物和調味劑工業中的食物級提取劑。每年有100-120億磅丁醇通過石油化學方法進行生產，並且關於這種日用化學藥品的需要將很可能增加。
用於化學合成1-丁醇的方法是已知的，例如Oxo Process、ReppeProcess、和巴豆醛氫化(Ullmann＇s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第6版，2003，Wiley-VCHVerlag GmbH and Co.，Weinheim，德國，第5卷，第716-719頁)。這些方法使用來源於石油化學的原材料並且一般是昂貴且不是環境友好的。來自植物衍生原材料的1-丁醇生產將使溫室氣體排放減到最小且將代表本領域的進展。
用於通過其他有機化學藥品的生物轉化生產1-丁醇的方法也是已知的。例如，Muramoto等人(JP63017695)描述了使用假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株用於從醛生產醇包括丁醇的方法。此外，Kuehnle等人(EP 1149918)描述了通過各種赤紅球菌(Rhodococcus ruber)菌株氧化烴來製備1-丁醇和2-丁醇的方法。
通過發酵生產丁醇的方法也是已知的，其中最普遍的方法生產丙酮、1-丁醇和乙醇的混合物，且被稱為ABE方法(Blaschek等人，美國專利號6,358,717)。通過丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)發酵是認識最久的已知工業發酵之一，並且負責生產這些溶劑的途徑和基因已得到報導((Girbal等人，Trends inBiotechnology 1611-16(1998))。然而，實際發酵仍是相當複雜且難以控制的。自20世紀50年代以後ABE發酵已不斷下降，且現在幾乎所有丁醇都經由如上所述的石油化學途徑生產。在一般的ABE發酵中，丁酸、丙酸、乳酸和乙酸首先通過丙酮丁醇梭菌生產，培養物pH降低且經歷代謝「蝶形(butterfly)」移動，隨後形成1-丁醇、丙酮、異丙醇和乙醇。在常規ABE發酵中，來自葡萄糖的1-丁醇產量低，一般為約15％且很少超過25％。因此，在常規ABE發酵中的1-丁醇濃度通常低於1.3％。
通過消除所有其他溶劑副產品使來自ABE方法的1-丁醇生產達到最大的嘗試尚未完全成功，且因此該方法產生相當大量不能用作汽油添加劑的丙酮。用於發酵生產丁醇的其中1-丁醇是唯一產物的方法將代表本領域的進展。
因此需要用於生產1-丁醇作為單一產物、環境負責、有成本效益的方法。本發明通過發現表達1-丁醇生物合成途徑的重組微生物生產宿主解決了這個需要。
發明概述 本發明提供了具有工程改造的1-丁醇生物合成途徑的重組微生物。工程改造的微生物可以用於1-丁醇的商業生產。因此本發明提供了包含編碼多肽的至少一種DNA分子的重組微生物宿主細胞，所述多肽催化選自下述的底物至產物轉化 a)乙醯輔酶A至乙醯乙醯輔酶A b)乙醯乙醯輔酶A至3-羥丁醯輔酶A c)3-羥丁醯輔酶A至巴豆醯輔酶A d)巴豆醯輔酶A至丁醯輔酶A e)丁醯輔酶A至丁醛和 f)丁醛至1-丁醇； 其中所述至少一種DNA分子對於所述微生物宿主細胞是異源的且其中所述微生物宿主細胞生產1-丁醇。
在另一個實施方案中，本發明提供了用於生產1-丁醇的方法，所述方法包括 i)提供包含編碼多肽的至少一種DNA分子的重組微生物宿主細胞，所述多肽催化選自下述的底物至產物轉化 a)乙醯輔酶A至乙醯乙醯輔酶A b)乙醯乙醯輔酶A至3-羥丁醯輔酶A c)3-羥丁醯輔酶A至巴豆醯輔酶A d)巴豆醯輔酶A至丁醯輔酶A e)丁醯輔酶A至丁醛和 f)丁醛至1-丁醇； 其中所述至少一種DNA分子對於所述微生物宿主細胞是異源的；和 ii)使(i)的所述宿主細胞在由此生產1-丁醇的條件下與可發酵的碳底物接觸。
附圖簡述和序列描述 根據形成本申請部分的下述詳細描述、附圖和伴隨的序列描述可以更充分地理解本發明。


圖1顯示了1-丁醇生物合成途徑。標記為「a」、「b」、「c」、「d」、「e」和「f」的步驟表示下文描述的底物至產物轉化。
下述序列符合37 C.F.R.1.821-1.825(＂Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules＂)，並且符合世界智慧財產權組織(WIPO)標準ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(管理條令(Administrative Instructions)的規則5.2和49.5(a-bis)，以及部分(section)208和附錄C)。對於核苷酸和胺基酸序列使用的符號和格式遵守37 C.F.R.§1.822中所述規則。
表1 基因和蛋白質SEQ ID NO.概括 SEQ ID NOs17-44是用於擴增1-丁醇生物合成途徑基因的寡核苷酸引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs45-72是用於測序的寡核苷酸引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs73-75是用於構建實施例9中所述轉化載體的寡核苷酸引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO76是在本文中稱為CaTER的密碼子最優化的CAC0462基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO77是在本文中稱為EgTER(opt)的密碼子最優化的EgTER基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO78是在本文中稱為ald(opt)的密碼子最優化的ald基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO79是質粒pFP988的核苷酸序列。
SEQ ID NO＇s 80-127、160-185、和190-207是用於克隆、測序或篩選本文所述的1-丁醇生物合成途徑基因的克隆、測序或PCR篩選引物的核酸序列，且在表4和5中更充分地描述。
SEQ ID NO156是cscBKA基因簇的核苷酸序列。
SEQ ID NO157是蔗糖水解酶(CscA)的胺基酸序列。
SEQ ID NO158是D-果糖激酶(CscK)的胺基酸序列。
SEQ ID NO159是蔗糖透性酶(CscB)的胺基酸序列。
SEQ ID NO186是實施例17中所述的密碼子最優化的tery基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO187是由密碼子最優化的tery基因(SEQ ID NO186)編碼的丁醯輔酶A脫氫酶(ter)的胺基酸序列。
SEQ ID NO188是實施例17中所述的密碼子最優化的aldy基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO189是由密碼子最優化的aldy基因(SEQ ID NO188)編碼的丁醯脫氫酶(ald)的胺基酸序列。
SEQ ID NO208是實施例14中使用的模板DNA的核苷酸序列。
發明詳述 本發明涉及使用重組微生物生產1-丁醇的方法。本發明滿足了許多商業和工業需要。丁醇是具有多種應用的重要工業日用化學藥品，其中它作為燃料或燃料添加劑的潛力特別重要。儘管只是4碳醇，但丁醇具有的能含量類似於汽油的那種，且可以與任何化石燃料摻合。丁醇作為燃料或燃料添加劑是有利的，因為當在標準內燃機中燃燒時，它只產生CO2，且產生很少或沒有SOx或NOx。此外丁醇的腐蝕性少於迄今為止最優選的燃料添加劑乙醇。
除了其作為生物燃料或燃料添加劑的效用，丁醇具有影響新興的燃料電池工業中的氫分布問題的潛力。燃料電池現今受到與氫運輸和分布有關的安全關心的困擾。丁醇可以容易地對於其氫含量進行改造，且可以通過現有加油站以燃料電池或車輛所需的純度進行分配。
最後本發明從植物衍生的碳源生產丁醇，從而避免了與用於丁醇生產的標準石油化學方法相關的負面環境影響。
下述定義和縮寫用於解釋權利要求和說明書。
如本文使用的，術語「發明」或「本發明」是非限制性術語，且不預期指本發明的任何單個實施方案，而是包含如說明書和權利要求中所述的所有可能實施方案。
「ABE」是關於丙酮-丁醇-乙醇發酵方法的縮寫。
術語「1-丁醇生物合成途徑」意指從乙醯輔酶A(乙醯CoA)生產1-丁醇的酶途徑。
術語「乙醯輔酶A乙醯轉移酶」指催化2個乙醯輔酶A分子轉化成乙醯乙醯輔酶A和輔酶A(CoA)的酶。優選的乙醯輔酶A乙醯轉移酶是對短鏈醯基輔酶A和乙醯輔酶A具有底物優先的乙醯輔酶A乙醯轉移酶(在正向中的反應)，且分類為E.C.2.3.1.9[EnzymeNomenclature 1992，Academic Press，San Diego]；儘管，具有更廣泛底物範圍的酶(E.C.2.3.1.16)也將起作用。乙醯輔酶A乙醯轉移酶可從許多來源獲得，例如大腸桿菌(GenBank NosNP_416728(SEQ IDNO129)，NC_000913(SEQ ID NO128)；NCBI(國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information))胺基酸序列，NCBI核苷酸序列)，丙酮丁醇梭菌(GenBank NosNP_349476.1(SEQ ID NO2)，NC_003030(SEQ ID NO1)；NP_149242(SEQID NO4)，NC_001988(SEQ ID NO3)，枯草芽孢桿菌(GenBankNosNP_390297(SEQ ID NO131)，NC_000964(SEQ ID NO130))，和啤酒糖酵母(GenBank NosNP_015297(SEQ ID NO133)，NC_001148(SEQ ID NO132))。
術語「3-羥丁醯輔酶A脫氫酶」指催化乙醯乙醯輔酶A轉化成3-羥丁醯輔酶A的酶。3-羥丁醯輔酶A脫氫酶可以是還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依賴性的，對(S)-3-羥丁醯輔酶A或(R)-3-羥丁醯輔酶A具有底物優先，且分別分類為E.C.1.1.1.35和E.C.1.1.1.30。此外，3-羥丁醯輔酶A脫氫酶可以是還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)依賴性的，對(S)-3-羥丁醯輔酶A或(R)-3-羥丁醯輔酶A具有底物優先，且分別分類為E.C.1.1.1.157和E.C.1.1.1.36。3-羥丁醯輔酶A脫氫酶可從許多來源獲得，例如，丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_349314(SEQ ID NO6)，NC_003030(SEQID NO5))，枯草芽孢桿菌(GenBank NOsAAB09614(SEQ ID NO135)，U29084(SEQ ID NO134))，富養羅爾斯通氏菌(GenBankNOsYP_294481(SEQ ID NO137)，NC_007347(SEQ ID NO136))，和真養產鹼菌(GenBank NOsAAA21973(SEQ ID NO139)，J04987(SEQ ID NO138))。
術語「巴豆酸酶」指催化3-羥丁醯輔酶A轉化成巴豆醯輔酶A和H2O的酶。巴豆酸酶可以對(S)-3-羥丁醯輔酶A或(R)-3-羥丁醯輔酶A具有底物優先，且分別分類為E.C.4.2.1.17和E.C.4.2.1.55。巴豆酸酶可從許多來源獲得，例如大腸桿菌(GenBank NOsNP_415911(SEQ ID NO141)，NC_000913(SEQ ID NO140))，丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_349318(SEQ ID NO8)，NC_003030(SEQID NO6))，枯草芽孢桿菌(GenBank NOsCAB13705(SEQ ID NO143)，Z99113(SEQ ID NO142))，和豚鼠氣單胞菌(GenBank NOsBAA21816(SEQ ID NO145)，D88825(SEQ ID NO144))。
術語「丁醯輔酶A脫氫酶」指催化巴豆醯輔酶A轉化成丁醯輔酶A的酶。丁醯輔酶A脫氫酶可以是NADH依賴性或NADPH依賴性的，且分別分類為E.C.1.3.1.44和E.C.1.3.1.38。丁醯輔酶A脫氫酶可從許多來源獲得，例如，丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_347102(SEQID NO10)，NC_003030(SEQ ID NO9)))，小眼蟲(GenBankNOsQ5EU90SEQ ID NO147)，AY741582SEQ ID NO146))，丘鏈黴菌(GenBank NOsAAA92890(SEQ ID NO149)，U37135(SEQ ID NO148))，和天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)(GenBank NOsCAA22721(SEQ ID NO151)，AL939127(SEQ IDNO150))。
術語「丁醛脫氫酶」指使用NADH或NADPH作為輔因子，催化丁醯輔酶A轉化成丁醛的酶。對於NADH具有優先的丁醛脫氫酶被稱為E.C.1.2.1.57，且可從下述來源獲得例如，拜氏梭菌(GenBank NOsAAD31841(SEQ ID NO12)，AF157306(SEQ ID NO11))和丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_149325(SEQ ID NO153)，NC_001988(SEQ ID NO152))。
術語「丁醇脫氫酶」指使用NADH或NADPH作為輔因子，催化丁醛轉化成1-丁醇的酶。丁醇脫氫酶可從下述來源獲得例如，丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_149325(SEQ ID NO153)，NC_001988SEQ ID NO152；注這種酶具有醛和醇脫氫酶活性)；NP_349891(SEQ ID NO14)，NC_003030(SEQ ID NO13)；和NP_349892(SEQ ID NO16)，NC_003030(SEQ ID NO15))和大腸桿菌(GenBankNOsNP_417484(SEQ ID NO155)，NC_000913(SEQ ID NO154))。
術語「兼性厭氧菌」指在需氧和厭氧環境中都能夠生長的微生物。
術語「碳底物」或「可發酵的碳底物」指能夠由本發明的宿主生物代謝的碳源，且特別是選自單糖、寡糖、多糖和一碳底物或其混合物的碳源。
術語「基因」指能夠表達為特定蛋白質的核酸片段，任選包括在編碼序列前(5＇非編碼序列)和後(3＇非編碼序列)的調節序列。「天然基因」指如在自然界中與其自身調節序列一起發現的基因。「嵌合基因」指不是天然基因的任何基因，包含在自然界中未在一起發現的調節和編碼序列。因此，嵌合基因可以包含來源於不同來源的調節序列和編碼序列，或調節序列和編碼序列來源於相同來源，但排列方式不同於自然界中發現的那種。「內源基因」指在生物基因組中其天然位置中的天然基因。「外來」或「異源基因」指在宿主生物中通常未發現，但通過基因轉移引入宿主生物內的基因。外來基因可以包含插入非天然生物內的天然基因，或嵌合基因。「轉基因」是已通過轉化程序引入基因組內的基因。
如本文使用的，術語「編碼序列」指編碼特定胺基酸序列的DNA序列。「合適的調節序列」指位於編碼序列上遊(5＇非編碼序列)、之內或下遊(3＇非編碼序列)，且影響轉錄、RNA加工或穩定性、或相關編碼序列翻譯的核苷酸序列。調節序列可以包括啟動子、翻譯前導序列、內含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應物結合位點和莖環結構。
術語「啟動子」指能夠控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。一般而言，編碼序列位於啟動子序列的3＇。啟動子可以整體來源於天然基因，或由來源於自然界中發現的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包含包含合成的DNA區段。本領域技術人員理解，不同啟動子可以指導基因在不同組織或細胞類型中，或在不同發育階段，或響應不同環境或生理條件表達。引起基因在大多數細胞類型中在大多數時間表達的啟動子通常被稱為「組成型啟動子」。進一步認識到因為在大多數情況下調節序列的確切邊界尚未完全限定，所以不同長度的DNA片段可以具有相同的啟動子活性。
術語「可操作地連接的」指單個核酸片段上的核酸序列的結合，從而使得一種的功能受另一種的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列表達時(即，編碼序列在啟動子的轉錄控制下)，它與那種編碼序列可操作地連接。編碼序列可以與調節序列在有義或反義方向上可操作地連接。
如本文使用的，術語「表達」指來源於本發明核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉錄和穩定累積。表達可以指mRNA翻譯成多肽。
如本文使用的，術語「轉化」指核酸片段轉移到宿主生物內，從而導致遺傳學穩定的遺傳。包含轉化的核酸片段的宿主生物被稱為「轉基因」或「重組」或「轉化」生物。
術語「質粒」、「載體」和「盒」指通常攜帶並非細胞中央代謝部分的基因的染色體外元件，且通常為環狀雙鏈DNA片段的形式。此類元件可以是來源於任何來源的自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，線性或環狀單或雙鏈DNA或RNA，其中許多核苷酸序列已連接或重組到獨特構建體內，所述獨特構建體能夠將關於所選基因產物的啟動子片段和DNA序列連同合適的3＇非翻譯序列引入細胞內。「轉化盒」指包含外來基因且具有除外來基因外的元件的特定載體，所述元件促進特定宿主細胞的轉化。「表達盒」指包含外來基因且具有除外來基因外的元件的特定載體，所述元件允許那種基因在外來宿主中增強的表達。
如本文使用的，術語「密碼子簡併」指允許核苷酸序列變異而不影響編碼的多肽的胺基酸序列遺傳密碼中的性質。技術人員將充分知道由特定宿主細胞在指定給定胺基酸的核苷酸密碼子選擇中顯示的「密碼子偏倚」。因此，當合成用於在宿主細胞中改善的表達的基因時，希望這樣設計基因，從而使得其密碼子選擇頻率接近宿主細胞的優選密碼子選擇頻率。
當術語「密碼子最優化的」指用於轉化各種宿主的基因或核酸分子編碼區時，它指基因或核酸分子編碼區中的密碼子改變，以反映宿主生物的一般密碼子選擇而不改變由DNA編碼的多肽。
本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域眾所周知的，且由下述參考文獻描述Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文＂Maniatis＂)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，由Greene Publishing Assoc.and Wiley-lnterscience出版(1987)。
1-丁醇生物合成途徑 利用碳水化合物的微生物使用Embden-Meyerhof-Parnas(EMP)途徑、Entner-Doudoroff途徑和戊糖磷酸循環作為中央代謝途徑，以提供能量和細胞前體用於生長和維持。這些途徑共有中間物甘油醛-3-磷酸，且最終直接或與EMP途徑組合形成丙酮酸鹽。隨後，丙酮酸鹽經由多種方法轉化成乙醯輔酶A(乙醯-CoA)，包括與丙酮酸脫氫酶複合體、丙酮酸-甲酸裂合酶、和丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶反應。乙醯輔酶A充當例如脂肪酸、胺基酸和次生代謝物產生中的關鍵中間物。糖轉化成乙醯輔酶A的組合反應產生能量(例如，腺苷-5＇-三磷酸，ATP)和還原當量(例如還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸NADH，和還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH)。NADH和NADPH必須再循環至其氧化形式(分別為NAD+和NADP+)。在無機電子受體(例如O2、NO3-和SO42-)的存在下，還原當量可以用於增加能量庫；可替代地，可以形成還原的碳副產品。起因於碳水化合物發酵的乙醇和1-丁醇產生是後者的例子。
通過提供如圖1中所示從乙醯輔酶A到1-丁醇的完整1-丁醇生物合成途徑，本發明使得能夠用重組微生物從碳水化合物來源生產1-丁醇。由於不存在基因或缺乏合適的基因調節，一般在微生物群落中缺乏的這種生物合成途徑，包括下述底物至產物的轉化 a)如例如由乙醯輔酶A乙醯轉移酶催化的，乙醯輔酶A至乙醯乙醯輔酶A； b)如例如通過3-羥丁醯輔酶A脫氫酶催化的，乙醯乙醯輔酶A至3-羥丁醯輔酶A； c)如例如通過巴豆酸酶催化的，3-羥丁醯輔酶A至巴豆醯輔酶A； d)如例如通過丁醯輔酶A脫氫酶催化的，巴豆醯輔酶A至丁醯輔酶A； e)如例如通過丁醛脫氫酶催化的，丁醯輔酶A至丁醛；和 f)如例如通過丁醇脫氫酶催化的，丁醛至1-丁醇。
該途徑不需要ATP且產生NAD+和/或NADP+，因此和產生乙醯輔酶A的中央代謝途徑平衡。天然生物通過發酵產生1-丁醇的能力是罕見的且最顯著地由拜氏梭菌和丙酮丁醇梭菌例示。關於丙酮丁醇梭菌的基因組織和基因調節已得到描述(L.Girbal和P.Soucaille，Trends inBiotechnology 21611-16(1998))。然而，這些酶活性中的許多還與可替代途徑相關，例如烴利用、脂肪酸氧化、和聚羥基鏈烷酸酯代謝。因此，在提供從乙醯輔酶A到1-丁醇的重組途徑中，存在實現個別反應步驟的許多選擇，且本領域技術人員將能夠利用公眾可用序列以構建相關途徑。本領域已知和1-丁醇生物合成途徑構建中有用的許多代表性基因列表在下文表2中列出。
表2 1-丁醇途徑基因來源 用於1-丁醇生產的微生物宿主 用於1-丁醇生產的微生物宿主可以選自細菌、藍細菌、絲狀真菌和酵母。用於1-丁醇生產的微生物宿主優選對1-丁醇是耐受的，從而使得得率不受丁醇毒性限制。在1-丁醇高效價水平上有代謝活性的微生物不是本領域眾所周知的。儘管丁醇耐受突變體已從產溶劑菌(solventogenic)梭菌(Clostridia)中分離，但關於其他潛在有用細菌菌株的丁醇耐受性的可用信息很少。關於細菌中的醇耐受性比較的大多數研究暗示丁醇比乙醇更有毒(de Cavalho等人，Microsc.Res.Tech.64215-22(2004)和Kabelitz等人，FEMS Microbiol.Lett.220223-227(2003))。Tomas等人(J.Bacteriol.1862006-2018(2004))報導了丙酮丁醇梭菌發酵期間的丁醇得率可能受丁醇毒性限制。丁醇對丙酮丁醇梭菌的主要作用是膜功能的破壞(Hermann等人，Appl.Environ.Microbiol.501238-1243(1985))。
選擇用於1-丁醇生產的微生物宿主優選對1-丁醇是耐受的，且能夠將碳水化合物轉化成1-丁醇。關於合適微生物宿主選擇的標準包括下述對1-丁醇的固有耐受性、高的葡萄糖利用率、用於基因操作的遺傳工具的有效性、和產生穩定染色體改變的能力。
對於1-丁醇具有耐受性的合適宿主菌株可以通過基於菌株的固有耐受性的篩選來鑑定。微生物對1-丁醇的固有耐受性可通過下述測量測定當在極限培養基中生長時負責50％生長速率抑制的1-丁醇濃度(IC50)。IC50值可以使用本領域已知的方法來測定。例如，目的微生物可以在各種量的1-丁醇的存在下生長，且通過測量600納米處的光密度來監控生長速率。倍增時間可以由生長曲線的對數部分來計算，且用作生長速率的測量。產生50％生長抑制的1-丁醇濃度可以從百分比生長抑制對1-丁醇濃度的圖來測定。優選地，宿主菌株對於1-丁醇應當具有大於約0.5％重量/體積的IC50。
用於1-丁醇生產的微生物宿主還應以高比率利用葡萄糖。大多數微生物能夠利用碳水化合物。然而，某些環境微生物不能利用碳水化合物至高效率，且因此將不是合適的宿主。
基因修飾宿主的能力是任何重組微生物生產所必需的。基因轉移技術的方式可以是電穿孔、接合、轉導或天然轉化。廣泛範圍的宿主接合質粒和藥物抗性標記是可用的。基於可以在那種宿主中起作用的抗生素抗性標記的性質使克隆載體適合於宿主生物。
微生物宿主還必須通過缺失各種基因進行處理，以滅活關於碳流的競爭途徑。這要求指導滅活的轉座子或染色體整合載體的有效性。此外，生產宿主應當順應化學誘變，從而使得可以獲得改善固有1-丁醇耐受性的突變。
基於上述標準，用於生產1-丁醇的合適微生物宿主包括但不限於，梭菌屬(Clostridium)、發酵單胞菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、產鹼菌屬(Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、節桿菌屬(Arthrobacter)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)和糖酵母屬(Saccharomyces)的成員。優選宿主包括大腸桿菌、真養產鹼菌、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、浸麻類芽孢桿菌(Paenibacillus macerans)、紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)、惡臭假單胞菌、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、鶉雞腸球菌(Enterococcus gallinarium)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、枯草芽孢桿菌和啤酒糖酵母。
生產宿主的構建 包含必需基因的重組生物可以使用本領域眾所周知的技術進行構建，所述必需基因將編碼使可發酵的碳底物轉化成1-丁醇的酶促途徑。在本發明中，編碼1-丁醇生物合成途徑酶的基因可以如上所述從各種來源分離，所述酶即乙醯輔酶A乙醯轉移酶、3-羥丁醯輔酶A脫氫酶、巴豆酸酶、丁醯輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶、和丁醇脫氫酶。
從細菌基因組獲得所需基因的方法是分子生物學領域常見和眾所周知的。例如，如果基因序列是已知的，那麼合適的基因組文庫可以通過限制性內切核酸酶消化來製備，且可以用與所需基因序列互補的探針來篩選。一旦序列分離，DNA就可以使用標準引物指導的擴增方法例如聚合酶鏈反應(Mullis，美國專利號4,683,202)進行擴增，以獲得適合於使用合適載體轉化的DNA量。對於在異源宿主中表達的密碼子最優化的工具是容易獲得的。用於密碼子最優化的一些工具基於宿主生物的GC含量是可用的。某些示例性微生物宿主的GC含量在表3中給出。
表3 微生物宿主的GC含量 一旦相關途徑基因被鑑定和分離，它們就可以通過本領域眾所周知的方法轉化到合適的表達宿主內。對於多種宿主細胞轉化有用的載體或盒是常見的，且從公司例如

(Madison，WI)，Invitrogen Co rp.(Carlsbad，CA)，Stratagene(La JoIIa，CA)，和New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)商購可得。一般地，載體或盒包含指導相關基因轉錄和翻譯的序列、選擇標記、和允許自主複製或染色體整合的序列。合適的載體包含具有轉錄起始控制的基因5＇區域，和控制轉錄終止的DNA片段3＇區域。2個控制區都可以來源於與轉化的宿主細胞同源的基因，儘管應當理解此類控制區也可以來源於對於選擇作為生產宿主的特定物種非天然的基因。
用於驅動相關途徑編碼區在所需宿主細胞中表達的起始控制區或啟動子是眾多的，且是本領域技術人員熟悉的。事實上能夠驅動這些遺傳元件的任何啟動子都適合於本發明，包括但不限於，CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、CUP1、FBA、GPD、和GPM(對於在糖酵母菌屬中表達有用)；AOX1(對於在畢赤氏酵母屬中表達有用)；和lac、ara、tet、trp、IPL、IPR、T7、tac，和trc(對於在大腸桿菌、產鹼菌屬和假單胞菌屬中表達有用)；amy、apr、npr啟動子和對於在枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和浸麻類芽孢桿菌中表達有用的各種噬菌體啟動子；nisA(對於在革蘭氏陽性細菌中表達有用，Eichenbaum等人Appl.Environ.Microbiol.64(8)2763-2769(1998))；和合成P11啟動子(對於在植物乳桿菌中表達有用，Rud等人，Microbiology 1521011-1019(2006))。
終止控制區也可以來源於對優選宿主天然的各種基因。任選地，終止位點可能是不必要的，然而，如果包括，那麼它是最優選的。
某些載體能夠在廣泛範圍的宿主細菌中複製且可以通過接合進行轉移。pRK404的完整和註解的序列以及3種相關載體-pRK437、pRK442和pRK442(H)是可用的。這些衍生物已被證明是用於在革蘭氏陰性細菌中基因操作的有價值的工具(Scott等人，Plasmid50(1)74-79(2003))。廣宿主範圍lnc P4質粒RSF1010的幾種質粒衍生物與可以在一系列革蘭氏陰性細菌中起作用的啟動子也是可用的。質粒pAYC36和pAYC37具有活性啟動子連同多克隆位點，以允許異源基因在革蘭氏陰性細菌中表達。
染色體基因替代工具也是廣泛可用的。例如，廣宿主範圍複製子pWV101的熱敏變體已進行修飾以構建質粒pVE6002，所述質粒pVE6002可以用於在一系列革蘭氏陽性細菌中產生基因替代(Maguin等人，J.Bacteriol.174(17)5633-5638(1992))。此外，體外transposomes可用於在來自商業來源例如

的多種基因組中產生隨機突變。
1-丁醇生物合成途徑在各種優選微生物宿主中的表達在下文更詳細地描述。
1-丁醇生物合成途徑在大腸桿菌中的表達 對於大腸桿菌轉化有用的載體或盒是常見的且從上文列出的公司商購可得。例如，如實施例11中所示，1-丁醇生物合成途徑的基因可以從各種梭菌菌株中分離、克隆到修飾的pUC19載體內，且轉化到大腸桿菌NM522內。1-丁醇生物合成途徑在幾種其他大腸桿菌菌株中的表達在實施例13中描述。
1-丁醇生物合成途徑在紅串紅球菌中的表達 一系列大腸桿菌-紅球菌屬穿梭載體可用於在紅串紅球菌中表達，包括但不限於pRhBR17和pDA71(Kostichka等人，Appl.Microbiol.Biotechnol 6261-68(2003))。此外，一系列啟動子可用於在紅串紅球菌中的異源基因表達(參見例如Nakashima等人，Appl.Envir.Microbiol.705557-5568(2004)，和Tao等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.2005，DOI 10.1007/s00253-005-0064)。紅串紅球菌中染色體基因的靶向的基因破壞可以使用由Tao等人，同上和Brans等人(Appl.Envir Microbiol.662029-2036(2000))描述的方法來製備。
如上所述1-丁醇生產所需的異源基因可以最初克隆到pDA71或pRhBR71中且轉化到大腸桿菌內。載體隨後可以如Kostichka等人，同上所述通過電穿孔轉化到紅串紅球菌內。重組體可以在包含葡萄糖的合成培養基中生長，且1-丁醇的生產可以使用本領域已知方法來跟蹤。
1-丁醇生物合成途徑在枯草芽孢桿菌中的表達 關於在枯草芽孢桿菌中基因表達和生成突變的方法也是本領域眾所周知的。例如，如實施例12中所述，1-丁醇生物合成途徑的基因可以從各種梭菌菌株中分離、克隆到修飾的pUC19載體內，且轉化到枯草芽孢桿菌BE1010內。此外，如實施例14中所述，1-生物合成途徑的6種基因可以分成2個操縱子用於表達。將該途徑的前3種基因(thl、hbd和crt)整合到枯草芽孢桿菌BE1010染色體內(Payne和Jackson，J.Bacteriol.1732278-2282(1991))。將後3種基因(EgTER、ald和bdhB)克隆到表達質粒內，且轉化到攜帶整合的1-丁醇基因的芽孢桿菌菌株內。
1-丁醇生物合成途徑在地衣芽胞桿菌中的表達 在枯草芽孢桿菌中複製的大多數質粒和穿梭載體可以用於通過原生質體轉化或電穿孔轉化地衣芽孢桿菌。例如，1-丁醇生產所需的基因可以克隆到質粒pBE20或pBE60衍生物內(Nagarajan等人，Gene 114121-126(1992))。轉化地衣芽孢桿菌的方法是本領域已知的(例如參見Fleming等人Appl.Environ.Microbiol.，61(11)3775-3780(1995))。構建用於在枯草芽孢桿菌中表達的質粒也可以轉化到地衣芽孢桿菌內，以產生生產1-丁醇的重組微生物宿主。
1-丁醇生物合成途徑在浸麻類芽胞桿菌中的表達 質粒可以如上文關於在枯草芽孢桿菌中表達所述進行構建，且通過原生質體轉化用於轉化浸麻類芽孢桿菌，以產生生產生產1-丁醇的重組微生物宿主。
1-丁醇生物合成途徑在真養產鹼菌(富養羅爾斯通氏菌)中的表達 關於在富養羅爾斯通氏菌中基因表達和生成突變的方法是本領域已知的(參見例如，Taghavi等人，Appl.Environ.Microbiol.，60(10)3585-3591(1994))。關於1-丁醇生物合成途徑的基因可以克隆到上文所述的任何廣宿主範圍載體中，且進行電穿孔以產生生產1-丁醇的重組體。羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)中的多羥基丁酸鹽途徑已得到詳細描述，且修飾富養羅爾斯通氏菌基因組的多種遺傳技術是已知的，且那些工具可應用於工程改造1-丁醇生物合成途徑。
1-丁醇生物合成途徑在惡臭假單胞菌中的表達 關於在惡臭假單胞菌中基因表達的方法是本領域已知的(參見例如Ben-Bassat等人，美國專利號6,586,229，所述專利引入本文作為參考)。例如，丁醇途徑基因可以插入到pPCU18內，且這種連接的DNA可以電穿孔到電轉化感受態的惡臭假單胞菌DOT-T1 C5aAR1細胞內，以產生生產1-丁醇的重組體。
1-丁醇生物合成途徑在啤酒糖酵母中的表達 關於在啤酒糖酵母中基因表達的方法是本領域已知的(參見例如Methods in Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics andMolecular and Cell Biology(Part A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(Eds.)，Elsevier Academic Press，San Diego，CA)。基因在酵母中的表達一般需要啟動子、隨後為目的基因、和轉錄終止子。許多酵母啟動子可以用於構建關於編碼1-丁醇生物合成途徑的基因的表達盒，包括但不限於，組成型啟動子FBA、GPD和GPM，以及誘導型啟動子GAL1、GAL10和CUP1。合適的轉錄終止子包括但不限於，FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t和GAL1t。如實施例17中所述，合適的啟動子、轉錄終止子和1-丁醇生物合成途徑的基因可以克隆到酵母2微米(2μ)質粒內。
1-丁醇生物合成途徑在植物乳桿菌中的表達 乳桿菌屬屬於乳桿菌目(Lactobacillales)科，且在枯草芽孢桿菌和鏈球菌屬(Streptococcus)轉化中使用的許多質粒和載體可以用於乳桿菌屬。合適載體的非限制性例子包括pAMβ1及其衍生物(Renault等人，Gene 183175-182(1996)；和O＇Sullivan等人，Gene 137227-231(1993))；pMBB1和pMBB1的衍生物pHW800(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol.621481-1486(1996))；接合質粒pMG1(Tanimoto等人，J.Bacteriol.1845800-5804(2002))；pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.634581-4584(1997))；pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.671262-1267(2001))；和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.Agents Chemother.381899-1903(1994))。來自植物乳桿菌的幾種質粒已得到報導(例如，vanKranenburg R，Golic N，Bongers R，Leer RJ，de Vos WM，Siezen RJ，KleerebezemM.Appl.Environ.Microbiol.2005Mar；71(3)1223-1230)。例如，1-丁醇生物合成途徑在植物乳桿菌中的表達在實施例18中描述。
1-丁醇生物合成途徑在屎腸球菌、鶉雞腸球菌和糞腸球菌中的表達 腸球菌屬屬於乳桿菌目科，且在乳桿菌屬、枯草芽孢桿菌和鏈球菌屬轉化中使用的許多質粒和載體可以用於腸球菌屬。合適載體的非限制性例子包括pAMβ1及其衍生物(Renault等人，Gene 183175-182(1996)；和O＇Sullivan等人，Gene 137227-231(1993))；pMBB1和pMBB1的衍生物pHW800(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol.621481-1486(1996))；接合質粒pMG1(Tanimoto等人，J.Bacteriol.1845800-5804(2002))；pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.634581-4584(1997))；pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.671262-1267(2001))；和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.Agents Chemother.381899-1903(1994))。使用來自乳球菌屬(Lactococcus)的nisA基因的糞腸球菌的表達載體也可以使用(Eichenbaum等人，Appl.Environ.Microbiol.642763-2769(1998)。此外，用於在屎腸球菌染色體中基因替代的載體可以使用(Nallaapareddy等人，Appl.Environ.Microbiol.72334-345(2006))。例如，1-丁醇生物合成途徑在糞腸球菌中的表達在實施例19中描述。
發酵培養基 本發明中的發酵培養基必須包含合適的碳底物。合適的底物可以包括但不限於，單糖例如葡萄糖和果糖、寡糖例如乳糖或蔗糖、多糖例如澱粉或纖維素或其混合物，和來自可再生原料的未純化混合物，例如乾酪乳清滲透物、玉米漿、蔗糖蜜、和大麥芽。此外碳底物也可以是已證實代謝轉化為關鍵生物化學中間物的單碳底物，例如二氧化碳、或甲醇。除了單和二碳底物，也已知甲基營養生物利用許多其他含碳化合物，例如甲胺、葡萄胺和多種胺基酸用於代謝活性。例如，已知甲基營養酵母利用來自甲胺的碳以形成海藻糖或丙三醇(Bellion等人，Microb.Growth C1 Compd.，[Int.Symp.]，7th(1993)，415-32.Editor(s)Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.PublisherIntercept，Andover，UK)。類似地，各種假絲酵母屬(Candida)物種將代謝丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153485-489(1990))。因此預期本發明中利用的碳源可以包含廣泛多樣的含碳底物，且將只受宿主選擇限制。
儘管預期所有上文提及的碳底物及其混合物都適合於本發明，但優選碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖。
除了合適的碳源，發酵培養基必須包含本領域技術人員已知的，適合於培養物生長和促進1-丁醇生產所需酶促途徑的合適礦物質、鹽、輔因子、緩衝液及其他組分。
培養條件 細胞一般在約25℃-約40℃溫度下在合適培養基中生長。本發明中合適的生長培養基是常見的商業製備培養基，例如Luria Bertani(LB)液體培養基、沙氏葡萄糖(Sabouraud Dextrose)(SD)液體培養基或酵母培養基(YM)液體培養基。其他確定成分或合成生長培養基也可以使用，並且關於特定微生物生長的合適培養基將是微生物學或發酵科學領域技術人員已知的。已知直接或間接調節分解代謝物阻抑的試劑的使用，例如環狀腺苷2＇3＇-一磷酸也可以摻入發酵培養基內。
用於發酵的合適pH範圍為pH5.0-pH9.0，其中pH6.0-pH8.0作為初始條件是優選的。
發酵可以在需氧或厭氧條件下進行，其中厭氧或微需氧條件是優選的。
在發酵培養基中生產的1-丁醇量可以使用本領域已知的許多方法來測定，例如，高效液相層析(HPLC)或氣相層析(GC)。
工業分批和連續發酵 本方法使用分批發酵法。傳統分批發酵是其中培養基組成在發酵開始時設定，且在發酵期間不實施人工改變的封閉系統。因此，在發酵開始時，用所需一種或多種生物接種培養基，且允許發酵發生而不向系統中添加任何東西。然而，一般地「分批」發酵是就碳源添加而言的分批，且通常在控制因素例如pH和氧濃度方面進行嘗試。在分批系統中，系統的代謝物和生物量組成不斷改變直至發酵停止時。在分批培養中，細胞適度(moderate)通過靜態滯後期至高生長對數期，且最後至其中生長速率減小或停止的穩定期。如果未處理，那麼穩定期的細胞將最終死亡。對數期的細胞一般負責終產物或中間物的大量生產。
關於標準分批系統的變化是補料分批系統(Fed-Batch system)。補料分批發酵方法也適合於本發明，且除了底物隨發酵進展以增量添加之外，包含一般的分批系統。當分解代謝物阻抑傾向於抑制細胞代謝且希望在培養基中具有有限量的底物時，補料分批系統是有用的。補料分批系統中的實際底物濃度測量是困難的，且因此基於可測量因素例如pH、溶解氧和廢氣例如CO2的分壓變化來估計。分批和補料分批發酵是本領域常見和眾所周知的，並且例子可以在下述參考文獻中找到Thomas D.Brock in BiotechnologyA Textbook of IndustrialMicrobiology，第2版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36227，(1992)，所述參考文獻引入本文作為參考。
儘管本發明以分批模式來進行，但預期該方法將適應於連續發酵法。連續發酵是其中向生物反應器中連續添加確定成分發酵培養基，且同時取出等量條件培養基用於加工的開放系統。連續發酵一般使培養物維持在恆定高密度，其中細胞主要處於對數生長期。
連續發酵允許調節影響細胞生長或終產物濃度的一種因素或許多因素。例如，一種方法將使限制營養物例如碳源或氮水平維持在固定比率，且允許所有其他參數保持適度。在其他系統中，影響生長的許多因素可以不斷改變，而通過培養基濁度測量的細胞濃度保持恆定。連續系統努力維持穩定狀態生長條件，且因此由於培養基排出的細胞喪失必須針對發酵中的細胞生長速率進行平衡。對於連續發酵方法調節營養物和生長因子的方法以及使產物發酵速率達到最大的技術是工業微生物學領域眾所周知的，且各種方法由Brock同上詳細描述。
預期本發明可以使用分批、補料分批或連續方法進行實踐，且任何已知發酵模式都將是合適的。此外，預期細胞可以作為全細胞催化劑固定化在底物上，且實施用於1-丁醇生產的發酵條件。
從發酵培養基分離1-丁醇的方法 生物生產的1-丁醇可以使用本領域已知方法從發酵培養基進行分離。例如，固體可以通過離心、過濾、傾析等從發酵培養基中取出。隨後，1-丁醇可以使用例如蒸餾、液液提取、或基於膜的分離的方法從發酵培養基分離，所述發酵培養基已如上所述進行處理以取出固體。因為1-丁醇與水形成低沸點、共沸混合物，所以蒸餾只能用於使混合物分離直至其共沸組成。蒸餾可以與另一種分離方法組合使用，以獲得大約在共沸混合物的分離。可以與蒸餾組合使用以分離和純化1-丁醇的方法包括但不限於，傾析、液液提取、吸附、和基於膜的技術。此外，1-丁醇可以使用共沸蒸餾使用共沸劑進行分離(參見例如Doherty和Malone，Conceptual Design of Distillation Systems，McGraw Hill，New York，2001)。
1-丁醇-水混合物形成不均態共沸混合物，從而使得蒸餾可以與傾析組合使用以分離和純化1-丁醇。在這種方法中，將包含1-丁醇的發酵液體培養基蒸餾至接近共沸組成。隨後，將共沸混合物濃縮，且通過傾析使1-丁醇與發酵培養基分開。傾析的水相可以作為回流送回第一個蒸餾柱。富含1-丁醇的傾析的有機相可以通過在第二個蒸餾柱中蒸餾進一步得到純化。
1-丁醇還可以使用液液提取與蒸餾組合從發酵培養基中分離。在這種方法中，1-丁醇使用液液提取用合適的溶劑從發酵液體培養基中提取。含1-丁醇的有機相隨後進行蒸餾以使1-丁醇與溶劑分開。
蒸餾與吸附組合也可以用於從發酵培養基分離1-丁醇。在這種方法中，將包含1-丁醇的發酵液體培養基蒸餾至接近共沸組成，且隨後剩餘的水通過使用吸附劑例如分子篩去除(Aden等人LignocellulosicBiomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-CurrentDilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover，Report NREL/TP-510-32438，National Renewable Energy Laboratory，June 2002)。
此外，蒸餾與全蒸發組合可以用於從發酵培養基分離和純化1-丁醇。在這種方法中，將包含1-丁醇的發酵液體培養基蒸餾至接近共沸組成，且隨後剩餘的水經由全蒸發通過親水膜去除(Guo等人，J.Membr.Sci.245，199-210(2004))。
實施例 本發明在下述實施例中進一步限定。應當理解這些實施例在指出本發明的優選實施方案的同時，僅作為舉例說明而給出。由於上文討論和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特徵，並且在不背離其精神和範圍的情況下，可以進行本發明的各種變化和修飾以使其適應各種用途和條件。
一般方法 實施例中使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域眾所周知的，且由下述參考文獻描述Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory PressCold Spring Harbor，(1989)(Maniatis)，T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1984)，和Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，由GreenePublishing Assoc and Wiley-lnterscience出版(1987)。
適合於細菌培養物維持和生長的材料和方法是本領域眾所周知的。適合於在下述實施例中使用的技術可以如下述參考文獻中所述找到Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，NoelR.Krieg和G.Briggs Phillips，eds)，American Society for Microbiology，Washington，DC.(1994))或Thomas D.Brock in BiotechnologyATextbook of Industrial Microbiology，第2版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)。除非另有說明，用於細菌細胞生長和維持的所有試劑、限制酶和材料都得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，Wl)、BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)、Life Technologies(Rockville，MD)、或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。
在下述實施例中用於克隆的寡核苷酸引物在表4中給出。用於測序或篩選克隆的基因的引物在表5中給出。所有寡核苷酸引物都由Sigma-Genosys(Woodlands，TX)合成。
表4 寡核苷酸克隆引物 表5 測序和PCR篩選引物 用於測定培養基中的1-丁醇濃度的方法 培養基中的1-丁醇濃度可以通過本領域已知的許多方法進行測定。例如，具體高效液相層析(HPLC)法使用購自Waters Corporation(Milford，MA)的Shodex SH-1011柱與Shodex SH-G保護柱，其具有折射率(RI)檢測。層析分離使用流速為0.5mL/分鐘的0.01M H2SO4作為流動相和50℃的柱溫來完成。1-丁醇在使用的條件下具有52.8分鐘的保留時間。可替代地，氣相層析(GC)法是可用的。例如，具體GC法使用HP-INNOWax柱(30m x 0.53mm id，1μm膜厚度，AgilentTechnologies，Wilmington，DE)，其具有火焰離子化檢測器(FID)。載氣是流速為4.5mL/分鐘的氦，使用恆定排出壓力於150℃測量；注射器分流在200℃時為125；烤箱溫度為45℃1小時，以10℃/分鐘45-220℃，和220℃5分鐘；和於240℃使用FID檢測，其具有26mL/分鐘氦補充氣體。1-丁醇的保留時間為5.4分鐘。使用Varian CP-WAX58(FFAP)CB柱(25m x 0.25mm id X 0.2μm膜厚度，Varian，Inc.，Palo Alto，CA)的類似GC法也可以使用。
縮寫含義如下「s」表示秒，「min」表示分鐘，「h」表示小時，「psi」表示磅/平方英寸，「nm」表示納米，「d」表示天，「μL」表示微升，「mL」表示毫升，「L」表示升，「mm」表示毫米，「nm」表示納米，「mM」表示毫摩爾濃度(millimolar)，「M」表示摩爾濃度(molar)，「mmol」表示毫摩爾，「μmole」表示微摩爾，「g」表示克，「μg」表示微克和「ng」表示納克，「PCR」表示聚合酶鏈反應，「OD」表示光密度，「OD600」表示在600nm波長處測量的光密度，「OD550」表示在550nm波長處測量的光密度，「kDa」表示千道爾頓，「g」表示重力加速度，「rpm」表示每分鐘轉數，「bp」表示鹼基對，「kbp」表示千鹼基對，「％w/v」表示重量/體積百分比，「％v/v」表示體積/體積百分比，「HPLC」表示高效液相層析，且「GC」表示氣相層析。
實施例1 乙醯輔酶A乙醯轉移酶的克隆和表達 這個實施例的目的是在大腸桿菌中表達乙醯輔酶A乙醯轉移酶，在本文中也稱為乙醯乙醯輔酶A硫解酶。乙醯乙醯輔酶A硫解酶基因thlA從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)克隆且在大腸桿菌中表達。thlA基因使用PCR從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA擴增，從而導致產生1.2kbp產物。
來自丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)的基因組DNA購自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，或如下所述從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)培養物分離。
來自丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)的基因組DNA由厭氧生長的培養物製備。梭菌屬菌株在塞好和捲曲的100mL Bellco血清瓶(BellcoGlass Inc.，Vineland，NJ)的10mL梭菌生長培養基(Lopez-Contreras等人，Appl.Env.Microbiol.69(2)，869-877(2003))中，在厭氧室中於30℃生長。接種物是來自2X YTG板(Kishii，等人，AntimicrobialAgents & Chemotherapy，47(1)，77-81(2003))在2.5L MGCAnaeroPakTM(Mitsubishi Gas Chemical America Inc，New York，NY)中於37℃生長的單個菌落。
基因組DNA使用Gentra

試劑盒(Gentra Systems，Inc.，Minneapolis，MN；目錄號D-6000A)，使用製造商說明書的修改(Wong等人，Current Microbiology，32，349-356(1996))進行製備。thlA基因通過PCR使用引物N7和N8(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因組DNA進行擴增，所述引物N7和N8分別作為SEQ ID NO21和22給出。其他PCR擴增試劑在製造商的試劑盒例如Kod HiFi DNAPolymerase(Novagen Inc.，Madison，WI；目錄號71805-3)中提供，且根據製造商的規程使用。擴增在DNA Thermocycler GeneAmp 9700(PE Applied Biosystems，Foster city，CA)中進行。
對於表達研究，使用Gateway克隆技術(Invitrogen Co rp.，Carlsbad，CA)。進入載體(entry vector)pENTR/SD/D-TOPO允許定向克隆且為目的基因提供SD序列。目的載體pDEST14使用T7啟動子用於表達無標籤的基因。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個鹼基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內，以產生質粒pENTRSDD-TOPOthlA。將pENTR構建體轉化到大腸桿菌Top10(Invitrogen)細胞內，且根據製造商的建議進行鋪平板。轉化體生長過夜，且使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen，Valencia，CA；目錄號27106)根據製造商的建議製備質粒DNA。提交克隆用於由M13正向和反向引物(參見表5)測序，所述M13正向和反向引物分別作為SEQ ID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。需要另外的測序引物N7SeqF1和N7SeqR1(參見表5)以對PCR產物完全測序，所述N7SeqF1和N7SeqR1分別作為SEQ IDNOs47和48給出。關於這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預測胺基酸序列分別作為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2給出。
為了生成表達克隆，通過重組將thlA基因轉移至pDEST14載體以產生pDEST14thlA。將pDEST14thlA載體轉化到BL21-AI細胞內。將轉化體接種到補加了50μg/mL氨苄青黴素的LB培養基內且生長過夜。等分試樣的過夜培養物用於接種補加了50μg/mL氨苄青黴素的50mLLB。培養物於37℃伴隨振蕩溫育直至OD600達到0.6-0.8。將培養物分成2個25-mL培養物，且將阿拉伯糖加入瓶之一至0.2重量％的終濃度。陰性對照瓶不用阿拉伯糖誘導。瓶於37℃伴隨振蕩溫育4小時。細胞通過離心進行收穫，且將細胞沉澱重懸浮於50mM MOPS，pH7.0緩衝液中。細胞通過超聲處理或通過弗氏壓碎器來破壞。將全細胞溶解產物離心，從而產生上清液或無細胞提取物和沉澱或不溶性級分。將等分試樣的每種級分(全細胞溶解產物、無細胞提取物和不溶性級分)重懸浮於SDS(MES)加樣緩衝液(Invitrogen)中，加熱至85℃ 10分鐘，且實施SDS-PAGE分析(NuPAGE 4-12％Bis-Tris Gel，目錄號NP0322Box，Invitrogen)。如由核酸序列推導的預期分子量約41kDa的蛋白質，存在於誘導的培養物中但不存在於未誘導的對照中。
無細胞提取物中的乙醯乙醯輔酶A硫解酶活性通過監控303nm處吸光度中的減少作為Mg2+-乙醯乙醯輔酶A複合物降解來測量。標準測定條件為100mM Tris-HCl pH8.0，1mM DTT(二硫蘇糖醇)和10mMMgCl2。使混合物(cocktail)於37℃平衡5分鐘；隨後加入無細胞提取物。反應用添加0.05mM乙醯乙醯輔酶A加0.2mM輔酶A來起始。蛋白質濃度通過Bradford方法或通過Bicinchoninic Kit(Sigma，目錄號BCA-1)來測量。牛血清清蛋白(Bio-Rad，Hercules，CA)在2種情況下用作標準。在一種一般測定中，與未誘導的培養物中的0.27μmolmg-1min-1比較，誘導的培養物中的ThlA蛋白質比活性測定為16.0μmolmg-1min-1。
實施例2 乙醯輔酶A乙醯轉移酶的克隆和表達 這個實施例的目的是在大腸桿菌中表達乙醯輔酶A乙醯轉移酶，在本文中也稱為乙醯乙醯輔酶A硫解酶。乙醯乙醯輔酶A硫解酶基因thlB從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)克隆且在大腸桿菌中表達。thlB基因使用PCR從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA擴增。
thlB基因以與實施例1中所述的thlA基因相同的方式克隆和表達。丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA通過PCR使用引物N15和N16(參見表4)來擴增，所述引物N15和N16分別作為SEQ ID NOs27和28給出，從而產生1.2kbp產物。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個鹼基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內，以產生質粒pENTRSDD-TOPOthlB。提交克隆用於由M13正向和反向引物測序，所述M13正向和反向引物分別作為SEQID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。需要另外的測序引物N15SeqF1和N16SeqR1(參見表5)以對PCR產物完全測序，所述N15SeqF1和N16SeqR1分別作為SEQ ID NOs49和50給出。關於這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預測胺基酸序列分別作為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4給出。
為了生成表達克隆，通過重組將thlB基因轉移至pDEST14(Invitrogen)載體以產生pDEST14thlB。將pDEST14thlB載體轉化到BL21-AI細胞內，且通過添加阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。如由核酸序列推導的預期分子量約42kDa的蛋白質，存在於誘導的培養物中但不存在於未誘導的對照中。酶測定如實施例1中所述進行。在一種一般測定中，與未誘導的培養物中的0.28μmol mg-1min-1比較，誘導的培養物中的ThlB蛋白質比活性測定為14.9μmol mg-1min-1。
實施例3 3-羥丁醯輔酶A脫氫酶的克隆和表達 這個實施例的目的是從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)克隆hbd基因且在大腸桿菌中表達它。hbd基因使用PCR從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因組DNA擴增。
hbd基因使用實施例1中所述方法進行克隆和表達。hbd基因通過PCR使用引物N5和N6(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物N5和N6分別作為SEQ ID NO19和20給出，從而產生881bp產物。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個鹼基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內，以產生質粒pENTRSDD-TOPOhbd。提交克隆用於由M13正向和反向引物測序，所述M13正向和反向引物分別作為SEQ ID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。需要另外的測序引物N5SeqF2和N6SeqR2(參見表5)以對PCR產物完全測序，所述N5SeqF2和N6SeqR2分別作為SEQ ID NOs51和52給出。關於這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預測胺基酸序列分別作為SEQ ID NO5和SEQ ID NO6給出。
為了生成表達克隆，通過重組將hbd基因轉移至pDEST 14(Invitrogen)載體以產生pDEST14hbd。如實施例1中所述，將pDEST14hbd載體轉化到BL21-AI細胞內，且通過添加阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。如由核酸序列推導的預期分子量約31kDa的蛋白質，存在於誘導的培養物中但不存在於未誘導的對照中。
如通過340nm處吸光度中的減少測量的，通過測量NADH氧化率來測定羥丁醯輔酶A脫氫酶活性。標準測定混合物包含50mM MOPS，pH7.0，1mM DTT和0.2mM NADH。使混合物於37℃平衡5分鐘，且隨後加入無細胞提取物。反應通過添加底物0.1mM乙醯乙醯輔酶A來起始。在一種一般測定法中，與未誘導的培養物中的0.885μmol mg-1min-1比較，誘導的培養物中的BHBD蛋白質比活性測定為57.4μmolmg-1min-1。
實施例4 巴豆酸酶的克隆和表達 這個實施例的目的是從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)克隆crt基因且在大腸桿菌中表達它。crt基因使用PCR從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA擴增。
crt基因使用實施例1中所述方法進行克隆和表達。crt基因通過PCR使用引物N3和N4(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物N3和N4分別作為SEQ ID NO17和18給出，從而產生794bp產物。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個鹼基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內，以產生質粒pENTRSDD-TOPOcrt。提交克隆用於由M13正向和反向引物測序，所述M13正向和反向引物分別作為SEQ ID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。關於這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預測胺基酸序列分別作為SEQ IDNO7和SEQ ID NO8給出。
為了生成表達克隆，通過重組將crt基因轉移至pDEST 14(Invitrogen)載體以產生pDEST14crt。如實施例1中所述，將pDEST14crt載體轉化到BL21-AI細胞內，且通過添加阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。如由核酸序列推導的預期分子量約28kDa的蛋白質，存在於誘導的培養物中的量比未誘導的對照中的多得多。
巴豆酸酶活性如Stern(Methods Enzymol.1，559-566，(1954))所述進行測定。在一種一般測定中，與未誘導的培養物中的47μmolmg-1min-1比較，誘導的培養物中的巴豆酸酶蛋白質比活性測定為444μmol mg-1min-1。
實施例5 丁醯輔酶A脫氫酶的克隆和表達 這個實施例的目的是在大腸桿菌中表達丁醯輔酶A脫氫酶，在本文中也稱為反式-2-烯醯輔酶A還原酶。CAC0462基因，推定的反式-2-烯醯輔酶A還原酶同源物從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)克隆且在大腸桿菌中表達。CAC0462基因使用PCR從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA擴增。
CAC0462基因使用實施例1中所述方法進行克隆和表達。CAC0462基因通過PCR使用引物N17和N21(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物N17和N21分別作為SEQ ID NO29和30給出，從而產生1.3kbp產物。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個鹼基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內，以產生質粒pENTRSDD-TOPOCAC0462。提交克隆用於由M13正向和反向引物測序，所述M13正向和反向引物分別作為SEQ ID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。需要另外的測序引物N22SeqF1(SEQ ID NO53)、N22SeqF2(SEQ ID NO54)、N22SeqF3(SEQ ID NO55)、N23SeqR1(SEQ ID NO56)、N23SeqR2(SEQID NO57)、和N23SeqR3(SEQ ID NO58)(參見表5)以對PCR產物完全測序。關於這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預測胺基酸序列分別作為SEQ ID NO9和SEQ ID NO10給出。
為了生成表達克隆，通過重組將CAC0462基因轉移至pDEST 14(Invitrogen)載體以產生pDEST14CAC0462。如實施例1中所述，將pDEST14CAC0462載體轉化到BL21-AI細胞內，且通過添加阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。通過SDS-PAGE的分析顯示在陰性對照或誘導的培養物中沒有預期分子量的超表達的蛋白質。丙酮丁醇梭菌CAC0462基因使用許多罕見的大腸桿菌密碼子。為了避免密碼子選擇問題，將pRARE質粒(Novagen)轉化到具有pDEST14CAC0462載體的BL21-A1細胞內。用攜帶pRARE載體的培養物重複使用阿拉伯糖誘導的表達研究。預期分子量約46kDa的蛋白質存在於誘導的培養物中但不存在於未誘導的對照中。
反式-2-烯醯輔酶A還原酶活性如Hoffmeister等人(J.Biol.Chem.280，4329-4338(2005))所述進行測定。在一種一般測定中，與未誘導的培養物中的0.0128μmol mg-1min-1比較，誘導的培養物中的TERCAC0462蛋白質比活性測定為0.694μmol mg-1min-1。
實施例6 丁醛脫氫酶(乙醯化)的克隆和表達 這個實施例的目的是從拜氏梭菌(ATCC 35702)克隆ald基因且在大腸桿菌中表達它。ald基因使用PCR從拜氏梭菌(ATCC 35702)基因組DNA擴增。
ald基因使用實施例1中所述方法進行克隆和表達。ald基因通過PCR使用引物N27F1和N28 R1(參見表4)從拜氏梭菌(ATCC 35702)基因組DNA(如實施例1中所述由厭氧生長的培養物製備)進行擴增，所述引物N27F1和N28 R1分別作為SEQ ID NO31和32給出，從而產生1.6kbp產物。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個鹼基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內，以產生質粒pENTRSDD-TOPOald。提交克隆用於由M13正向和反向引物測序，所述M13正向和反向引物分別作為SEQ ID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。需要另外的測序引物N31SeqF2(SEQ ID NO59)、N31SeqF3(SEQ ID NO60)、N31SeqF4(SEQ ID NO61)、N32SeqR1(SEQ ID NO72)、N31SeqR2(SEQID NO62)、N31SeqR3(SEQ ID NO63)、N31SeqR4(SEQ ID NO64)、和N31SeqR5(SEQ ID NO65)(參見表5)以對PCR產物完全測序。關於這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預測胺基酸序列分別作為SEQ ID NO11和SEQ ID NO12給出。
為了生成表達克隆，通過重組將ald基因轉移至pDEST14(Invitrogen)載體以產生pDEST14ald。如實施例1中所述，將pDEST14ald載體轉化到BL21-AI細胞內，且通過添加阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。如由核酸序列推導的預期分子量約51kDa的蛋白質，存在於誘導的培養物中但不存在於未誘導的對照中。
如Husemann等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.31435-444(1989))所述，如通過340nm處吸光度中的增加測量的，通過監控NADH的形成來測定醯化醛脫氫酶活性。在一種一般測定中，與未誘導的培養物中的0.01μmol mg-1min-1比較，誘導的培養物中的Ald蛋白質比活性測定為0.106μmol mg-1min-1。
實施例7 丁醇脫氫酶的克隆和表達 這個實施例的目的是從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)克隆bdhB基因且在大腸桿菌中表達它。bdhB基因使用PCR從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因組DNA擴增。
bdhB基因使用實施例1中所述方法進行克隆和表達。bdhB基因通過PCR使用引物N11和N12(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物N11和N12分別作為SEQ ID NO25和26給出，從而產生1.2kbp產物。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個鹼基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內，以產生質粒pENTRSDD-TOPObdhB。翻譯起始密碼子也通過引物序列從「GTG」變成「ATG」。提交克隆用於由M13正向和反向引物測序，所述M13正向和反向引物分別作為SEQ ID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。需要另外的測序引物N11SeqF1(SEQ ID NO66)、N11SeqF2(SEQ ID NO67)、N12SeqR1(SEQ ID NO68)、和N12SeqR2(SEQ ID NO69)(參見表5)以對PCR產物完全測序。關於這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預測胺基酸序列分別作為SEQ ID NO13和SEQID NO14給出。
為了生成表達克隆，通過重組將bdhB基因轉移至pDEST14(Invitrogen)載體以產生pDEST14bdhB。如實施例1中所述，將pDEST14bdhB載體轉化到BL21-AI細胞內，且通過添加阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。如由核酸序列推導的預期分子量約43kDa的蛋白質，存在於誘導的培養物但不存在於未誘導的對照中。
如Husemann和Papoutsakis同上所述，如通過340nm處吸光度中的減少測量的，由NADH的氧化率來測定丁醇脫氫酶活性。在一種一般測定中，與未誘導的培養物中的0.022μmol mg-1min-1比較，誘導的培養物中的BdhB蛋白質比活性測定為0.169μmol mg-1min-1。
實施例8 丁醇脫氫酶的克隆和表達 這個實施例的目的是從丙酮丁醇梭菌824克隆bdhA基因且在大腸桿菌中表達它。bdhA基因使用PCR從丙酮丁醇梭菌824基因組DNA擴增。
bdhA基因使用實施例1中所述方法進行克隆和表達。bdhA基因通過PCR使用引物N9和N10(參見表4)從丙酮丁醇梭菌824基因組DNA進行擴增，所述引物N9和N10分別作為SEQ ID NO23和24給出，從而產生1.2kbp產物。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個鹼基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內，以產生質粒pENTRSDD-TOPObdhA。克隆分別作為SEQ ID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。需要另外的測序引物N9SeqF1(SEQ ID NO70)和N10SeqR1(SEQ ID NO71)(參見表5)以對PCR產物完全測序。關於這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預測胺基酸序列分別作為SEQ ID NO15和SEQ ID NO16給出。
為了生成表達克隆，通過重組將bdhA基因轉移至pDEST14(Invitrogen)載體以產生pDEST14bdhA。如實施例1中所述，將pDEST14bdhA載體轉化到BL21-AI細胞內，且通過添加阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。如由核酸序列推導的預期分子量約43kDa的蛋白質，存在於誘導的培養物但不存在於未誘導的對照中。
如Husemann和Papoutsakis同上所述，如通過340nm處吸光度中的減少測量的，由NADH的氧化率來測定丁醇脫氫酶活性。在一種一般測定中，與未誘導的培養物中的0.028μmol mg-1min-1比較，誘導的培養物中的BdhA蛋白質比活性測定為0.102μmol mg-1min-1。
實施例9 關於1-丁醇生物合成途徑中的基因的轉化載體構建-下遊(lower)途徑 為了構建包含編碼1-丁醇生物合成途徑中6個步驟的基因的轉化載體，將編碼途徑中6個步驟的基因分成2個操縱子。上遊途徑包含由乙醯輔酶A乙醯轉移酶、3-羥丁醯輔酶A脫氫酶、巴豆酸酶和丁醯輔酶A脫氫酶催化的前4個步驟。下遊途徑包含由丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶催化的後2個步驟。
這個實施例的目的是構建下遊途徑操縱子。上遊途徑操縱子的構建在實施例10中描述。
個別基因通過PCR使用引物進行擴增，所述引物摻入限制位點以用於稍後克隆，且正向引物包含最優化的大腸桿菌核糖體結合位點(AAAGGAGG)。將PCR產物TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO載體內且轉化到大腸桿菌Top10細胞(Invitrogen)內。質粒DNA由TOPO克隆製備且驗證基因序列。限制酶和T4DNA連接酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)根據製造商的建議使用。對於克隆實驗，限制片段通過凝膠電泳使用QIAquick Gel Extraction試劑盒(Qiagen)進行純化。
序列證實後，將基因亞克隆到作為克隆平臺的修飾的pUC19載體內。pUC19載體通過HindIII/SapI消化進行修飾，從而產生pUC19dHS。消化去除鄰近於MCS(多克隆位點)的lac啟動子，從而防止操縱子在載體中轉錄。
ald基因通過PCR使用引物N58和N59(參見表4)從拜氏梭菌ATCC 35702基因組DNA進行擴增，所述引物N58和N59分別作為SEQ ID NO41和42給出，從而產生1.5kbp產物。正向引物摻入限制位點AvaI和BstEII以及RBS(核糖體結合位點)。反向引物摻入HpaI限制位點。將PCR產物克隆到pCRBlunt II-TOPO內，從而產生pCRBluntII-ald。質粒DNA由TOPO克隆製備，且用下述引物驗證基因序列M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N31SeqF2(SEQ ID NO59)、N31SeqF3(SEQ ID NO60)、N31SeqF4(SEQ ID NO61)、N32SeqR1(SEQ ID NO72)、N31SeqR2(SEQID NO62)、N31SeqR3SEQ ID NO63)、N31SeqR4(SEQ ID NO64)、和N31SeqR5(SEQ ID NO65)(參見表5)。
bdhB基因通過PCR使用引物N64和N65(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物N64和N65分別作為SEQ ID NO43和44給出，從而產生1.2kbp產物。正向引物摻入HpaI限制位點和RBS。反向引物摻入PmeI和SphI限制位點。將PCR產物克隆到pCRBlunt II-TOPO內，從而產生pCRBluntII-bdhB。質粒DNA由TOPO克隆製備，且用下述引物驗證基因序列M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N11SeqF1(SEQID NO66)、N11SeqF2(SEQ ID NO67)、N12SeqR1(SEQ ID NO68)、和N12SeqR2(SEQ ID NO69)(參見表5)。
為了構建下遊途徑操縱子，使來自pCRBluntII-bdhB的1.2kbp SphI和HpaI片段，來自pCRBluntII-ald的1.4kbp HpaI和SphI片段，以及來自AvaI和SphI消化的pUC19dHS的大片段連接在一起。三向連接產生pUC19dHS-ald-bdhB。
pUC19dHS-ald-bdhB載體用BstEII和PmeI進行消化，從而釋放克隆到pBenBP內的2.6kbp片段，所述pBenBP是大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體。質粒pBenBP通過pBE93載體修飾產生，所述pBE93由Nagarajan，WO93/24631(實施例4)描述。解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)中性蛋白酶啟動子(NPR)、信號序列和phoA基因用NcoI/HindIII消化從pBE93中去除。NPR啟動子通過引物BenF和BenBPR從pBE93進行PCR擴增，所述引物BenF和BenBPR分別由SEQ ID NO73和75給出。引物BenBPR摻入啟動子下遊的BstEII、PmeI和HindIII位點。PCR產物用NcoI和HindIII進行消化，且將片段克隆到載體pBE93的相應位點內以產生pBenBP。將下遊操縱子片段亞克隆到pBenBP中的BstEII和PmeI位點內，從而產生pBen-ald-bdhB。
使用上述方法對粗提取物來進行關於丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶活性的測定。2種酶活性均在超過包含空載體的對照菌株的水平上得到證實。
實施例10(預示的) 關於1-丁醇生物合成途徑中的基因的轉化載體構建-上遊途徑 這個預示的實施例的目的是描述如何裝配上遊途徑操縱子。一般方法與實施例9中所述的相同。
thlA基因通過PCR使用引物對N44和N45(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因組DNA進行擴增，所述引物對N44和N45分別作為SEQ ID NO33和34給出，從而產生1.2kbp產物。正向引物摻入SphI限制位點和核糖體結合位點(RBS)。反向引物摻入AscI和PstI限制位點。將PCR產物克隆到pCR4Blunt-TOPO內，從而產生pCR4Blunt-TOPO-thlA。質粒DNA由TOPO克隆製備，且用下述引物驗證基因序列M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ IDNO46)、N7SeqF1(SEQ ID NO47)、和N7SeqR1(SEQ ID NO48)(參見表5)。
hbd基因通過PCR使用引物對N42和N43(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物對N42和N43分別作為SEQ ID NO35和36給出，從而產生0.9kbp產物。正向引物摻入SalI限制位點和RBS。反向引物摻入SphI限制位點。將PCR產物克隆到pCR4Blunt-TOPO內，從而產生pCR4Blunt-TOPO-hbd。質粒DNA由TOPO克隆製備，且用下述引物驗證基因序列M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N5SeqF2(SEQID NO51)、和N6SeqR2(SEQ ID NO52)(參見表5)。
CAC0462基因對於在作為第一宿主的大腸桿菌和作為第二宿主的枯草芽孢桿菌中的表達進行密碼子最優化。作為SEQ ID NO76給出的稱為CaTER的新基因由Genscript Corp(Piscataway，NJ)合成。基因CaTER作為BamHI-SalI片段克隆到pUC57載體中且包括RBS，從而產生質粒pUC57-CaTER。
crt基因通過PCR使用引物對N38和N39(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物對N38和N39分別作為SEQ ID NO39和40給出，從而產生834bp產物。正向引物摻入EcoRI和MluI限制位點和RBS。反向引物摻入BamHI限制位點。將PCR產物克隆到pCR4Blunt-TOPO內，從而產生pCR4Blunt-TOPO-crt。質粒DNA由TOPO克隆製備，且用引物M13正向(SEQ ID NO45)和M13反向(SEQ ID NO46)(參見表5)驗證基因序列。
序列證實後，將基因亞克隆到作為克隆平臺的修飾的pUC19載體內。pUC19載體通過SphI/SapI消化進行修飾，從而產生pUC19dSS。消化去除鄰近於MCS的lac啟動子，從而防止操縱子在載體中轉錄。
為了構建上遊途徑操縱子，pCR4 Blunt-TOPO-crt用EcoRI和BamHI進行消化，從而釋放0.8kbp crt片段。pUC19dSS載體也用EcoRI和BamHI進行消化，從而釋放2.0kbp載體片段。crt片段和載體片段使用T4 DNA連接酶(New England Biolabs)連接在一起，以形成pUC19dSS-crt。CaTER基因通過用BamHI和SalI消化pUC57-CaTER從而釋放1.2kbp CaTER片段，插入pCU19dSS-crt內。pUC19dSS-crt用BamHI和SalI進行消化，且使大載體片段與CaTER片段連接，從而產生pUC19dSS-crt-CaTER。為了完成操縱子，連接來自pCR4Blunt-TOPO-hbd的884 bp SalI和SphI片段，來自pCR4Blunt-TOPO-thlA的1.2 kb SphI和PstI thlA片段，以及來自pUC19dSS-crt-CaTER的SalI和PstI消化的大片段。三向連接產物是pUC19dSS-crt-CaTER-hbd-thlA。
pUC19dSS-crt-CaTER-hbd-thlA載體用MluI和AscI進行消化，從而釋放克隆到pBE93衍生物(Caimi，WO 2004/018645，第39-40頁)內的4.1kbp片段，所述pBE93衍生物是大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體，稱為pBenMA。質粒pBenMA通過pBE93載體修飾產生。解澱粉芽孢桿菌中性蛋白酶啟動子(NPR)、信號序列和phoA基因用NcoI/HindIII消化從pBE93中去除。NPR啟動子通過引物BenF和BenMAR從pBE93進行PCR擴增，所述引物BenF和BenMAR分別由SEQ ID NO73和74給出。引物BenMAR摻入啟動子下遊的MluI、AscI和HindIII位點。PCR產物用NcoI和HindIII進行消化，且將片段克隆到載體pBE93的相應位點內，從而產生pBenMA。將上遊操縱子片段亞克隆到pBenMA中的MluI和AscI位點內，從而產生pBen-crt-hbd-CaTER-thlA。
實施例11(預示的) 1-丁醇生物合成途徑在大腸桿菌中的表達 這個預示的實施例的目的是描述如何在大腸桿菌中表達1-丁醇生物合成途徑。
將分別如實施例10和9中所述構建的質粒pBen-crt-hbd-CaTER-thlA和pBen-ald-bdhB轉化到大腸桿菌NM522(ATCC47000)內，且每個操縱子中的基因表達通過SDS-PAGE分析、酶測定和蛋白質印跡分析來監控。對於蛋白質印跡，抗體針對經由Sigma-Genosys(The Woodlands，TX)的合成肽產生。所有基因的表達證實後，用EcoRI和PmeI消化pBen-ald-bdhB，以釋放NPR啟動子-ald-bdhB片段。將EcoRI消化的片段使用DNA聚合酶的克列諾(Klenow)片段(New England Biolabs，目錄號M0210S)平端化。質粒pBen-crt-hbd-CaTER-thlA用PvuII進行消化，以產生線性化平端載體片段。使載體與NPR-ald-bdhB片段連接，從而產生p1B1 O.1和p1B1O.2，包含其中NPR啟動子-ald-bdhB片段為相反方向的完整1-丁醇生物合成途徑。將質粒p1B1 O.1和p1B1 O.2轉化到大腸桿菌NM522內，且如前所述監控基因表達。
將大腸桿菌菌株NM522/p1B1 O.1或NM522/p1B1 O.1接種到包含50mL培養基的250mL搖瓶內，且於250rpm和35℃振蕩。培養基由下述組成葡萄糖，5g/L；MOPS，0.05M；硫酸銨0.01M；一代磷酸鉀，0.005M；S10金屬混合物，1％(v/v)；酵母提取物，0.1％(w/v)；酪蛋白胺基酸，0.1％(w/v)；硫胺素，0.1mg/L；脯氨酸，0.05mg/L；和生物素0.002mg/L，且用KOH滴定至pH7.0。S10金屬混合物包含MgCl2，200mM；CaCl2，70mM；MnCl2，5mM；FeCl3，0.1mM；ZnCl2，0.1mM；鹽酸硫胺素，0.2mM；CuSO4，172μM；CoCl2，253μM；和Na2MoO4，242μM。18-24小時後，如一般方法部分中所述，1-丁醇通過HPLC或GC分析來檢測。
實施例12(預示的) 1-丁醇生物合成途徑在枯草芽孢桿菌中的表達 這個預示的實施例的目的是描述如何在枯草芽孢桿菌中表達1-丁醇生物合成途徑。使用與實施例11中所述相同的方法。
使用分別如實施例10和9中所述構建的上遊和下遊操縱子。將質粒p1B1 O.1和p1B1O.2轉化到枯草芽孢桿菌BE1010(J.Bacteriol.1732278-2282(1991))內，且如實施例11中所述監控每個操縱子中的基因表達。
將枯草芽孢桿菌菌株BE1010/p1B1 O.1或BE1010/p1B1 O.2接種到包含50mL培養基的250mL搖瓶內，且於250rpm和35℃振蕩18小時。培養基由下述組成葡萄糖，5g/L；MOPS，0.05M；穀氨酸，0.02M；硫酸銨0.01M；一代磷酸鉀緩衝液，0.005M；S10金屬混合物(如實施例11中所述)，1％(v/v)；酵母提取物，0.1％(w/v)；酪蛋白胺基酸，0.1％(w/v)；色氨酸，50mg/L；甲硫氨酸，50mg/L；和賴氨酸，50mg/L，且用KOH滴定至pH7.0。18-24小時後，如一般方法部分中所述，1-丁醇通過HPLC或GC分析來檢測。
實施例13 使用重組大腸桿菌從葡萄糖生產1-丁醇 這個實施例描述了1-丁醇在大腸桿菌中的生產。編碼1-丁醇生物合成途徑6個步驟的基因的表達分成3個操縱子。上遊途徑包含在1個操縱子中由thlA、hbd、crt和EgTER編碼的前4個步驟。由ald編碼的下一個步驟由第2個操縱子提供。由yqhD編碼的途徑中的最後1個步驟在第3個操縱子中提供。1-丁醇生產在包含3個操縱子的大腸桿菌菌株中證實。
除非上下文另有說明，這個實施例中描述的克隆引物通過其SEQID NO參考表4，且測序和PCR篩選引物通過其SEQ ID NO參考表5。
乙醯輔酶A乙醯轉移酶。thlA基因通過PCR使用引物對N44和N45(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因組DNA進行擴增，所述引物對N44和N45分別作為SEQ ID NO33和34給出，從而產生1.2kbp產物。正向引物摻入SphI限制位點和核糖體結合位點(RBS)。反向引物摻入AscI和PstI限制位點。將PCR產物克隆到pCR4Blunt-TOPO(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)內，從而產生pCR4Blunt-TOPO-thlA。質粒DNA由TOPO克隆製備，且基因序列用下述引物驗證M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N7SeqF1(SEQ ID NO47)、和N7SeqR1(SEQ ID NO48)(參見表5)。
3-羥丁醯輔酶A脫氫酶。hbd基因通過PCR使用引物對N42和N43(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物對N42和N43分別作為SEQ ID NO35和36給出，從而產生0.9kbp產物。正向引物摻入SalI限制位點和RBS。反向引物摻入SphI限制位點。將PCR產物克隆到pCR4Blunt-TOPO內，從而產生pCR4Blunt-TOPO-hbd。質粒DNA由TOPO克隆製備，且基因序列用下述引物驗證M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N5SeqF2(SEQ ID NO51)、和N6SeqR2(SEQ ID NO52)(參見表5)。
巴豆酸酶。crt基因通過PCR使用引物對N38和N39(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因組DNA進行擴增，所述引物對N38和N39分別作為SEQ ID NO39和40給出，從而產生834bp產物。正向引物摻入EcoRI和MluI限制位點和RBS。反向引物摻入BamHI限制位點。將PCR產物克隆到pCR4Blunt-TOPO內，從而產生pCR4Blunt-TOPO-crt。質粒DNA由TOPO克隆製備，且基因序列用引物M13正向(SEQ ID NO45)和M13反向(SEQ ID NO46)(參見表5)驗證。
丁醯輔酶A脫氫酶(反式-2-烯醯輔酶A還原酶)。CAC0462基因針對作為第一宿主的大腸桿菌和作為第二宿主的枯草芽孢桿菌中的增強的密碼子選擇進行合成。合成新基因(CaTER，SEQ ID NO76)且在pUC57載體中作為BamHI-SalI片段由Genscript Corporation(Piscataway，NJ)克隆，且包括RBS。
來自小眼蟲(TER，GenBank No.Q5EU90)的關於丁醯輔酶A脫氫酶的備選基因針對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的增強的密碼子選擇進行合成。基因由GenScript Corporation合成和克隆到pUC57內，從而產生pUC57::EgTER。引物N85和N86(分別為SEQ ID NO80和81)連同作為模板DNA的pUC57::EgTER，提供包含來自pUC57::EgTER DNA的1224bp的PCR片段。1224bp序列作為SEQ IDNO77給出，其中bp1-1218是EgTER(opt)的編碼序列(cds)。EgTER(opt)是密碼子最優化的TER基因，從而缺乏正常的線粒體前序列，以便在大腸桿菌中起作用(Hoffmeister等人，J.Biol.Chem.2804329(2005))。
將EgTER(opt)克隆到pCR4Blunt-TOPO內，並且其序列用引物M13正向(SEQ ID NO45)和M13反向(SEQ ID NO46)證實。需要另外的測序引物N62SeqF2(SEQ ID NO114)、N62SeqF3(SEQID NO115)、N62SeqF4(SEQ ID NO116)、N63SeqR1(SEQ IDNO117)、N63SeqR2(SEQ ID NO118)、N63SeqR3(SEQ ID NO119)和N63SeqR4(SEQ ID NO120)以對PCR產物完全測序。1.2kbpEgTER(opt)序列隨後用HincII和PmeI切割，並且克隆到用HincII線性化的pET23+(Novagen)內。EgTER(opt)基因對於啟動子的方向通過用引物T7Primer和N63SeqR2(分別為SEQ ID NO82和118)的菌落PCR篩選證實。將所得到的質粒pET23+::EgTER(opt)轉化到BL21(DE3)(Novagen)內用於表達研究。
反式-2-烯醯輔酶A還原酶活性如Hoffmeister等人，J.Biol.Chem.280，4329(2005)所述進行測定。在一般測定中，與未誘導的培養物中的0.547μmol mg-1min-1比較，誘導的BL21(DE3)/pET23+::EgTER(opt)培養物中的EgTER(opt)蛋白質比活性測定為1.9μmol mg-1min-1。
隨後將EgTER(opt)基因克隆到在trc啟動子控制下的pTrc99a載體內。EgTER(opt)基因作為1287-bpBamHI/SalI片段從pET23+::EgTER(opt)分離。4.2kbp載體pTrc99a用BamHI/SalI線性化。使載體與片段連接，從而產生5.4kbp pTrc99a-EgTER(opt)。陽性克隆通過用引物Trc99aF和N63SeqR3(分別為SEQ ID NO83和119)的菌落PCR來證實，從而產生0.5kb產物。
包含編碼乙醯輔酶A乙醯轉移酶(thlA)、3-羥丁醯輔酶A脫氫酶(hbd)、巴豆酸酶(crt)、和丁醯輔酶A脫氫酶(反式-2-烯醯輔酶A還原酶，EgTER(opt))基因的質粒pTrc99a-E-C-H-T構建。為了起始包含上遊途徑(EgTER(opt)、crt、hbd和thlA)的4基因操縱子的構建，pCR4Blunt-TOPO-crt用EcoRI和BamHI進行消化，從而釋放0.8kbp crt片段。pUC19dSS載體(在實施例10中描述)同樣用EcoRI和BamHI進行消化，從而釋放2.0kbp載體片段。crt片段和載體片段使用T4DNA連接酶(New England Biolabs)連接在一起，以形成pUC19dSS-crt。CaTER基因通過用BamHI和SalI消化pUC57-CaTER從而釋放1.2kbp CaTER片段，插入pCU19dSS-crt內。pUC19dSS-crt用BamHI和SalI進行消化，且使大載體片段與CaTER片段連接，從而產生pUC19dSS-crt-CaTER。為了完成操縱子，連接來自pCR4Blunt-TOPO-hbd的884bp SalI和SphI片段，來自pCR4Blunt-TOPO-thlA的1.2kb SphI和PstI thlA片段，以及來自pUC19dSS-crt-CaTER的SalI和PstI消化的大片段。三向連接的產物是所謂的pUC19dSS-crt-CaTER-hbd-thlA或pUC19dss::Operonl。
從pTrc99a-EgTER(opt)獲得的丁醯輔酶A脫氫酶活性比來自CaTER構建體的更高，因此，構建來源於pTrc99a-EgTER(opt)的操縱子。CaTER基因通過用BamHI/SalI消化，且將5327-bp載體片段凝膠純化，從pUC19dss::Operonl中取出。載體用克列諾處理且重新連接，從而產生pUC19dss::Operon1ΔCaTer。2934-bp crt-hbd-thlA(C-H-T)片段隨後作為EcoRI/PstI片段從pUC19dssOperon1 ΔCaTer分離。C-H-T片段用克列諾處理以使末端變為平頭的。使平端化載體與平端化C-H-T片段連接，以產生pTrc99a-E-C-H-T。菌落PCR反應用引物N62SeqF4和N5SeqF4(分別為SEQ ID NO116和84)進行，以證實插入片段的方向。
包含編碼丁醛脫氫酶(ald和ald(opt))的基因的質粒pBHR T7-ald和pBHR-Ptrc-ald(opt)的構建。將PT7-ald操縱子從pDEST14-ald(實施例6)亞克隆到廣宿主範圍質粒pBHR1(MoBitec，Goettingen，德國)內，以產生pBHR1 PT7-ald。pBHR1質粒與pUC19或pBR322質粒相容，因此pBHR1 PT7-ald可以與攜帶上遊途徑操縱子的pUC19或pBR322衍生物組合使用，以用於在大腸桿菌中的1-丁醇生產。pDEST14-ald質粒用BglII進行消化，且用DNA聚合酶的克列諾片段處理，以產生平端。質粒隨後用EcoRI進行消化，且將2,245bp PT7-ald片段凝膠純化。質粒pBHR1用ScaI和EcoRI進行消化，且將4,883bp片段凝膠純化。使PT7-ald片段與pBHR1載體連接，從而產生pBHRT7-ald。使用引物T-ald(BamHI)和B-ald(EgTER)(分別為SEQ IDNO85和86)的轉化體的菌落PCR擴增證實預期的1.4kb PCR產物。pBHR T7-ald克隆使用EcoRI和DrdI的限制酶切作圖證實預期的4,757和2,405bp片段。
對於丁醛脫氫酶活性測定，如實施例1中所述，將質粒pBHR T7-ald轉化到BL21StarTM(DE3)細胞(Invitrogen)內，且通過添加L-阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。如實施例6中所述，如通過340nm處吸光度中的增加測量的，通過監控NADH的形成來測定醯化醛脫氫酶活性。
關於來自拜氏梭菌ATCC 35702的ald基因的備選DNA序列由GenScript Corporation(Biscataway，NJ)合成(對於大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的密碼子選擇最優化)且克隆到pUC57內，從而產生質粒pUC57-ald(opt)。pUC57-ald(opt)用SacI和SalI進行消化，以釋放包含密碼子最優化基因、ald(opt)和已用於大腸桿菌的RBS的1498bp片段。1498bp片段的序列作為SEQ ID NO78給出。
pTrc99a用SacI和SalI進行消化，從而產生4153bp載體片段，使所述載體片段與1498bp ald(opt)片段連接，以產生pTrc-ald(opt)。合成基因ald(opt)的表達在IPTG誘導型Ptrc啟動子的控制下。
將Ptrc-ald(opt)操縱子亞克隆到廣宿主範圍質粒pBHR1(MoBitec)內，以與上述上遊途徑質粒相容。Ptrc-ald(opt)片段用在相應引物內摻入BspEI和ScaI限制位點的T-Ptrc(BspEI)和B-aldopt(ScaI)(分別為SEQ ID NO87和88)從pTrc99A::ald(opt)進行PCR擴增。PCR產物用BspEI和ScaI進行消化。質粒pBHR1用ScaI和BspEI進行消化，且將4,883bp片段凝膠純化。使Ptrc-ald(opt)片段與pBHR1載體連接，從而產生pBHR-PcatPtrc-ald(opt)。pBHR-PcatPtrc-ald(opt)克隆使用ScaI和BspEI的限制酶切作圖證實預期的4,883和1,704bp片段。為了去除質粒攜帶的cat啟動子(Pcat)區域，質粒pBHR-PcatPtrc-ald(opt)用BspEI和AatII進行消化，且將6,172bp片段凝膠純化。T-BspEIAatII和B-BspEIAatII(分別為SEQ ID NOs89和90)在包含50mM NaCl、10mM Tris-HCl和10mM MgCl2(pH7.9)的溶液中混合至100μM的終濃度，且通過於75℃溫育5分鐘並緩慢冷卻至室溫進行雜交。使雜交的寡核苷酸與6,172bp片段連接，從而產生pBHR-Ptrc-ald(opt)。
表達丁醇脫氫酶(yqhD)的大腸桿菌菌株的構建。大腸桿菌包含鑑定為1，3-丙二醇脫氫酶(美國專利號6,514,733)的天然基因(yqhD)。yqhD基因與梭菌屬中的基因adhB具有40％的同一性，所述adhB基因是可能的NADH依賴性丁醇脫氫酶。yqhD基因在大腸桿菌菌株MG1655 1.6yqhD::Cm(WO 2004/033646)中使用λ Red技術(Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.976640(2000))，置於葡糖異構酶啟動子1.6GI(SEQ ID NO91)變體的組成型表達控制下。類似地，天然啟動子用1.5GI啟動子(WO 2003/089621)(SEQ ID NO92)替換，從而產生菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm，因此用1.5GI啟動子替換MG 1655 1.6yqhD::Cm的1.6GI啟動子。
P1溶解產物由MG1655 1.5GI yqhD::Cm製備，且將盒移動至表達菌株MG1655(DE3)和BL21(DE3)(Invitrogen)，從而分別產生MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm和BL21(DE3)1.5GI-yqhD::Cm，所述MG1655(DE3)由大腸桿菌菌株MG1655和λDE3溶原化試劑盒(Invitrogen)製備。
來自重組大腸桿菌的1-丁醇生產的證實。大腸桿菌菌株MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm用質粒pTrc99a-E-C-H-T和pBHR T7-ald轉化，以產生菌株MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHRT7-ald。2個獨立分離物最初在包含50μg/mL卡那黴素和100μg/mL羧苄青黴素的LB培養基中生長。細胞用於接種包含15、50和150mL的TM3a/葡萄糖培養基(含合適的抗生素)的搖瓶(約175mL總體積)，以分別代表高、中和低氧條件。TM3a/葡萄糖培養基包含(每升)10g葡萄糖、13.6g KH2PO4、2.0g檸檬酸一水化物、3.0g(NH4)2SO4、2.0g MgSO4·7H2O、0.2g CaCl2·2H2O、0.33g檸檬酸鐵銨、1.0mg鹽酸硫胺素、0.50g酵母提取物、和10mL痕量元素溶液，用NH4OH調節至pH6.8。所述痕量元素溶液包含檸檬酸·H2O(4.0g/L)、MnSO4·H2O(3.0g/L)、NaCl(1.0g/L)、FeSO4·7H2O(0.10g/L)、CoCl2·6H2O(0.10g/L)、ZnSO4·7H2O(0.10g/L)、CuSO4·5H2O(0.010g/L)、H3BO3(0.010g/L)、和Na2MoO4·2H2O(0.010g/L)。瓶以≤0.01單位的起始OD600接種，且於34℃伴隨300rpm振蕩溫育。包含15和50mL培養基的瓶蓋上通氣蓋；包含150mL的瓶蓋上非通氣蓋，以使氣體交換最小化。添加IPTG至0.04mM的終濃度；添加時瓶的OD600≥0.4單位。
誘導後約15小時，如一般方法部分中所述，等分試樣的液體培養基通過具有折射率(RI)檢測的HPLC(Shodex Sugar SH1011柱)，和具有火焰離子化檢測(FID)的GC(Varian CP-WAX 58(FFAP)CB柱，25m x 0.25mm id X 0.2μm膜厚度)分析1-丁醇含量。1-丁醇測定結果在表6中給出。
表6 通過大腸桿菌菌株MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的1-丁醇生產。
-值由HPLC分析測定。
-菌株後綴「a」和「b」指示獨立分離物。
MG 1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的2個獨立分離物以相同方式測試1-丁醇生產，只是除了培養基包含5g/L酵母提取物。結果顯示於表7中。
表7 通過大腸桿菌菌株MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的1-丁醇生產。
-定量值由HPLC分析測定。
-「-」＝未檢測。
-菌株後綴「a」和「b」指示獨立分離物。
大腸桿菌BL21(DE3)1.5GI-yqhD::Cm用質粒pTrc99a-E-C-H-T和pBHR T7-ald轉化，以產生菌株BL21(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald。如上所述準確地測試2個獨立分離物的1-丁醇生產。結果在表8和9中給出。
表8 通過大腸桿菌菌株BL21(DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的1-丁醇生產。
-定量值由HPLC分析測定。
-「-」指示未檢測。
「+」指示通過GC的陽性、定性鑑定，所述GC具有比HPLC更低的檢出限。
-菌株後綴「a」和「b」指示獨立分離物。
表9 通過大腸桿菌菌株BL21(DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的1-丁醇生產。
-定量值由HPLC分析測定。
-「-」指示未檢測。
「+」指示通過GC的陽性、定性鑑定，所述GC具有比HPLC更低的檢出限。
-菌株後綴「a」和「b」指示獨立分離物。
大腸桿菌菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm用質粒pTrc99a-E-C-H-T和pBHR-Ptrc-ald(opt)轉化，以產生菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)。2個分離物最初在包含50μg/mL卡那黴素和100μg/mL羧苄青黴素的LB培養基中生長。細胞用於接種包含50和150mL的TM3a/葡萄糖培養基(含合適的抗生素)的搖瓶(約175mL總體積)。瓶以≤0.04單位的起始OD550接種，且如上所述溫育，含和不含誘導。添加IPTG至0.4mM的終濃度；添加時瓶的OD550為0.6-1.2單位。在這種情況下，誘導對於1-丁醇途徑基因表達不是必要的，這是因為IPTG誘導型啟動子的洩漏程度和1.5GI啟動子的組成型性質；然而，誘導提供廣泛範圍的表達。
誘導後約15小時，如上所述，等分試樣的液體培養基通過具有火焰離子化檢測的GC分析1-丁醇含量。結果在表10中給出。對於重組大腸桿菌菌株，在所有情況下產生1-丁醇；在分開的實驗中，野生型大腸桿菌菌株顯示不產生可檢測的1-丁醇(數據未顯示)。
表10 通過大腸桿菌菌株MG16551.5GI-yqhD::Cm/ pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)的1-丁醇生產。
-菌株後綴「a」和「b」指示獨立分離物。
實施例14 使用重組枯草芽孢桿菌從葡萄糖生產1-丁醇 這個實施例描述了1-丁醇在枯草芽孢桿菌中的生產。編碼6種酶活性的1-生物合成途徑的6種基因分成2個操縱子用於表達。將該途徑的前3種基因(thl、hbd和crt)整合到枯草芽孢桿菌BE1010染色體內(Payne和Jackson，J.Bacteriol.1732278-2282(1991))。將後3種基因(EgTER、ald和bdhB)克隆到表達質粒內，且轉化到攜帶整合的1-丁醇基因的芽孢桿菌屬菌株內。
除非上下文另有說明，這個實施例中描述的克隆引物通過其SEQID NO參考表4，且測序和PCR篩選引物通過其SEQ ID NO參考表5。
整合質粒。質粒pFP988是芽孢桿菌屬整合載體，它包含來自pBR322的大腸桿菌複製子、用於在大腸桿菌中進行選擇的氨苄青黴素抗生素標記和與芽孢桿菌屬染色體中sacB基因同源的2個部分，所述2個同源部分通過同源重組指導載體和間插序列整合。在sacB同源區之間是可以指導克隆的基因合成和分泌的Pamy啟動子和信號序列，His-標籤和作為用於芽孢桿菌屬的選擇標記的紅黴素。Pamy啟動子和信號序列來自解澱粉芽孢桿菌α澱粉酶。啟動子區還包含lacO序列用於通過lacI阻抑蛋白調節表達。pFP988(6509bp)序列作為SEQ ID NO79給出。
因為1-丁醇途徑基因將在細胞質中表達，所以缺失澱粉酶信號序列。質粒pFP988使用引物Pamy/lacO F和Pamy/lacO R進行擴增，從而產生包含Pamy/lacO啟動子的317bp(0.3kbp)產物。Pamy/lacO F引物的5＇末端摻入BsrGI限制位點隨後為EcoRI位點。Pamy/lacO R引物的5＇末端摻入BsrGI限制位點隨後為PmeI限制位點。將PCR產物TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO內，從而產生pCR4Blunt-TOPO-Pamy/lacO。質粒DNA由過夜培養物製備，且提交用於由M13正向和M13反向引物(分別為SEQ ID NOs45和46)測序，以確保沒有突變已引入啟動子內。pCR4Blunt-TOPO-Pamy/lacO克隆用BsrGI進行消化，且將0.3kbp產物凝膠純化。載體pFP988用BsrGI進行消化，從而導致產生來自5＇sacB同源區的11bp缺失以及Pamy/lacO啟動子和信號序列和His標籤的去除。將6kbp BsrGI消化的載體凝膠純化且與Pamy/lacO BsrGI插入片段連接。所得到的質粒用引物Pamy SeqF2和Pamy SeqR篩選，以確定啟動子的方向。正確克隆使Pamy/lacO啟動子恢復其原始方向且命名為pFP988Dss。
具有基因thl-crt的盒通過SOE(重疊延伸剪接)來構建。基因使用模板pUC19dss::Operonl進行擴增。thl引物是Top TF和Bot TR，從而擴增0.9kbp產物。crt引物是Top CF和Bot CR，從而擴增1.3kbp產物。2種基因通過SOE用使用引物Top TF和Bot CR的PCR擴增進行連接，從而產生2.1kbp產物，將所述2.1kbp產物TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO內，從而產生pCR4Blunt-TOPO-T-C。提交克隆用於測序以證實序列。質粒pCR4Blunt-TOPO-T-C用BstEII和PmeI進行消化，從而釋放凝膠純化的2.1kbp片段。插入片段用克列諾聚合酶處理，以使BstEII位點變成平頭的。載體pFP988Dss用PmeI進行消化，且用牛小腸鹼性磷酸酶(New England BioLabs)處理以防止自身連接。使2.1kbp thl-crt片段與消化的pFP988Dss連接，且轉化到大腸桿菌Top10細胞內。轉化體通過PCR擴增篩選0.7kbp產物，所述PCR擴增使用Pamy SeqF2和N7SeqR2，正確產物命名為pFP988Dss-T-C。
thl-crt盒的構建在2種基因之間產生獨特的SalI和SpeI位點。為了向盒中添加hbd基因，從pCR4Blunt-TOPO-hbd亞克隆作為0.9kbpSalI/SpeI片段的hbd基因。載體pFP988Dss-T-C用SalI和SpeI進行消化，且將8kbp載體片段凝膠純化。使載體與hbd插入片段連接，且轉化到大腸桿菌Top10細胞內。轉化體通過PCR擴增篩選3.0kbp片段，所述PCR擴增使用Pamy SeqF和N3SeqF3。所得到的質粒命名為pFP988Dss-T-H-C。
Pamy啟動子隨後替換為來自質粒pMUTIN4的Pspac啟動子(Vagner等人，Microbiol.1443097-3104(1998))。Pspac啟動子從pMUTIN4使用引物Spac F和Spac R作為0.4kbp產物擴增，且TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO內。轉化體通過PCR擴增篩選0.5kbp插入片段的存在，所述PCR擴增使用M13正向和M13反向引物。提交陽性克隆用於由相同引物測序。質粒pCR4Blunt-TOPO-Pspac用SmaI和XhoI進行消化，且將0.3kbp片段凝膠純化。載體pFP988Dss-T-H-C用SmaI和XhoI進行消化，且9kbp載體通過凝膠純化來分離。使消化的載體與Pspac插入片段連接，且轉化到大腸桿菌Top10細胞內。轉化體通過使用引物SpacF Seq和N7SeqR2的PCR擴增進行篩選。陽性克隆產生0.7kbp產物。質粒DNA由陽性克隆製備，且通過用引物SpacF Seq和N3SeqF2的PCR擴增進一步篩選。陽性克隆產生3kbpPCR產物，且命名為pFP988DssPspac-T-H-C。
整合到枯草芽孢桿菌BE1010內，以形成包含外源thl、hbd和crt基因的枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28。枯草芽孢桿菌BE1010的感受態細胞如Doyle等人，J.Bacteriol.144957-966(1980)中所述進行製備。感受態細胞通過離心進行收穫，且將細胞沉澱重懸浮於小體積的細胞上清液中。向1體積感受態細胞中加入2體積SPII-EGTA培養基(Methods for General and Molecular Bacteriology，P.Gerhardt等人，Eds，American Society for Microbiology，Washington，DC(1994))。將等分試樣的0.3mL細胞分配到試管內，且將質粒pFP988DssPspac-T-H-C加入管中。細胞於37℃伴隨振蕩溫育30分鐘，這之後向每個管中加入0.1mL 10％酵母提取物，且將細胞再溫育60分鐘。轉化體在LB紅黴素板上進行鋪平板用於選擇，其中使用雙重瓊脂覆層法(Methods for General and Molecular Bacteriology，同上)。轉化體通過使用引物Pamy SeqF和N5SeqF3的PCR擴增進行最初篩選。擴增預期2kbp PCR產物的陽性克隆通過PCR擴增進一步篩選。如果盒插入染色體內已經由雙交換事件發生，那麼引物組sacB Up和N7SeqR2以及引物組sacB Dn和N4SeqR3將分別擴增1.7kbp和a2.7kbp產物。陽性克隆被鑑定且命名為枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28。
EgTER、ald和bdhB基因的質粒表達。剩餘的3種1-丁醇基因由質粒pHT01(MoBitec)表達。質粒pHT01是經由θ機制複製的芽孢桿菌屬-大腸桿菌穿梭載體。克隆的蛋白質由與lacO序列融合的GroEL啟動子表達。lacO下遊是來自gsiB基因的有效RBS，隨後為MCS。ald基因通過PCR用引物AF BamHI和AR Aat2使用pUC19dHS-ald-bdhB(在實施例9中描述)作為模板進行擴增，從而產生1.4kbp產物。將產物TOPO克隆到pCR4-TOPO內且轉化到大腸桿菌Top10細胞內。轉化體用M13正向和M13反向引物進行篩選。陽性克隆擴增1.6kbp產物。提交克隆用於由下述引物測序M13正向和M13反向、N31SeqF2、N31SeqF3、N32SeqR2、N32SeqR3和N32SeqR4。質粒命名為pCR4TOPO-B/A-ald。
載體pHT01和質粒pCR4TOPO-B/A-ald都用BamHI和AatII進行消化。使7.9kbp載體片段與1.4kbp ald片段連接在一起，以產生pHT01-ald。將連接物轉化到大腸桿菌Top10細胞內，且轉化體通過PCR擴增篩選1.3kbp產物，所述PCR擴增使用引物N31SeqF1和HT R。
為了給pHT01載體添加途徑的最後2個步驟，設計2種克隆方案。對於2種方案，EgTER和bdhB通過SOE一起擴增。隨後，將EgTER-bdh片段克隆到pHT01-ald內，從而產生pHT01-ald-EB，或克隆到pCR4-TOPO-B/A-ald內，從而產生pCR4-TOPO-ald-EB。隨後將來自TOPO載體的ald-EgTer-bdhB片段克隆到pHT01內，從而產生pHT01-AEB。
EgTER-bdhB片段使用引物正向1(E)和反向2(B)進行PCR擴增，其中使用作為SEQ ID NO208給出的模板DNA。將所得到的2.5kbp PCR產物TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO內，從而產生pCR4Blunt-TOPO-E-B。將TOPO反應物轉化到大腸桿菌Top10細胞內。菌落用M13正向和M13反向引物通過PCR擴增進行篩選。陽性克隆產生2.6kbp產物。提交pCR4Blunt-TOPO-E-B的克隆用於由下述引物測序M 13正向和反向，N62SeqF2、N62SeqF3、N62SeqF4、N63SeqR1、N63SeqR2、N63SeqR3、N11Seq F1和N11Seq F2、N12SeqR1和N12SeqR2。
質粒pCR4Blunt-TOPO-E-B用HpaI和AatII進行消化，以釋放2.4kbp片段。E-B片段用克列諾聚合酶處理以使末端變成平頭的，且隨後進行凝膠純化。質粒pHT01-ald用AatII進行消化，且用克列諾聚合酶處理，以使末端變成平頭的。載體隨後用牛小腸鹼性磷酸酶處理且進行凝膠純化。使E-B片段與線性化載體pHT01-ald連接，轉化到大腸桿菌Top10細胞內，且在包含100μg/mL氨苄青黴素的LB板上選擇。轉化體通過使用引物N3SeqF1和N63SeqR1進行PCR擴增以產生2.4kbp產物來篩選。將所得到的質粒pHT01-ald-EB轉化到JM103細胞recA+大腸桿菌菌株內。由recA+菌株製備的質粒形成比recA-菌株更多的多聚體。使用質粒多聚體而不是單體的枯草芽孢桿菌轉化更有效(Methods for General and Molecular Bacteriology，同上)。質粒DNA由JM103製備且轉化到感受態枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28內，從而形成菌株枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28/pHT01-ald-EB。感受態細胞如先前所述進行製備和轉化。轉化體在包含5μg/mL氯黴素的LB板上進行選擇，且通過菌落PCR篩選1.3kbp產物，所述菌落PCR使用引物N31SeqF1和N63SeqR4。
在可替代的克隆策略中，pCR4Blunt-TOPO-E-B用HpaI和AatII進行消化，從而釋放凝膠純化的2.4kbp片段。質粒pCR4-TOPO-B/A-ald用HpaI和AatII進行消化，且將5.4kbp載體片段凝膠純化。使來自pCR4-TOPO-B/A-ald的載體片段與HpaI-AatII E-B片段連接，從而產生pCR4-TOPO-ald-EB。將連接物轉化到大腸桿菌Top10細胞內，且所得到的轉化體通過PCR擴增篩選2.1kbp產物，所述PCR擴增使用引物N11SeqF2和N63SeqR4。質粒pCR4-TOPO-ald-EB用BamHI和AatII和SphI進行消化。BamHI/AatII消化釋放凝膠純化的3.9kbp ald-EB片段。SphI消化的目的是將剩餘載體切割成較小片段，從而使得它不能在凝膠上與ald-EB插入片段共遷移。載體pHT01用BamHI和AatII進行消化，且將7.9kbp載體片段凝膠純化。使載體與ald-EB插入片段連接，以形成質粒pHT01-AEB，且轉化到大腸桿菌Top10細胞內。菌落通過PCR擴增篩選1.5kbp產物，所述PCR擴增使用引物N62SeqF4和HT R。製備質粒且轉化到JM103內。質粒DNA由JM 103製備且轉化到感受態枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28內，從而形成菌株枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm # 28/pHT01-AEB。感受態BE1010細胞如先前所述進行製備和轉化。芽孢桿菌屬轉化體通過PCR擴增篩選1.3kbp產物，所述PCR擴增使用引物N31SeqF1和N63SeqR4。
來自重組枯草芽孢桿菌的1-丁醇生產的證實。
每種菌株枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28/pHT01-ald-EB和枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm #28/pHT01-AEB的3個獨立分離物接種到包含15mL培養基的搖瓶(約175mL總體積)內。也包括缺乏外源1-丁醇、6基因途徑的枯草芽孢桿菌BE1010菌株作為陰性對照。培養基包含(每升)10mL 1M(NH4)2SO4；5mL 1M磷酸鉀緩衝液，pH7.0；100mL 1M MOPS/KOH緩衝液，pH7.0；20mL 1M L-穀氨酸，鉀鹽；10g葡萄糖；各10mL 5g/L L-甲硫氨酸、L-色氨酸和L-賴氨酸；酵母提取物和酪蛋白胺基酸各0.1g；20mL金屬混合物；以及合適的抗生素(5mg氯黴素和紅黴素用於重組菌株)。金屬混合物包含200mMMgCl2、70mM CaCl2、5mM MnCl2、0.1mM FeCl3、0.1mM ZnCl2、0.2mM鹽酸硫胺素、172μM CuSO4、253μM CoCl2、和242μMNa2MoO4。瓶以≤0.1單位的起始OD600接種，用非通氣蓋密封，且於37℃伴隨約200rpm振蕩溫育。
接種後約24小時，如一般方法部分中所述，等分試樣的液體培養基通過具有折射率(RI)檢測的HPLC(Shodex Sugar SH1011柱)，和具有火焰離子化檢測(FID)GC(Varian CP-WAX 58(FFAP)CB柱，0.25mm X 0.2μm X 25m)分析1-丁醇含量。1-丁醇測定結果在表11中給出。
表11 通過菌株枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28/DHT01-ald-EB和枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28/DHT01-AEB的1-丁醇生產。
*通過GC測定的濃度。
-菌株後綴「a」、「b」和「c」指示獨立分離物。
實施例15 通過重組大腸桿菌從葡萄糖或蔗糖生產1-丁醇。
為了賦予大腸桿菌MG1655使用蔗糖作為碳源和能源用於1-丁醇生產的能力，將來自質粒pScrI(下文描述)的蔗糖利用基因簇(cscBKA)亞克隆到這種生物中的pBHR-Ptrc-ald(opt)(在實施例13中描述)內。蔗糖利用基因(cscA、cscK和cscB)編碼作為SEQ ID NO157給出的蔗糖水解酶(CscA)，作為SEQ ID NO158給出的D-果糖激酶(CscK)，和作為SEQ ID NO159給出的蔗糖透性酶(CscB)。為了允許來自其天然啟動子的3種基因的組成型表達，調節該基因簇的蔗糖特異性阻抑基因cscR不存在於構建體中。
蔗糖利用基因簇cscBKA在質粒pBHR-Ptrc-ald(opt)中的克隆和表達。作為SEQ ID NO156給出的蔗糖利用基因簇cscBKA，從蔗糖利用大腸桿菌菌株基因組DNA中分離，所述蔗糖利用大腸桿菌菌株來源於大腸桿菌菌株ATCC 13281。基因組DNA用BamHI和EcoRI消化完全。從瓊脂糖凝膠分離平均大小約4kbp的片段，與質粒pLitmus28(New England Biolabs，Beverly，MA)連接，隨後用BamHI和EcoRI進行消化。將所得到的DNA轉化到超感受態(ultracompetent)大腸桿菌TOP10F』(Invitrogen，Carlsbad，CA)內。轉化體在包含1％蔗糖和100μg/mL氨苄青黴素的MacConkey瓊脂板上進行鋪平板，且篩選紫色菌落。從紫色轉化體中分離質粒DNA，且使用下述引物測序M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、scr1(SEQID NO160)、scr2(SEQ ID NO161)、scr3(SEQ ID NO162)和scr4(SEQ ID NO163)。包含cscB、cscK和cscA(cscBKA)基因的質粒命名為pScr1。
質粒pScrI用XhoI進行消化，且用DNA聚合酶的克列諾片段處理，以產生平端。質粒隨後用AgeI進行消化，且將4,179bp cscBKA基因簇片段凝膠純化。質粒pBHR-Ptrc-ald(opt)如實施例13中所述製備，且用AgeI和NaeI進行消化。將所得到的6,003bp pBHR-Ptrc-ald(opt)片段凝膠純化。使cscBKA片段與pBHR-Ptrc-ald(opt)連接，從而產生pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB。將質粒pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB轉化到大腸桿菌NovaXG電轉化感受態細胞(Novagen，Madison，WI)內，且蔗糖利用通過使轉化體在包含2％蔗糖和25μg/mL卡那黴素的McConkey瓊脂板上鋪平板來證實。在pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB構建體中，蔗糖利用基因作為獨立片段以cscA、cscK和cscB的順序克隆到Ptrc-ald(opt)下遊。
可替代地，將蔗糖利用基因以相反方向克隆到pBHR-Ptrc-ald(opt)中。質粒pBHR-Ptrc-ald(opt)用ScaI和AgeI進行消化，且將5,971bppBHR-Ptrc-ald(opt)片段凝膠純化。使如上所述製備的4,179bp cscBKA片段與pBHR-Ptrc-ald(opt)片段連接，從而產生pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA。將質粒pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA轉化到大腸桿菌NovaXG電轉化感受態細胞(Novagen，Madison，WI)內，且蔗糖利用通過使轉化體在包含2％蔗糖和25μg/mL卡那黴素的McConkey瓊脂板上鋪平板來證實。在pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA構建體中，蔗糖利用基因作為獨立片段以cscB、cscK和cscA的順序克隆到Ptrc-ald(opt)下遊。
使用重組大腸桿菌從葡萄糖或蔗糖的1-丁醇生產的證實。大腸桿菌菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm(在實施例13中描述)用質粒pTrc99a-E-C-H-T(如實施例13中所述製備)和pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB或pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA轉化，以產生2種菌株，MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB#9和MG16551.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA#1。2種菌株的起子培養物通過使細胞在包含25μg/mL卡那黴素和100μg/mL羧苄青黴素的LB培養基中培養細胞來製備。如實施例13中所述，這些細胞隨後用於接種包含50、70和150mL的TM3a/葡萄糖培養基(含合適的抗生素)的搖瓶(約175mL總體積)，以分別代表高、中和低氧條件。在包含100μg/mL羧苄青黴素的TM3a/葡萄糖培養基中生長的第3種菌株大腸桿菌MG 1655/pScr1，用作陰性對照。對於每種菌株，相同組的瓶用TM3a/蔗糖培養基(含合適的抗生素)製備。TM3a/蔗糖培養基等同於TM3a/葡萄糖培養基，只是除了蔗糖(10g/L)替換葡萄糖。瓶以≤0.03單位的起始OD550接種，且如實施例13中所述溫育。除了陰性對照瓶，當培養物達到OD550 0.2-1.8單位時，向瓶中加入IPTG(終濃度0.04mM)。當培養物OD550增加至少3倍時收穫細胞。
接種後約24小時，如一般方法部分中所述，等分試樣的液體培養基通過具有折射率(RI)檢測的HPLC(Shodex Sugar SH1011柱)，和具有火焰離子化檢測(FID)的GC(HP-INNOWax柱，30m x 0.53mm id，1μm膜厚度)分析1-丁醇含量。
在含葡萄糖和蔗糖的培養基中生長後培養物中的1-丁醇濃度分別在表12和表13中給出。包含1-丁醇生物合成途徑的2種重組大腸桿菌菌株在所有氧條件下從葡萄糖和蔗糖產生1-丁醇，而陰性對照菌株不產生可檢測的1-丁醇。
表12 通過重組大腸桿菌菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB#9和 MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt) -cscBKA#1從葡萄糖的1-丁醇生產 表13 通過重組大腸桿菌菌株從蔗糖的1-丁醇生產。
實施例16 使用重組枯草芽孢桿菌從蔗糖生產1-丁醇。
這個實施例描述了使用重組枯草芽孢桿菌從蔗糖生產1-丁醇。基本上如實施例14中所述檢查枯草芽孢桿菌菌株ΔsacB::T-H-C::erm#28/pHT01-ald-EB(實施例14)的2個獨立分離物的1-丁醇生產。將菌株接種到包含20mL或100mL培養基的搖瓶(約175mL總體積)內，以分別模擬高和低氧條件。培養基A完全如實施例14中所述，只是除了葡萄糖替換為5g/L蔗糖。培養基B等同於實施例13中所述的TM3a/葡萄糖培養基，只是除了葡萄糖替換為10g/L蔗糖，且培養基補加了(每L)各10mL 5g/L L-甲硫氨酸、L-色氨酸和L-賴氨酸溶液。瓶以≤0.1單位的起始OD550接種，蓋上通氣蓋，且於34℃伴隨300rpm振蕩溫育。
接種後約24小時，如一般方法部分中所述，等分試樣的液體培養基通過具有FID檢測的GC(HP-INNOWax柱，30m x 0.53mm id，1.0μm膜厚度)分析1-丁醇含量。1-丁醇測定結果在表14中給出。包含1-丁醇生物合成途徑的重組芽孢桿菌屬菌株在高和低氧條件下在2種培養基中都產生可檢測水平的1-丁醇。
表14 通過枯草芽孢桿菌菌株ΔsacB::T-H-C::erm#28/pHT01-ald-EB從蔗糖生產1-丁醇 1通過GC測定的濃度。
2「+」指示1-丁醇的定性存在。
菌株後綴「a」和「b」指示獨立分離物。
實施例17 使用重組啤酒糖酵母從葡萄糖和蔗糖生產1-丁醇 這個實施例描述了1-丁醇在啤酒糖酵母中的生產。在編碼催化1-丁醇生物合成途徑步驟的酶的6種基因中，將5種克隆到3種相容性酵母2微米(2μ)質粒內，且在啤酒糖酵母中共表達。「上遊途徑」定義為由乙醯輔酶A乙醯轉移酶(thlA，硫解酶)、3-羥丁醯輔酶A脫氫酶(hbd)和巴豆酸酶(crt)催化的前3個酶促步驟。下遊途徑定義為該途徑的第4個(丁醯輔酶A脫氫酶，ter)和第5個(丁醛脫氫酶，ald)酶促步驟。1-丁醇途徑的最後1個酶促步驟由醇脫氫酶催化，所述醇脫氫酶可以由內源酵母基因例如adhI和adhII編碼。
基因在酵母中的表達一般需要啟動子，隨後為目的基因，和轉錄終止子。許多組成型酵母啟動子在構建用於編碼1-丁醇生物合成途徑的基因的表達盒中使用，包括FBA、GPD和GPM啟動子。一些誘導型啟動子例如GAL1、GAL10、CUP1也在中間質粒構建中使用，但不在最終顯示菌株中使用。使用幾種轉錄終止子，包括FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、和GAL1t。將編碼1-丁醇生物合成途徑的基因首先亞克隆到酵母質粒內，側面為啟動子和終止子，這產生關於每種基因的表達盒。如下文所述表達盒通過缺口修復克隆任選與單個載體組合。例如，將編碼上遊途徑的3種基因盒亞克隆到酵母2μ質粒內。ter和ald基因各自在2μ質粒中個別表達。所有3種質粒在單個酵母菌株中的共轉化導致功能性1-丁醇生物合成途徑。可替代地，編碼啟動子、基因和終止子的幾個DNA片段通過缺口修復克隆在單個載體中直接組合。
關於在啤酒糖酵母中構建質粒和菌株的方法。基本酵母分子生物學規程包括轉化、細胞生長、基因表達、缺口修復重組等，在Methodsin Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics and Molecular andCell Biology(Part A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(Eds.)，Elsevier Academic Press，San Diego，CA)中描述。
這個實施例中使用的質粒是大腸桿菌-啤酒糖酵母穿梭載體pRS423、pRS424、pRS425、和pRS426(美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD)，所述穿梭載體包含大腸桿菌複製起點(例如，pMB1)、酵母2μ複製起點、和用於營養選擇的標記。關於這4種載體的選擇標記為His3(載體pRS423)、Trp1(載體pRS424)、Leu2(載體pRS425)和Ura3(載體pRS426)。這些載體允許在大腸桿菌和酵母菌株中的菌株繁殖。酵母單倍體菌株BY4741(MATa his3Δ1 leu2Δ0 metl5Δ0 ura3Δ0)(Research Genetics，Huntsville，AL，也可從ATCC 201388獲得)和二倍體菌株BY4743(MATa/alpha his3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0lys2Δ0/LYS2 MET15/metl5Δ0 ura3Δ0/ura3Δ0)(Research Genetics，Huntsville，AL，也可從ATCC 201390獲得)用作基因克隆和表達的宿主。關於編碼1-丁醇生物合成途徑酶的基因的表達載體的構建通過在大腸桿菌中的標準分子克隆技術，或通過在酵母中的缺口修復重組法來進行。
缺口修復克隆方法利用酵母中的高效同源重組。一般地，酵母載體DNA進行消化(例如，在其多克隆位點中)以在其序列中產生「缺口」。產生在5＇和3＇末端包含≥21bp序列的許多目的插入DNA，所述插入DNA與彼此且與載體DNA的5＇和3＇末端連續重疊。例如，為了構建關於「基因X」的酵母表達載體，選擇酵母啟動子和酵母終止子用於表達盒。啟動子和終止子從酵母基因組DNA擴增，且基因X從其來源生物進行PCR擴增，或從包含基因X序列的克隆載體獲得。在線性化載體的5＇末端和啟動子序列之間、在啟動子和基因X之間、在基因X和終止子序列之間、以及在終止子和線性化載體的3＇末端之間存在至少21bp重疊序列。隨後將「缺口的」載體和插入DNAs共轉化到酵母菌株內，且在SD極限撤除成分培養基上鋪平板，且選擇菌落用於培養物生長和小量製備(mini preps)質粒DNAs。正確插入片段組合的存在可以通過PCR作圖來證實。從酵母分離的質粒DNA(濃度通常低)隨後可以轉化到大腸桿菌菌株例如TOP10內，隨後為小量製備和限制酶切作圖，以進一步驗證質粒構建體。最後構建體可以通過序列分析來驗證。陽性質粒的酵母轉化體在SD培養基中生長用於執行酶測定，以表徵由目的基因表達的酶的活性。
酵母培養物在YPD複合培養基或包含葡萄糖(SD培養基)和合適的化合物混合物的合成極限撤除成分培養基中生長，所述化合物混合物允許質粒上的營養選擇標記互補(Methods in Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology，2004，PartA，第13-15頁)。SD撤除成分培養基中的糖組分為2％葡萄糖。對於1-丁醇生產，酵母培養物也在含2％蔗糖的合成極限撤除成分培養基(SS培養基)中生長。
對於酶活性分析，將每種菌株的單個菌落在包含SD極限撤除成分培養基的新鮮板上劃線，且於30℃溫育2天。這個板上的細胞用於接種125mL搖瓶中的20mL SD撤除成分培養基，且於30℃伴隨250rpm振蕩生長過夜。測量過夜培養物的光密度(OD600)，且在1.0L搖瓶中的250mL相同培養基中將培養物稀釋至OD600＝0.1，且於30℃伴隨250rpm振蕩生長至OD600 0.8-1.0。細胞隨後通過在2000xg下離心10分鐘進行收穫，且重懸浮於20mL 50mM Tris-HCl緩衝液，pH8.5中。酶測定如上所述進行。
用於thlA和hbd共表達的質粒pNY102的構建。構建許多雙重表達載體用於共表達thlA和hbd基因。啤酒糖酵母ERG10基因是thlA基因的功能性直向同源物。最初，ERG10和hbd的雙重載體使用酵母GAL1-GAL10反向雙啟動子、GAL1終止子(GAL1t)和ERG10終止子(ERG10t)來構建。ERG10基因-ERG10t DNA片段從啤酒糖酵母菌株BY4743基因組DNA進行PCR擴增，其中使用引物OT731(SEQ IDNO164)和OT732(SEQ ID NO165)。酵母GAL1-GAL10反向啟動子也通過PCR從BY4743基因組DNA擴增，其中使用引物OT733(SEQ ID NO166)和OT734(SEQ ID NO167)。hbd基因從大腸桿菌質粒pTrc99a-E-C-H-T(在實施例13中描述)擴增，其中使用PCR引物OT735(SEQ ID NO168)和OT736(SEQ ID NO169)。GAL1t從BY4743基因組DNA擴增，其中使用引物OT737(SEQ ID NO170)和OT738(SEQ ID NO171)。因此獲得的4種PCR片段erg10-ERG10t、GAL1-GAL10啟動子、hbd和GAL1t，在每個相鄰PCR片段之間具有約25bp重疊序列。GAL1t和ERG10-ERG10t片段各自包含與酵母載體pRS425的約25bp重疊序列。為了通過缺口修復重組裝配這些序列，將DNA片段連同載體pRS425共轉化到酵母菌株BY4741內，所述載體pRS425用BamHI和HindIII酶進行消化。菌落選自SD-Leu極限板，且具有插入片段的克隆通過PCR擴增鑑定。新質粒命名為pNY6(pRS425.ERG10t-erg10-GAL10-GAL1-hbd-GAL1t)。進一步的證實通過限制酶切作圖來進行。
通過將質粒pNY6轉化到啤酒糖酵母BY4741內製備的酵母菌株BY4741(pNY6)顯示良好的Hbd活性，但無硫解酶活性。由於缺乏硫解酶活性，ERG10基因通過缺口修復重組替換為thlA基因。thlA基因通過PCR從大腸桿菌載體pTrc99a-E-C-H-T擴增，其中使用引物OT797(SEQ ID NO172)和OT798(SEQ ID NO173)，所述引物OT797添加ShpI限制位點，所述引物OT798添加AscI限制位點。質粒pNY6用SphI和PstI限制酶進行消化，凝膠純化，且連同thlA的PCR產物一起共轉化到酵母BY4741內。由於thlA的PCR產物和消化的pNY6之間的30bp重疊序列，thlA基因重組到pNY6內的GAL10啟動子和ERG10t終止子之間。這產生質粒pNY7(pRS425.ERG10t-th1A-GAL10-GAL1-hbd-GAL1t)，所述質粒pNY7通過PCR和限制酶切作圖來驗證。
在基於缺口修復重組的後續克隆步驟中，pNY7中的GAL10啟動子替換為CUP1啟動子，且GAL1啟動子替換為強GPD啟動子。這種質粒pNY10(pRS425.ERG10t-thlA-CUP1-GPD-hbd-GAL1t)允許在銅誘導型啟動子CUP1下表達thlA基因，和在GPD啟動子下表達hbd基因。CUP1啟動子序列從酵母BY4743基因組DNA進行PCR擴增，其中使用引物OT806(SEQ ID NO174)和OT807(SEQ ID NO175)。GPD啟動子從BY4743基因組DNA擴增，其中使用引物OT808(SEQID NO176)和OT809(SEQ ID NO177)。CUP1和GPD啟動子的PCR產物與用NcoI和SphI限制酶消化的pNY7質粒組合。從這個缺口修復克隆步驟構建質粒pNY10，所述質粒pNY10通過PCR和限制酶切作圖來驗證。包含pNY10的酵母BY4741菌株具有Hbd活性，但無ThlA活性。與GAL1啟動子控制的Hbd活性相比較，在GPD啟動子下的Hbd活性顯著改善(1.8U/mg對0.40U/mg)。測序分析揭示pNY10中的thlA基因在3＇末端附近具有1個鹼基缺失，這導致截短的蛋白質。這解釋了菌株中硫解酶活性的缺乏。
質粒pNY12用正確的thlA基因序列構建。thlA基因通過用SphI和AscI消化從載體pTrc99a-E-C-H-T中切割。FBA1啟動子從BY4743基因組DNA進行PCR擴增，其中使用引物OT799(SEQ ID NO178)和OT761(SEQ ID NO179)，且用SalI和SphI限制酶進行消化。將thlA基因片段和FBA1啟動子片段連接到質粒pNY10內的AscI和SalI位點上，從而產生質粒pNY12(pRS425.ERG10t-thlA-FBA1)，所述質粒pNY12通過限制酶切作圖來驗證。將pNY12轉化到酵母菌株BY4741內，且所得到的轉化體顯示1.66U/mg的ThlA活性。
將來自pNY12的FBA1啟動子-thlA基因片段重新亞克隆到pNY10內。pNY10載體用AscI限制酶切割，且與從質粒pNY12分離的AscI消化的FBA1啟動子-thlA基因片段連接。這產生了具有2個可能的插入方向的新質粒。選擇具有以相反方向彼此相鄰定位的FBA1和GPD啟動子的克隆，且這種質粒命名為pNY102。pNY102(pRS425.ERG10t-thlA-FBA1-GPD-hbd-GAL1t)通過限制酶切作圖來驗證。菌株DPD5206通過將pNY102轉化到酵母菌株BY4741內來製備。DPD5206的ThlA活性為1.24U/mg，且Hbd活性為0.76U/mg。
用於crt表達的質粒pNY11的構建。crt基因表達盒通過在酵母在使用缺口修復重組，將GPM1啟動子、crt基因、和GPM1t終止子組合到載體pRS426內來構建。GPM1啟動子從酵母BY4743基因組DNA進行PCR擴增，其中使用引物OT803(SEQ ID NO180)和OT804(SEQ ID NO181)。crt基因從大腸桿菌質粒pTrc99a-E-C-H-T使用PCR引物OT785(SEQ ID NO182)和OT786(SEQ ID NO183)擴增。GPM1t終止子從酵母BY4743基因組DNA進行PCR擴增，其中使用OT787(SEQ ID NO184)和OT805(SEQ ID NO185)。酵母載體pRS426用BamHI和HindIII進行消化，且進行凝膠純化。這種DNA與GPM1啟動子、crt基因和GPM1終止子的PCR產物共轉化到酵母BY4741感受態細胞內。具有正確插入片段的克隆通過PCR和限制酶切作圖來驗證，且所得到的酵母菌株BY4741(pNY11pRS426-GPM1-crt-GPM1t)具有85U/mg的Crt活性。
用於thlA、hbd和crt共表達的質粒pNY103的構建。關於上遊1-丁醇途徑酶的共表達，將來自pNY11的crt基因盒亞克隆到質粒pNY102內，以產生hbd、thlA和crt表達載體。包含GPM1啟動子、crt基因和GPM1終止子的2,347bp DNA片段用SacI和NotI限制酶從質粒pNY11中切割，且克隆到載體pNY102內，所述pNY102用NtoI進行消化且用SacI部分消化，從而產生表達載體pNY103(pRS425.ERG10t-thlA-FBA1-GPD-hbd-GAL1t-GPM1t-crt-GPM1)。通過用HindIII消化證實pNY103中存在所有3種盒後，將質粒轉化到酵母BY4743細胞內，且轉化的酵母菌株命名為DPD5200。當在標準條件下生長時，DPD5200顯示分別為0.49U/mg、0.21 U/mg和23.0 U/mg的ThlA、Hbd和Crt酶活性。
用於ald表達的質粒pNY8的構建。編碼Ter蛋白質(SEQ ID NO187)、命名為tery的密碼子最優化基因(SEQ ID NO186)，和編碼Ald蛋白質(SEQ ID NO189)、命名為aldy的密碼子最優化基因(SEQ ID NO188)，使用啤酒糖酵母的優選密碼子來合成。包含密碼子最優化的ter基因的質粒pTERy和包含密碼子最優化的ald基因的pALDy由DNA2.0(Palo Alto，CA)製備。
為了裝配pNY8(pRS426.GPD-ald-GPDt)，包括GPD啟動子的PCR產物(由引物OT800(SEQ ID NO190)和OT758(SEQ ID NO191)，以及BY4743基因組DNA合成)，通過用NcoI和SfiI從pALDy中切割的aldy基因片段(SEQ ID NO188)，和GPD終止子的PCR產物(由引物OT754(SEQ ID NO192)和OT755(SEQ ID NO193)，以及BY4743基因組DNA合成)的3種插入片段，經由缺口修復重組克隆與BamHI、HindIII消化的pRS426載體重組。酵母BY4741轉化克隆通過PCR作圖進行分析。因此構建的新質粒pNY8通過限制酶切作圖進一步證實。分析包含pNY8的酵母BY4741轉化體的Ald活性，且針對丁醯輔酶A的比活性為約0.07U/mg。
用於ter表達的質粒pNY9和pNY13的構建。通過缺口修復克隆將密碼子最優化的tery基因克隆到在FBA1啟動子控制下的載體pRS426內。FBA1啟動子從酵母BY4743基因組DNA進行PCR擴增，其中使用引物OT760(SEQ ID NO194)和OT792(SEQ ID NO195)。tery基因通過SphI和NotI限制酶消化質粒pTERy來獲得，這導致作為SEQ ID NO186給出的片段。FBA1終止子的PCR片段通過PCR從酵母BY4743基因組DNA產生，其中使用引物OT791(SEQ ID NO196)和OT765(SEQ ID NO197)。3種DNA片段-FBA1啟動子、ter基因和FBA1終止子，與BamHI、HindIII消化的pRS426載體組合，且通過缺口修復重組轉化到酵母BY4741內。所得到的質粒pNY9(pRS426-FBA1-tery-FBA1t)通過PCR作圖以及限制酶切消化來證實。pNY9的酵母BY4741轉化體產生0.26U/mg的Ter活性。
為了製備最終的1-丁醇生物合成途徑菌株，必需構建包含幾種質粒的酵母表達菌株，所述質粒各自具有獨特的營養選擇標記。因為親本載體pRS426包含Ura選擇標記，所以將ter表達盒亞克隆到包含His3標記的載體pRS423內。包含FBA1-tery-FBA1t盒的3.2kb片段通過用SacI和XhoI限制酶消化從質粒pNY9分離，且連接到用這2種相同酶切割的載體pRS423內。新質粒pNY13(pRS423-FBA1-tery-FBAIt)通過限制酶切消化進行作圖。將pNY13轉化到BY4741菌株內，且在SD-His培養基中培養轉化體，從而產生具有0.19U/mg Ter活性的菌株。
包含1-丁醇生物合成途徑基因用於證實1-丁醇生產的酵母菌株的構建。如上所述，酵母菌株DPD5200通過將質粒pNY103轉化到啤酒糖酵母菌株BY4743內來構建，所述質粒pNY103允許thlA、hbd和crt基因共表達。DPD5200的酵母感受態細胞如上所述進行製備，且將質粒pNY8和pNY13共轉化到DPD5200內，從而產生菌株DPD5213。DPD5213允許1-丁醇生物合成途徑中的5種基因thlA、hbd、crt、ter和ald同時組成型表達。菌株DPD5212(用空質粒，pRS425和pRS426轉化的啤酒糖酵母菌株BY4743)用作陰性對照。菌株DPD5213的4個獨立分離物在SD-Ura，-Leu，-His撤除成分極限培養基中在2％葡萄糖或2％蔗糖的存在下生長，以允許所有3種質粒的生長互補。DPD5212的單個分離物在合適培養基中類似地生長。
為了證實通過需氧培養物的1-丁醇生產，將每種菌株的單個菌落在新鮮瓊脂板上劃線，所述新鮮瓊脂板包含SD極限撤除成分生長培養基(包含2％葡萄糖)或SS極限撤除成分生長培養基(包含2％蔗糖)，且於30℃溫育2天。來自這些板的細胞用於接種125mL塑料搖瓶中的20mL極限撤除成分培養基(SD或SS)，且於30℃伴隨250rpm振蕩生長過夜。測量過夜培養物的光密度(OD600)，且在125mL搖瓶中的25mL相同培養基中將培養物稀釋至OD6000.1，且於30℃伴隨250rpm振蕩生長。
如一般方法部分中所述，在24小時和48小時時取出等分試樣的培養物用於1-丁醇生產的GC分析(HP-INNOWax柱，30m x 0.53mmid，1μm膜厚度)，其具有FID檢測。GC分析結果在表15中給出。
表15 通過啤酒糖酵母菌株DPD5213從葡萄糖和蔗糖的1-丁醇生產 1獨立分離物由a-d指示。
2通過GC測定的濃度。
實施例18(預示的) 1-丁醇生物合成途徑在植物乳桿菌中的表達 這個預示的實施例的目的是描述如何在植物乳桿菌中表達1-丁醇生物合成途徑。將編碼6種酶活性的1-丁醇途徑的6種基因分成2個操縱子用於表達。使用由Hols等人(Appl.Environ.Microbiol.601401-1413(1994))描述的方法，通過同源重組將該途徑的前3種基因(thl、hbd和crt，分別編碼乙醯輔酶A乙醯轉移酶、3-羥丁醯輔酶A脫氫酶和巴豆酸酶)整合到植物乳桿菌染色體內。將後3種基因(EgTER、ald和bdhB，分別編碼丁醯輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶)克隆到表達質粒內，且轉化到攜帶整合的上遊途徑1-丁醇基因的乳桿菌屬菌株內。乳桿菌屬在MRS培養基(DifcoLaboratories，Detroit，MI)中於37℃生長。如由Moreira等人(BMCMicrobiol.515(2005))所述，從植物乳桿菌分離染色體DNA。
整合。通過同源重組將在合成的P11啟動子(Rud等人，Microbiology 1521011-1019(2006))控制下的thl-hbd-crt盒整合到植物乳桿菌ATCC BAA-793(NCIMB8826)染色體內的ldhL1基因座上。為了構建ldhL整合靶向載體，來自植物乳桿菌(GenbankNC_004567)與ldhL具有同源性的DNA片段進行PCR擴增，其中使用引物LDH EcoRV F(SEQ ID NO198)和LDH AatIIR(SEQ ID NO199)。將1986 bp PCR片段克隆到pCR4Blunt-TOPO內且測序。pCR4Blunt-TOPO-ldhL1克隆用EcoRV和AatII進行消化，從而釋放凝膠純化的1982 bp ldhL1片段。在實施例14中描述的整合載體pFP988用HindIII進行消化，且用克列諾DNA聚合酶處理，以使末端變成平頭的。線性化質粒隨後用AatII進行消化，且將2931bp載體片段凝膠純化。使EcoRV/AatII ldhL1片段與pFP988載體片段連接，且轉化到大腸桿菌Top10細胞內。轉化體在包含氨苄青黴素(100μg/mL)的LB瓊脂板上進行選擇，且通過菌落PCR進行篩選，以證實pFP988-1dhL的構建。
為了給整合DNA添加選擇標記，Cm基因與其啟動子從pC194(Genbank NC_002013)進行PCR擴增，其中使用引物Cm F(SEQ IDNO200)和Cm R(SEQ ID NO201)，從而擴增836bp PCR產物。將擴增子克隆到pCR4Blunt-TOPO內，且轉化到大腸桿菌Top10細胞內，從而產生pCR4Blunt-TOPO-Cm。測序以證實通過PCR沒有引入錯誤後，Cm盒作為828 bp MluI/SwaI片段從pCR4Blunt-TOPO-Cm中消化，且進行凝膠純化。包含ldhL同源性的整合載體pFP988-ldhL用MluI和SwaI進行消化，且將4740bp載體片段凝膠純化。Cm盒片段與pFP988-ldhL載體連接，從而生成pFP988-DldhL::Cm。
最後來自實施例14中描述的pFP988Dss-T-H-C的thl-hbd-crt盒進行修飾，以用合成的P11啟動子替換澱粉酶啟動子。隨後，將整個操縱子移至pFP988-DldhL::Cm內。P11啟動子通過與引物P11F(SEQ IDNO202)和P11R(SEQ ID NO203)的寡核苷酸退火構建。退火的寡核苷酸在6％ Ultra PAGE凝膠(Embi Tec，San Diego，CA)上進行凝膠純化。質粒pFP988Dss-T-H-C用XhoI和SmaI進行消化，且將9kbp載體片段凝膠純化。使分離的P11片段與消化的pFP988Dss-T-H-C連接，以產生pFP988-P11-T-H-C。質粒pFP988-P11-T-H-C用XhoI和BamHI進行消化，且將3034bp P11-T-H-C片段凝膠純化。pFP988-Dldh L::Cm用XhoI和BamHI進行消化，且分離5558bp載體片段。使上遊途徑操縱子與整合載體連接，以產生pFP988-DldhL-P11-THC::Cm。
將pFP988-DldhL-P11-THC::Cm整合到植物乳桿菌BAA-793內，以形成包含外源thl、hbd和crt基因的植物乳桿菌ΔldhL1::T-H-C::Cm。植物乳桿菌的電轉化感受態細胞如Aukrust，T.W.，等人(InElectroporation Protocols for Microorganisms；Nickoloff，J.A.，Ed.；Methods in Molecular Biology，第47卷；Humana Press，Inc.，Totowa，NJ，1995，第201-208頁)所述製備。如Aukrust等人同上所述，電穿孔後，細胞在MRSSM培養基(補加了0.5M蔗糖和0.1M MgCl2的MRS培養基)於37℃不伴隨振蕩過度生長(outgrow)2小時。為了選擇將電穿孔的細胞在包含氯黴素(10μg/mL)的MRS板上進行鋪平板且於37℃溫育。轉化體通過菌落PCR擴增進行最初篩選以證實整合，且最初的陽性克隆隨後通過PCR擴增使用一組引物更嚴格地篩選。
EgTER、ald和bdhB基因的質粒表達。剩餘3種1-丁醇基因在植物乳桿菌ldhL啟動子(Ferain等人，J.Bacteriol.176596-601(1994))控制下，由質粒pTRKH3(O＇Sullivan DJ和Klaenhammer TR，Gene 137227-231(1993))表達。ldhL啟動子從植物乳桿菌ATCC BAA-793基因組進行PCR擴增，其中使用引物PldhL F(SEQ ID NO204)和PldhL R(SEQ ID NO205)。將369bp PCR產物克隆到pCR4Blunt-TOPO內且測序。所得到的質粒pCR4Blunt-TOPO-PldhL用SacI和BamHI進行消化，從而釋放359 bp PldhL片段。
實施例14中描述的pHT01-ald-EB用SacI和BamHI進行消化，且通過凝膠純化回收10503bp載體片段。使PldhL片段和載體連接，從而產生pHT01-Pldhl-ald-EB。
為了亞克隆ldhL啟動子-ald-EgTER-bdh盒，用MluI消化pHT01-Pldhl-ald-EB，且用克列諾DNA聚合酶處理末端。線性化的載體用SalI進行消化，且將包含PldhL-AEB片段的4270bp片段凝膠純化。質粒pTRKH3用SalI和EcoRV進行消化，且使凝膠純化的載體片段與PldhL-AEB片段連接。將連接混合物轉化到大腸桿菌Top10細胞內，且將轉化體在包含紅黴素(150mg/L)的腦心浸液(Brain HeartInfusion)(BHI，Difco Laboratories，Detroit，MI)板上進行鋪平板。轉化體通過PCR進行篩選，以證實pTRKH3-ald-E-B的構建。如上所述通過電穿孔將表達質粒pTRKH3-ald-E-B轉化到植物乳桿菌ΔldhL1::T-H-C::Cm內。
將包含pTRKH3-ald-E-B的植物乳桿菌ΔldhL1::T-H-C::Cm接種到250mL搖瓶內，所述搖瓶包含50mL MRS培養基加紅黴素(10μg/mL)，且於37℃不伴隨振蕩生長18-24小時。18-24小時後，如一般方法部分中所述，通過HPLC或GC分析檢測1-丁醇。
實施例19(預示的) 1-丁醇生物合成途徑在糞腸球菌中的表達 這個預示的實施例的目的是描述如何在糞腸球菌中表達1-丁醇生物合成途徑。糞腸球菌菌株V583的全基因組序列已得到公開(Paulsen等人，Science 2992071-2074(2003))，所述菌株V583在這個實施例中作為宿主菌株用於表達1-丁醇生物合成途徑。質粒pTRKH3(O＇Sullivan DJ和Klaenhammer TR，Gene 137227-231(1993))-大腸桿菌/革蘭氏陽性穿梭載體用於表達在1個操縱子中的1-丁醇途徑的6種基因(thlA、hbd、crt、EgTER、ald、bdhB)。pTRKH3包含大腸桿菌質粒p15A複製起點和pAMβ1複製子，以及2種抗生素抗性選擇標記-四環素抗性和紅黴素抗性。四環素抗性只在大腸桿菌中表達，而紅黴素抗性在大腸桿菌和革蘭氏陽性細菌中均表達。質粒pAMβ1衍生物可以在糞腸球菌中複製(Poyart等人，FEMS Microbiol.Lett.156193-198(1997))。已通過乳鏈菌肽在多種革蘭氏陽性細菌包括糞腸球菌中用於有效控制基因表達的誘導型nisA啟動子(PnisA)(Eichenbaum等人，Appl.Environ.Microbiol.642763-2769(1998))，用於控制編碼1-丁醇生物合成途徑酶的6種所需基因的表達。
包含nisA啟動子(Chandrapati等人，Mol.Microbiol.46(2)467-477(2002))的線性DNA片段(215bp)從乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)基因組DNA進行PCR擴增，其中使用引物F-PnisA(EcoRV)(SEQ IDNO206)和R-PnisA(PmeI BamHI)(SEQ ID NO207)。215bp PCR片段用EcoRV和BamHI進行消化，且將所得到的PnisA片段凝膠純化。質粒pTRKH3用EcoRV和BamHI進行消化，且將載體片段凝膠純化。使線性化的pTRKH3與PnisA片段連接。通過電穿孔將連接混合物轉化到大腸桿菌Top10細胞內，且轉化體於37℃在包含紅黴素(25μg/mL)的LB瓊脂板上過夜生長後進行選擇。轉化體隨後通過菌落PCR使用引物F-PnisA(EcoRV)和R-PnisA(BamHI)進行篩選，以證實pTRKH3-PnisA的正確克隆。
質粒pTRKH3-PnisA用PmeI和BamHI進行消化，且將載體凝膠純化。質粒pHTO1-ald-EgTER-bdhB如實施例14中所述進行構建並用SmaI和BamHI進行消化，且將2,973bpald-EgTER-bdhB片段凝膠純化。將2,973bpald-EgTER-bdhB連接到pTRKH3-PnisA載體內的PmeI和BamHI位點上。通過電穿孔將連接混合物轉化到大腸桿菌Top10細胞內，且轉化體於37℃在包含紅黴素(25μg/mL)的LB瓊脂板上過夜溫育後進行選擇。轉化體隨後通過菌落PCR用引物ald正向引物N27F1(SEQ ID NO31)和bdhB反向引物N65(SEQ ID NO44)進行篩選。所得到的質粒命名為pTRKH3-PnisA-ald-EgTER-bdhB(＝pTRKH3-A-E-B)。
質粒pTRKH3-A-E-B從轉化體中進行純化，且用於進一步將剩餘基因(thlA、hbd、crt)克隆到位於bdhB基因下遊的BamHI位點內。質粒pTRKH3-A-E-B用BamHI進行消化，且用DNA聚合酶的克列諾片段處理，以產生平端。質粒pFP988Dss-thlA-hbd-crt(＝pFP988Dss-T-H-C)如實施例14中所述進行構建，且用SmaI和BamHI進行消化。所得到的2,973bpthlA-hbd-crt片段用DNA聚合酶的克列諾片段處理，以產生平端，且進行凝膠純化。使2,973bpthlA-hbd-crt片段與線性化的pTRKH3-A-E-B連接。通過電穿孔將連接混合物轉化到大腸桿菌Top10細胞內，且轉化體於37℃在包含紅黴素(25μg/mL)的LB瓊脂板上過夜生長後進行選擇。轉化體隨後通過菌落PCR用引物thlA正向引物N7(SEQ ID NO21)和crt反向引物N4(SEQ ID NO18)進行篩選。所得到的質粒命名為pTRKH3-PnisA-ald-EgTER-bdhB-thlA-hbd-crt(＝pTRKH3-A-E-B-T-H-C)。質粒pTRKH3-A-E-B-T-H-C由大腸桿菌轉化體製備，且使用本領域已知方法(Aukrust，T.W.，等人InElectroporationProtocols for Microorganisms；Nickoloff，J.A.，Ed.；Methods in MolecularBiology，第47卷；Humana Press，Inc.，Totowa，NJ.，1995，第217-226頁)，通過電穿孔轉化到電轉化感受態糞腸球菌V583細胞內，從而導致產生糞腸球菌V583/pTRKH3-A-E-B-T-H-C。
通過電穿孔將第2種質粒轉化到糞腸球菌V583/pTRKH3-A-E-B-T-H-C內，所述第2種質粒包含nisA調節基因、nisR和nisK、add9壯觀黴素抗性基因、以及pSH71複製起點。包含pSH71複製起點的質粒與pAMβ1衍生物在糞腸球菌中是相容的(Eichenbaum等人，同上)。雙重藥物抗性轉化體在包含紅黴素(25μg/mL)和壯觀黴素(100μg/mL)的LB瓊脂板上進行選擇。
所得到的糞腸球菌菌株V583B具有2種質粒，即表達質粒(pTRKH3-A-E-B-T-H-C)和調節質粒(pSH71-nisRK)，被接種到包含50mL Todd-Hewitt液體培養基的250mL搖瓶內，所述Todd-Hewitt液體培養基補加了酵母提取物(0.2％)(Fischetti等人，J.Exp.Med.1611384-1401(1985))、乳鏈菌肽(20μg/mL)(Eichenbaum等人，同上)、紅黴素(25μg/mL)、和壯觀黴素(100μg/mL)。瓶於37℃不伴隨振蕩溫育18-24小時，這之後，如一般方法部分中所述，通過HPLC或GC分析測量1-丁醇生產。
序列表
E.I.du Pont de Nemours and Co.
4碳醇的發酵生產
CL3241 PCT
208
PatentIn version 3.3
1
1179
DNA
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
1
2
392
PRT
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
2
3
1179
DNA
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
3
4
392
PRT
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
4
5
849
DNA
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
5
6
282
PRT
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
6
7
786
DNA
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
7
8
261
PRT
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
8
9
1197
DNA
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
9
10
398
PRT
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
10
11
1407
DNA
拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)
11
12
468
PRT
拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)
12
13
1215
DNA
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
13
14
390
PRT
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
14
15
1170
DNA
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
15
16
389
PRT
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
16
17
29
DNA
人工序列

引物
17
18
25
DNA
人工序列

引物
18
19
28
DNA
人工序列

引物
19
20
23
DNA
人工序列

引物
20
21
30
DNA
人工序列

引物
21
22
26
DNA
人工序列

引物
22
23
29
DNA
人工序列

引物
23
24
25
DNA
人工序列

引物
24
25
30
DNA
人工序列

引物
25
26
25
DNA
人工序列

引物
26
27
32
DNA
人工序列

引物
27
28
24
DNA
人工序列

引物
28
29
26
DNA
人工序列

引物
29
30
27
DNA
人工序列

引物
30
31
27
DNA
人工序列

引物
31
32
24
DNA
人工序列

引物
32
33
35
DNA
人工序列

引物
33
34
38
DNA
人工序列

引物
34
35
39
DNA
人工序列

引物
35
36
28
DNA
人工序列

引物
36
37
44
DNA
人工序列

引物
37
38
30
DNA
人工序列

引物
38
39
38
DNA
人工序列

引物
39
40
30
DNA
人工序列

引物
40
41
42
DNA
人工序列

引物
41
42
32
DNA
人工序列

引物
42
43
41
DNA
人工序列

引物
43
44
37
DNA
人工序列

引物
44
45
17
DNA
人工序列

引物
45
46
16
DNA
人工序列

引物
46
47
22
DNA
人工序列

引物
47
48
24
DNA
人工序列

引物
48
49
21
DNA
人工序列

引物
49
50
20
DNA
人工序列

引物
50
51
20
DNA
人工序列

引物
51
52
24
DNA
人工序列

引物
52
53
22
DNA
人工序列

引物
53
54
28
DNA
人工序列

引物
54
55
22
DNA
人工序列

引物
55
56
24
DNA
人工序列

引物
56
57
22
DNA
人工序列

引物
57
58
20
DNA
人工序列

引物
58
59
23
DNA
人工序列

引物
59
60
22
DNA
人工序列

引物
60
61
24
DNA
人工序列

引物
61
62
23
DNA
人工序列

引物
62
63
25
DNA
人工序列

引物
63
64
22
DNA
人工序列

引物
64
65
22
DNA
人工序列

引物
65
66
22
DNA
人工序列

引物
66
67
22
DNA
人工序列

引物
67
68
22
DNA
人工序列

引物
68
69
24
DNA
人工序列

引物
69
70
24
DNA
人工序列

引物
70
71
22
DNA
人工序列

引物
71
72
21
DNA
人工序列

引物
72
73
21
DNA
人工序列

引物
73
74
47
DNA
人工序列

引物
74
75
79
DNA
人工序列

引物
75
76
1197
DNA
人工序列

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的密碼子最優化的CACO462基因
76
77
1224
DNA
人工序列

密碼子最優化的EgTER
77
78
1498
DNA
人工序列

密碼子最優化的ald基因
78
79
6509
DNA
人工序列

質粒pFP988
79
80
46
DNA
人工序列

引物N85
80
81
20
DNA
人工序列

引物N86
81
82
20
DNA
人工序列

T7引物
82
83
20
DNA
人工序列

引物Trc99af
83
84
21
DNA
人工序列

引物N5SeqF4
84
85
46
DNA
人工序列

引物T-ald(BamHI)
85
86
54
DNA
人工序列

引物B-ald(ETGER)
86
87
42
DNA
人工序列

引物T-Ptrc(BspEI)
87
88
43
DNA
人工序列

引物B-aldopt(BspEI)
88
89
32
DNA
人工序列

引物T-BspEIAatII
89
90
24
DNA
人工序列

引物B-BspEIAatII
90
91
42
DNA
人工序列

1.6GI啟動子
91
92
42
DNA
人工序列

1.5GI啟動子
92
93
39
DNA
人工序列

引物AFBamHI
93
94
39
DNA
人工序列

引物ARAat2
94
95
50
DNA
人工序列

引物正向1(E)
95
96
43
DNA
人工序列

引物底部反向1(E)
96
97
51
DNA
人工序列

引物Top正向2(B)
97
98
42
DNA
人工序列

引物反向2(B)
98
99
47
DNA
人工序列

引物Pamy/lacOF
99
100
52
DNA
人工序列

引物Pam/la cOR
100
101
52
DNA
人工序列

引物Spac F
101
102
36
DNA
人工序列

引物Spac R
102
103
44
DNA
人工序列

引物Top TF
103
104
51
DNA
人工序列

引物Bot TR
104
105
57
DNA
人工序列

引物Top CF
105
106
38
DNA
人工序列

引物Bot CR
106
107
20
DNA
人工序列

引物N3SeqF1
107
108
20
DNA
人工序列

引物N3SeqF2
108
109
24
DNA
人工序列

引物N3SeqF3
109
110
20
DNA
人工序列

引物N4SeqR3
110
111
22
DNA
人工序列

引物N5SeqF3
111
112
22
DNA
人工序列

引物N7SeqR2
112
113
20
DNA
人工序列

引物N31SeqF1
113
114
20
DNA
人工序列

引物N62SeqF2
114
115
20
DNA
人工序列

引物N62SeqF3
115
116
24
DNA
人工序列

引物N62SeqF4
116
117
24
DNA
人工序列

引物N63SeqR1
117
118
21
DNA
人工序列

引物N63SeqR2
118
119
23
DNA
人工序列

引物N63SeqR3
119
120
20
DNA
人工序列

引物N63SeqR4
120
121
24
DNA
人工序列

引物Pamy SeqF2
121
122
24
DNA
人工序列

引物Pamy SeqF
122
123
24
DNA
人工序列

引物Pamy seqR
123
124
20
DNA
人工序列

引物SpacF Seq
124
125
24
DNA
人工序列

引物sacB Up
125
126
24
DNA
人工序列

引物sacB Dn
126
127
22
DNA
人工序列

引物HT R
127
128
1185
DNA
大腸桿菌(Escherichia coli)
128
129
394
PRT
大腸桿菌(Escherichia coli)
129
130
1182
DNA
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
130
131
393
PRT
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
131
132
1197
DNA
啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)
132
133
398
PRT
啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)
133
134
864
DNA
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
134
135
287
PRT
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
135
136
855
DNA
富養羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)
136
137
284
PRT
富養羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)
137
138
741
DNA
真養產鹼菌(Alcaligenes eutrophis)
138
139
246
PRT
真養產鹼菌(Alcaligenes eutrophus)
139
140
768
DNA
大腸桿菌(Escherichia coli)
140
141
255
PRT
大腸桿菌(Escherichia coli)
141
142
783
DNA
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
142
143
260
PRT
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
143
144
405
DNA
豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)
144
145
134
PRT
豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)
145
146
1912
DNA
小眼蟲(Euglena gracilis)
146
147
539
PRT
小眼蟲(Euglena gracilis)
147
148
1344
DNA
丘鏈黴菌(Sreptomyces collinus)
148
149
447
PRT
丘鏈黴菌(Streptomyces collinus)
149
150
1344
DNA
天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)
150
151
447
PRT
天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)
151
152
2589
DNA
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
152
153
862
PRT
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
153
154
1164
DNA
大腸桿菌(Escherichia coli)
154
155
387
PRT
大腸桿菌(Escherichia coli)
155
156
3883
DNA
大腸桿菌(Escherichia coli)
156
157
477
PRT
大腸桿菌(Escherichia coli)
157
158
304
PRT
大腸桿菌(Escherichia coli)
158
159
415
PRT
大腸桿菌(Escherichia coli)
159
160
18
DNA
人工序列

引物Scr1
160
161
18
DNA
人工序列

引物Scr2
161
162
20
DNA
人工序列

引物Scr3
162
163
20
DNA
人工序列

引物Scr4
163
164
74
DNA
人工序列

引物OT731
164
165
50
DNA
人工序列

引物OT732
165
166
79
DNA
人工序列

引物OT733
166
167
72
DNA
人工序列

引物OT734
167
168
60
DNA
人工序列

引物OT735
168
169
71
DNA
人工序列

引物OT736
169
170
81
DNA
人工序列

引物OT737
170
171
73
DNA
人工序列

引物OT738
171
172
65
DNA
人工序列

引物OT797
172
173
73
DNA
人工序列

引物OT798
173
174
41
DNA
人工序列

引物OT806
174
175
55
DNA
人工序列

引物OT807
175
176
55
DNA
人工序列

引物OT808
176
177
60
DNA
人工序列

引物OT809
177
178
62
DNA
人工序列

引物OT799
178
179
60
DNA
人工序列

引物OT761
179
180
68
DNA
人工序列

引物OT803
180
181
49
DNA
人工序列

引物OT804
181
182
51
DNA
人工序列

引物OT785
182
183
63
DNA
人工序列

引物OT786
183
184
65
DNA
人工序列

引物OT787
184
185
77
DNA
人工序列

引物PT805
185
186
1269
DNA
人工序列

密碼子最優化的ter
186
187
398
PRT
人工序列

修飾的Ter蛋白
187
188
1484
DNA
人工序列

密碼子最優化的ald
188
189
468
PRT
人工的

修飾的Ald
189
190
69
DNA
人工序列

引物PT800
190
191
50
DNA
人工序列

引物OT758
191
192
52
DNA
人工序列

引物OT754
192
193
52
DNA
人工序列

引物OT755
193
194
50
DNA
人工序列

引物OT760
194
195
71
DNA
人工序列

引物OT792
195
196
71
DNA
人工序列

引物OT791
196
197
73
DNA
人工序列

引物OT765
197
198
29
DNA
人工序列

引物LDHEcoRV F
198
199
30
DNA
人工序列

引物LDH AatlR
199
200
47
DNA
人工序列

引物Cm F
200
201
29
DNA
人工序列

引物Cm R
201
202
62
DNA
人工序列

引物P11 F
202
203
58
DNA
人工序列

引物P11 R
203
204
38
DNA
人工序列

引物PldhL F
204
205
30
DNA
人工序列

引物PldhL R
205
206
34
DNA
人工序列

引物F-PnisA(EcoRV)
206
207
48
DNA
人工序列

引物R-PnisA(PmeI BamHI)
207
208
2460
DNA
人工序列

模板DNA
208
權利要求
1.一種重組微生物宿主細胞，其包含編碼多肽的至少一種DNA分子，所述多肽催化選自下述的底物至產物轉化
a)乙醯輔酶A至乙醯乙醯輔酶A
b)乙醯乙醯輔酶A至3-羥丁醯輔酶A
c)3-羥丁醯輔酶A至巴豆醯輔酶A
d)巴豆醯輔酶A至丁醯輔酶A
e)丁醯輔酶A至丁醛和
f)丁醛至1-丁醇；
其中所述至少一種DNA分子對於所述微生物宿主細胞是異源的且其中所述微生物宿主細胞生產1-丁醇。
2.根據權利要求1的宿主細胞，其中催化乙醯輔酶A至乙醯乙醯輔酶A的底物至產物轉化的所述多肽是乙醯輔酶A乙醯轉移酶。
3.根據權利要求1的宿主細胞，其中催化乙醯乙醯輔酶A至3-羥丁醯輔酶A的底物至產物轉化的所述多肽是3-羥丁醯輔酶A脫氫酶。
4.根據權利要求1的宿主細胞，其中催化3-羥丁醯輔酶A至巴豆醯輔酶A的底物至產物轉化的所述多肽是巴豆酸酶。
5.根據權利要求1的宿主細胞，其中催化巴豆醯輔酶A至丁醯輔酶A的底物至產物轉化的所述多肽是丁醯輔酶A脫氫酶。
6.根據權利要求1的宿主細胞，其中催化丁醯輔酶A至丁醛的底物至產物轉化的所述多肽是丁醛脫氫酶。
7.根據權利要求1的宿主細胞，其中催化丁醛至1-丁醇的底物至產物轉化的所述多肽是丁醇脫氫酶。
8.根據權利要求1的宿主細胞，其中所述細胞選自細菌、藍細菌、絲狀真菌和酵母。
9.根據權利要求8的宿主細胞，其中所述細胞是選自梭菌屬、發酵單胞菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、產鹼菌屬、克雷伯氏菌屬、類芽孢桿菌屬、節桿菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、畢赤氏酵母屬、假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬和糖酵母屬的屬的成員。
10.根據權利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是大腸桿菌。
11.根據權利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是真養產鹼菌。
12.根據權利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是地衣芽孢桿菌。
13.根據權利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是浸麻類芽孢桿菌。
14.根據權利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是紅串紅球菌。
15.根據權利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是惡臭假單胞菌。
16.根據權利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是枯草芽孢桿菌。
17.根據權利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是植物乳桿菌。
18.根據權利要求9的宿主細胞，其中所述細胞選自屎腸球菌、鶉雞腸球菌、和糞腸球菌。
19.根據權利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是啤酒糖酵母。
20.根據權利要求3的宿主細胞，其中所述乙醯輔酶A乙醯轉移酶具有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO129、SEQ IDNO131、和SEQ ID NO133的胺基酸序列。
21.根據權利要求4的宿主細胞，其中所述3-羥丁醯輔酶A脫氫酶具有選自SEQ ID NO6、SEQ ID NO135、SEQ ID NO137、和SEQ ID NO139的胺基酸序列。
22.根據權利要求5的宿主細胞，其中所述巴豆酸酶具有選自SEQID NO8、SEQ ID NO141、SEQ ID NO143、和SEQ ID NO145的胺基酸序列。
23.根據權利要求6的宿主細胞，其中所述丁醯輔酶A脫氫酶具有選自SEQ ID NO10、SEQ ID NO147、SEQ ID NO149、SEQ IDNO151、和SEQ ID NO187的胺基酸序列。
24.根據權利要求7的宿主細胞，其中所述丁醛脫氫酶具有選自SEQ ID NO12、SEQ ID NO153、和SEQ ID NO189的胺基酸序列。
25.根據權利要求8的宿主細胞，其中所述丁醇脫氫酶具有選自SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO153、SEQ ID NO155、和SEQ ID NO157的胺基酸序列。
26.根據權利要求1的宿主細胞，其中所述宿主細胞是兼性厭氧菌。
27.一種用於生產1-丁醇的方法，其包括
i)提供包含編碼多肽的至少一種DNA分子的重組微生物宿主細胞，所述多肽催化選自下述的底物至產物轉化
a)乙醯輔酶A至乙醯乙醯輔酶A
b)乙醯乙醯輔酶A至3-羥丁醯輔酶A
c)3-羥丁醯輔酶A至巴豆醯輔酶A
d)巴豆醯輔酶A至丁醯輔酶A
e)丁醯輔酶A至丁醛和
f)丁醛至1-丁醇；
其中所述至少一種DNA分子對於所述微生物宿主細胞是異源的；和
ii)使(i)的所述宿主細胞在由此生產1-丁醇的條件下與可發酵的碳底物接觸。
28.根據權利要求27的方法，其中所述可發酵的碳底物選自單糖、寡糖和多糖。
29.根據權利要求27的方法，其中所述碳底物選自葡萄糖、蔗糖和果糖。
30.根據權利要求27的方法，其中由此生產1-丁醇的所述條件是厭氧的。
31.根據權利要求27的方法，其中由此生產1-丁醇的所述條件是微需氧的。
32.根據權利要求27的方法，其中所述宿主細胞在極限培養基中與所述碳底物接觸。
33.根據權利要求27的方法，其中催化乙醯輔酶A至乙醯乙醯輔酶A的底物至產物轉化的所述多肽是乙醯輔酶A乙醯轉移酶。
34.根據權利要求27的方法，其中催化乙醯乙醯輔酶A至3-羥丁醯輔酶A的底物至產物轉化的所述多肽是3-羥丁醯輔酶A脫氫酶。
35.根據權利要求27的方法，其中催化3-羥丁醯輔酶A至巴豆醯輔酶A的底物至產物轉化的所述多肽是巴豆酸酶。
36.根據權利要求27的方法，其中催化巴豆醯輔酶A至丁醯輔酶A的底物至產物轉化的所述多肽是丁醯輔酶A脫氫酶。
37.根據權利要求27的方法，其中催化丁醯輔酶A至丁醛的底物至產物轉化的所述多肽是丁醛脫氫酶。
38.根據權利要求27的方法，其中催化丁醛至1-丁醇的底物至產物轉化的所述多肽是丁醇脫氫酶。
39.根據權利要求27的方法，其中所述細胞選自細菌、藍細菌、絲狀真菌和酵母。
40.根據權利要求39的方法，其中所述細胞是選自梭菌屬、發酵單胞菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、產鹼菌屬、克雷伯氏菌屬、類芽孢桿菌屬、節桿菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、畢赤氏酵母屬、假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬和糖酵母屬的屬的成員。
41.根據權利要求40的方法，其中所述細胞是大腸桿菌。
42.根據權利要求40的方法，其中所述細胞是真養產鹼菌。
43.根據權利要求40的方法，其中所述細胞是地衣芽孢桿菌。
44.根據權利要求40的方法，其中所述細胞是浸麻類芽孢桿菌。
45.根據權利要求40的方法，其中所述細胞是紅串紅球菌。
46.根據權利要求40的方法，其中所述細胞是惡臭假單胞菌。
47.根據權利要求40的方法，其中所述細胞是枯草芽孢桿菌。
48.根據權利要求40的方法，其中所述細胞是植物乳桿菌。
49.根據權利要求40的方法，其中所述細胞選自屎腸球菌、鶉雞腸球菌、和糞腸球菌。
50.根據權利要求40的方法，其中所述細胞是啤酒糖酵母。
51.根據權利要求33的方法，其中所述乙醯輔酶A乙醯轉移酶具有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO129、SEQ ID NO131、和SEQ ID NO133的胺基酸序列。
52.根據權利要求34的方法，其中所述3-羥丁醯輔酶A脫氫酶具有選自SEQ ID NO6、SEQ ID NO135、SEQ ID NO137、和SEQID NO139的胺基酸序列。
53.根據權利要求35的方法，其中所述巴豆酸酶具有選自SEQ IDNO8、SEQ ID NO141、SEQ ID NO143、和SEQ ID NO145的胺基酸序列。
54.根據權利要求36的方法，其中所述丁醯輔酶A脫氫酶具有選自SEQ ID NO10、SEQ ID NO147、SEQ ID NO149、SEQ ID NO151、和SEQ ID NO187的胺基酸序列。
55.根據權利要求37的方法，其中所述丁醛脫氫酶具有選自SEQID NO12、SEQ ID NO153、和SEQ ID NO189的胺基酸序列。
56.根據權利要求38的宿主細胞，其中所述丁醇脫氫酶具有選自SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO153、SEQ ID NO155、和SEQ ID NO157的胺基酸序列。
57.根據權利要求27的方法，其中所述宿主細胞是兼性厭氧菌。
全文摘要
提供了用於發酵生產4碳醇的方法。具體而言，丁醇，優選地1-丁醇通過表達1-丁醇生物合成途徑的重組細菌的發酵生長來生產。
文檔編號C12P7/16GK101432434SQ200680035878
公開日2009年5月13日 申請日期2006年9月28日 優先權日2005年9月29日
發明者G·K·唐納森, L·L·黃, L·A·馬吉奧-黑爾, V·納加拉彥, C·E·納卡穆拉, W·叔 申請人:納幕爾杜邦公司