甲矽烷基胺改性的納米粒載體的製作方法
2023-12-03 17:01:31 2
專利名稱：：甲矽烷基胺改性的納米粒載體的製作方法曱矽烷基胺改性的納米粒栽體發明領域本發明涉及含有曱矽烷基胺改性的納米粒栽體顆粒的膠體。更具體地，本發明描述舍有芯-殼納米粒載體顆粒的膠體，其中所述殼含有曱矽烷基胺官能團(functionality)。所述載體顆粒在生理條件下穩定。
背景技術：
：納米組分及分子組分的有序組裝有望產生能模仿生物功能、能與活細胞和細胞組分相互作用的分子組裝體。已開發了許多用於產生納米組裝體的技術，包括小分子組裝、聚電解質組裝、納米沉澱、芯殼組裝、非均相沉澱及多種其他技術。但是，一個巨大的挑戰在於創建將納米粒或分子組裝或精加工至材料中的方法，所述材料能被裝配入獨立式、穩定的工作"裝置"中。納米組裝體通常不穩定，抗拒被整合入工作系統中。一個簡單的例子涉及將納米組裝體整合入活器官中。成功的整合要求在高度特定的條件(生理pH和離子強度)下呈膠態穩定的組裝體能與血液組分相容，能避免被免疫系統覺察，並可以在活器官固有的多個過濾和廢棄物排除系統中倖存。高精確的組裝方法對於構建能在嚴格條件下發揮作用的納米有序組裝體是必需的。新近，人們的強烈興趣集中於開發能承載生物組分、藥物組分或診斷組分的表面改性的納米粒材料。然後所述組分(可包括藥物、治療劑、診斷劑和靶向部分)可被直接傳送到患病組織或骨，在緊鄰病灶(disease)處被釋放，降低對患者的副作用風險。該方法顯著改善了癌症和其他致命疾病的治療，可使其臨床診斷和治療發生革命。通過眾所周知的生物結合技術可使由納米粒承載的組分附著到納米粒，BioconjugateTechniques(G.T.Hermanson，AcademicPress,SanDiego,Ca.(1996))中對所述生物結合扶術進行了詳細描述。最普通的生物結合技術包括結合或連接至胺官能團。美國專利申請2003/0206859Al(Chen等，受讓人賓夕法尼亞大學董事會)描述了"胺封端"的二氧化矽顆粒的膠態分散體，其在水相中具有狹窄控制的粒度範圍，用於診斷成像、藥物傳送等。在"第0038段中，在含有0.61g二氧化矽的50.0mL二氧化矽分散體中加入2.0mL(或1.90g)矽烷偶聯劑。從而矽烷偶聯劑(曱矽烷基胺)與二氧化矽的比例為1.90:0.61或約3:1。我們發現這大大超過了在二氣化矽顆粒表面形成單分子層的所需量。在Chen的組合物中，分散體中的活性矽烷偶聯劑中只有很少一部分(少於約10%)實際結合至二氧化矽顆粒的表面。沒有吸附到顆粒表面的矽烷偶聯劑(游離的胺偶聯劑)會干擾生物組分、藥物組分或診斷組分的後續附著或結合，因為診斷劑或治療劑可與"游離"胺偶聯，而不與顆粒締合。希望製備用於生物結合和靶向傳送的納米粒載體，其為穩定膠體，從而能對其進行體內注射，特別是靜脈內注射。另外，希望納米粒載體在生理條件(pH7.4和137mMNaCl)下穩定。此外，希望顆粒避免被免疫系統覺察。希望使未吸附到納米粒的胺基數量達到最小，並限制溶液中"游離"胺官能度，因為游離胺可幹擾納米粒組裝體的功能。本發明要解決的問題人們對包含芯-殼載體顆粒的膠體存在著需求，所述膠體在有用的時段內穩定，在生理條件下穩定，並可以調節pH以實現生物組分、藥物組分或診斷組分的生物結合。人們對包含芯-殼載體顆粒的膠體存在著需求，所述膠體使溶液中"游離"胺官能團的數量受到限制或最小化，同時保持生理條件下的膠體穩定性，且優選只使用一個或幾個在殼中具有胺官能團的聚合物分子層。人們對包含芯-殼載體顆粒的膠體的製備方法存在著需求，所述方法提供高濃度(550%固體)的穩定膠體。人們還對能以高生產率、低成本製備的此類膠體存在著需求。人們乎不含未改性的膠體顆粒，且幾乎不含未附著到膠粒的胺官能團。還希望有其中pH可在pH5pH9之間自由調節，而不使殼中的胺官能團脫附的膠體。本發明提供一種組合物，其包含在生理pH和離子強度下穩定的膠體，所述膠體包含具有芯和殼的顆粒a)其中所述殼包含曱矽烷基胺偶聯劑；b)其中所述顆粒的體積加權平均粒徑小於2OOnm，以及5C)其中存在於所述膠體中的所述甲矽烷基胺偶聯劑超過35%結合到芯表面。所述組合物是穩定的膠體(有時也稱作懸浮體或分散體)。膠體由液體(例如水)中的小固體顆粒的混合物組成。通常在數小時，優選數周至數月的時段中，如果固體顆粒不聚集(如粒度測量所確定的)，且不會從膠體中沉降出來，則認為膠體是穩定的。描述膠體不穩定性的術語包括聚集、附聚、絮凝、膠凝和沉降。在其製備l天內，平均粒度明顯增大至粒徑大於芯直徑的約3倍，並肉眼可見膠體出現沉降，則表示為不穩定膠體。通常，膠體中顆粒的表面性質(例如它們的靜電荷)有助於膠體的穩定性。典型地，表面明顯帶有正電荷或負電荷，以便提供靜電排斥來克服會引起膠體顆粒聚集和沉降的力。人們感興趣的是，對顆粒進行表面改性或"組裝"相反電荷的膠體顆粒，以得到特定的性質。但是，這樣做通常是困難的，因為表面改性或組裝破壞了膠體穩定性所必需的靜電力和位阻力；不容易得到穩定的膠體。本組合物是穩定膠體，因此在超過數小時(更優選超過數天，最優選超過數周)的時段內應保持為懸浮體。所述膠體的C電位的最大值為大於約±20mV，更優選為大於約士30mV。高^電位是優選的，因為其增加了膠體的膠態穩定性。在製備最終組合物必需的工藝步驟中，可根據需要來調節分散體的pH，以得到穩定膠體。在這些工藝步驟中，膠體的pH可以為約pH4pH10，更優選為約pH5pH9。最終形式的膠體在生理條件(例如pH7.4，137mMNaCl)下穩定，或者在典型用於體內應用(特別是用來靜脈內注射的組合物)的緩沖液或鹽溶液中穩定。因此，當被引入此類溶液或被此類溶液稀釋時，膠體可保持穩定。生理pH和離子強度可以為約pH6約pH8，以及約30mM約600mM的鹽濃度，所述組合物在這些範圍內的任意組合條件下穩定。所述組合物包含含有可用作載體顆粒的芯-殼顆粒的膠體。這些芯-殼顆粒的平均粒徑小於200nm。為了方便起見，將這些顆粒稱作"納米粒"或"納米粒子"或類似的術語。"載體顆粒"是包含芯以及曱矽烷基胺偶聯劑的那些顆粒。這種芯-殼子組裝體(subassembly)可以是用於其它組裝顆粒的起點，所述其它組裝顆粒包含附加組分，,如生物組分、藥物組分或診斷組分，以及改善諸如生物相容性和耙向的組分。這些附加組分可使所得顆粒增大。膠體中芯-殼顆粒的粒度可用多種方法或方法組合來表徵，所述方法包括計數器方法、光散射方法、沉降方法、光學顯微術和電子顯微術。實施例中的顆粒用光散射方法表徵。光散射方法可取樣109或更多的顆粒，且能夠給出優異的膠態顆粒統計。可用光散射方法給出存在於給定粒徑或粒度區間內的顆粒百分比，例如90%的顆粒位於某一給定值之下。光散射方法可用來獲得有關平均粒徑、顆粒的平均數量分布、顆粒的平均體積分布、所述分布的標準偏差以及納米粒的分布寬度。在可用作栽體顆粒的本發明芯-殼顆粒中，優選至少90%的顆粒小於4倍平均粒徑，更優選至少90%的顆粒小於3倍平均粒徑。平均粒徑可確定為數量加權平均(顆粒總數量的平均值)或面積加權平均、體積加權平均或質量加權平均。優選確定體積加權平均粒徑或質量加權平均粒徑，因為使用這種技術更突出對質量大得多的較大顆粒進行計數。此外，可以得到狹窄的顆粒粒度頻率分布。通過所測定的粒度的標準偏差(a)來測定體積加權粒度頻率分布,，體積加權平均粒徑分布的標準偏差優選小於平均粒徑，更優選小於平均粒徑的一半。這描述了可注射組合物優選的粒度分布。芯粒可具有負的表面電荷。膠體的表面電荷可從電泳遷移率來計算，用C電位表示。帶有負的表面電荷的膠體具有負G電位；而帶有正的表面電荷的膠體具有正^電位。芯粒的^電位的絕對值優選大於10mV,更優選大於20mV。進一步優選芯粒具有負《電位。"TheChemistryofSilica"(R,K,Iler,JohnWileyandSons,979)中對電泳遷移率和^電位的測定進行了描述。芯粒物質可選自無機物質，例如金屬氧化物、金屬羥基氧化物和不溶性鹽。芯粒物質優選為無機膠態顆粒，例如氧化鋁、二氧化矽、勃姆石、氧化鋅、碳酸鈣、二氧化鈦和氧化鋯。一種特別優選的實施方案中，芯粒為二氧化矽顆粒。一種特別優選的實施方案中，芯粒為直徑為約45nm的二氧化矽顆粒。芯粒可具有包膠的近紅外發光(near-infraredemitting)染料或顏料。近紅外發光染料或顏料已用於活組織的光學成像中，因為近紅外波長的光透射大於紫外波長、可見光波長或紅外波長的光透射。近紅外發光染料或顏料一般在約6001500nm波長區域內呈現發光。近紅外發光染料或顏料可選自但不限於近紅外焚光團，仿B口cy7、cy5、cy5.5、拔普糹錄(indocyaminegreen)、Lajolla藍、IRD41、IRD700、NIR-和Alexafluor染料。出版物US2003/0044353A1中對這些染料及其它染料進行了詳細討論。在如下所述的顆粒的殼中也可以使用這些相同的染料和顏料。有用的殼物質在本文稱作"曱矽烷基胺"偶聯劑。此類物質通常通稱為"矽烷"偶聯劑或者有時稱作"有機矽烷"偶聯劑，但在本案中，其特別具有胺官能團。用於本發明的殼物質為用以下通式表示的曱矽烷基胺或可水解甲矽烷基胺Si(OR)aZb其中R為氫或具有1約20個碳原子的取代或未取代的烷基，或具有約6~約20個碳原子的取代或未取代的芳基；Z為具有l-約20個碳原子的有機基，或具有約6約20個碳原子的芳基，其中至少一個所述Z具有至少一個伯、仲或叔氮原子；a為1~3的整數；以及b為13的整數；條件是a+b=4。曱矽烷基胺偶聯劑優選含有至少一個可水解取代基，例如羥基、甲氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基。可水解取代基還可以是無機基團(例如C1、Br或I)，其在置於水中時轉化成上式的化合物。通過與顆粒表面的水解反應，所述可水解取代基使曱矽烷基胺偶聯劑附著到芯粒表面。本發明的一種優選實施方案中，曱矽烷基胺偶聯劑含有至少一個具有至少一個氮原子的不可水解的取代基。本發明的一種特別優選的實施方案中，所述氮原子是伯、仲或叔胺或醯胺。用於本發明的甲矽烷基胺和可水解曱矽烷基胺偶聯劑包括3-氨丙基三曱氧基矽烷、3-氨丙基三乙氧基矽烷、3-氨丙基二曱基曱氧基矽烷、N-(2-氨乙基)-3-氨丙基曱基二曱氧基矽烷、1,4-雙[3-(三曱氧基曱矽烷基)丙基]乙二胺、雙(2-羥乙基)-3-氨丙基三乙氧基矽烷、l-(3-三甲氧基曱矽烷基)-丙脲、(N,N-二乙基-3-氨丙基)三曱氧基矽烷和(3-三曱氧基曱矽烷基丙基)二亞乙基三胺。有用的甲矽烷基胺偶聯劑可從諸如GelestInc.;UnitedChemicalTechnologies;AldrichChemicalCo.等購得。存在於溶液中的具有胺官能團的甲矽烷基胺偶聯劑中，超過35%(更優選超過70%)直接吸附到芯粒表面。該百分比為直接結合到芯粒的甲矽烷基胺偶聯劑除以膠體中的曱矽烷基胺偶聯劑總量的重量百分比。希望使未吸附到納米粒的胺基數量達到最小，並限制溶液中"游離"胺官能度，因為游離胺可能妨礙納米粒組裝體的功能，在隨後的結合步驟中尤其如此。吸附或結合到芯粒表面的曱矽烷基胺8偶聯劑的量可用實驗章節中所描述的溶液態(solutionstate)核磁共振(NMR)測定。如果納米粒芯-殼顆粒包含細胞毒素組分，例如金屬、金屬氧化物或有機化合物，希望保證納米粒與可能施用納米粒的患者之間的生物相容性。某些組分相對惰性，比其他組分的生理侵入少。用生物相容的物質對芯-殼納米粒栽體進行包覆或其他形式的全部或部分覆蓋，可使得任何金屬有機材料或聚合材料的有害效應達到最小。"生物相容的"指組合物不破壞其被導入的生物體系的正常功能。典型地，生物相容的組合物將與血液相容，不會另外在身體中引起不良反應。例如，生物相容的物質不應是有毒的、免疫原性的或凝血酶原性的。"可生物降解的"指在生理條件下能被酶促降解或水解降解成較小分子的物質，所述較小分子可通過自然過程排出體外。在一些實施方案中，為使所述芯-殼納米粒膠體具有生物相容性，以使其具有適當長的體內存留期(半衰期)，通過與至少一些胺官能團締合，可將保護鏈添加到納米粒的表面。保護鏈可以是殼的一部分或者附著到所述殼以形成第二殼。有用的保護鏈的例子包括聚乙二醇(PE(])、曱氧基聚乙二醇(MPEG)、曱氧基聚丙二醇、聚乙二醇二酸、聚乙二醇一胺、MPEG—胺、MPEG醯肼和MPEG咪唑。保護鏈還可以是PEG和其它聚合物的嵌段共聚物，所述其它聚合物例如為多肽、多糖、聚醯胺胺、聚乙烯胺、多核苷酸、蛋白質(例如BSA)、脂質(包括被膜)和碳水化合物。在"BiodegradablePolymers"(Holland等，1992，AdvancesinPharmaceuticalSciences6:101-164)中對合成的生物相容聚合物進行了總體討論。這些生物相容性化合物的添加可在加入其它的生物組分、藥物組分或i拿斷組分之後進行，並作為將組裝體引入被試者或系統之前的最後合成步驟。這些物質還可以是納米粒栽體及與之結合的生物組分、藥物組分或診斷組分的保護劑或掩蔽劑，以防止被免疫系統或其它生物系統識別，所述其它生物系統例如為蛋白酶、核酸酶(例如DNA酶或RNA酶)，或者與不想要的降解有關的其它酶或生物實體,，因此，對聚合物殼加入保護劑提供了掩蓋或隱蔽性質，以促使帶有完整生物組分、藥物組分或診斷組分的組裝體到達目標細胞或組織。本發明芯-殼納米粒組合物可用作承栽生物組分、藥物組分或診斷組分的載體。特別地，納米粒載體顆粒不一定要包封特定的治療組分或成像組分，而是作為生物組分、藥物組分或診斷組分的載體。生物組分、藥物組分或診斷組分(例染料或放射造影劑)可與殼或芯締合。術語"診斷劑"包括可作為造影劑，由此在宿主哺乳動物中產生可檢測的指示信號的組分。所述可檢測的指示信號可以是Y-發射信號、放射性信號、回聲信號、螢光信號或生理信號等等。可通過使染料或螢光團附著到顆粒栽體來產生螢光指示信號。螢光團廣泛用於生物學應用中，其包括諸如螢光素或若丹明染料的分子或物質。而且，近紅外螢光團特別有用，其例如為cy7、cy5、cy5.5、靛菁綠、Lajolla藍、IRD41、IRD700、NIR-1和Alexafluor染料。US2003/0044353A1中對這些染料及其它染料進行了詳糹田i寸i倉。本文所使用的術語"生物藥劑，，包括有效治療生理紊亂的生物活性物質、藥物、酶、激素、類固醇、重組產品等。治療劑的例子為抗生素、溶栓酶(例如尿激酶或鏈激酶)、胰島素、生長激素、化學治療劑(例如阿黴素)和抗病毒劑(例如幹擾素和阿昔洛韋)。這些治療劑可與納米粒的殼或芯締合，其在酶促降解(例如被蛋白酶或水解酶降解)下，可經一段時間釋放治療劑。所述組合物可進一步包含生物組分、藥物組分或包括識別特定靶細胞的靶向部分的診斷組分。所述組合物的一個特徵可以是通過與所述納米粒芯-殼栽體締合的靶向部分來識別和結合細胞表面受體。該特徵利用如下認識細胞表面結合活動通常是引起各種活動的細胞級聯(值得注意的是受體介導的胞吞)中的引發步驟。術語"受體介導的胞吞"("RME")—般表示一種機制，其受到配體與位於細胞表面上的受體的結合的催化，通過該機制使受體結合的配體在細胞內被內化。許多蛋白質和其它結構通過受體介導的胞吞進入細胞，所述其它結構包括胰島素、表皮生長因子、生長激素、促曱狀腺素、神經生長因子、降鈣素、胰高血糖素及許多其它結構。受體介導的胞吞(下文稱"RME")為將所述納米粒(可能含有其它生物組分、藥物組分或診斷組分)輸送至細胞內部提供了便利機制。在RME中，配體與位於細胞表面的受體的結合，可啟動月包內信號，所述胞內信號可包括胞吞反應。因此，締合有靶向部分的納米粒芯-殼載體可結合於細胞表面上，隨後內陷及內化在細胞內。可用作對本發明組合物有用的靶向劑的部分的代表性但非限制性的列表選自蛋白質、肽、適體(aptomer)、小有機分子、毒素、白喉毒素、假單胞菌毒素、霍亂毒素、蓖麻毒蛋白、刀豆蛋白A、勞氏肉瘤病毒、西門利克森林病毒、水泡性口炎病毒、腺病毒、運鐵蛋白、低密度脂蛋白、鈷胺傳遞蛋白、卵黃蛋白、表皮生長因子、生長激素、促曱狀腺素、神經生長因子、降鈣素、胰高血糖素、催乳素、黃體生成素、甲狀腺激素，血小板衍生生長因子、千擾素、兒茶酚胺、肽模擬物、糖脂、糖蛋白和多糖。還可以使用所述部分的同源物或片段。這些靶向部分可與納米粒芯-殼締合，並用來將納米粒引導至把細胞，納米粒隨後內化於靶細胞內。並不要求將整個部分用作靶向部分。已知與特定受體或其它結構相互作用的這些部分的較小片段也可以作用靶向部分。抗體或抗體片段表示一類最普遍使用的靶向部分，其可用來增強納米粒攝取進入細胞。可用本領域普通技術人員已知的各種技術中的任一種製備抗體(例如參見Harlow和Lane，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988)。可通過細胞培養技術產生抗體，其包括單克隆抗體的產生或通過將抗體基因轉染至合適的細菌或哺乳類細胞宿主從而允許產生重組抗體。一種技術中，起初將包含多肽的免疫原注射入多種哺乳動物(例如小鼠、大鼠、兔子、綿羊或山羊)中的任何一種。如果多肽連接至載體蛋白(例如牛血清白蛋白或匙孔械血藍蛋白)，可引起優異的免疫反應。將免疫原注射入動物宿主，優選根據預定日程結合一次或多次加強免疫，並定期對動物進行抽血。然後可以用諸如親和色i普法(使用偶合至適當固體栽體的多肽)等從此類抗血清中純化得到對多肽專一的多克隆抗體。例如可使用Kohler和Milstein(Eur.J.Immunol,6:511-519，1976)的技術及其改進技術製備對感興趣的抗原多肽專一的單克隆抗體。可從生長的雜交瘤克隆的上清液中分離單克隆抗體。此外，可採用多種技術來增強產率，例如將雜交瘤細胞系注射入合適的脊推動物宿主(例如小鼠)的腹膜腔。然後可從腹水或血液中收穫單克隆抗體。可用常規技術(例如層析、凝膠過濾、沉澱和萃取)從抗體中去除雜質。本發明的多肽可用於諸如親和色譜步驟中的純化過程中。許多包含源自非人免疫球蛋白的抗原結合部位的"人化"抗體分子已得到描述(Winter等(1991)Nature349:293-299;Lobuglio等，(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA86:4220-4224)。設計這些"人化"分子以使不需要的對齧齒動物抗人抗體分子的免疫反應達到最小，所述免疫反應限制了那些部分在接受人中治療應用的持續期和有效性。維生素和其它必需礦物質及營養素可用作靶向部分，以增強細胞對納米粒的攝取。具體地，維生素配體可選自葉酸(folate)、葉酸受體-結合葉酸類似物(bindinganalogsoffolate)、以及其它的葉酸受體-結合配體；生物素、生物素受體-結合生物素類似物、以及其它的生物素受體-結合配體；核黃素、核黃素受體-結合核黃素類似物、以及其它的核黃素受體-結合配體；以及硫胺素、硫胺素受體-結合硫胺素類似物、以及其它的硫胺素受體-結合配體。被認為觸發受體介導的胞吞，從而也能在本發明公開的方法中應用的其它營養素為肉鹼、肌醇、硫辛酸、煙酸、泛酸、吡。多醛和抗壞血酸，以及脂溶性維生素A、D、E和K。另外，現有技術所述的任何"免疫脂質體"(具有連接至脂質體表面的抗體的脂質體)適用於所述組合物。由於並非所有的天然細胞膜具有生物活性生物素或葉酸受體，所述組合物在具體細胞系上的體外使用可涉及首先對細胞系進行改變或其它修飾以保證存在生物活性生物素或葉酸受體。因此，可通過以下方式增加細胞膜上的生物素或葉酸受體數量使細胞系在生物素或葉酸缺陷培養基上生長以促進生物素和葉酸受體的產生，或者使插入的外源基因表達與生物素或葉酸受體對應的蛋白質或脫輔蛋白質。RMI-:不是將所述芯-殼納米粒轉運入細胞的獨有方法。可通過使恰當的實體附著到納米粒所開發的其它攝取方法包括膜孔的有利使用。吞噬和胞飲機制也提供了使納米粒能在細胞內部內化的有利機制。識別部分可進一步包含容易受到酶切割或電化學切割的序列。從而識別部分可包含容易被存在於細胞內各種位置的酶切割的序列，所述酶例如為蛋白酶或限制性內切核酸酶(例如DNA酶或RNA酶)。細胞表面識別序列並不是必要條件。因此，雖然細胞表面受體靶向部分可用來靶向給定的細胞類型，或者用來誘導所述納米粒與細胞表面的締合，但並不要求在納米粒的表面上存在細胞表面受體靶向部分。為了將生物組分、藥物組分或診斷組分組裝至所述芯-殼納米粒載體，可通過鍵(linkage)使組分與納米粒栽體締合。就"締合"而言，其意指組分被納米粒(例如芯-殼納米粒的殼)承栽。組分可被溶解且非共價地併入顆粒中。使組分締合的一種優選方法是通過殼的胺官能進行共價鍵合。一般地，可使用在感興趣的生物組分、藥物組分或診斷組分與芯-殼納米粒載體之間形成鍵的任何方法。這可包括直接或間接地通過連接基團使配體與外源12分子共價鍵合、離子鍵合或氫鍵合。一般通過以下方式形成鍵通過在複合體的各組分上的酸、酸酐、羥基、氨基或亞肼基之間形成醯胺、酯或亞氨基鍵使生物組分、藥物組分或診斷組分共價鍵合至芯-殼納米粒載體。優選本領域承認的(art-recognized)的生物不穩定共價鍵，例如亞氨基鍵以及具有-COOCH、-O-O-或-COOCH鍵合的所謂的"活性"酯。氫鍵合(例如出現於核酸互補鏈間的氫鍵合)也可用來形成鍵。在製備充分純的膠體(優選包含帶有生物組分、藥物組分或診斷組分的芯-殼納米粒載體)之後，可能希望製備藥物組合物中的納米粒，所述組合物可施用於被試者或試樣。優選的給藥技術包括胃腸外給藥、靜脈內給藥和直接輸注到希望的粑組織(包括但不限於實體腫瘤或其它腫瘤組織)中。通過實施最終的純化步驟可實現純化，所述純化步驟在包含合適的藥物組合物的介質中處理納米粒組合物。合適的藥物組合物一般包含一定量帶有符合劑量信息(以個案為基礎來確定)的活性劑的所需納米粒。所需顆粒與可接受的藥物稀釋劑或賦形劑(例如無菌水溶液)混合，以得到適當的終濃度。此類劑型典型包括緩衝劑(例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))或其它的添加劑，例如藥物賦形劑、穩定劑(例如BSA或HSA),或鹽(例如氯化鈉)。對於胃腸外給藥，一般希望通過確保其無菌性、無免疫原性和無致熱性進一步使組合物為藥學上可接受的。這樣的技術一般為本領域所熟知。另外，就對人給藥而言，製劑應符合FDA生物學標準(FDAOfficeofBiologicalStandards)所要求的無菌性、致熱性、一般安全性和純度標準。將所述納米粒組合物引入懸浮於細胞培養物中的細胞時，其足以使細胞與納米粒在適當的生長培養基中一起孵育，所述生長培養基例如為Luriabroth(LB)或合適的細胞培養基。雖然其它引入方法是可能的，但這些引入處理是優選的，並能實施而不考慮存在於納米粒載體的表面上的實體。實施例二氣化矽膠體購自NalcoChemical公司，例如為Nalco1130,平均粒徑為8nm,30%固體，pH=10.0，比表面積=375m2/g;以及Nalco1140，平均粒徑為5nm，40%固體，pH=9.7,比表面積=200m2/g。所有芯粒具有負G電位。曱矽烷基胺偶聯劑購自Gelest，為3-氨丙基(三乙氧基)矽烷和(3-三甲氧基曱矽烷基丙基)二亞乙基三胺。NHS-mPEG(Mw-5000Da)購自NektarMoleculeEngineering(目錄號2M4M0H01)。通過使以下物質溶解於1.0L蒸餾水來製備PBS(磷酸鹽緩沖系統)緩沖液137mMNaCl(8g)、2.7mMKCl(0.2g)、10mMNa2HP04(1.44g)、2mMKH2P04(0.24g)。含有包膠螢光染料的芯粒的製備用Stober(W.stober，A.Fink和E.Bohn，J.ColloidInterfaceSci.26,62(1968);N.A.MVerhaegh和A.vanBlaaderen,Langmuir10，1427(1994))所述方法的修改方法製備二氧化矽顆粒。四乙基正矽烷(TEOS)和3-氨丙基三乙氧基珪烷購自SigmaAldrich。聚乙烯亞胺購自AldrichChemicals,'平均MW=10，000g/mol,233單體/摩爾聚合物。聚乙烯亞胺(以下為"PEI")的單體分子量為43.0g/mol。BVSM為1,1，-1亞曱基雙(磺醯):1雙乙烯(bis-ethene,1，1，-[methylenebis(sulfonyl)])，得自EastmanKodak公司。通過使以下物質溶解於1.0L蒸餾水來製備PBS(磷酸鹽緩沖系統)緩衝液137mMNaCl(8g)、2.7mMKCl(0.2g)、10mMNa2HP04(l,44g)、2mMKH2P04(0.24g)。曱氧基聚乙二醇丙酸琥珀醯亞胺酯，MW=5，000g/mol(以下稱作mPEG-NHS)，購自NektarMoleculeEngineering目錄號m-spa-5000)。螢光染料(5(6)-異硫氰酸螢光素和異硫氰酸四曱基若丹明)購自Sigma-Aldrich。近紅外螢光團(CY7)購自Amersham公司，分子量=817g/mo1，具有如下化學結構formulaseeoriginaldocumentpage14近紅外螢光NIR-2室溫下，在含有前體-1的碘化物鹽(1.3g，2mmol)的染料的無水吡啶(20mL)溶液中加入1-(3-二曱基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.8g，4.1mmol)和3-氨丙基三乙氧基矽烷(1.32g，6mmo1)。氮氣下攪拌所得的混合物直至耗盡原材料(用TLC監控)。然後用無水乙醚(100ml)稀釋混合物，沉澱出產物，其為粘稠的半固體物質，用矽膠色譜(使用10:1乙酸乙酯/曱醇作為洗脫液)對其進行進一步純化。NIR-2粒度測定。使用MICRTRAC"超糹田粒子分析儀(UltrafineParticleAnalyzer)(UPA，型號150，購自Leeds&Northrop),通過動態光散射法測定以下實施例中得到的芯-殼納米粒載體的體積加權平均粒徑。該分析提供百分位數據，其顯示小於指示大小的顆粒的體積百分比。50百分位稱作中位數直徑，在本文稱之為"中值粒徑"。如MICROTRAC⑧超細粒子分析儀(UPA,型號150)手冊中所描述的，從粒度面積分布計算"體積加權平均粒徑"。標準偏差描述粒度分布的寬度。標準偏差越小，粒度分布寬度越窄。曱矽烷基胺吸附的定量測定。使用溶液態'HNMR波譜法作為測定吸附到膠體納米粒上的甲矽烷基胺偶聯劑量的定量方法。這是有可能的，因為已知吸附到顆粒表面的化學種類(chemicalspecies)呈現遷移率降低，磁化率也容易發生變化。這些因素均導致充分增加了NMR共振的譜線寬度，並導致無法觀察與顆粒表面絲'合(吸附或附著)的物質的共振。因此，只觀察到由溶於溶液中的化學種類發生的NMR共振。從而從對總存在量的了解而間接得到吸附量。該方法採用外參比，以逐個樣品比較分散劑的信號。將參比物3-(三曱基曱矽烷基)丙-3,3,2，2-d4酸鈉鹽(TSP)放置於密封的同軸管中，所述同軸管在含有感興趣的樣品的管內。對每個樣品使用相同的同軸參比管。為了校準對同軸參比的信號，製備含有已知量的甲矽烷基胺偶聯劑的對照溶液。使用VarianInovaNMR波譜儀(Varianinc.,PaloAlto，CA)獲得數據，波譜-儀在500MHz的'I1頻率下才喿作。採用預飽和以降15低水信號，使用13.5秒的總弛豫延遲以確保定量條件。所有的樣品使用同樣的實驗參數。典型地，在不足5分鐘獲得'HNMR波譜。納米粒栽體表面改性比較例的符號為"C"。本發明實施例的符號為"I"。C-l:在250mL容器中加入100.0g10%w/w二氧化矽膠體(由Naco1140稀釋製備)。然後在攪拌的懸浮液中加入0.37g(3-三曱氧基曱矽烷基丙基)二亞乙基三胺。隨後通過加入1.34g4.0N硝酸溶液將混合物的pH調節至約5.0。之後在室溫下攪拌懸浮液3天。表1給出了平均粒徑、吸附到顆粒表面的曱矽烷基胺偶聯劑的百分率以及物理特性。1-1:以與C-l相同的方式進行操作，除了用0.77g代替(3-三曱氧基曱矽烷基丙基)二亞乙基三胺在C-l中的加入量，通過加入1.98g4.0N硝酸溶液將混合物的pH調節至約5.0。表1給出了平均粒徑、吸附到顆粒表面的曱矽烷基胺偶聯劑的百分率以及物理特性。1-2:以與C-l相同的方式進行搡作，除了用1J9g代替(3-三曱氧基曱矽烷基丙基)二亞乙基三胺在C-l中的加入量，通過加入2.94g4.0N硝酸溶液將混合物的pll調節至約5.0。表1給出了平均粒徑、吸附到顆粒表面的曱矽烷基胺偶聯劑的百分率以及物理特性。1-3:以與C-l相同的方式進行操作，除了用3.01g代替(3-三曱氧基曱矽烷基丙基)二亞乙基三胺在C-1中的加入量，通過加入6.55g4.0N硝酸溶液將混合物的pH調節至約5.0。表1給出了平均粒徑、吸附到顆粒表面的曱矽烷基胺偶聯劑的百分率以及物理特性。C-2:以與C-1相同的方式進行操作，除了用12.05g代替(3-三甲氧基曱矽烷基丙基)二亞乙基三胺在C-1中的加入量，通過加入26.07g4.0N硝酸溶液將混合物的pH調節至約5.0。表1給出了平均粒徑、吸附到顆粒表面的甲矽烷基胺偶聯劑的百分率以及物理特性。表1實施例或曱矽烷基胺平均粒徑標準偏差穩定膠體%結合比較例二氧化矽比率(w/w)(nm)(■)曱矽烷基胺C-l0.034,5003,000否981-10.0612378是851-2—0.09—13是691-30.20-246曰疋一—一40—5:5——一——0.50...27—5—是11.—三—氣化矽..——14——是—n.a.n.a.=不適用表l的結果表明，本發明的實施例提供膠態穩定的載體顆粒，其具有高百分率(大於35%)的結合甲矽烷基胺偶聯劑，這隻有在窄的曱矽烷基胺對二氧化矽的比率範圍(約0.4約0.20)的情況下出現,，曱矽烷基胺偶聯劑對二氧化矽表面積的摩爾比可提供顆粒表面覆蓋率的另一種測定。以上的重量比(.040.2)相當於0.753.8mmol曱矽烷基胺/m2二氧化矽表面。C-3:在250mL容器中加入100.0g10%w/w二氧化矽膠體(由Nalco("l40稀釋製備)。然後在攪拌的懸浮液中加入0.25g3-氨丙基(三乙氧基)矽烷。隨後通過加入0.74g4.0N硝酸溶液將混合物的pH調節至約5.0。之後在室溫下攪拌懸浮液3天。表2給出了平均粒徑、吸附到顆粒表面的甲矽烷基胺偶聯劑百分率以及物理特性。1—4:以與C-l同樣的方式進行操作，除了用0.53g代替3-氨丙基(三乙氧基)石圭烷在C-l中的加入量，通過加入1.05g4.0N硝酸溶液將混合物的pH調節至約5.0。表2給出了平均粒徑、吸附到顆粒表面的甲矽烷基胺偶聯劑的百分率以及物理特性。1-5:以與C-l同樣的方式進行操作，除了用0.82g代替3-氨丙基(三乙氧基)矽烷在C-l中的加入量，通過加入.31g4.0N硝酸溶液將混合物的pH調節'至約5.0。表2給出了平均粒徑、吸附到顆粒表面的曱矽烷基胺偶聯劑的百分率以及物理特性。1-6:以與C-1同樣的方式進行操作，除了用2.06g代替3-氨丙基(三乙氧基)石圭烷在C-l中的加入量，通過加入2.85g4.ON硝酸溶液將混合物的pH調節至約5.0。表2給出了平均粒徑、吸附到顆粒表面的曱矽烷基胺偶聯劑的百分率以及物理特性C_4:以與C-l同樣的方式進行操作，除了用8.24g代替3-氨丙基(三乙氧基)矽烷在C-l中的加入量，通過加入10.52g4.0N硝酸溶液將混合物的pH調節至約5.0。表2給出了平均粒徑、吸附到顆粒表面的曱矽烷基胺偶聯劑的百分率以及物理特性。表2實施例或平均粒徑標準偏差穩定膠體%結合比庫交例二氧化矽(nm)(nm)甲矽烷基胺比率(w/w)0.025—343—62—一——————￥—————一—..———94I-4—26——————11——————是78I-50:082———44——_————…———1》—'——…——是——681-60.21—26————4是37C-4「0.824284是19—三—福匕石圭——0144曰疋表2的結果表明，本發明的實施例提供膠態穩定的載體顆粒，其具有高百分率(大於35%)的結合曱矽烷基胺偶聯劑，這隻有在窄的甲矽烷基胺對二氣化矽的比率範圍(約0.04約0.20)的情況下出現。甲矽烷基胺偶聯劑對二氧化矽表面積的摩爾比可提供顆粒表面覆蓋率的另一種測定。以上的重量比(0.040.20)相當於0.94.5jamol甲矽烷基胺/m2二氧化石圭表面,,PBS緩衝液中的穩定C-5:劇烈攪拌下，在10.0mLPBS緩沖液(pH::7.3)中緩慢加入10.0mL得自C-l的納米粒載體懸浮液。必要時用1.0NNaOH將所得懸浮液的pH調節至pH7.0。在室溫下攪拌懸浮液1天。表3給出了懸浮液的平均粒徑和標準偏差。1-7:以與C-5同樣的方式進行操作，除了在劇烈攪拌下，在10.0mLPBS緩沖液(pH-:7.3)中緩慢加入lO.mL得自1-1的納米粒載體懸浮液。表3給出了懸浮液的平均粒徑和標準偏差。1-8:以與C-5同樣的方式進行操作，除了在劇烈攪拌下，在10.0mLPBS緩沖液(pll:::7.3)中緩慢加入10.0vnL得自1-2的納米粒載體懸浮液。表3給出了懸浮液的平均粒徑和標準偏差。1-9:以與C-5同樣的方式進行操作，除了在劇烈攪拌下，在1.OmLPBS緩沖液(pH::7.3)中緩慢加入1.0mL得自1-3的納米粒載體懸浮液。表3給出了懸浮液的平均粒徑和標準偏差。C-6:以與C-5同樣的方式進行操作，除了在劇烈攪拌下，在10.0mLPBS緩沖液(pH-力.3)中緩慢加入10.0mL得自C-2的納米粒栽體懸浮液。表3給出了懸浮液的平均粒徑和標準偏差。表3實施例或曱矽烷基胺平均粒徑標準偏差穩定膠體%結合tableseeoriginaldocumentpage19表3的結果表明，本發明的納米粒載體可以在生理pH和離子強度(PBS緩沖液)中穩定，其具有高百分率的結合曱矽烷基胺偶聯劑，這隻有在窄的曱矽烷基胺對二氧化矽的比率範圍(約0.6約0.20)的情況下出現。納米粒的聚乙二醇化(pegylation)I-l:使實施例2(1-2)所得到的芯-殼納米粒載體在蒸餾水中透析過夜，用0.05M碳酸氫鈉水溶液稀釋至0.3%固體。使顆粒與已知濃度的焚光胺反應，對照標準物的螢光校準值表明，每1.00g二氧化矽芯粒計，顆粒含有102pmol結合至其表面的伯胺。然後在1.OmL0.3%胺化的芯粒懸浮液中加入100mgNHS-mPEG(Mw:5000Da),並攪拌樣品2小時。表4報導了平均粒徑和C電位值。1-11:以與1-10同樣的方式進行操作，除了加入150mgNHS-mPEG(Mw=5OODa)。表4報導了平均粒徑和^電位值。1-12:以與1-10同樣的方式進行4喿作，除了加入20mgNHS-mPEG(Mw二5000Da)。表4報導了平均粒徑和C電位值。表4tableseeoriginaldocumentpage19表4的數據表明，可以用生物相容的殼(本例中由聚乙二醇聚合物提供)包覆芯-殼納米粒載體。粒度分布數據證實包覆成功，且^電位進一步證實這一點，C電位顯示，芯-殼納米粒載體的表面電荷變得與pH無關。染料附著到聚乙二醇化納米粒栽體上1-13:使實施例2(1-2)所得到的芯-殼納米粒載體在蒸餾水中透析過夜，用0.05M碳酸氮鈉水溶液(pH7.4)稀釋至0.3%固體。然後在15.0mL0.3%胺化的芯粒懸浮液中加入150mgNHS-mPEG(Mw-:5000Da)，並在室溫下攪拌樣品4小時。隨後使7.5mL反應混合物在PBS緩沖液中透析(使用30,000MWCO過濾器)以去除任何未附著的m-PEG。之後在該透析樣品中加入0.002gCY7-NHS近紅外焚光團，黑暗中對懸浮液室溫攪拌3小時。然後使反應混合物在PBS緩沖液中透析(使用30，00MWCO過濾器)，以去除任何未附著的NHS-CY7或其水解產物。懸浮液的平均粒徑為60nm。焚光光譜顯示一條中心位於785nm的螢光帶，所用的激發波長為730nm。權利要求1.一種組合物，其包含在生理pH和離子強度下穩定的膠體，所述膠體包含具有芯和殼的顆粒a)其中所述殼包含甲矽烷基胺偶聯劑；b)其中所述顆粒的體積加權平均粒徑小於200nm，以及c)其中存在於所述膠體中的所述甲矽烷基胺偶聯劑超過35％結合到芯表面。2、根據權利要求1所述的組合物，其中所述體積加權平均粒徑小於100nm。3、根據權利要求1所述的組合物，其中所述體積加權平均粒徑的標準偏差小於平均粒徑。4、根據權利要求l所述的組合物，其中所述曱矽烷基胺偶聯劑選自3-氨丙基三甲氧基矽烷、3-氨丙基三乙氧基矽烷、3-氨丙基二甲基甲氧基矽烷、N-(2-氨乙基)-3-氨丙基曱基二曱氧基,圭烷、1,4-雙[3-(三曱氧基曱矽烷基)丙基]乙二胺、雙(2-羥乙基)-3-氨丙基三乙氧基矽烷、l-(3-三曱氧基甲矽烷基)-丙脲、(N,N-二乙基-3-氨丙基)三曱氧基矽烷和(3-三曱氧基曱矽烷基丙基)二亞乙基三胺。5、根據權利要求1所述的組合物，其中所述芯為二氧化矽。6、根據權利要求5所述的組合物，其中所述芯具有包膠染料或顏料。7、根據權利要求1所述的組合物，其中所述芯具有負電荷。8、恨據權利要求1所述的組合物，其中膠體中的所述甲矽烷基胺偶聯劑超過7%結合到芯表面。9、根據權利要求1所述的組合物，其中所述顆粒的表面上有保護鏈。10、根據權利要求1所述的組合物，其中所述顆粒進一步包含生物組分、藥物組分或i貪斷組分。11、根據權利要求1所述的組合物，其中所述膠體的固體含量為約130重量％。12、根據權利要求1所述的組合物，其中所述膠體含有0.55|Jmol.曱矽烷基胺/m2芯粒表面積。13、根據權利要求1所述的組合物，所述膠體含有1010(K)iumo1曱矽烷基胺/g芯粒。14、根據權利要求1所述的組合物，其中所述體積加權平均粒徑小於50nm。15、根據權利要求1所述的組合物，其中所述膠體在pH5~9下穩定。16、根據權利要求1所述的組合物，其進一步包含螢光物質。17、根據權利要求1所述的組合物，其中芯粒選自Si02、Ti2、A1203、A100H、Zr02或Fe304月交體。全文摘要本發明公開一種組合物，其包含在生理pH和離子強度下穩定的膠體。所述膠體包含具有芯和殼的顆粒a)其中所述殼包含甲矽烷基胺偶聯劑；b)其中所述顆粒的體積加權平均粒徑小於200nm，以及c)其中所述膠體中所存在的甲矽烷基胺偶聯劑中超過35％結合到芯表面。這些芯-殼納米粒物質能夠承載生物組分、藥物組分或診斷組分。然後可將所述組分直接傳送到患病組織或骨，在緊鄰病灶處釋放，並降低對病人的副作用風險，所述組分可包括藥物、治療劑、診斷劑和靶向部分。文檔編號B01J13/02GK101263191SQ200680029506公開日2008年9月10日申請日期2006年8月11日優先權日2005年8月18日發明者J·F·布林利,T·A·喬申請人:卡爾斯特裡姆保健公司