治療HPV感染的dsRNA組合物和方法

2023-11-03 01:38:17

專利名稱：治療HPV感染的dsRNA組合物和方法
技術領域：
本發明涉及雙鏈核糖核酸(dsRNA)及其在介導RNA幹擾以治療人乳頭瘤病毒(HPV)感染介導的病理過程(例如子宮頸癌、肛門癌、HPV相關癌前病變和生殖器疣)中的用途。

背景技術：
乳頭瘤病毒(PV)為誘導上皮過度增生性病變的無包膜DNA病毒。乳頭瘤病毒廣泛存在於自然界，並已在高等脊椎動物中發現。特別是來自人、牛、兔、馬和狗的病毒已被表徵。1993年，棉尾兔乳頭瘤病毒(CRPV)成為第一種被描述的乳頭瘤病毒。從此以後，棉尾兔乳頭瘤病毒和1型牛乳頭瘤病毒(BPV-1)一直被用作研究乳頭瘤病毒的實驗原型。大多數動物乳頭瘤病毒與單純的上皮增生性病變相關，並且動物中的大多數病變是皮膚病變。在人類中，已經鑑定出多於100種的乳頭瘤病毒(HPV)，並根據感染部位(皮膚上皮和黏膜上皮(口腔和生殖器黏膜))對其進行了分類。皮膚相關疾病包括扁平疣和蹠疣等。黏膜相關疾病包括喉乳頭狀瘤和肛門生殖器疾病，包括宮頸癌(Fields，1996，Virology，3rd ed.Lippincott-Raven Pub.，Philadelphia，N.Y.；Bernard，H-U.，2005.J.Clin.Virol.328S1-S6)。
人乳頭瘤病毒(HPV)感染是世界上最普遍的性傳播感染之一。大部分的HPV感染是無害的。一些類型的HPV會引起生殖器疣，表現為在男性和女性的生殖器區域(包括陰道、子宮頸、外陰(陰道之外的區域)、陰莖和直腸)出現一個或多個腫塊。許多感染HPV的人沒有症狀。
儘管大多數HPV亞型只造成良性病變，但是某些亞型被認為是高危的，並會導致更嚴重的病變，例如子宮頸和肛門發育異常。15種類型的HPV近期被劃分為高危類型(Munoz，N.等人2003.N.Engl.J.Med.348(6)518-27)。這些高危亞型具有遺傳多樣性，主要的病毒衣殼蛋白的L1基因證明有＞10％的序列差異(Bernard，H-U.，2005.J.Clin.Virol.328S 1-S6)。
攜帶HPV感染的女性通常無症狀，只有在子宮頸篩查之後才能發現她們的病變。子宮頸篩查主要採用巴氏試驗(Pap test)進行。巴氏試驗是用來識別異常子宮頸細胞的子宮頸組織的組織學評價。作為巴氏試驗的一部分，HPV感染的存在和具體的亞型可以使用基於核酸的分析來確定，例如PCR或商業化的雜交捕獲II技術(HCII)(Digene，Gaithersburg，馬裡蘭，美國)。
如果鑑別到異常的子宮頸細胞，則將其劃分為不同等級具有較低的發展成癌症的風險的LSIL(低等級鱗狀上皮內病變)(包括稱為CIN-1的細胞(「子宮頸上皮內瘤-1」))；或具有較高的發展成癌症的可能性的HSIL(高等級鱗狀上皮內病變)，包括稱為CIN-2和CIN-3的細胞。
大約85％的低等級病變會自發恢復，其餘的或者維持不變、或者發展成為高等級病變。如果不進行治療的話，大約10％的高等級病變預期會轉化成為癌組織。儘管其它的幾種轉化HPV亞型也與發育異常相關，但是HPV-16和HPV-18最經常與發育異常相關。
近期研究顯示多達89％的HIV陽性的男性同性戀者有可能感染這些高危HPV亞型。HIV陽性患者還更有可能同時感染多種亞型的HPV，這與高危發育異常進展有關。
過去20年的證據使人們普遍接受這樣的觀點儘管感染HPV並不一定會導致子宮頸癌，但是子宮頸癌的發展是由HPV感染引起的。子宮頸癌中存在HPV的機率估計為99.7％。與子宮頸癌一樣，肛門癌也被認為在HPV感染與發展成為肛門發育異常以及肛門癌之間具有類似的關聯。在一項對HIV陰性的肛門癌患者的研究中，發現88％的肛門癌患者感染HPV。美國2003年估計發生子宮頸癌新病例12200例，子宮頸癌死亡4100例；肛門癌新病例4000例，肛門癌死亡500例。儘管在過去的40年中，由於廣泛開展了預防性的篩查，使得子宮頸癌的發病率已有所下降，但是肛門癌的發病率卻在上升。肛門癌發病率的上升可能部分是由於HIV感染，因為HIV陽性的患者相比普通人群具有較高的肛門癌發病率。肛門癌在普通人群中的發病率是每100000人中發病0.9例，而肛門癌在男性同性戀人群中的發病率是每100000人中發病35例，在HIV陽性的男性同性戀人群中的發病率是每100000人中發病70-100例。事實上，由於HIV感染的患者中肛門發育異常非常普遍並且發展為肛門癌的趨勢也逐漸增長，《2003USPHA/IDSA Guidelines for theTreatment of Opportunistic Infections in HIV Positive Patients》中將會包括針對那些診斷為肛門發育異常的患者的治療方針。
目前尚沒有已知的治癒HPV感染的方法。現有一些治療生殖器疣的方法，儘管生殖器疣經常會不治而愈。該治療方法取決於諸如生殖器疣的大小和位置等因素。治療包括使用咪喹莫特乳膏、20％鬼臼樹脂抗有絲分裂溶液、0.5％普達非洛溶液、5％5-氟尿嘧啶乳膏和三氯乙酸。孕婦不推薦使用鬼臼樹脂或普達非洛，因為它們被皮膚吸收，有可能導致出生缺陷。孕婦也不推薦使用5-氟尿嘧啶乳膏。可以通過冷凍(冷凍手術)、灼燒(電灼術)或雷射治療來物理去除小的生殖器疣。對其它治療沒有響應的大的疣可能只能通過手術切除。已知生殖器疣在物理切除之後還會復發；在這樣的情況下，曾經直接向這些疣注射α幹擾素。但是，α幹擾素是昂貴的，並且其使用也並沒有降低生殖器疣的復發率。
因此，需要有效的HPV治療來滿足人們的需要。令人驚訝的是，已經發現了能夠滿足這種需要的化合物，並且提供了其它的益處。
近期，雙鏈RNA分子(dsRNA)已顯示在被稱為RNA幹擾(RNAi)的高度保守的調節機制中能夠阻斷基因的表達。WO99/32619(Fire等人)公開了使用至少25個核苷酸長度的dsRNA來抑制秀麗線蟲(C.elegans)中的基因表達。dsRNA也已顯示出能夠降解其它生物體中的靶RNA，包括植物(參見例如WO 99/53050，Waterhouse等人；和WO 99/61631，Heifetz等人)、果蠅(參見例如Yang，D.，等人，Curr.Biol.(2000)101191-1200)和哺乳動物(參見WO 00/44895，Limmer；和DE 10100586.5，Kreutzer等人)。這種天然機制已經成為開發用於治療由異常或不希望的基因調控引起的病症的新型藥物製劑的焦點。
PCT公布WO 03/008573公開了先前的開發用於治療由HPV感染引起的疾病的基於核酸的藥物的嘗試。該公布報告了使用針對HPV mRNA的兩種siRNA來抑制基於細胞的系統中的HPV複製；相關公布見Jiang，M.等人2005.N.A.R.33(18)el51。
儘管在RNAi領域已經取得了顯著的進步，在治療HPV感染介導的病理過程中也取得了進步，但是仍然需要能夠抑制HPV感染進展以及能夠治療HPV感染相關疾病的製劑。該挑戰是非常嚴峻的，因為這樣的製劑必須設計成能夠抑制顯示出非常大的基因型多樣性的所有高危HPV亞型。


發明內容
本發明通過使用雙鏈核糖核酸(dsRNA)來沉默化(silence)對HPV繁殖關鍵的基因表達，提供了解決治療HPV感染相關疾病中的問題的方案。E6AP是人宿主種類中HPV增殖所需的保守基因。
本發明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)，以及使用這樣的dsRNA抑制細胞或哺乳動物中E6AP基因表達的組合物和方法。本發明還提供了治療由E6AP基因的表達和HPV感染引起的病理狀態和疾病(例如子宮頸癌和生殖器疣)的組合物和方法。本發明的dsRNA包含RNA鏈(反義鏈)，該RNA鏈具有小於30個核苷酸的長度(通常為19-24個核苷酸長度)的區域，該區域與E6AP基因的mRNA轉錄物的至少一部分基本互補。
在一個實施方案中，本發明提供了抑制E6AP基因表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子。該dsRNA包含至少兩種相互互補的序列。dsRNA包括包含第一序列的有義鏈和包含第二序列的反義鏈。反義鏈包含與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補的核苷酸序列，並且互補區具有小於30個核苷酸的長度，通常為19-24個核苷酸的長度。一旦與表達E6AP的細胞相接觸，dsRNA可至少40％地抑制E6AP基因表達。
例如，本發明的dsRNA分子可以包含選自表1中有義序列的dsRNA的第一序列以及選自表1中反義序列的第二序列。本發明的dsRNA分子可以包含天然存在的核苷酸，或者可以包含至少一種修飾的核苷酸，例如2』-O-甲基修飾的核苷酸、包含5』-硫代磷酸基團的核苷酸和與膽甾醇衍生物連接的末端核苷酸。可替代地，修飾的核苷酸可以選自2』-脫氧-2』-氟修飾的核苷酸、2』-脫氧修飾的核苷酸、鎖定核苷酸、脫鹼基核苷酸、2』-氨基修飾的核苷酸、2』-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然鹼基的核苷酸。一般而言，這樣的修飾的序列將會基於選自表1中有義序列的所述dsRNA的第一序列和選自表1中反義序列的第二序列。
在另一個實施方案中，本發明提供了包含本發明的一種dsRNA的細胞。該細胞一般為哺乳動物細胞，例如人類細胞。
在另一個實施方案中，本發明提供了抑制生物體(一般為人類受試者)中E6AP基因表達的藥物組合物，其包含一種或多種本發明的dsRNA和藥學上可接受的載體或遞送載體(delivery vehicle)。
在另一個實施方案中，本發明提供了抑制細胞中E6AP基因表達的方法，包括下述步驟 (a)將雙鏈核糖核酸(dsRNA)導入細胞，其中，該dsRNA包含至少兩種相互互補的序列。該dsRNA包括包含第一序列的有義鏈和包含第二序列的反義鏈。反義鏈包含與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補的互補區，其中，互補區的長度小於30個核苷酸、一般為19-24個核苷酸的長度，其中，一旦與表達所述E6AP的細胞相接觸，dsRNA會抑制E6AP基因的表達至少40％；和 (b)維持步驟(a)中產生的細胞一段足以獲得E6AP基因的mRNA轉錄物的降解的時間，從而抑制細胞中E6AP基因的表達。
在另一個實施方案中，本發明提供了治療、預防或控制由HPV感染介導的病理過程(例如癌症或生殖器疣)的方法，包括給予需要這種治療、預防或控制的患者治療或預防有效量的本發明的一種或多種dsRNA。
在另一個實施方案中，本發明提供了用於抑制細胞中E6AP基因表達的載體，該載體包含與編碼本發明的一種dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列可操作地連接的調控序列。
在另一個實施方案中，本發明提供了包含抑制細胞中E6AP基因表達的載體的細胞。該載體包含與編碼本發明的一種dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列可操作地連接的調控序列。



無附圖。

具體實施例方式 本發明通過使用雙鏈核糖核酸(dsRNA)來沉默化對HPV增殖關鍵的基因表達，提供了解決治療HPV感染相關疾病中的問題的方案。特別地，本發明的dsRNA沉默化人E6AP基因，一種人宿主種類中HPV增殖所需的保守基因。在此，這些基因有時被統稱為HPV靶基因。
本發明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)，以及使用dsRNA來抑制細胞或哺乳動物中E6AP基因表達的組合物和方法。本發明還提供了使用dsRNA來治療哺乳動物中由E6AP基因的表達和HPV感染引起的病理狀態和疾病的組合物和方法。dsRNA通過被稱為RNA幹擾(RNAi)的過程引導了序列特異性的mRNA降解。
本發明的dsRNA包含RNA鏈(反義鏈)，該RNA鏈包含小於30個核苷酸長度(通常為19-24個核苷酸長度)的區域，該區域與HPV靶mRNA轉錄物的至少一部分基本互補。這些dsRNA的使用使得哺乳動物中與HPV複製和/或維持有關的基因的mRNA能夠發生靶向降解。使用基於細胞和基於動物的分析，本發明人已經證明極低劑量的這些dsRNA可以特異性地以及高效地介導RNAi，因而顯著抑制E6AP基因的表達。因此，通過靶向HPV生活周期中涉及的宿主因子基因，包含這些dsRNA的本發明的方法和組合物可用於治療由HPV感染介導的病理過程。
HPV靶標的描述HPV E1和E6和人E6AP 人宿主的細胞遍在蛋白連接酶E6AP通過其與病毒E6蛋白質的複合物參與HPV、特別是整合型(非附加型)HPV的複製。E6與許多調控細胞增殖途徑的蛋白質相結合，並通常引起它們的降解(Chakrabarti，O.和Krishna，S.2003.J.Biosci.28337-348)。E6與E6AP複合，以靶向腫瘤抑制物p53，從而實現降解(Scheffner，M.等人，1990.Cell.631129-1136；和Scheffner，M.等人，1993.Cell75495-505)。通過使p53失活，病毒不但阻止了p53介導的感染細胞的細胞凋亡(Chakrabarti和Krishna，2003)以及有利於可被p53阻斷的其DNA的複製(Lepik，D.等人1998.J.Virol.726822-6831)，而且通過降低p53介導的基因組完整性的控制而有利於腫瘤發生(Thomas，M.等人1999.Oncogene.187690-7700)。
E1和E6都已經在Fundamental Virology，3rd ed.Bernard N.Fields，David M.Knipe，和Peter M.Howley，eds.Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，1996的第947-978頁的Peter M.Howley的「PapillomaviridaeThe Viruses and Their Replication」中進行了詳細的描述。E1ORF編碼質粒DNA複製所必需的68-76kD的蛋白質。全長E1產物為磷酸化的核蛋白，與BPV1的LCR中的複製起點相結合。E1還顯示與ATP相結合，並在體外與被稱為E2轉錄反式激活蛋白(E2TA)的全長E2蛋白質相結合，從而提高了病毒的轉錄。與E2的結合還加強了E1對DNA複製起點的親和力。在HPV-16中，E1對無限增殖化具有間接的影響。
E6是小的鹼性細胞轉化蛋白質(例如HPV16E6包含151個胺基酸)，大約為16-19kD，位於核基質和非核膜部分。E6基因產物包含4個Cys-X-X-Cys基序，說明有可能與鋅結合；它還可以作為核酸結合蛋白。在高危HPV(例如HPV-16)中，E6和E7蛋白質是使它們的宿主——鱗狀上皮細胞無限增殖化的必要和充分條件。高危HPV的E6基因產物顯示與p53相複合，並促進其降解。
下述的具體描述公開了如何製備和使用dsRNA和包含dsRNA的組合物來抑制HPV靶基因的表達，以及用於治療由HPV感染引起的疾病和病症(例如子宮頸癌和生殖器疣)的組合物和方法。本發明的藥物組合物包含具有反義鏈的dsRNA和藥學上可接受的載體，該反義鏈包含小於30個核苷酸長度(一般為19-24個核苷酸長度)的互補區，該互補區與HPV靶基因的RNA轉錄物的至少一部分基本互補。本發明的一個實施方案在藥物製劑中聯合使用多於一種的dsRNA(可選地，靶向不同的HPV靶基因)。
因此，本發明的某些方面提供了包含本發明的dsRNA和藥學上可接受的載體的藥物組合物、使用該組合物抑制一種或多種HPV靶基因表達的方法以及使用該藥物組合物治療由HPV感染引起的疾病的方法。
I.定義 為了方便起見，下面提供了說明書、實施例和所附權利要求書中使用的某些術語和短語的含義。如果在說明書的其它部分使用的術語與此部分提供的定義存在明顯區別，以此部分的定義為準。
每個「G」、「C」、「A」和「U」一般分別代表包含作為鹼基的鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶的核苷酸。但是，應當理解術語「核糖核苷酸」或「核苷酸」還可指如下文進一步詳述的修飾的核苷酸，或者替代部分。本領域技術人員知道鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其它部分替代，而不會顯著改變包含帶有這種替代部分的核苷酸的寡核苷酸的鹼基配對性質。例如，非限制性地，包含肌苷作為其鹼基的核苷酸可以與包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸鹼基配對。因此，包含尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可在本發明的核苷酸序列中被包含例如肌苷的核苷酸替代。包含這樣的替代部分的序列是本發明的實施方案。
此處所使用的「E6AP」是指遍在蛋白連接酶E3A(ube3A，還被稱為E6相關蛋白質或E6AP)基因或蛋白質。代表不同同工型的E6AP的人mRNA序列以GenBank登錄號NM 130838.1、NM 130839.1和NM 000462.2提供。
此處所使用的「E1」是指16型人乳頭瘤病毒(HPV 16)E1基因(GenBank登錄號NC 001526，核苷酸865至2813)。此處所使用的「E6」是指16型人乳頭瘤病毒(HPV16)E6基因(GenBank登錄號NC 001526，核苷酸65至559)。E1和E6基因的許多變體也已經被公開。意在使用「E1」和「E6」涵蓋這些和將來發表的E1和E6基因變體，除非文中特別排除。
此處所使用的「靶序列」是指在一種HPV靶基因的轉錄過程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的相鄰部分，包括作為初級轉錄產物的RNA加工產物的mRNA。
此處所使用的術語「包含序列的鏈」是指包含由使用標準核苷酸命名法表示的序列所描述的核苷酸鏈的寡核苷酸。
當用於描述第一核苷酸序列與第二核苷酸序列的關係時，本領域技術人員知道，除非特別說明，此處所使用的術語「互補」是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交和形成雙鏈體結構的能力。這樣的條件例如可以是嚴格性條件，該嚴格性條件可以包括400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，在50℃或70℃下12-16小時，然後進行洗滌。也可以使用其它的條件，例如生物體內可能遇到的生理相關條件。本領域技術人員根據雜交核苷酸的最終應用能夠確定測試兩種序列互補性的最佳條件設置。
這包括將包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的整個長度內進行鹼基配對。這些序列可被稱為相對於彼此「完全互補的」。但是，當此處稱第一序列相對於第二序列「基本互補」時，這兩種序列可以為完全互補的，或者在雜交之後，它們可以形成一個或多個、但是通常不多於4個、3個或2個錯配的鹼基對，同時保持在與它們的最終應用最相關的條件下雜交的能力。但是，當兩種寡核苷酸被設計為在雜交之後形成一個或多個單鏈突出端(overhang)時，這樣的突出端在確定互補性時不應該被認為是錯配。例如，包含21個核苷酸長度的一種寡核苷酸和23個核苷酸長度的另一種寡核苷酸的dsRNA，其中較長的寡核苷酸包含與較短的寡核苷酸完全互補的21個核苷酸的序列，在本發明中也可以稱為「完全互補的」。
此處所使用的「互補的」序列還可以包括非Watson-Crick鹼基對和/或由非天然和修飾的核苷酸形成的鹼基對，或者完全由所述鹼基對形成，只要上述對於其雜交能力的要求能夠滿足即可。
此處的術語「互補的」、「完全互補的」和「基本互補的」可根據dsRNA的有義鏈和反義鏈之間的鹼基配對或dsRNA的反義鏈和靶序列之間的鹼基配對進行使用，可根據所使用的上下文進行理解。
此處所使用的與信使RNA(mRNA)的「至少一部分基本互補的」多核苷酸是指與興趣mRNA(例如編碼E6AP)的相鄰部分基本互補的多核苷酸。例如，如果該序列與編碼E6AP的mRNA的非中斷部分基本互補的話，多核苷酸與E6AP mRNA的至少一部分互補。
此處所使用的術語「雙鏈RNA」或「dsRNA」是指核糖核酸分子複合物，其具有包含兩條反平行的並且如上定義的基本互補的核酸鏈的雙鏈體結構。形成雙鏈體結構的兩條鏈可以為一個較大RNA分子的不同部分，或者它們也可以為單獨的RNA分子。如果是單獨的RNA分子，這樣的dsRNA在文獻中通常被稱為siRNA(「小幹擾RNA」)。如果兩條鏈是一個較大分子的部分，並因此被位於一條鏈的3』末端和相對另一條鏈的5』末端之間的非間斷核苷酸鏈連接，形成雙鏈體結構時，連接RNA鏈被稱為「髮夾環」、「短髮夾RNA」或「shRNA」。當兩條鏈通過除了位於一條鏈的3』末端和相對另一條鏈的5』末端之間的非間斷核苷酸鏈之外的手段共價連接而形成雙鏈體結構時，該連接結構被稱為「連接體」。RNA鏈可以包含相同或不同數目的核苷酸。鹼基對的最大數目為dsRNA中最短鏈的核苷酸數目減去雙鏈體中存在的任何突出端。除了雙鏈體結構之外，dsRNA可以包含一個或多個核苷酸突出端。此外，本說明書使用的「dsRNA」可以包括對於核糖核苷酸、核苷間聯接、端基、帽(cap)和偶聯部分的化學修飾，包括在多個核苷酸處的實質修飾並且包括此處所公開的或本領域已知的所有類型的修飾。在本說明書和權利要求書中，「dsRNA」包括用於siRNA類型分子中的任何這樣的修飾。
此處所使用的「核苷酸突出端」是指未配對的核苷酸，或者是指當dsRNA中一條鏈的3』末端超出另一條鏈的5』末端伸長或相反的情況下從dsRNA雙鏈體結構中突出的核苷酸。「鈍」或「平端」是指在dsRNA的末端沒有未配對的核苷酸，即不存在核苷酸突出端。「平端」dsRNA為在整個長度中均為雙鏈的dsRNA，即分子的任一末端都不存在核苷酸突出端。為了清楚起見，在確定siRNA是具有突出端還是為平端時，不考慮與siRNA的3』末端或5』末端相連的化學帽或非核苷酸化學部分。
術語「反義鏈」是指包含與靶序列基本互補的區域的dsRNA的鏈。此處所使用的術語「互補區」是指與此處所限定的序列(例如靶序列)基本互補的反義鏈上的區域。當互補區與靶序列不完全互補時，錯配出現在末端區域是最可以接受的，如果出現錯配的話，通常出現在一個末端區域或兩個末端區域中，例如5』和/或3』末端的6、5、4、3或2個核苷酸之內。
此處所使用的術語「有義鏈」是指包含與反義鏈區域基本互補的區域的dsRNA鏈。
本領域的技術人員應當知道，當用於dsRNA時，「導入細胞內」是指有利於向細胞內的攝取或吸收。dsRNA的吸收或攝取可通過未輔助的擴散性或主動細胞過程進行，或者通過輔助劑或裝置進行。該術語的含義不局限於體外細胞；當細胞是活生物體的部分時，dsRNA也可「被導入細胞內」。在這樣的情況下，導入細胞內將包括運送到生物體中。例如，對於體內遞送，可將dsRNA注射到組織部位或系統施用。在體外導入細胞內包括本領域已知的方法，例如電穿孔和脂轉染。
用於HPV靶基因時，此處的術語「沉默化」和「抑制表達」是指至少部分抑制HPV靶基因的表達，表現為與第二細胞或細胞組相比，由可從第一細胞或細胞組中分離出來的HPV靶基因轉錄的mRNA的量降低，在該第一細胞或細胞組中，HPV靶基因被轉錄，並且該第一細胞或細胞組經過處理，以使得HPV靶基因的表達受到抑制，而所述第二細胞或細胞組與所述第一細胞或細胞組基本相同，但是未經這樣的處理(對照細胞)。抑制的程度通常表示為 (對照細胞中的mRNA)-(受處理細胞中的mRNA)·100％ (對照細胞中的mRNA) 可替代地，抑制的程度可以用與HPV靶基因轉錄功能上相關的參數的降低來表示，例如由細胞分泌的、HPV靶基因編碼的蛋白質的量，或顯示某些表型例如細胞凋亡的細胞的數量。原則上，HPV靶基因的沉默化可以在或者通過組成型或者通過基因工程表達靶標的任何細胞中通過任何適當的分析確定。但是，當為了確定特定的dsRNA是否在某種程度上抑制HPV靶基因的表達而需要參考並因此包括在本發明中時，下述實施例中提供的分析可作為這樣的參考。
例如，在某些情況下，給予本發明的雙鏈寡核苷酸將抑制E6AP基因的表達至少大約20％、25％、35％或50％。在某些實施方案中，給予本發明的雙鏈寡核苷酸將抑制E6AP基因至少大約60％、70％或80％。在某些實施方案中，給予本發明的雙鏈寡核苷酸將抑制E6AP基因至少大約85％、90％或95％。表2給出了在體外試驗中，使用不同濃度的不同E6AP dsRNA分子得到的寬範圍的轉錄抑制值。
在用於HPV感染時，術語「治療」等是指由HPV感染介導的病理過程的減輕或改善。這樣的描述包括使用本發明的治療劑來預防或防止HPV感染，以及由HPV感染引起的症狀或病變的減輕。在本發明的內容中，當涉及下述其它任何狀況(除HPV感染介導的病理過程以外)時，術語「治療」等是指減輕或改善至少一種與這種狀況相關的症狀，或者減緩或逆轉這種狀況的發展。
此處所使用的短語「治療有效量」和「預防有效量」是指在治療、預防或控制由HPV感染介導的病理過程或者由HPV感染介導的病理過程的明顯症狀中提供治療益處的量。具體的治療有效量可由普通的醫師容易地進行確定，並可根據本領域已知的因素進行改變，例如由HPV感染介導的病理過程的類型、患者的病史和年齡、由HPV感染介導的病理過程的階段以及其它抗疾病藥劑的給藥。
此處所使用的「藥物組合物」包含藥理學上有效量的dsRNA和藥學上可接受的載體。此處所使用的「藥理學上有效量」、「治療有效量」或簡稱「有效量」是指能夠有效產生預期的藥理學、治療或預防結果的dsRNA的量。例如，如果在特定的臨床治療中，當與疾病或病症相關的可測量的參數至少降低25％才被認為是有效時，那麼，治療該疾病或病症的藥物的治療有效量為實現該參數至少降低25％所需的量。
術語「藥學上可接受的載體」是指用於給予治療劑的載體。這樣的載體包括但不限於鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。該術語特別不包括細胞培養基。對於口服給藥，藥學上可接受的載體包括但不限於藥學上可接受的賦形劑，例如惰性稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、著色劑和防腐劑。合適的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和碳酸鈣，以及乳糖，而玉米澱粉和褐藻酸為合適的崩解劑。粘合劑可以包括澱粉和明膠，而如果存在潤滑劑的話，一般為硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。如果需要的話，片劑可由例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯等材料包衣來延緩在胃腸道中的吸收。
此處所使用的「轉化的細胞」為已導入載體並可表達dsRNA分子的細胞。
II.雙鏈核糖核酸(dsRNA) 在一個實施方案中，本發明提供了用於抑制細胞或哺乳動物中HPV靶基因表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子，其中，該dsRNA包括包含與在表達HPV靶基因中形成的mRNA的至少一部分互補的互補區的反義鏈，其中，該互補區小於30個核苷酸長度，通常為19-24個核苷酸長度，其中，在與表達所述HPV靶基因的細胞相接觸之後，所述dsRNA抑制所述HPV靶基因的表達至少10％、25％或40％。
dsRNA包含足夠互補以雜交形成雙鏈體結構的兩條RNA鏈。dsRNA的一條鏈(反義鏈)包含與來自在表達HPV靶基因中形成的mRNA序列的靶序列基本互補、一般完全互補的互補區，另一條鏈(有義鏈)包含與反義鏈互補的區域，因而在合適的條件下混合時，兩條鏈雜交並形成雙鏈體結構。一般而言，雙鏈體結構為15至30個鹼基對長度，更一般為28至25個鹼基對長度，更一般為19至24個鹼基對長度，最一般為19至21個鹼基對長度。同樣地，與靶序列的互補區為15至30個核苷酸長度，更一般為18至25個核苷酸長度，更一般為19至24個核苷酸長度，最一般為19至21個核苷酸長度。本發明的dsRNA還可以進一步包含一個或多個單鏈核苷酸突出端。可以使用下述本領域已知的標準方法來合成dsRNA，例如使用自動DNA合成儀，例如Biosearch，Applied Biosystems，Inc.銷售的自動DNA合成儀。在一個優選實施方案中，HPV靶基因為人E6AP基因。在特定的實施方案中，dsRNA的反義鏈包含選自表1中有義序列的鏈，和選自表1中反義序列的第二序列。靶向表1提供的靶序列中的其它地方的替代反義試劑可以使用靶序列和側翼E6AP序列容易地確定。
在進一步的實施方案中，dsRNA包含選自表1中提供的序列的至少一種核苷酸序列。在另一個實施方案中，dsRNA包含選自該組的至少兩種序列，其中，所述至少兩種序列中的一種與所述至少兩種序列中的另一種互補，並且所述至少兩種序列中的一種與在表達E6AP基因中產生的mRNA的序列基本互補。一般而言，dsRNA包含兩種寡核苷酸，其中，一種寡核苷酸描述為表1中的有義鏈，第二種寡核苷酸描述為表1中的反義鏈。表1提供了每種優選dsRNA的雙鏈體名稱和序列ID號。
本領域技術人員知道包含20-23個、特別是21個鹼基對的雙鏈體結構的dsRNA能夠特別有效地誘導RNA幹擾(Elbashir等人，EMBO 2001，206877-6888)。但是，也有人發現更短或更長的dsRNA也是有效的。在上述的實施方案中，由於表1中提供的寡核苷酸序列的性質，本發明的dsRNA可以包含至少一條長度最短為21nt的鏈。可以合理地預期，表1中的一種序列只在其一端或兩端減去幾個核苷酸，包含該序列的較短dsRNA可與上述dsRNA類似地有效。因此，本發明涉及這樣的dsRNA其包含表1中一種序列的至少15、16、17、18、19、20或更多個相鄰核苷酸的部分序列，並且在下述FACS分析或其它分析中，抑制HPV靶基因表達的能力與包含全長序列的dsRNA相比，抑制區別不超過5、10、15、20、25或30％。使用提供的參考序列和靶序列可以容易地製備在表1所提供的靶序列內切割的其它dsRNA。
此外，表1提供的RNAi試劑能夠識別在對基於RNAi的切割敏感的相應HPV靶mRNA中的位點。因此，本發明進一步包括在由本發明的一種試劑靶向的序列內靶向的RNAi試劑。在此使用時，如果第二RNAi試劑在與第一RNAi試劑的反義鏈互補的mRNA內的任意位置切割信使，則該第二RNAi試劑被稱為在第一RNAi試劑的序列內靶向。這樣的第二試劑通常由來自表1中提供的一種序列的至少15個相鄰的核苷酸組成，這些核苷酸與來自與HPV靶基因中選擇的序列相鄰的區域的附加核苷酸序列連接。例如，SEQ IDNO1的最後15個核苷酸(減去添加的AA序列)加上後面的來自靶E6AP基因的6個核苷酸，產生了基於表1中提供的一種序列的包含21個核苷酸的單鏈試劑。
本發明的dsRNA可以包含一個或多個與靶序列的錯配。在優選實施方案中，本發明的dsRNA包含不多於3個錯配。如果dsRNA的反義鏈包含與靶序列的錯配的話，優選該錯配區域並非位於互補區的中心。如果dsRNA的反義鏈包含與靶序列的錯配的話，優選該錯配局限於每個末端的5個核苷酸，例如互補區5』或3』端的5、4、3、2或1個核苷酸。例如，對於與HPV靶基因區域互補的23個核苷酸的dsRNA鏈而言，dsRNA通常在中心13個核苷酸內不包含任何錯配。本發明描述的方法可用於確定包含與靶序列的錯配的dsRNA是否能夠有效地抑制HPV靶基因的表達。尤其是當HPV靶基因中特定的互補區已知在病毒(如果是E1或E6的話)或人群(對於E6AP)中具有多態性序列差異時，考慮包含錯配的dsRNA在抑制HPV靶基因表達中的有效性是非常重要的。
在一個實施方案中，dsRNA的至少一端具有包含1至4個、通常為1或2個核苷酸的單鏈核苷酸突出端。具有至少一個核苷酸的突出端的dsRNA比它們的平端對應物具有意想不到的好的抑制性能。此外，本發明人已經發現存在僅一個核苷酸的突出端能夠加強dsRNA的幹擾活性，而不會影響它的整體穩定性。僅具有一個突出端的dsRNA證明在體內，以及在多種細胞、細胞培養基、血液和血清中特別穩定和有效。一般而言，單鏈突出端位於反義鏈的3』末端或可選地位於有義鏈的3』末端。dsRNA還可以具有平端，通常位於反義鏈的5』末端。這樣的dsRNA具有提高的穩定性和抑制活性，因而可以以低劑量-即小於每日5mg/kg接受者體重的劑量給藥。一般而言，dsRNA的反義鏈在3』末端具有核苷酸突出端，5』末端為平端。在另一個實施方案中，突出端中的一個或多個核苷酸由核苷硫代磷酸取代。
在另一個實施方案中，dsRNA經化學修飾以提高其穩定性。本發明的核酸可以使用本領域已知的方法來合成和/或修飾，例如在《Current protocols in nucleic acid chemistry》，Beaucage，S.L.等人(Edrs.)，John Wiley&Sons，Inc.，紐約，紐約州，美國中描述的那些方法，該文獻在此引入作為參考。化學修飾可以包括但不限於2』修飾、寡核苷酸的糖或鹼基的其它位點的修飾、非天然鹼基引入寡核苷酸鏈、與配體或化學部分共價連接以及使用可選的連接(linkage)(例如硫代磷酸)來替代核苷酸之間的磷酸連接。還可以使用一種以上的這樣的修飾。
可以使用多種公知技術中的任一種實現兩個單獨的dsRNA鏈的化學連接，例如通過引入共價鍵、離子鍵或氫鍵；疏水相互作用、範得華力或堆積相互作用；通過金屬離子配位或通過使用嘌呤類似物。一般而言，可用於修飾dsRNA的化學基團包括但不限於亞甲基藍；雙功能基團，一般為雙-(2-氯乙基)胺；N-乙醯基-N』-(對-乙醛醯基苯甲醯基)胱胺；4-硫尿嘧啶；和補骨脂素。在一個實施方案中，連接體為六乙二醇連接體。在這種情況下，使用固相合成法生成dsRNA並根據標準方法(例如Williams，D.J.，和K.B.Hall，Biochem.(1996)3514665-14670)引入六乙二醇連接體。在一個特定的實施方案中，反義鏈的5』末端和有義鏈的3』末端通過六乙二醇連接體化學連接。在另一個實施方案中，dsRNA的至少一個核苷酸包含硫代磷酸或二硫代磷酸基團。dsRNA末端的化學鍵通常由三螺旋鍵形成。表1提供了本發明的修飾的RNAi試劑的例子。
在另一個實施方案中，兩條單鏈中的一條或兩條的核苷酸可經過修飾來預防或抑制細胞酶(例如但不限於某些核酸酶)的降解活性。用於抑制細胞酶降解核酸的活性的技術是本領域已知的，包括但不限於2』-氨基修飾、2』-氨基糖修飾、2』-F糖修飾、2』-F修飾、2』-烷基糖修飾、不帶電的骨架的修飾、嗎啉代修飾、2』-O-甲基修飾和氨基磷酸酯(參考例如Wagner，Nat.Med.(1995)11116-8)。因而，dsRNA上核苷酸的至少一個2』-羥基基團被化學基團取代，通常被2』-氨基或2』-甲基取代。還可以修飾至少一個核苷酸來形成鎖定核苷酸。這樣的鎖定核苷酸包含連接核糖的2』-氧和核糖的4』-碳的亞甲基橋。包含鎖定核苷酸的寡核苷酸在Koshkin，A.A.，等人，Tetrahedron(1998)，543607-3630和Obika，S.等人，TetrahedronLett.(1998)，395401-5404中有描述。將鎖定核苷酸引入寡核苷酸中改善了對互補序列的親和力，並使解鏈溫度增加幾度(Braasch，D.A.和D.R.Corey，Chem.Biol(2001)，81-7)。
將配體與dsRNA偶聯能夠提高其細胞吸收，以及向特定組織的靶向，或者特定細胞類型(例如陰道上皮細胞)的攝取。在某些情況下，疏水配體與dsRNA偶聯，有利於直接透過細胞膜。可選地，與dsRNA偶聯的配體為受體介導的胞吞作用的底物。這些方法已用於促進反義寡核苷酸和dsRNA試劑的細胞透過。例如，膽固醇與不同的反義核苷酸偶聯之後，使得化合物與未偶聯的類似物相比具有顯著提高的活性。參考M.Manoharan Antisense&Nucleic Acid DrugDevelopment 2002，12，103。與寡核苷酸偶聯的其它親脂性化合物包括1-芘丁酸、1，3-雙-O-(十六烷基)甘油和甲醇。用於受體介導的胞吞作用的配體的一個例子是葉酸。葉酸通過葉酸-受體介導的胞吞作用進入細胞內。攜帶葉酸的dsRNA化合物能夠通過葉酸-受體介導的胞吞作用有效地轉運到細胞內。Li和合作者報告了葉酸與寡核苷酸的3』末端的連接使得寡核苷酸的細胞攝取增加了八倍。Li，S.；Deshmukh，H.M.；Huang，L.Pharm.Res.1998，75，1540。與寡核苷酸偶聯的其它配體包括聚乙二醇、碳水化合物組、交聯劑、卟啉配合物和遞送肽。
在某些情況下，陽離子配體與寡核苷酸的偶聯導致提高的核酸酶抗性。代表性的陽離子配體的例子包括丙基銨和二甲基丙基銨。有趣的是，當陽離子配體遍布核苷酸中分散時，據報告反義寡核苷酸能夠保持它們與mRNA的高結合親和力。參見M.ManoharanAntisense&Nucleic Acid Drug Development 2002，12，103和其中所引用的參考文獻。
可以使用具有懸垂反應官能團的dsRNA，例如連接分子連接到dsRNA上產生的dsRNA，來合成配體偶聯的本發明的dsRNA。這種反應性的寡核苷酸可與市售配體、合成的帶有任一種保護基的配體或連接有連接部分的配體直接反應。在某些優選實施方案中，通過使用已經與配體適當偶聯並且還可以進一步連接到固體支持材料上的核苷單體，本發明的方法有利於合成配體偶聯的dsRNA。這些任選地與固體支持材料相連的配體-核苷偶聯物根據本發明的方法的一些優選實施方案製備，是通過選擇的血清結合配體與位於核苷或寡核苷酸的5』位置上的連接部分的反應。在某些情況下，具有與dsRNA 3』末端連接的芳烷基配體的dsRNA是這樣製備的首先通過長鏈氨基烷基將單體結構單元與可控孔度玻璃(controlled-pore-glass)支持物共價連接。然後通過標準的固相合成技術將核苷酸與結合在固體支持物上的單體結構單元相鍵合。單體結構單元可以是與固相合成兼容的核苷或其它有機化合物。
可以使用公知的固相合成技術方便地和常規地製備在本發明的偶聯物中使用的dsRNA。用於這種合成的儀器由幾家銷售商提供，包括例如Applied Biosystems(Foster City，CA)。還可以另外地或可替代地使用本領域已知的用於這種合成的其它任何方式。也知道使用類似的技術來製備其它的寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
關於合成特定的修飾寡核苷酸的教導可參考下述美國專利美國專利5,138,045和5,218,105，涉及聚胺偶聯的寡核苷酸；美國專利5,212,295，涉及用於製備具有手性磷連接的寡核苷酸的單體；美國專利5,378,825和5,541,307，涉及具有修飾的骨架的寡核苷酸；美國專利5,386,023，涉及骨架修飾的寡核苷酸及其通過還原偶聯的製備；美國專利5,457,191，涉及基於3-脫氮嘌呤環系統的修飾的核鹼基及其合成方法；美國專利5,459,255，涉及基於N-2取代的嘌呤的修飾的核鹼基；美國專利5,521,302，涉及用於製備具有手性磷連接的寡核苷酸的方法；美國專利5,539,082，涉及肽核酸；美國專利5,554,746，涉及具有β-內醯胺骨架的寡核苷酸；美國專利5,571,902，涉及用於合成寡核苷酸的方法和材料；美國專利5,578,718，涉及具有烷基硫代基團的核苷，其中這些基團可用作與核苷多個位置中的任一位置連接的其它部分的連接體；美國專利5,587,361和5,599,797，涉及具有高手性純度的硫代磷酸連接的寡核苷酸；美國專利5,506,351，涉及用於製備2』-O-烷基鳥苷和相關化合物(包括2，6-二氨基嘌呤化合物)的方法；美國專利5,587,469，涉及包含N-2取代的嘌呤的寡核苷酸；美國專利5,587,470，涉及包含3-脫氮嘌呤的寡核苷酸；美國專利5,223,168和美國專利5,608,046，均涉及偶聯的4』-去甲基核苷類似物；美國專利5,602,240和5,610,289，涉及骨架修飾的寡核苷酸類似物；美國專利6,262,241和5,459,255，特別涉及合成2』-氟-寡核苷酸的方法。
在具有序列特異性連接的本發明的核苷的配體偶聯的dsRNA和配體分子中，使用標準的核苷酸或核苷前體、或者已經帶有連接部分的核苷酸或核苷偶聯物前體、已經帶有配體分子的核苷酸或核苷偶聯物前體、或帶有非核苷配體的結構單元，可以在合適的DNA合成儀上裝配寡核苷酸和寡核苷。
當使用已帶有連接部分的核苷酸-偶聯物前體時，通常先完成序列特異性連接的核苷的合成，然後配體分子與連接部分反應形成配體偶聯的寡核苷酸。帶有多種分子(例如類固醇、維生素、脂質和受體分子)的寡核苷酸偶聯物以前已經描述(參見Manoharan等人，PCT申請WO 93/07883)。在一個優選實施方案中，本發明的寡核苷酸或連接的核苷是通過自動合成儀合成的，其中除了使用可商購獲得和寡核苷酸合成中常規使用的標準亞磷醯胺和非標準亞磷醯胺以外，還使用來自配體-核苷偶聯物的亞磷醯胺。
在寡核苷酸的核苷中引入2』-O-甲基、2』-O-乙基、2』-O-丙基、2』-O-烯丙基、2』-O-氨基烷基或2』-脫氧-2』-氟基團使得寡核苷酸的雜交能力增強。此外，包含硫代磷酸骨架的寡核苷酸具有增強的核酸酶穩定性。因此，本發明的功能化的、連接的核苷可以增加，以包括硫代磷酸骨架或者2』-O-甲基、2』-O-乙基、2』-O-丙基、2』-O-氨基烷基、2』-O-烯丙基或2』-脫氧-2』-氟基團中的一個或兩個。例如PCT公布WO 200370918概括列舉了本領域已知的一些寡核苷酸修飾。
在一些實施方案中，使用DNA合成儀來製備在5』末端具有氨基的本發明的功能化核苷序列，然後與選擇的配體的活性酯衍生物反應。活性酯衍生物是本領域技術人員已知的。代表性的活性酯包括N-羥基琥珀醯亞胺酯、四氟酚酯、五氟酚酯和五氯酚酯。氨基和活性酯的反應產生了寡核苷酸，在其5』位置上通過連接基團與選擇的配體相連。可以使用5』-氨基-修飾物(5′-Amino-Modifier)C6試劑來製備5』末端的氨基。在一個實施方案中，通過使用配體-核苷亞磷醯胺，配體分子可與寡核苷酸在其5』位置處偶聯，其中，配體與5』-羥基直接連接或通過連接體間接相連。這樣的配體-核苷亞磷醯胺通常在自動合成程序的最後使用，以提供在5』末端帶有配體的配體偶聯的寡核苷酸。
修飾的核苷間連接或骨架的例子包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3』-烯基膦酸酯和手性膦酸酯)、亞膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3』-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫逐氨基磷酸酯、硫逐烷基磷酸酯、硫逐烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯，它們具有正常的3』-5』連接，2』-5』連接的類似物，以及具有相反極性的那些，其中核苷單元的相鄰的配對為連接的3』-5』對5』-3』或2』-5』對5』-2』。還可以包括不同的鹽、混合鹽和游離酸形式。
涉及製備上述包含磷原子的連接的代表性的美國專利包括但不限於美國專利3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；和5,697,248，在此均引入作為參考。
不包括磷原子的修飾的核苷間連接或骨架的例子(即寡核苷)具有由短鏈烷基或環烷基糖間連接、混合雜原子和烷基或環烷基糖間連接、或一種或多種短鏈雜原子或雜環糖間連接形成的骨架。包括具有嗎啉代連接(部分由核苷的糖部分形成)的骨架；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸和碸骨架；甲醯基(formacetyl)和硫代甲醯基骨架；亞甲基甲醯基和硫代甲醯基骨架；包含烯的骨架；氨基磺酸骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺胺骨架；醯胺骨架；和其它具有N、O、S和CH2混合組分的骨架。
涉及製備上述寡核苷的代表性的美國專利包括但不限於美國專利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，在此均引入作為參考。
在某些情況下，寡核苷酸可由非配體基團修飾。許多非配體分子已與寡核苷酸偶聯，以提高寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取，可在科技文獻中查閱到用於進行這種偶聯的方法。這些非配體部分包括脂質部分，例如膽固醇(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，866553)、膽酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，41053)、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660306；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，32765))、硫代膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.，1992，20533)、脂肪鏈(例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.，1991，10111；Kabanov等人，FEBS Lett.，1990，259327；Svinarchuk等人，Biochimie，1993，7549))、磷脂(例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基銨1，2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，363651；Shea等人，Nucl.Acids Res.，1990，183777))、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides，1995，14969)、或金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，363651)、或棕櫚基部分(Mishra等人，Biochem.Biophys.Acta，1995，1264229)、或十八烷胺或己基氨基-羰基-羥膽甾醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277923)。以上已經列舉了教導如何製備這樣的寡核苷酸偶聯物的代表性的美國專利。典型的偶聯方案包括合成在其序列的一個或多個位置上帶有氨基連接體的寡核苷酸。然後使用適當的偶聯劑或活化劑，使氨基與將要偶聯的分子反應。偶聯反應可以使用仍然結合在固體支持物上的寡核苷酸進行，也可以在溶液相中切下寡核苷酸後進行。使用HPLC純化寡核苷酸偶聯物得到純的偶聯物。使用膽固醇偶聯物是特別優選的，因為這種部分能夠增加向陰道上皮細胞(HPV感染部位)的靶向。
本發明描述了用於沉默化HPV靶基因並因此治療HPV相關病症的dsRNA的多種實施方案。雖然特定治療劑的設計可以採用多種形式，某些功能特徵將會從其它的dsRNA中區別出優選的dsRNA。特別地，將測試本領域技術人員可進行測量的例如良好的血清穩定性、高效力、缺乏誘導的免疫應答和良好的藥物樣行為等特徵，以鑑定本發明優選的dsRNA。在某些情況下，優選的dsRNA並不會具有所有這些功能特徵。但是，本領域技術人員能夠優化這些變量和其它因素來選擇本發明的優選化合物。
雖然許多核苷酸修飾都是可能的，但是本發明人確定了一些化學修飾模式，它們能夠提供顯著提高的藥理學、免疫學和最終治療益處。表3示出了本發明表1中列出的雙鏈dsRNA優選使用的化學修飾模式。
表3 編碼RNAi試劑的載體 本發明的dsRNA還可通過重組病毒載體在體內細胞內表達。本發明的重組病毒載體包含編碼本發明的dsRNA的序列和用於表達dsRNA序列的任何合適的啟動子。合適的啟動子包括例如U6或H 1RNA pol III啟動子序列以及巨細胞病毒啟動子。本領域技術人員知道其它合適的啟動子的選擇。本發明的重組病毒載體還可以包含用於在特定的組織或特定的細胞內環境中表達dsRNA的誘導型或調節型啟動子。下面將會詳細描述如何使用重組病毒載體在體內將本發明的dsRNA轉運到細胞內。
本發明的dsRNA可以由重組病毒載體表達，或者表達為兩個單獨的互補RNA分子，或者表達為具有兩個互補區的單個RNA分子。
可以使用任何能夠接受將要表達的dsRNA分子的編碼序列的病毒載體，例如來自以下病毒的載體腺病毒(AV)；腺相關病毒(AAV)；逆轉錄病毒(例如慢病毒(LV)、彈狀病毒、鼠白血病病毒)；皰疹病毒等。可以適當地通過假型化(pseudotyping)具有來自其它病毒的包膜蛋白或其它表面抗原的載體、或者通過取代不同的病毒衣殼蛋白來改變病毒載體的向性。
例如，來自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、伊波拉病毒、莫科拉病毒等的表面蛋白可以假型化本發明的慢病毒載體。通過工程化載體使其表達不同的衣殼蛋白血清型，本發明的AAV載體可靶向不同的細胞。例如，表達血清型2基因組上的血清型2衣殼的AAV載體被稱為AAV 2/2。AAV 2/2載體中的這種血清型2衣殼基因可被血清型5衣殼基因代替，而產生AAV 2/5載體。構建表達不同衣殼蛋白血清型的AAV載體的技術是本領域已知的，例如參見Rabinowitz J E等人(2002)，J Virol 76791-801，其全部內容在此引入作為參考。
適用於本發明的重組病毒載體的選擇、將用於表達dsRNA的核酸序列插入載體中的方法，以及將病毒載體轉運到興趣細胞的方法是本領域已知的。例如參見Dornburg R(1995)，Gene Therap.2301-310；Eglitis M A(1988)，Biotechniques 6608-614；Miller A D(1990)，Hum Gene Therap.15-14；Anderson W F(1998)，Nature 39225-30；和Rubinson D A等人，Nat.Genet.33401-406，其全部內容在此引入作為參考。
優選的病毒載體為來自AV和AAV的載體。在一個特別優選的實施方案中，本發明dsRNA表達為來自重組AAV載體的兩個單獨的、互補的單鏈RNA分子，該載體包含例如U6或H1RNA啟動子，或巨細胞病毒(CMV)啟動子。
用於表達本發明的dsRNA的合適的AV載體、構建重組AV載體的方法和將載體轉運到靶細胞的方法已在Xia H等人(2002)，Nat.Biotech.201006-1010中描述。
用於表達本發明的dsRNA的合適的AAV載體、構建重組AAV載體的方法和將載體轉運到靶細胞的方法已在Samulski R等人(1987)，J.Virol.613096-3101；Fisher K J等人(1996)，J.Virol，70520-532；Samulski R等人(1989)，J.Virol.633822-3826；美國專利5,252,479；美國專利5,139,941；國際專利申請WO 94/13788；和國際專利申請WO 93/24641中描述，其全部內容在此引入作為參考。
III.包含dsRNA的藥物組合物 在一個實施方案中，本發明提供了包含此處所描述的dsRNA以及藥學上可接受的載體的藥物組合物。包含dsRNA的藥物組合物可用於治療與HPV靶基因的表達或活性相關的疾病或病症，例如由HPV感染介導的病理過程。基於給藥方式配製這些藥物組合物。一個例子是配製成經子宮頸局部給藥或者經腸胃外遞送系統給藥的組合物。
本發明的藥物組合物以足以抑制HPV靶基因的表達的劑量給藥。本發明人已經確定，由於其提高的有效性，包含本發明的dsRNA的組合物可以以令人驚訝的低劑量給藥。每日每千克接受者體重5mg dsRNA的劑量足以抑制或降低HPV靶基因的表達，對於針對疣或子宮頸或肛門的治療，可以直接對感染組織給藥。
一般而言，合適的dsRNA劑量範圍為每日每千克接受者體重0.01至5.0毫克，一般是每日每千克體重1微克至1毫克。可以每日給予一次藥物組合物，或者可以在一天當中以適當的間隔作為兩個、三個或更多個亞劑量給予dsRNA，或者甚至使用陰道凝膠的控制釋放製劑進行連續輸注或遞送。在這種情況下，每個亞劑量中包含的dsRNA必然相應地較低，以實現總的日劑量。劑量單元還可以配製供幾天給藥，例如，使用傳統的緩釋製劑使dsRNA在幾天的時間內持續釋放。緩釋製劑是本領域已知的，特別適用於藥物的陰道給藥，例如可以用於本發明的藥物。在這個實施方案中，劑量單元包含相應的多個每日劑量。
本領域技術人員應當知道，某些因素可能影響有效治療受試者所需的劑量和時間，包括但不限於疾病或病症的嚴重性、之前的治療、受試者的總體健康和/或年齡和存在的其它疾病。此外，使用治療有效量的組合物治療受試者可以包括單次治療或一系列的治療。可以使用傳統的方法或基於使用適當的動物模型進行的體內測試來估計本發明包括的各dsRNA的有效劑量和體內半衰期，如本文其它地方所述。
本發明人意識到，由於多種原因，包括HPV基因型的變異性，有可能需要同時使用多於一種的本發明的dsRNA來治療HPV感染。在一個實施方案中，選擇dsRNA的組合，使其能夠靶向最寬範圍的HPV基因型，同時具有最不複雜的dsRNA混合物。包含多於一種類型的dsRNA的本發明的藥物組合物預期包含此處所述的各dsRNA的劑量。
dsRNA的組合可以在單一劑型藥物組合物中一起提供。可選地，dsRNA的組合可以在單獨的劑型中提供，在這種情況下，它們可以同時或不同時給藥，並且可能通過不同的方式給藥。因此，本發明涉及包含本發明的dsRNA的理想組合的藥物組合物；還涉及旨在作為聯合療法的一部分提供的單一dsRNA的藥物組合物。在後一情況下，聯合治療的發明因此是給藥方法，而不是物質的組合物。
小鼠遺傳學的進展產生了許多用於研究不同人類疾病(例如由HPV感染介導的病理過程)的小鼠模型。這些模型用於dsRNA的體內測試，以及用於確定治療有效劑量。
可以使用任何方法將本發明的dsRNA給予到包含感染HPV的細胞的哺乳動物。例如，給藥可以是局部的(例如陰道、經皮等)；口服的；或腸胃外的(例如皮下、心室內、肌肉內或腹膜內注射，或者通過靜脈滴注)。可以快速給藥(例如通過注射)，或者也可以在一段時間內給藥(例如通過慢速輸注或給予緩釋製劑)。
典型地，當治療攜帶感染HPV的細胞的哺乳動物時，dsRNA分子以陰道凝膠或乳膏的形式局部給藥。例如，配製的含或不含脂質體的dsRNA可以直接局部給藥到子宮頸、肛道或HPV病變處，例如生殖器疣。對於局部給藥，可將dsRNA分子配製為組合物，例如滅菌和非滅菌水溶液、在普通溶劑(例如酒精)中的非水溶液，或在液體或固體油基中的溶液。這些溶液還可以包含緩衝液、稀釋劑和其它合適的添加劑。用於局部給藥的組合物可被配製成為透皮貼劑、軟膏、洗液、乳膏、膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末的形式。可以使用本領域已知的聚合物和透化劑來配製膠劑和乳膏。可以使用子宮頸帽、陰道隔膜、塗覆保險套、手套等將包含dsRNA以及相關的賦形劑的膠劑和乳膏施用到子宮頸。可以添加傳統的藥物載體、水溶液、粉末或油狀基質、增稠劑等。
對於腸胃外、鞘內或心室內給藥，dsRNA分子可被配製到組合物中，例如滅菌水溶液，還可以包含緩衝液、稀釋劑和其它合適的添加劑(例如穿透增強劑、載體化合物和其它藥學上可接受的載體)。
此外，使用非病毒的方法(例如生物或非生物方式，例如在美國專利6,271,359中所述)，可以將dsRNA分子給予到包含HPV感染的細胞的哺乳動物中。可以使用多種方法進行非生物遞送，包括但不限於(1)將在此提供的dsRNA酸分子裝載到脂質體中，和(2)將dsRNA分子與脂質或脂質體進行複合以形成核酸-脂質或核酸-脂質體複合物。脂質體可以包含通常用於體外轉染細胞的陽離子和中性脂質。陽離子脂質可以與帶負電的核酸複合(例如電荷結合)形成脂質體。陽離子脂質體的例子包括但不限於lipofectin、lipofectamine、lipofectace、DOTAP(1，2-二油醯-3-三甲銨丙烷)、DOTMA(N-[1，2(2，3-二油醯氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨)、DOSPA(2，3-二油醯氧基-N-[2-(精胺甲醯氨基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙銨)、DOGS(二-十八烷基醯氨基甘氨醯精胺)和DC-chol(3，[N-N′，N-二甲基乙二胺)-氨基甲醯基]膽固醇)。
形成脂質體的程序是本領域已知的。脂質體組合物可例如由磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油或二油醯磷脂醯乙醇胺形成。許多親脂性試劑可以商購獲得，包括Lipofectin.RTM.(Invitrogen/Life Technologies，Carlsbad，Calif.)和Effectene.TM.(Qiagen，Valencia，Calif.)。此外，可以使用市售的陽離子脂質(例如DDAB或DOTAP，每種都可以與例如DOPE或膽固醇的中性脂質混合)來優化系統遞送方法。在一些情況下，可以使用Templeton等人(Nature Biotechnology，15647-652(1997))描述的脂質體。在另一些實施方案中，可以使用聚陽離子(例如聚乙撐亞胺)來實現體內和離體的遞送(Boletta等人，J.Am Soc.Nephrol.71728(1996))。還可以在美國專利6,271,359、PCT公開WO 96/40964和Morrissey，D.等人2005.Nat Biotechnol.23(8)1002-7中發現關於使用脂質體遞送核酸的其它信息。
將dsRNA分子給予到包含HPV感染的細胞的哺乳動物的其它非病毒方法包括基於陽離子脂質的遞送系統(除了脂質體以外)，例如脂複合物(lipoplex)和納米乳劑。此外，還可以使用縮合聚合物遞送系統(即DNA-聚合物複合物或「聚複合物(polyplex)」，包括但不限於殼聚糖、聚(L-賴氨酸)(PLL)、聚乙撐亞胺(PEI)、樹狀聚體(dendrimer)(例如聚乙二胺(PANAM)樹狀聚體)和泊洛沙胺。此外，還可以使用非縮合的聚合物遞送系統，包括但不限於泊洛沙姆、明膠、PLGA(聚乳酸-乙醇酸共聚物)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和PVA(聚乙烯醇)。
上述遞送或給藥技術的方法是本領域已知的。例如，縮合聚合物遞送系統是通過與陰離子DNA分子容易地複合而起作用的；例如，聚(L-賴氨酸)(PLL)通過形成與負電細胞表面相互作用的帶正電荷複合物、然後發生快速內在化而起作用。
可以使用多種方法完成生物遞送，包括但不限於使用病毒載體。例如，可以使用病毒載體(例如腺病毒和皰疹病毒載體)將dsRNA分子遞送到皮膚細胞和子宮頸細胞中。可以使用標準的分子生物學技術將一種或多種此處提供的dsRNA導入到以前為了將核酸遞送到細胞內而開發的眾多不同病毒載體中的一種內。可以使用這些產生的病毒載體將一種或多種dsRNA遞送到細胞內，例如通過轉染。
本發明的dsRNA可被配製在藥學上可接受的載體或稀釋劑中。「藥學上可接受的載體」(在此也被稱為「賦形劑」)為藥學上可接受的溶劑、懸浮劑或其它任何藥理學惰性載體。藥學上可接受的載體可以為液體或固體，可以根據計劃的給藥方式進行選擇，以提供理想的大規模、一致性和其它相關的遞送和化學性質。典型的藥學上可接受的載體包括但不限於水；鹽溶液；粘合劑(例如聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填料(例如乳糖和其它糖、明膠或硫酸鈣)；潤滑劑(例如澱粉、聚乙二醇或乙酸鈉)；崩解劑(例如澱粉或澱粉羥乙酸鈉)和溼潤劑(例如月桂基硫酸鈉)。
此外，靶向HPV靶基因的dsRNA可配製成為組合物，該組合物包含與其它分子、分子結構或核酸混合物相混合、膠囊化、偶聯或以其它方式結合的dsRNA。例如，包含靶向E6AP基因的一種或多種dsRNA試劑的組合物可以包含其它治療劑，例如消炎藥(例如非甾體消炎藥和皮質類固醇)和抗病毒藥(例如利巴韋林、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋)。在一些實施方案中，該組合物可以包含一種或多種具有與HPV靶基因互補的序列的dsRNA，以及角質溶解劑。角質溶解劑為分離或放鬆表皮角質層的藥物。角質溶解劑的例子包括但不限於水楊酸。美國專利5,543,417提供了其它的例子。可使用有效量的角質溶解劑來提高dsRNA的穿透，例如進入組織(例如皮膚)。例如，可以使用一定量的角質溶解劑，使施用到生殖器疣的dsRNA可以滲入整個疣。
可以在細胞培養物或試驗動物中使用標準的藥物方法(例如確定LD50(種群的50％致死的劑量)和ED50(種群的50％治療有效的劑量))來確定這些化合物的毒性和治療有效性。毒性和治療效果之間的劑量比例為治療指標，可以表示為LD50/ED50之比。顯示高治療指標的化合物為優選化合物。
從細胞培養分析和動物研究中獲得的數據可用於確定人使用的劑量範圍。本發明的組合物的劑量通常在循環濃度的範圍之內，包括ED50，具有非常少的毒性或沒有毒性。取決於使用的劑型和使用的給藥途徑，劑量可以在這個範圍內變化。對於任何用於本發明的方法中的化合物而言，可以根據細胞培養分析初步估計治療有效劑量。可以將劑量配製到動物模型中，從而達到化合物或(如果合適的話)靶序列的多肽產物(例如實現多肽濃度的降低)的循環血漿濃度範圍，包括在細胞培養中確定的IC50(即達到半數最大症狀抑制的測試化合物的濃度)。這些信息可用於精確確定對人有用的劑量。可以通過例如高效液相色譜來測量血漿中的水平。
除了上述單獨給藥或者組合給藥，本發明的dsRNA還可以與其它已知有效治療HPV感染介導的病理過程的藥物聯合給藥。在任何情況下，醫生可以根據使用本領域已知或此處描述的有效性的標準測量獲得的結果來調節dsRNA給藥的量和時間。
使用與確定優選的單個dsRNA相同的方法在體外和體內測試dsRNA的組合。可以僅僅基於生物信息學來選擇這些組合，其中，選擇能夠覆蓋最寬的基因型範圍的最小數量的siRNA。或者，可以按照此處對於單個dsRNA試劑所述，基於體外或體內評價來選擇這些組合。用於測試dsRNA組合的優選的分析是評價在HPV 16陽性癌細胞系中(例如SiHa或Caski，例如在Hengstermann等人(2005)Journal Vir.79(14)9296；和Butz等人(2003)Oncogene 225938中描述)或者在器官型培養系統中(例如在Jeon等人(1995)JournalVir.69(5)2989中描述)的siRNA介導的HPV靶基因抑制(knockdown)的表型結果。
本發明人已經確定了某些優選的可用於治療HPV感染的dsRNA組合。最一般地來說，dsRNA的組合包含多於一種選自表1的dsRNA。因此，本發明涉及選自表1的2、3、4、5或更多種dsRNA雙鏈體在聯合治療中的應用。原則上，為了簡化治療產品，最小數量的dsRNA是優選的。這就促使dsRNA的選擇包含最大數量的有害或潛在有害的HPV基因型，並且事實上可以證明組合的選擇無需包括所有這些HPV基因型。
治療由HPV感染引起的疾病的方法 此處所描述的方法和組合物可用於治療由人乳頭瘤病毒引起的疾病和病症，該疾病和病症可能是臨床或亞臨床乳頭瘤病毒感染的結果。這些疾病和病症在此有時也被稱為「HPV相關病症」或「由HPV感染介導的病理過程」，包括例如上皮惡性腫瘤、皮膚癌(非黑素瘤或黑素瘤)、肛門生殖器惡性腫瘤(例如子宮頸癌)、HPV相關癌前病變(包括LSIL或HSIL子宮頸組織)、肛門癌、惡性病變、良性病變、乳頭狀瘤、乳頭狀腺囊瘤、神經性乳頭瘤、乳頭狀瘤病、皮膚和黏膜乳頭瘤、溼疣、成纖維細胞瘤和其它與乳頭瘤病毒相關的病理狀況。
例如，此處所描述的組合物可用於治療由HPV引起的疣。這樣的疣包括例如普通疣(尋常疣)，例如手掌疣、蹠疣、甲周疣；扁平疣和絲狀疣；肛門、口腔、咽、喉和舌乳頭狀瘤；性病溼疣(尖銳溼疣)也稱為生殖器疣(例如陰莖、外陰、陰道和子宮頸疣)，是最嚴重的HPV感染表現之一。HPV DNA可在所有級別的子宮頸上皮內腫瘤(CIN I-III)中發現，HPV類型的特定亞組可在子宮頸的原位癌中發現。因此，患有生殖器疣、攜帶特定的HPV類型的女性被認為具有發展成為子宮頸癌的高風險。
最常見的與乳頭瘤病毒感染相關的疾病為良性皮膚疣或普通疣。普通疣通常包含1、2、3、4或10型HPV。其它的由乳頭瘤病毒引起的病症包括例如喉乳頭狀瘤，這是一種良性的喉上皮腫瘤。乳頭瘤病毒HPV-6和HPV-11為與喉乳頭狀瘤相關的最常見的兩種類型。此處所描述的組合物可用於治療這些疾病和病症。
在此描述的組合物也可用於治療疣狀表皮發育不良(EV)，這是一種罕見的遺傳轉播疾病，其特徵在於散布著小的紅色斑點的扁平疣。
此外，在此描述的組合物可用於治療以HPV作為病原的、由細胞轉化引起的病變，例如，用於治療子宮頸癌。
此處所描述的組合物還可用於治療HPV誘導的發育異常，例如陰莖、外陰、子宮頸、陰道、口、肛門和咽發育異常，和治療HPV誘導的癌症，例如陰莖、外陰、子宮頸、陰道、肛門、口腔、咽和頭頸癌。
本發明還可以通過包括特定的dsRNA與另一種抗癌化療劑例如任何常規的化療劑聯合來實施。特定的結合劑與其它藥物的聯合使用可以加強化療方案。本領域的技術人員還可以想到能夠向本發明的方法中加入的許多化療方案。可以使用任何化療劑，包括烷化劑、抗代謝物、激素和拮抗劑、放射性同位素和天然產物。例如，本發明的化合物可與抗生素(如阿黴素)和其它蒽環類類似物、氮芥(例如環磷醯胺)、嘧啶類似物(例如5-氟尿嘧啶)、順鉑、羥脲、紫杉醇及其天然和合成衍生物等一起給藥。作為另一個例子，對於混合型腫瘤，例如乳腺的腺癌，其中，腫瘤包含依賴促性腺激素的和不依賴促性腺激素的細胞，該化合物可與亮丙瑞林或戈舍瑞林(LH-RH的合成肽類似物)共同給藥。其它的抗腫瘤方案包括使用四環素化合物和其它的治療方式，例如手術、放射等，在此也被稱為「輔助抗癌方式」。因此，本發明的方法可與這樣的常規治療聯合使用，具有降低副作用和提高有效性的優點。
在另一個替代方案中，靶向E6AP的dsRNA可用於治療神經障礙和行為異常。通過確定患有Angelman症候群的患者中的E6AP突變，發現E6AP與神經障礙和行為異常相關。Angelman症候群(AS)為一種特別的神經行為異常，其特徵在於智力遲鈍、失語、過笑、癲癇發作、共濟失調和特有的EEG模式(Hitchins，M.P.等人2004.Am J Med Genet A.125(2)167-72)。推測誘導這種狀況不是治療的意圖；相反，正如在許多遺傳性缺陷中觀察到的一樣，E6AP在神經和行為狀況中具有關鍵作用的這種證據也表明了該靶標在人類病理學中可能具有多種作用，並且可能是這一類別的其它疾病的合適靶標，在這一類疾病中，E6AP的沉默化將會彌補其它生化缺陷或疾病。此處所使用的「E6AP相關病症」包括上述HPV相關病症和其它的神經和行為異常。
抑制E6AP基因表達的方法 另一方面，本發明提供了抑制哺乳動物中E6AP基因的表達的方法。該方法包括給哺乳動物施用本發明表1中的組合物，以使靶基因E6AP的表達沉默化。由於它們的高特異性，本發明這些dsRNA特異性地針對靶基因E6AP的RNA(初級的或處理的)。使用這些dsRNA抑制這些E6AP基因表達的組合物和方法可如本文其它部分所述實現。
在一個實施方案中，此方法包括施用包含dsRNA的組合物，其中該dsRNA包含與將要治療的哺乳動物的E6AP基因RNA轉錄物至少一部分互補的核苷酸序列。當被治療的生物體是如人類的哺乳動物時，該組合物可以使用本領域內公知的任何方式給藥，包括但不限於口服或者腸胃外途徑，包括靜脈內、肌肉內、皮下、經皮、呼吸道(氣溶膠)、經鼻、直腸、陰道以及局部(包括口腔和舌下)給藥。在優選的實施方案中，該組合物通過局部/陰道給藥或者靜脈輸液或注射給藥。
除非另外指出，此處所用的所有技術和科技術語的含義與本發明所屬領域技術人員通常理解的相同。儘管與此處的描述相似或等同的方法和材料也可用於實施或測試本發明，但是下面描述了合適的方法和材料。在此提到的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻在此全文引入作為參考。如果存在衝突，以本說明書(包括定義部分)為準。此外，材料、方法和實施例僅為示例性的，並不意於局限本發明。
實施例 E6AP基因的基因步移(walking) 設計siRNA以鑑定靶向人遍在蛋白連接酶E3A(ube3A，還被稱為E6AP)的siRNA。使用代表不同同工型的人E6AP mRNA序列(NM_130838.1，NM_130839.1，NM_000462.2)。
對所有人E6AP同工型應用BioEdit軟體的ClustalW多重序列對比功能(Thompson J.D.，等人，Nucleic Acids Res.1994，224673)以確定mRNA序列NM 130838.1為最短的序列，同時證實了參考序列的位點5至4491(末端位點)的序列保守性，這是所有E6AP同工型有效靶向的條件。
確定了橫跨E6AP參考序列NM 130838.1的所有可能的重疊19聚體(代表siRNA有義鏈序列)，得到4473種19聚體的候選序列。綜合起來，這些候選靶序列覆蓋了E6AP mRNA的5′UTR、編碼區和3′UTR域，以及這些域的連接位點。
為了從候選序列的集合中排序和選擇siRNA，預測的與無關靶標相互作用的可能性(脫靶可能性(off-target potential))被作為排序參數。具有低的脫靶可能性的siRNAs被確定為優選的，並且假定更具有體內特異性。
為了預測siRNA特異性的脫靶可能性，做出以下假設 1)在鏈的2至9位(從5′至3′)(種子區域)與靶基因的互補性可能足以讓該鏈與從該靶基因轉錄的mRNA發生相互作用以及隨後的表達下調(Jackson AL，等人Nat Biotechnol.2003Jun；21(6)635-7)。
2)每條鏈的1到19位與脫靶相互作用無關 3)種子區域對脫靶可能性的貢獻可能大於其他序列 4)一條鏈的切割位點區域位置10和11(從5′至3′)對於脫靶可能性的貢獻可能比位於切割位點3′的序列(非種子區域)的貢獻大，但是沒有種子區域的貢獻大 5)考慮假設1到4，基於siRNA鏈序列與基因序列的互補性以及錯配的位置，可以計算每個基因和每條鏈的脫靶得分 6)假設有義鏈活性可能被引入的內部修飾消除，只有反義鏈的脫靶可能性是相關的 7)siRNA的脫靶可能性可以從根據我們的標準表現出最高同源性的基因(最佳脫靶基因)來推斷，因此可以表示為與相應基因的脫靶得分 為了確定潛在的脫靶基因，將19聚體反義鏈序列對可公開獲得的人mRNA序列進行同源性檢索。基於這個目的，使用所有的19聚體候選反義序列對人RefSeq資料庫進行FastA(3.4版本)檢索。使用Perl腳本(script)從候選19聚體序列中產生反義序列(perl腳本2)。為了在19聚體的全長上考慮同源性，並格式化適合於下一步腳本分析的輸出，使用參數/數值對-g 30-f 30-L-i-H執行FastA檢索。此檢索產生對於候選siRNA的可能的脫靶基因的列表。
進一步，FastA檢索參數使用數值-E 15000，以使具有多於8個連續核鹼基的資料庫條目與19聚體有義鏈序列相同，這些有義鏈序列很有可能被轉移到FastA輸出文件，同時顯示19聚體全長的同源性(參見假設1)。
為了確定最佳的脫靶基因及其脫靶得分，分析FastA輸出文件。對每個可能的脫靶基因，提取每一個19聚體輸入序列的以下脫靶性質 種子區域中的錯配數 非種子區域中的錯配數 切割位點區域中的錯配數 每種脫靶基因的脫靶得分計算如下 (種子錯配數乘以10)+(切割位點錯配數乘以1.2)+非種子錯配數 對每個輸入19聚體序列提取最低脫靶得分，並連續寫入輸出文件，產生對應於輸入19聚體序列的所有siRNA的脫靶得分列表。
為了產生siRNA排序，將脫靶得分輸入結果表格。所有的siRNA最終根據脫靶得分按降序排列，並且從選擇中排除在同一行中包含多於3個G的延伸的序列。
選擇並分析了327個脫靶得分＞＝3的siRNA(表1)










dsRNA合成 試劑來源 在此沒有具體給出試劑的來源，這些試劑可以從任何分子生物學試劑供應商處獲得，具有可應用於分子生物學的質量/純度標準。
siRNA合成 單鏈RNA是應用Expedite 8909合成儀(Applied Biosystems，Applera Deutschland GmbH，Darmstadt，德國)以及可控孔度玻璃(CPG，

Proligo Biochemie GmbH，漢堡，德國)作為固相支持體，以1微摩爾的規模通過固相合成產生的。分別使用相應的亞磷醯胺和2』-O-甲基亞磷醯胺(Proligo Biochemie GmbH，漢堡，德國)通過固相合成產生RNA和含有2』-O-甲基核苷酸的RNA。應用例如記載於Current protocols in nucleic acid chemistry，Beaucage，S.L.等人(Ed rs.)，John Wiley&Sons，Inc.，紐約，紐約，美國中的標準核苷亞氨基磷酸酯化學法，這些結構單元被添加到寡核糖核苷酸鏈的序列的所選位置上。通過用含Beaucage試劑(Chruachem Ltd，Glasgow，UK)的乙腈溶液(1％)代替碘氧化劑溶液，引入硫代磷酸連接。其它輔助試劑從Mallinckrodt Baker(Griesheim，德國)獲得。
根據確定的操作步驟，使用陰離子交換HPLC進行寡核糖核苷酸粗品的脫保護以及純化。使用分光光度計(DU 640B，BeckmanCoulter GmbH，Unterschleiβheim，Germany)測量相應RNA溶液在260nm波長下的紫外吸收，由此確定收率和濃度。雙鏈RNA如下產生將等摩爾的互補鏈溶液在退火緩衝液(20mM磷酸鈉，pH 6.8；100mM氯化鈉)中混合，在85-90℃水浴中加熱3分鐘，經3-4小時冷卻至室溫。退火的RNA溶液儲存於-20℃直至使用。
為了合成3′-膽固醇-偶聯的siRNA(在此稱為-Chol-3′)，經過適當修飾的固相支持體用於RNA合成。該修飾的固相支持體如下製備 2-氮雜丁-1，4-二甲酸二乙酯AA
將4.7M氫氧化鈉水溶液(50mL)加入攪拌的、冰冷的甘氨酸乙酯鹽酸鹽(32.19g，0.23mol)水溶液(50mL)中。接著，加入丙烯酸乙酯(23.1g，0.23mol)並在室溫下攪拌混合物，直至由TLC確定反應完成。19小時後，使用二氯甲烷(3×100mL)將溶液分層。有機層用無水硫酸鈉乾燥、過濾並蒸發。殘餘物蒸餾生成AA(28.8g，61％)。
3-{乙氧羰基甲基-[6-(9H-芴-9-基甲氧羰基-氨基)-己醯基]-氨基}-丙酸乙酯AB
Fmoc-6-氨基-己酸(9.12g，25.83mmol)溶於二氯甲烷(50mL)並用冰冷卻。在0℃下，將二異丙基碳二亞胺(3.25g，3.99mL，25.83mmol)加入此溶液中。繼而加入氮雜丁-1，4-二甲酸二乙酯(5g，24.6mmol)和二甲氨基吡啶(0.305g，2.5mmol)。待此溶液至室溫，攪拌6小時。由TLC確定反應完成。反應混合物在真空下濃縮，並加入乙酸乙酯沉澱二異丙基尿素。過濾懸浮液。用5％鹽酸水溶液、5％碳酸氫鈉及水洗滌濾過物。合併有機層，用硫酸鈉乾燥並濃縮成粗產物，粗產物用柱色譜法純化(50％EtOAC/己烷)，得到AB 11.87g(88％)。
3-[(6-氨基-己醯基)-乙氧羰基甲基-氨基]-丙酸乙酯AC
在0℃下，將3-{乙氧羰基甲基-[6-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-己醯基]-氨基}-丙酸乙酯AB(11.5g，21.3mmol)溶解於含20％哌啶的二甲基甲醯胺中。繼續攪拌溶液1小時。反應混合物真空濃縮，加水至殘留物中，產物用乙酸乙酯萃取。粗產物通過轉化成其鹽酸鹽純化。
3-({6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環戊並[a]菲-3-基氧羰基氨基]-己醯基}乙氧羰基甲基-氨基)-丙酸乙酯AD
3-[(6-氨基-己醯基)-乙氧羰基甲基-氨基]-丙酸乙酯AC的鹽酸鹽(4.7g，14.8mmol)吸收於二氯甲烷中。懸浮液用冰冷卻至0℃。二異丙基乙胺(3.87g，5.2mL，30mmol)加入此懸浮液中。向得到的溶液中加入膽固醇氯甲酸酯(6.675g，14.8mmol)。攪拌反應混合物過夜。用二氯甲烷稀釋反應混合物，並用10％鹽酸溶液清洗。產物通過急驟色譜法純化(10.3g，92％)。
1-{6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環戊並[a]菲-3-基氧羰基氨基]-己醯基}-4-氧代-吡咯-3-甲酸乙酯AE
將叔丁醇鉀(1.1g，9.8mmol)在30mL幹甲苯中成漿。混合物用冰冷卻至0℃，20分鐘內邊攪拌邊緩慢加入5g(6.6mmol)二酯AD。添加過程中，溫度保持在5℃以下。繼續在0℃攪拌30分鐘，加入1mL冰醋酸後立即加入溶於40mL水的4g NaH2PO4.H2O。產生的混合物用每次100mL二氯甲烷萃取兩次，合併有機層，用每次10mL磷酸鹽緩衝液清洗兩次，乾燥，蒸發至幹。剩餘物溶於60mL甲苯，冷卻至0℃，用三份50mL的冷pH 9.5碳酸鹽緩衝液萃取。用磷酸調節水提取物至pH 3，用五份40mL的氯仿萃取，合併，乾燥，蒸發至幹。剩餘物用柱色譜法純化(使用25％乙酸乙酯/己烷)，生成1.9g b-酮酯(39％)。
[6-(3-羥基-4-羥甲基-吡咯烷-1-基)-6-氧代-己基]-氨基甲酸17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環戊並[a]菲-3基酯AF
1小時內，將甲醇(2mL)逐滴加入回流的b-酮酯AE(1.5g，2.2mmol)與硼氫化鈉(0.226g，6mmol)在四氫呋喃(10mL)中的混合物中。在回流溫度下繼續攪拌1小時。冷卻至室溫後，加入1N HCl(12.5mL)，混合物用乙酸乙酯萃取(3×40mL)。合併的乙酸乙酯層用無水硫酸鈉乾燥，並真空濃縮，產物用柱色譜法純化(10％MeOH/CHCl3)(89％)。
(6-{3-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-4-羥基-吡咯-1-基}-6-氧代-己基)-氨基甲酸17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環戊並[a]菲-3基酯AG
二醇AF(1.25g 1.994mmol)通過在真空下與吡啶(2×5mL)蒸發乾燥。邊攪拌邊加入無水吡啶(10mL)和4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(0.724g，2.13mmol)。室溫反應過夜。加入甲醇終止反應。反應混合物真空濃縮，向剩餘物中加入二氯甲烷(50mL)。有機層用1M的碳酸氫鈉水溶液清洗。有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮。殘餘的吡啶通過與甲苯蒸發而除去。粗產物用柱色譜法(2％甲醇/氯仿，Rf＝0.5，在5％甲醇/氯仿中)純化(1.75g，95％)。
琥珀酸單(4-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-1-{6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環戊並[a]菲-3-基氧羰基氨基]-己醯基}-吡咯-3-基)酯AH
化合物AG(1.0g，1.05mmol)與琥珀酸酐(0.150g，1.5mmol)和DMAP(0.073g，0.6mmol)混合，於40℃過夜真空乾燥。將混合物溶解於無水二氯乙烷(3mL)中，加入三乙胺(0.318g，0.440mL，3.15mmol)，並在氬氣氛下室溫攪拌16小時。然後用二氯甲烷(40mL)稀釋，用冰冷檸檬酸水溶液(5wt％，30mL)以及水(2×20mL)清洗。用無水硫酸鈉乾燥有機相，濃縮至幹。剩餘物用於下一步反應。
膽固醇衍生化的CPG AI
將琥珀酸酯AH(0.254g，0.242mmol)溶於二氯甲烷/乙腈(3∶2，3mL)混合物中。在此溶液中依次加入DMAP(0.0296g，0.242mmol)的乙腈(1.25mL)溶液、2，2′-二硫-雙(5-硝基吡啶)(0.075g，0.242mmol)的乙腈/二氯甲烷(3∶1，1.25mL)溶液。在所生成的溶液中再加入溶於乙腈(0.6ml)的三苯基膦(0.064g，0.242mmol)溶液。反應混合物變為鮮桔色。溶液用機械腕搖床短暫搖動(5mins)。加入長鏈烷基胺-CPG(LCAA-CPG)(1.5g，61mM)。將懸浮液搖動2小時。用燒結漏鬥過濾CPG，並依次用乙腈、二氯甲烷和乙醚清洗。未反應的氨基用乙酸酐/吡啶掩蔽(masked)。獲得的CPG的載量通過進行紫外測量而確定(37mM/g)。
含有5′-12-月桂酸雙癸基醯胺基團(在此稱為″5′-C32-″)或者5′-膽固醇衍生基團(在此稱為″5′-Chol-″)的siRNAs按照WO2004/065601所述合成，不同之處是對於膽固醇衍生物，為了在核酸寡聚體的5′端引入硫代磷酸連接，氧化步驟使用Beaucage試劑完成。
dsRNA表達載體 在本發明的另一方面，調控E6AP基因表達活性的E6AP特異性dsRNA分子由插入DNA或RNA載體內的轉錄單元表達(參見例如，Couture，A，等人，TIG.(1996)，125-10；Skillern，A.，等人，國際PCT公布WO 00/22113，Conrad，國際PCT公布WO 00/22114，和Conrad，美國專利6,054,299)。這些轉基因可以作為線性構建體、環狀質粒或病毒載體引入，它們可以併入宿主基因組並作為整合至宿主基因組中的轉基因遺傳。這些轉基因也可以構建為允許作為染色體外質粒遺傳(Gassmann，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)921292)。
dsRNA的各鏈可由位於兩個分別的表達載體上的啟動子轉錄並且共轉染進一個靶細胞內。或者，dsRNA的各鏈可以由均位於同一個表達質粒上的啟動子轉錄。在一個優選實施方案中，dsRNA表達為通過連接體多核苷酸序列連接的反向重複，使得dsRNA具有莖環結構。
重組dsRNA表達載體通常是DNA質粒或者病毒載體。表達dsRNA的病毒載體可以基於但不限於腺相關病毒(綜述見Muzyczka，等人，Curr.Topics Micro.Immunol.(1992)15897-129))、腺病毒(見，例如，Berkner，等人，BioTechniques(1998)6616)，Rosenfeld等人(1991，Science 252431-434)，和Rosenfeld等人(1992)，Cell68143-155))或α病毒以及本領域已知的其他病毒進行構建。逆轉錄病毒已被用於在體內和/或在體外將多種基因引入許多不同的細胞型中，包括上皮細胞(見，例如，Eglitis，等人，Science(1985)2301395-1398；Danos和Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)856460-6464；Wilson等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA853014-3018；Armentano等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA876141-6145；Huber等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA888039-8043；Ferry等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA888377-8381；Chowdhury等人，1991，Science 2541802-1805；vanBeusechem.等人，1992，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 897640-19；Kay等人，1992，Human Gene Therapy 3641-647；Dai等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895；Hwu等人，1993，J.Immunol.1504104-4115；美國專利4,868,116；美國專利4,980,286；PCT申請WO 89/07136；PCT申請WO 89/02468；PCT申請WO 89/05345；和PCT申請WO 92/07573)。可以通過將重組逆轉錄病毒基因組轉染至合適的包裝細胞系，例如PA317和Psi-CRIP(Comette等人，1991，Human Gene Therapy 25-10；Cone等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816349)，來產生能夠轉導和表達插入細胞基因組的基因的重組逆轉錄病毒載體。重組逆轉錄病毒載體可用於感染易感宿主(如大鼠、倉鼠、狗和黑猩猩)中的多種細胞和組織(Hsu等人，1992，J.Infectious Disease，166769)，同時具有感染無需有絲分裂活躍細胞的優點。
在本發明的DNA質粒或病毒載體中驅動dsRNA表達的啟動子可以是真核RNA聚合酶I(如核糖體RNA啟動子)、RNA聚合酶II(如CMV早期啟動子或肌動蛋白啟動子或U1snRNA啟動子)，或者一般的RNA聚合酶III啟動子(如U6snRNA或7SK RNA啟動子)，或原核啟動子，比如T7啟動子，只要該表達質粒也編碼由T7啟動子轉錄所需的T7RNA聚合酶。該啟動子也可以將轉基因表達引導至胰腺(參見，例如，胰腺內的胰島素調控序列(Bucchini等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 832511-2515))。
另外，轉基因的表達可被精確調控，比如，使用誘導型調控序列和表達體系，比如對特定生理調節因素(如循環葡萄糖水平或者激素(Docherty等人，1994，FASEB J.820-24)敏感的調節序列。這些適用於控制轉基因在細胞或者哺乳動物中表達的誘導型表達體系包括由蛻皮素、雌激素、孕酮、四環素、二聚化化學誘導劑以及異丙基-β-D1-硫代吡喃半乳糖苷(EPTG)的調控。本領域技術人員能夠根據dsRNA轉基因的預期用途選擇合適的調節/啟動子序列。
一般來講，能夠表達dsRNA分子的重組載體如下所述遞送，並且保持在靶細胞中。或者，可以使用提供dsRNA分子的瞬時表達的病毒載體。這些載體可根據需要重複使用。一旦被表達，dsRNA就結合在靶RNA上，並且調節其功能或者表達。表達dsRNA的載體可以系統遞送，例如通過靜脈內或者肌肉內施用，通過向從患者中外植出的靶細胞施用並隨後重新引入患者體內，也可通過允許引入所需的靶細胞內的其他任何方法。
dsRNA表達DNA質粒通常是作為與陽離子脂質載體(如Oligofectamine)或基於非陽離子脂質的載體(如Transit-TKOTM)的複合物而被轉染至靶細胞內。本發明也涉及在一周或者更長時間內針對單個E6AP基因或者多個E6AP基因不同區域的dsRNA介導的抑制的多脂質轉染。本發明的載體向宿主細胞內的成功引入可以通過各種已知方法進行監控。比如，瞬時轉染可以用報告子作為信號，比如螢光標記，如綠色螢光蛋白(GFP)。離體細胞的穩定轉染可以使用給轉染細胞提供對特定環境因素(如抗生素和藥物)的抗性(如潮黴素B抗性)的標記來確定。
E6AP特異的sRNA分子也可以插入載體中，並作為應用於人類患者的基因治療載體。基因治療載體可以通過如靜脈注射、局部給藥(見美國專利5,328,470)或者立體定向注射(參見，例如Chen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913054-3057)給予受試者。基因治療載體的藥物製劑可以包括在可接受的稀釋劑中的基因治療載體，或者可以包含包埋基因遞送載體的緩釋基質。可選擇地，當完整基因遞送載體(如逆轉錄病毒載體)可由重組細胞完整地產生時，藥物製劑可以包括產生基因遞送系統的一個或者多個細胞。
在HCT-116細胞中的E6AP siRNA篩選 HCT-116細胞從DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)(Braunschweig，Germany，cat.No.ACC 581)得到，在37℃和5％CO2氣氛的潮溼溫箱中，在添加了10％胎牛血清(FCS)、青黴素100U/ml、鏈黴素100μg/ml及2mML-穀氨醯胺的McCoys(Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.F1015)培養基中進行培養。
對於siRNA的轉染，將HCT-116細胞以2.0×104個細胞/孔的密度接種到96孔板上並立即轉染。按供應商提供的方法，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)進行siRNA轉染(對於單劑量篩選為30nM和3nM)。
轉染後24小時將HCT-116細胞裂解，按照標準方案、使用Quantigene Explore試劑盒(Panomics，Inc.(Fremont，CA)(以前為Genospectra，Inc.))定量測定E6AP mRNA的表達水平。E6AP mRNA水平針對GAP-DH mRNA進行標準化。每一個siRNA採集四個單獨的數據點。使用與E6AP基因不相關的siRNA雙鏈體作為對照。特定E6AP特異性siRNA雙鏈體的活性表示為處理細胞中的E6APmRNA濃度相對於用對照siRNA雙鏈體處理的細胞中的E6APmRNA濃度的百分比。
下面的表2給出了結果。確定了許多靶向E6AP基因的活性siRNA分子。
表2靶向E6AP的dsRNA的活性。




本領域技術人員熟悉本說明書中具體公開的方法和組合物以及其它方法和組合物，從而能夠在隨後所附的權利要求書的全部範圍內實施本發明。
權利要求
1.一種抑制細胞中人E6AP基因表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中，所述dsRNA包含至少兩種相互互補的序列，其中，有義鏈包含第一序列，反義鏈包括包含與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補的互補區的第二序列，其中，所述互補區的長度小於30個核苷酸，其中，一旦所述dsRNA與表達所述E6AP的細胞相接觸，會抑制所述E6AP基因的表達至少40％。
2.根據權利要求1所述的dsRNA，其中，所述第一序列選自表1，所述第二序列選自表1。
3.根據權利要求1所述的dsRNA，其中，所述dsRNA包含至少一種修飾的核苷酸。
4.根據權利要求2所述的dsRNA，其中，所述dsRNA包含至少一種修飾的核苷酸。
5.根據權利要求3或4所述的dsRNA，其中，所述修飾的核苷酸選自2』-O-甲基修飾的核苷酸、包含5』-硫代磷酸基團的核苷酸和與膽甾醇衍生物或十二烷酸雙癸醯胺連接的末端核苷酸。
6.根據權利要求3或4所述的dsRNA，其中，所述修飾的核苷酸選自2』-脫氧-2』-氟修飾的核苷酸、2』-脫氧修飾的核苷酸、鎖定核苷酸、脫鹼基核苷酸、2』-氨基修飾的核苷酸、2』-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然鹼基的核苷酸。
7.根據權利要求3或4所述的dsRNA，其中，所述第一序列選自表1，所述第二序列選自表1。
8.根據權利要求6或7所述的dsRNA，其中，所述第一序列選自表1，所述第二序列選自表1。
9.一種包含權利要求1所述的dsRNA的細胞。
10.一種用於抑制生物體中E6AP基因表達的藥物組合物，包含dsRNA和藥學上可接受的載體，其中，dsRNA包含至少兩種相互互補的序列，其中，有義鏈包含第一序列，反義鏈包括包含與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補的互補區的第二序列，其中，所述互補區的長度小於30個核苷酸，其中，一旦所述dsRNA與表達所述E6AP的細胞相接觸，會抑制所述E6AP基因的表達至少20％。
11.根據權利要求10所述的藥物組合物，其中，所述dsRNA的所述第一序列選自表1，所述dsRNA的所述第二序列選自表1。
12.根據權利要求10所述的藥物組合物，其中，所述dsRNA的所述第一序列選自表1，所述dsRNA的所述第二序列選自表1。
13.一種抑制細胞中E6AP基因表達的方法，該方法包括
(a)將雙鏈核糖核酸(dsRNA)導入細胞，其中，該dsRNA包含至少兩種相互互補的序列，其中，有義鏈包含第一序列，反義鏈包括包含與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補的互補區的第二序列，其中，所述互補區的長度小於30個核苷酸，其中，一旦所述dsRNA與表達所述E6AP的細胞相接觸，會抑制所述E6AP基因的表達至少40％；和
(b)維持步驟(a)中產生的細胞一段足以獲得E6AP基因的mRNA轉錄物的降解的時間，從而抑制細胞中E6AP基因的表達。
14.一種治療、預防或控制HPV感染介導的病理過程的方法，包括給予需要這種治療、預防或控制的患者治療或預防有效量的dsRNA，其中，該dsRNA包含至少兩種相互互補的序列，其中，有義鏈包含第一序列，反義鏈包括包含與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補的互補區的第二序列，其中，所述互補區的長度小於30個核苷酸，其中，一旦所述dsRNA與表達所述E6AP的細胞相接觸，會抑制所述E6AP基因的表達至少40％。
15.一種抑制細胞中E6AP基因表達的載體，所述載體包含與編碼dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列可操作地連接的調控序列，其中，所述dsRNA的一條鏈與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補，其中，所述dsRNA的長度小於30個鹼基對，其中，一旦所述dsRNA與表達所述E6AP的細胞相接觸，會抑制所述E6AP基因的表達至少40％。
16.一種包含權利要求16所述的載體的細胞。
17.一種用於降低細胞中人E6AP基因表達水平的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中，所述dsRNA包含至少兩種相互互補的序列，其中，有義鏈包含第一序列，反義鏈包括包含與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補的互補區的第二序列，其中，一旦所述dsRNA與表達所述E6AP的細胞相接觸，會降低所述E6AP基因的表達水平。
18.根據權利要求17所述的dsRNA，其中，所述接觸降低了所述E6AP基因的表達水平至少40％。
19.根據權利要求17所述的dsRNA，其中，所述接觸以30nM或更低的濃度在體外進行。
20.一種用於降低生物體中E6AP基因表達水平的藥物組合物，包含權利要求17所述的dsRNA和藥學上可接受的載體。
21.一種治療HPV相關病症的方法，包括給予需要這種治療的患者治療有效量的權利要求17所述的dsRNA。
22.一種治療E6AP相關病症的方法，包括給予需要這種治療的患者治療有效量的權利要求17所述的dsRNA。
23.一種藥物組合物，包含至少兩種選自權利要求2所述的dsRNA中的dsRNA。
24.一種治療HPV相關病症的方法，包括給予需要這種治療的患者治療有效量的權利要求23所述的藥物組合物。
全文摘要
本發明涉及治療人乳頭瘤病毒(HPV)感染的雙鏈核糖核酸(dsRNA)。dsRNA包含具有小於30個核苷酸長度(通常的長度為19-25個核苷酸)的核苷酸序列的反義鏈，該核苷酸序列與選自人E6AP基因的HPV靶基因的至少一部分基本互補。本發明還涉及一種包含dsRNA和藥學上可接受的載體的藥物組合物；通過使用該藥物組合物治療由HPV感染和E6AP基因的表達引起的疾病的方法；以及抑制細胞中HPV靶基因表達的方法。
文檔編號C12N15/113GK101743311SQ200880015038
公開日2010年6月16日 申請日期2008年3月25日 優先權日2007年3月26日
發明者J·本森, K·菲茲格拉爾德, B·布拉姆拉格, P·坦恩, H-P·福恩洛赫爾 申請人:阿爾尼拉姆醫藥品有限公司