人b淋巴細胞刺激因子單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區基因及其應用的製作方法
2023-11-11 19:28:07
專利名稱：人b淋巴細胞刺激因子單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及人B淋巴細胞刺激因子單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區基因，由所述基因編碼的多肽，含有所述基因的載體及所述的基因和多肽在製備BLyS相關的自身免疫性疾病的臨床檢測試劑中的應用，以及其製備方法。具體地，本發明的重鏈和輕鏈可變區基因來自BALB/C小鼠雜交瘤細胞ABL-1。
背景技術：
人B淋巴細胞刺激因子(hBLyS)是Moore PA等人(Science.1999 Jul9；285(5425)260-3)1999年新發現的一種與人體免疫調控密切相關的細胞因子，屬腫瘤壞死因子(TNF)超家族，為II型跨膜蛋白，主要在人體外周血單核細胞、脾臟、淋巴結、骨髓等組織中表達，並能在某些金屬蛋白酶的作用下以胞外可溶性部分(hsBLyS)游離於外周血中發揮作用。hsBLyS是一種淋巴細胞的共刺激因子，對活化的B細胞有強烈的促進增殖和分化的刺激作用對正常的B細胞，在用PMA和Anti-IgM預活化後，hsBLyS能誘導其大量增殖並分泌各型免疫球蛋白，其中大部分為IgM和IgA。在體內，hBLyS對囊外B細胞的活化及抗原特異性IgM的分泌；免疫球蛋白的同型轉換；脾臟生發中心(GC)的形成有重要作用；同時hBLyS對CD4+和CD8+亞型T細胞也有間接活化作用。hBLyS作為B淋巴細胞發育的正調節因子，在體內具有促進B淋巴細胞的分化，存活的作用，而過多的hBLyS可導致B淋巴細胞的過度活化而引起自身免疫性疾病，證據如下(1)hBLyS轉基因小鼠由於過度表達hBLyS，導致了自身耐受的破壞，血清和組織中出現多種自身抗體，同時伴有系統性紅斑狼瘡樣症狀。(2)狼瘡樣模型小鼠(NZB×NZWF1和MRL-lpr/lpr)中，血清hBLyS滴度明顯升高，而且hBLyS的水平與疾病的進展呈平行的關係。(3)在多種自身免疫性疾病(如系統性紅斑狼瘡，類風溼性關節炎和系統性硬化症及重症肌無力等)患者血清中均可檢測到hBLyS滴度明顯升高。2003年BLyS(M.Petri et al.，abstract 1712，ACR 2003meeting)被作為臨床上診斷系統性紅斑狼瘡的一種Biomarker。所以BLyS抗體的研製對於BLyS相關的自身免疫性疾病的診斷和治療意義重大。
單克隆抗體由兩條相同的重鏈和輕鏈組成。每一條重鏈(VH)和輕鏈(VL)都分為恆定區和可變區兩大部分。其中，VH和VL共同組成抗原結合部位。抗體的特異性正是由這一部位決定的。VH和VL長約110胺基酸，分別佔輕重鏈的1/2和1/4。在抗原結合部位中真正與抗原決定簇空間構象互補的是3個胺基酸變化較大的區域(CDR)。與可變區相對的是骨架區，其胺基酸序列相對保守。scFv是由VH和VL與一柔性胺基酸短肽拼接而成。
國外有報導從噬菌體展示文庫篩選到BLyS的抗體(Baker KP等ArthritisRheum.2003 Nov；48(11)3253-65.)，但由於這種抗體是沒有經過免疫過的，一般親和力較抵，不適合作為臨床檢測試劑。國內有BLyS抗體雜交瘤細胞株建立的報導(張志方等，中山醫科大學學報，2002年03期)，但迄今為止還沒有相關基因序列的報導。
發明內容
為了尋找針對用於BLyS相關的自身免疫性疾病的臨床檢測試劑，針對抗體雜交瘤細胞株應用於大規模生產上容易突變，細胞株不穩定，容易丟失，代價昂貴等諸多缺點，本發明應用基因工程手段，提供了一種人B淋巴細胞刺激因子單克隆抗體輕鏈可變區基因和重鏈可變區基因及其表達產物，並組裝了scFv型的基因工程抗體片段，使得大規模廉價生產抗體成為可能。
本發明的另一個目的在於人B淋巴細胞刺激因子單克隆抗體及其scFv抗體片段在製備用於BLyS相關的自身免疫性疾病的檢測試劑中的應用。
根據本發明的一個方面，本發明涉及一種人B淋巴細胞刺激因子單克隆抗體輕鏈可變區基因和重鏈可變區基因，其中，所述的重鏈可變區基因全長為342bp，其核苷酸序列如4001所示，其編碼的胺基酸序列如4003所示；所述的輕鏈可變區基因全長為321bp，其核苷酸序列如4002所示，其編碼的胺基酸序列如4004所示。
一種表達載體，其含有所述重鏈可變區基因及輕鏈可變區基因。具體可以是如圖2所示的pET28a-scFv。
涉及上述表達載體所表達的多肽，能夠與BLyS作用，可以用於製備BLyS相關的自身免疫性疾病的檢測試劑。
和基因工程生產所述scFv蛋白的方法是從BLyS單克隆細胞株分離出抗體的輕重鏈可變區基因，並組裝scFv，用組裝的scFv構建原核表達載體，轉化大腸桿菌，構建基因工程菌，並誘導表達，對表達產物進行分離、純化和復性。
作為優選的方案，具體操作是1)從BLyS單克隆細胞株ABL-1分離抗體的可變區基因收集生長良好，能分泌BLyS單克隆抗體的雜交瘤細胞株ABL-1，用TRIZOL試劑提取總RNA，
設計兼併引物，VH採用引物VH Back(5』-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3』)和引物VH For(5』-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3』)，VL基因採用引物VL back(5』-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3』)和引物VLFor(5』-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3』)按照Promega公司一步法RT-PCR試劑盒分別擴增VH和VL，分別採用RT-PCR方法，釣取抗體可變區VH和VL基因，分別克隆進入載體pMD18-T；2)VH，VL基因擴增產物的克隆引物設計如下VH P1(5』-ACCATGGAATTCCTGCAGGAGTCTGGTGGCTTG-3』)，含有EcoRI酶切位點，VH P2(5』-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTG-3』)，VL P1(5』-CAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGACATTGAGCTCAC-3』)，VL P2(5』-GTGGTGAAGCTTTCACTCGAGCTTGGTACCACCTC-3』)，含有HindIII酶切位點，採用Over-lap PCR，在VH和VL之間設計一段柔性linker(G4S)3，VH-linker-VL，克隆於高效原核表達載體pET28a；3)高效表達，純化，復性scFvpET28a-scFv轉化進入BL21(DE3)，IPTG誘導表達，收集包含體沉澱，尿素溶解，Ni2+-IDA His-bind親和層析純化蛋白，稀釋法和透析法對目的蛋白復性，純化的蛋白稀釋到復性緩衝液I50mM Tris-HCl、0.15mM NaCl、2M urea、0.5Mm還原型穀胱甘肽、0.1mM氧化型穀胱甘肽、pH8.0，終濃度為100μg/ml，復性24h，然後將蛋白裝入復性緩衝液II50mmol/L Tris-HCl、0.15mol/LNaCl、pH8.0，透析復性12h，超濾管Centricon 30濃縮蛋白，13％SDS-PAGE檢測，蛋白-20℃保存。
我們利用基因工程手段首先從分泌BLyS的單克隆抗體的雜交瘤細胞株中獲得了單克隆抗體的輕重鏈可變區基因，並組裝了scFv小分子抗體，克隆到pET28a表達載體中，並能在大腸桿菌中進行高效表達，其產生的蛋白質保留了與抗體結合的能力，能夠與BLyS作用，而且與傳統意義上雜交瘤抗體比較具有以下優勢scFv分子小，容易通過基因工程技術的改造，與一些其他效應分子結合，為構建生物飛彈打下基礎；雜交瘤細胞株不容易保存，規模化生產成本高，而基因工程抗體可以採用原核表達系統，可以很方便的生產抗體，成本大大降低，利於工業化生產。因此基因工程抗體的生產較雜交瘤細胞株產生抗體優勢明顯，從而可以代替傳統雜交瘤細胞株生產抗體。此外，BLyS的基因工程抗體可以用來製作BLyS的親和層析介質用於BLyS的純化。
圖1是ABL-1抗體可變區VH和VL的RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中泳道1為標準蛋白；泳道2為VH基因，分子量大約在340bp；泳道3為VL基因，分子量大約在330bp；泳道4為VH-linker-VL基因，大小在750bp左右。
圖2是ABL-1 scFv基因的組裝以及表達載體構建的示意圖。
圖3是ABL-1 scFv的誘導表達，純化和鑑定的分析結果，其中(A1)標準蛋白；(A2)未誘導全菌蛋白；(A3)誘導後全菌蛋白；(A4)超聲上清；(A5)超聲沉澱；(A6)純化產物；(B1)Western blotting檢測蛋白的表達。
圖4是非競爭性ELISA測定ABL-1 scFv與hsBLyS的結合示意圖。
圖5是競爭性ELISA測定ABL-1 scFv抑制ABL-1單克隆抗體與hsBLyS的結合示意圖。
圖6是Western blotting檢測ABL-1 scFv與hsBLyS的結合，其中(A1)標準蛋白；(A2)純化hsBLyS蛋白；(B)ABL-1mAb與hsBLyS的結合(C)ABL-1scFv與hsBLyS的結合；(D)無關IgG與hsBLyS的結合(作為陰性對照)。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
實施例1從BLyS單克隆細胞株ABL-1分離抗體的可變區基因收集生長良好，能分泌BLyS單克隆抗體的雜交瘤細胞株ABL-1107個(本研究室構建，按照「Current protocol in immunology」Production of MonoclonalAntibodies)，用TRIZOL試劑提取總RNA。
RT-PCR釣取VH基因參照Promega公司的(Access RT-PCR System and Access RT-PCRIntroductory System)提供的方法一步法RT-PCR試劑盒分別擴增VH基因VH基因採用引物VH Back(5』-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3』)和引物VH For(5』-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3』)，RT-PCR反應總共為50μl體系1μg的總RNA，10μl的5×AMV/Tf1反應緩衝液，濃度為10pmol的引物VH Back和VH For各5μl，濃度為500uM的dNTP1μl，3mM的MgSO42μl；5u AMV逆轉錄酶1μl和5u Tf1 DNA聚合酶1μ。反應步驟48℃逆轉錄反應45分鐘；94℃變性30秒；55℃退火1分鐘；68℃延伸1分鐘，共35個循環。
RT-PCR釣取VL基因VL基因採用引物VL back(5』-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3』)和VL For(5』-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3』)。按照Promega公司一步法RT-PCR試劑盒擴增VL。50μl反應體系如下1μg的總RNA，10μl的5×AMV/Tf1反應緩衝液，濃度為10pmol的引物VL back和VL For各5μl，濃度為500uM的dNTP1μl，3mM的MgSO42μl；5u AMV逆轉錄酶1μl和5u Tf1 DNA聚合酶1μ。反應步驟48℃逆轉錄反應45分鐘；94℃變性30秒；60℃退火1分鐘；68℃延伸1分鐘，共35個循環。反應結束後，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果如圖1。
VH和VL基因擴增產物的克隆引物設計如下VH P1(5』-ACCATGGAATTCCTGCAGGAGTCTGGTGGCTTG-3』)，含有EcoRI酶切位點，VH P2(5』-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTG-3』)，VL P1(5』-CAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGACATTGAGCTCAC-3』)，VL P2(5』-GTGGTGAAGCTTTCACTCGAGCTTGGTACCACCTC-3』)，含有HindII酶切位點，PCR產物使用膠回收試劑盒純化。取載體pMD18-T 1μl，PCR產物4μl，T4連接酶1μl，5μlT4連接酶緩衝液(2倍)，16度連接18小時。連接產物10μl轉化感受態大腸桿菌DH5α。鋪板，第二天挑取單克隆，採用菌落PCR鑑定，並送交上海博亞公司測序。測序結果如序列表4001和4002所示。
實施例2scFv基因的組裝為獲得scFv，在VH和VL之間添加一柔性linker(G4S)3，為防止在擴增過程中引人突變，我們採用高保真酶Pyrobest(大連寶生物).整個組裝示意圖為圖2，結果如圖1。
第一輪PCR反應擴增VH50μl PCR反應體系如下5μl的10×反應緩衝液；濃度為10μM的引物VH P1和VH P22.5μl4μl的dNTP；35μl H2O；高保真Pyrobest酶0.5μl。95℃變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共26個循環；72℃，延伸5min。
第二輪PCR反應擴增VL50μl PCR反應體系如下5μl的10×反應緩衝液；濃度為10μM的引物VL P1和VL P22.5μl4μl的dNTP；35μl H2O；高保真Pyrobest酶0.5μl。95℃變性5min；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共26個循環；72℃，延伸5min。
割膠回收PCR產物。
第三輪PCR反應擴增VH-linker-VL50μl PCR反應體系如下5μl的10×反應緩衝液；濃度為10μM的引物VH P1和VL P22.5μl4μl的dNTP；35μl H2O；高保真Pyrobest酶0.5μl，上兩輪PCR產物各1μl做為模板。95℃變性5min；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共26個循環；72℃，延伸5min。反應。1％瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收產物。
實施例3scFv基因的酶切消化和連接雙酶切pET28aEcoRI和HindIII為Takara產品。2μl的10×M反應緩衝液；10μl的載體pET28a；EcoRI和HindIII各1μl；7μl H2O。37℃反應6小時。雙酶切實施例2中的第三輪擴增產物2μl的10×M反應緩衝液；10μl的第三輪PCR產物；EcoRI和HindIII各1μl；7μl H2O。37℃反應6小時。
1％瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收產物。
連接反應T4連接酶為Takara產品。2μl的連接反應緩衝液H2O；上輪酶切產物各1μl；16μl H2O。16℃反應12小時。
取10μl產物轉化轉化感受態DH5α。鋪板，第二天挑取單克隆，採用菌落PCR鑑定，並送交上海博亞公司測序。
實施例4scFv單鏈抗體在大腸桿菌中的誘導表達。
挑取測序正確的克隆轉化感受態BL21(DE3)。挑取單個菌落接種到3ml LB培養液(含50μg/ml卡那黴素)中，37℃培養10小時，收集細菌，按1∶100接種到50ml含相同濃度抗生素LB中，37℃培養至OD600＝0.6時，加IPTG(1mmol/L)誘導，37℃培養5小時，13％SDS-PAGE檢測表達情況。結果如圖3，清楚表明表達的蛋白分子量在27Kd左右。主要存在於包含體內。
實施例5表達產物的分離純化和復性4℃ 5000g/min離心10min收集菌體，以5ml 50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl重懸沉澱，然後冰上超聲(超聲5s，間隙5s，反覆160次)，至細胞懸液不再粘稠。室溫12000g/min離心10min，分別收集上清和沉澱。沉澱加入2.5ml Binding緩衝液(50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，8M urea，5mM咪唑，pH8.0)，室溫溶解2小時。室溫12000g/min離心10min，收集上清。取Ni2+-IDA His-bind resin 1ml裝柱，按照Novagen公司提供的操作手冊純化蛋白。
收集Elution緩衝液洗脫的蛋白，測定蛋白濃度，用復性緩衝液I(50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，2M urea，0.5mmol/L還原型穀胱甘肽，0.1mmol/L氧化型穀胱甘肽pH8.0)稀釋蛋白至終濃度為100μg/M1。復性24h，接著將蛋白裝人透析袋，用復性緩衝液II(50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，pH8.0)透析復性12h。超濾管Centricon 30(Millipore，USA)濃縮蛋白。13％SDS-PAGE檢測。蛋白-20℃保存。
實施例6scFv單鏈抗體與hsBLyS結合活性測定1)非競爭ELISA法測定10μg/ml hsBLyS(NaHCO3，pH9.6)4℃包板過夜。第二天用1％脫脂牛奶封閉(37℃，2h)。系列稀釋的scFv分別與hsBLyS孵育(37℃，2h)。以抗His單克隆抗體(Novagen，USA)為一抗，HRP偶聯的羊抗小鼠IgG為二抗，常規ELISA檢測(參照Current protocol in immunology unit2.1-2.3)。結果如圖42)競爭ELISA法測定10μg/ml hsBLyS(NaHCO3，pH9.6)4℃包板過夜。系列稀釋的scFv分別與ABL-1 mAb混合，與hsBLyS孵育(37℃，2h)。用HRP偶聯的羊抗小鼠IgG檢測scFv抑制ABL-1 mAb與hsBLyS的結合。結果如圖5，結果證實ABL-1 scFv與ABL-1單克隆抗體是同一表位結合hsBLyS。
3)Western blotting測定取hsBLyS 20μl，13％SDS-PAGE電泳，轉移至硝酸纖維素薄膜，1％BSA封閉後，加scFv 37℃孵育2h，抗His單克隆抗體(Novagen，USA)為一抗，HRP偶聯的羊抗小鼠IgG為二抗，TMB顯色。(具體參照Current protocol in immunology unit8.10)。結果如圖6，結果表明ABL-1 scFv與ABL-1單克隆抗體識別hsBLyS的線性表位。
序列表110南京師範大學120人B淋巴細胞刺激因子單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區基因及其應用16042101211342212DNA213小鼠(Mus)4001gtgcaactgc aggagtcagg aggaggcttg gtacagcctg ggggttctct gagactctcc 60tgtgcaactt ctgggttcac cttcactgat tactacatga gctgggtccg ccagcctcca 120ggaaaggcac ttgagtggtt gggttttatt agaaacaaag ctaatggtta cacaacagag 180tacagtgcat ctgtgaaggg tcggttcacc atctccagag ataattccca aagcatcctc 240tatcttcaaa tgaacaccct gagagctgag gacagtgcca cttattactg tgcaagagat 300atcacccttc tgggccaagg gaccacggtc accgtctcct ca 3422102211321212DNA213小鼠(Mus)4002gacattgagc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccgta cacgttcgga 300ggggggacca agctcgag 3182103211114212PRT213小鼠(Mus)4003Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp20 25 30Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu35 40 45Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu50 55 60Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn65 70 75Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu80 85 90Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ile Thr Leu Leu Gly95 100 105Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110 1142104211106212PRT213小鼠(Mus)4004Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu1 5 10 15Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser20 25 30Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro35 40 45Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro50 55 60Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr65 70 75Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His80 85 90Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu95 100 10權利要求
1.一種人B淋巴細胞刺激因子單克隆抗體的重鏈可變區基因，其具有4001的序列。
2.由權利要求1的基因編碼的多肽，其具有4003的序列。
3.一種人B淋巴細胞刺激因子單克隆抗體的輕鏈可變區基因，其具有4002的序列。
4.由權利要求3的基因編碼的多肽，其具有4004的序列。
5.一種表達載體，其含有權利要求1的人B淋巴細胞刺激因子單克隆抗體的重鏈可變區基因及權利要求2的人B淋巴細胞刺激因子單克隆抗體的輕鏈可變區基因。
6.如權利要求5的表達載體，其為圖2所示的pET28a-scFv。
7.如權利要求5或6的表達載體所表達的多肽。
8.權利要求7所述的多肽在製備用於BLyS相關的自身免疫性疾病的檢測試劑中的應用。
9.權利要求7所述的多肽的生產方法是從BLyS單克隆細胞株分離出抗體的輕重鏈可變區基因，並組裝scFv，用組裝的scFv構建原核表達載體，轉化大腸桿菌，構建基因工程菌，並誘導表達，對表達產物進行分離、純化和復性。
10.如權利要求9所述的多肽的生產方法，具體是從BLyS單克隆細胞株ABL-1分離抗體的可變區基因收集生長良好，能分泌BLyS單克隆抗體的雜交瘤細胞株ABL-1，用TRIZOL試劑提取總RNA，設計兼併引物，VH採用引物VH Back(5』-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3』)和引物VH For(5』-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3』)，VL基因採用引物VL back(5』-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3』)和引物VLFor(5』-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3』)按照Promega公司一步法RT-PCR試劑盒分別擴增VH和VL，分別採用RT-PCR方法，釣取抗體可變區VH和VL基因，分別克隆進入載體pMD18-T；VH，VL基因擴增產物的克隆引物設計如下VH P1(5』-ACCATGGAATTCCTGCAGGAGTCTGGTGGCTTG-3』)，含有EcoRI酶切位點，VH P2(5』-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTG-3』)，VL P1(5』-CAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGACATTGAGCTCAC-3』)，VL P2(5』-GTGGTGAAGCTTTCACTCGAGCTTGGTACCACCTC-3』)，含有HindIII酶切位點，採用Over-lap PCR，在VH和VL之間設計一段柔性linker(G4S)3，VH-linker-VL，克隆於高效原核表達載體pET28a；高效表達，純化，復性scFvpET28a-scFv轉化進入BL21(DE3)，IPTG誘導表達，收集包含體沉澱，尿素溶解，Ni2+-IDA His-bind親和層析純化蛋白，稀釋法和透析法對目的蛋白復性，純化的蛋白稀釋到復性緩衝液I50mM Tris-HCl、0.15mM NaCl、2M urea、0.5Mm還原型穀胱甘肽、0.1mM氧化型穀胱甘肽、pH8.0，終濃度為100μg/ml，復性24h，然後將蛋白裝入復性緩衝液II50mmol/L Tris-HCl、0.15mol/LNaCl、pH8.0，透析復性12h，超濾管Centricon 30濃縮蛋白，13％SDS-PAGE檢測，蛋白-20℃保存。
全文摘要
本發明涉及人B淋巴細胞刺激因子單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區基因，由所述基因編碼的多肽，含有所述基因的載體及所述的基因和多肽在製備BLyS相關的自身免疫性疾病的臨床檢測試劑中的應用，以及其製備方法。所述的重鏈可變區基因全長為342bp，其核苷酸序列如1所示，其編碼的胺基酸序列如3所示；所述的輕鏈可變區基因全長為321bp，其核苷酸序列如2所示，其編碼的胺基酸序列如4所示。利用基因工程表達產生的蛋白質保留了與抗體結合的能力，且scFv分子小，容易通過基因工程技術的改造，與一些其他效應分子結合，為構建生物飛彈打下基礎；還大大降低成本了，利於工業化生產。
文檔編號C12N15/63GK1654654SQ20051003767
公開日2005年8月17日 申請日期2005年1月11日 優先權日2005年1月11日
發明者張雙全, 曹鵬 申請人:南京師範大學