十二烷基哌嗪和十二烷基二乙醇胺以及它們的衍生物在體外淨化骨髓中的應用的製作方法

2023-11-11 20:51:02 2

專利名稱：十二烷基哌嗪和十二烷基二乙醇胺以及它們的衍生物在體外淨化骨髓中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及十二烷基哌嗪和十二烷基二乙醇胺以及它們的衍生物在體外淨化骨髓中的應用。
白血病佔青少年惡性腫瘤首位，化療的緩解率可達70％，但五年生存率僅10％左右。緩解病人如果病情復發就導致死亡。近二十年來骨髓移植已成為治療急性白血病的新方法，化療緩解病人進行骨髓移植可以降低復發率，五年無病存活可達50％。骨髓移植分異體骨髓移植和自體骨髓移植。我國近二十年來也先後開展了異體骨髓移植和自體骨髓移植。在同胞兄弟姐妹中骨髓供體與受體配型合格的機率為四分之一；而在正常人群中，合格的機率僅有1-5人/10萬。由於我國實行獨生子女政策，致使異體供髓來源受到制約，限制了急性白血病病人做異體骨髓移植的可行性。自體骨髓移植雖不受供髓來源的制約，但存在無法避免的嚴重缺陷，即緩解期病人骨髓中殘留白血病細胞可引起復發。因此採取體外骨髓淨化手段清除骨髓中殘留的白血病細胞(RLC)，保留正常造血幹細胞，是消除自體骨髓移植後急性白血病復發的關鍵。在自體骨髓移植的病例中，淨化組比不淨化組長期生存率提高20％左右。最近Brenner等(Brenner MK，Rill DK，Moen RC等人，Gene-marking to trace origin ofrelapse after autologous bone marrow transplantation，Lancet，1993，34185-86)用分子生物學的方法證明，殘存於骨髓中的腫瘤細胞可導致或有助於骨髓移植後白血病的復發，這一發現更加驗證了在自體骨髓移植中骨髓淨化的重要性。
目前淨化的方法有多種，包括藥物法、免疫單克隆抗體淨化法和細胞因子淨化法等。國外報導的骨髓淨化藥物有10餘種，其中4-HC、ASTA-Z用於AML移植患者骨髓淨化已取得了一定的效果。經淨化的骨髓移植後復發率為21％～38％，長期無病生存率為61％～76％；而未經淨化的骨髓移植後復發率為49％～67％，長期無病生存率為26％～44％。其它藥物的研究僅限於體外實驗階段。免疫學淨化方法是採用單抗加補體或免疫毒素法，其現有的抗體都是針對腫瘤相關抗原的抗體，但由於急性白血病細胞有不同類型，同一類型又有不同的分化階段，特別是急性粒細胞白血病細胞表面標記多與正常造血幹細胞某一分化階段交叉，目前還沒有發現針對急性白血病細胞的特異性抗原。相比較而言藥物淨化法價格低廉，方法簡便，適於臨床上推廣應用。
關於親溶酶體劑的藥物淨化骨髓研究，國外由法國學者Douay和Gorin於1982年率先報導(Douay L.等人，In vitro treatment Leukemia bone marrowfor autologous transplantation，Exp.Hematol，l982，10(suppl.12)113)，十二烷基嗎啉(NDM)對人的白血病祖細胞(CFU-L)的殺滅作用遠遠高於對正常造血祖細胞的損傷，其選擇性甚至優於環磷醯胺的衍生物4-HC。NDM是一種具有鹼性pK值和較長疏水鏈的胺類化合物，經細胞吞飲作用可進入細胞內並聚集在溶酶體內，待達到一定濃度時可使溶酶體膜破裂，釋放水解酶，導致細胞溶解和死亡。但如1988年Lopez等人報告(Lopez M.等人，Lack of differential sensitivity of normal hematopoieticstem cells and murine lymphoblastic leukemic cells to a lysosomotropic agent，N-dodecylmorpheline，Leukemia，1988，2697)，用NDM淨化L1210細胞做動物回輸實驗的結果並不理想，故此類藥物至今仍未應用於臨床。
AML細胞含有較豐富的溶酶體，細胞的吞飲作用也較強。正常骨髓細胞沒有溶酶體或溶酶體功能不健全。針對親溶酶體劑是否可作為骨髓淨化劑用於臨床，本申請的發明人從1985年起首先在國內獨家開展親溶酶體劑體外淨化骨髓的研究。先期研究結果顯示十二烷基嗎啉對富含溶酶體的小鼠白血病細胞L7811和急性髓系白血病M3和M5在體外均有特異性的殺滅作用，若聯合42℃加溫，其殺滅AML細胞的效果更佳，但動物模擬人骨髓移植實驗的效果不佳，與Lopez等報告的(同上)相一致。
本申請的發明人發現十二烷基嗎啉雖然對富含溶酶體的白血病細胞有特異性的殺滅作用，但需用酒精配製，在大劑量骨髓淨化時，隨著十二烷基嗎啉劑量的增加，酒精用量也隨之增加。而酒精是一種表面活性劑，它可以破壞細胞膜和殺害細胞；同時發現化合物分子通過細胞膜進入溶酶體，在溶酶體的酸性環境中質子化並堆積，這一過程可能既與分子的酸鹼平衡常數(pK)有關，又與分子的親脂親水性即油水分配係數(LogP)有關。
因此，本發明的目的是提供十二烷基哌嗪衍生物和十二烷基二乙醇胺在體外淨化骨髓中的應用，其消除了酒精對正常細胞的非特異性影響，簡化淨化時聯合42℃加溫，避免十二烷基嗎啉親水性較差、在細胞懸液中形成油滴影響藥物作用等缺陷，同時提高了親溶酶體劑的選擇性，保護正常造血幹細胞不受損害。
根據本發明，提供以下式之十二烷基哌嗪和十二烷基二乙醇胺以及它們的衍生物在體外淨化骨髓中的應用 其中，R為H、C1-12烷基、C1-4烷氧基、琥珀醯基、賴氨醯基、咪唑基、二(C1-4烷基醇)氨基、嗎啉基， 其中，X為-CH2OH或者-CH2Y，而Y為其他親水性基團，例如羧基、取代或未取代的氨基。
C1-12烷基中優選甲基、乙基、丙基、丁基和辛基。C1-4烷氧基優選為乙氧基，而二(C1-4烷基醇)氨基優選為二乙醇氨基。
本專利申請的發明人根據急性粒細胞白血病細胞吞飲能力強，溶酶體豐富和pH低以及親溶酶體劑的作用特點，並在現有技術的基礎上，保留親溶酶體必需的結構部分即長的脂肪烴鏈和叔胺結構，從增加分子的親水性和親脂性兩方面著手，對某些基團進行修改，設計合成了十二烷基哌嗪衍生物以及十二烷基二乙醇胺，並且發現它們可提高親溶酶體劑的選擇性，保護正常造血幹細胞不受損害。
發明人首先對十二烷基哌嗪和十二烷基二乙醇胺以及它們的衍生物的合成技術及構效關係的研究。通過對比烷基、芳基以及雜環不同取代的胺基比較，我們選擇出烷基哌嗪作為先導化合物，合成三個先導化合物，即、N，N′-雙十二烷基哌嗪(IHW1)、N-十二烷基哌嗪(IHW3)、和十二烷基二乙醇胺(IHW2)。繼而合成12個系列衍生物，具體的取代基見表1所示。
然後測定各化合物的IC50，並計算油水分配係數LogP，進行定量構效關係分析，結果總結於表1。每個化合物的細胞毒性由它們對L1210細胞的半數抑制率(IC50)來表示，並計算出油水分配係數LogP。構效關係分析表明此類化合物疏水性與生物活性有密切關係，即增加分子脂溶性導致殺腫瘤細胞活性降低，增加水溶性則活性增加。增加pH值會增加活性；降低pH值則減低活性。經Hansch法分析計算，得出方程1和方程2對於哌嗪衍生物方程1log 1/IC50＝3.09+1.18Pi-0.15(Pi)2n＝8r＝0.8s＝0.283(Pi)0＝3.9
對於十二烷基二乙醇胺衍生物方程2log 1/C＝1.354(0.781)+1.215(0.213)log P-0.089(0.013)(logP)2n＝12r＝0.959s＝0.23F＝46.75logP0＝6.82方程1是表1所列1～8號化合物，均為哌嗪衍生物，方程2是在方程1的基礎上擴增所得的。
表1親溶酶體劑的理化參數
以下將參考實施例更為詳細地說明本發明。
應用實驗動物模擬人骨髓移植，了解白血病骨髓的淨化意義和淨化藥物對白血病細胞殺傷作用以及對正常造血幹細胞的保護作用，是評價骨髓淨化劑不可缺少的依據。用藥物淨化骨髓的效果應以白血病祖細胞(CFU-L)和骨髓幹細胞(CFU-GM)培養的回收率作為主要的衡量指標。當CFU-L為零，CFU-GM保留5％以上，骨髓移植即可取得成功。
與已知的十二烷基嗎啉比較，IHW1增加油水分配係數LogP，IHW2降低LogP，IHW3降低LogP同時增加pKa。對這三個先導化合物進行體外殺L7811白血病實驗結果表明，不聯合42℃加溫，在37℃和一定藥量作用30分鐘即可殺滅幾乎全部L7811小鼠白血病細胞。100％殺滅L7811的最小濃度分別為十二烷基嗎啉15μg/ml，IHW1＞25μg/ml，IHW2＞10μg/ml，IHW3＞5μg/ml。IHW3由於分子中引入了親水基團，親水性強，易於進入細胞內，增加水溶性又增加鹼性，故作用最強；IHW3殺滅細胞的作用雖比IHW2強約1倍，但是可供選擇的用藥劑量範圍較小(42μg/l×107細胞)，這使其在應用上受到一定限制。IHW2細胞毒作用強，體內毒性低，對小鼠半數致死量LD50約80mg/kg，此劑量遠遠超過淨化所用劑量。將最大淨化劑量30μg鼠，直接從尾靜脈注射給3隻615小鼠，無任何毒性反應，小鼠長期存活大於40天，可作為骨髓淨化安全有效藥物(見表2和表3)。與IHW2和IHW3相比，IHW1的親脂性比十二烷基嗎啉強，體外幾乎沒有細胞毒作用。
表2IHW2對CFU-AML和正常CFU-GM的殺傷作用
表3IHW3對CFU-AML和正常CFU-GM的殺傷作用
我們還發現，小劑量IHW2對正常615小鼠骨髓CFU-GM集落生長沒有影響，說明IHW2對正常造血幹細胞有一定的保護作用(表4)。另外，在骨髓移植時觀察到輸注用IHW2淨化處理的白血病骨髓，結果淨化組絕大多數小鼠沒有因造血功能衰竭死於放射病，而且大劑量淨化組有30％小鼠獲得長生存(＞60天)，說明用IHW2淨化後，對正常造血幹細胞的損傷較輕，移植後小鼠有恢復造血能力(表4)。
表4IHW2對L7811及CFU-GM的影響
實施例3IHW2對混在骨髓中微量白血病細胞的淨化作用將L7811白血病細胞和正常小鼠骨髓細胞按1∶400的比例混合，製成4×109/L白血病骨髓細胞懸液，分成4組1組為對照，不加藥物；其餘3組分別加入6.8mg/L、10.25mg/L、20.49mg/L的IHW2進行淨化處理，然後腹腔接種於正常615小鼠，每組6隻，觀察36天以上。結果發現淨化組小鼠可長期存活，說明IHW2對白血病骨髓具有較強的淨化作用(見表5)。
表5IHW2淨化白血病骨髓的作用
實施例4IHW2淨化小鼠白血病骨髓的骨髓移植實驗1、材料和方法1.1淨化劑IHW2配成13.66g/L的溶液，於4℃冰箱中保存，用時稀釋。1.2瘤株小鼠腹水型可移植性淋巴細胞白血病L7811，為本單位所建細胞系。腹水中白血病細胞佔98％，接種成功率100％。1.3 動物近交系615小鼠，體重20～25g，雌性。由本所動物室及中國醫學科學院動物中心提供。1.4 照射加拿大Gammacell40機，放射源為137Se，615小鼠致死照射劑量為8Gy，劑量率為0.0195Gy/s。2、方法2.1 IHW2淨化方法取帶蓋無菌試管，加入1×107/ml細胞懸液，然後加入IHW2，對照管中不加藥物。混勻後放在37℃水浴中孵育30分鐘，每10分鐘搖動1次。30分鐘後取出試管，立即放在冰水中停止藥物反應。用RPMI1640液洗滌2次後細胞懸液恢復為原體積(1ml)。做細胞計數，臺盼藍拒染測定和白血症祖細胞(CFU-L，AML骨髓)或幹細胞粒—單祖細胞(CFU-GM，正常骨髓)培養。CFU-L培養體系每毫升中含2×105細胞，20％馬血清，15％PHA-p條件刺激液，0.3％瓊脂。CFU-GM培養體系每毫升中含2×105細胞，20％馬血清，10％AB血清，15％胎肌浸液，0.3％瓊脂。每個樣品同時用3個平皿(平皿直徑為35mm)，每個平皿中放入1ml培養體系。然後放在37℃含5％CO2的溼空氣中培養7天(CFU-L)和10天(CFU-GM)。用倒置顯微鏡記數集落數。與對照樣品比較，算出回收百分率。2.2骨髓移植淨化試驗將致死量照射的小鼠隨機分成6組，每組7隻I組小鼠照射後不做任何處理，為放射病對照組II組由尾靜脈回輸1×107/只正常細胞，使小鼠造血功能恢復，為正常骨髓對照組；III組回輸白血病骨髓，白血病細胞與骨髓細胞的比例是1∶1000，為白血病對照組；IV、V、VI組分別回輸不同劑量的IHW2淨化處理的白血病骨髓，藥物劑量分別為2μg/萬MNC，2.5μg/萬MNC，3μg/萬MNC為淨化組，(處理方法同上)。然後觀察小鼠的生存時間及死亡原因，死後進行大體解剖及心、肝、脾、肺及腎的病理切片檢查。結果見表6。
表6小鼠白血病骨髓淨化移植試驗
***P＜0.01從表6可以看出，淨化組小鼠的平均生存時間分別為13.70±3.50天(IV)、19.36±7.80天(V)、25.93±23.59天(VI)，均比不淨化的對照組(10.1±0.61天)明顯延長，說明移植的骨髓具有明顯的淨化效果。淨化組絕大多數小鼠沒有因造血功能衰竭死於放射病，而且大劑量淨化組(VI)有30％小鼠獲得長生存(＞60天)，說明用IHW2淨化後，對正常造血幹細胞的損傷較輕，移植後小鼠有恢復造血能力。
3.2單個核細胞分離將採集的骨髓每100ml置於預先裝有80ml淋巴細胞分離液的無菌空血袋的液面上，在4℃大容量離心機中以1500r/min的速度離心18分鐘，棄上清，收集單核細胞(NMC)層，將所收集的NMC匯集後用TC199細胞培養液洗滌兩次，其1/3，約相當於1×108/kg個有核細胞的量用於淨化處理。
3.3藥物來源實施例2中合成的十二烷基二乙醇胺(IHW2)，為無色透明水溶性藥物。
3.4淨化方法將用於淨化的骨髓單核細胞(MNC)盛入無菌塑料空袋中，用含10％人AB血清的TC199液稀釋成1×107/ml的細胞濃度，然後加入IHW2，濃度為20μg/ml。將血袋放入37℃水浴中孵育30分鐘，每10分鐘搖動混勻1次，孵育結束後再將袋子放入冰水5分鐘終止藥物反應。取出袋子，加入TC199液洗滌兩次，再用TC199液將細胞稀釋至100ml左右，使細胞濃度不超過5×107/ml。冷凍前取細胞做細胞計數、臺盼藍拒染率和CFU-GM、CFU-L測定。
3.5冷凍保存及回輸將保底及淨化後的MNC分別盛於低溫冷凍袋(上海血液中心製造，100ml)中，再與配製好的預冷於4℃的防凍液按1∶1比例緩慢混勻(防凍液的成分為20％DMSO，10％AB血清，70％TC199)，放入Cryo Med程控降低溫機中按1℃/min的速度降溫到-40℃，再以10℃/min的速度降溫到-80℃。取出裝有淨化後骨髓的袋子投入到液氮中保存。回輸時將骨髓放入42℃水浴中在1分鐘內快速融化，立即全速回輸。並留樣品做細胞計數及CFU-GM測定。
3.6 臨床淨化療效至2000年底，1例於移植後24天因並發急性呼吸窘迫綜合症(ARDS)死亡，2例於移植後3、17個月復發，2例無病生存分別為80和82個月。
權利要求
1.下式之十二烷基哌嗪衍生物在體外淨化骨髓中的應用 其中，R為H、C1-12烷基、C1-4烷氧基、琥珀醯基、賴氨醯基、咪唑基、二(C1-4烷基醇)氨基、嗎啉基。
2.如權利要求1所述的應用，其中R為甲基、乙基、丙基、丁基、辛基、乙氧基、二乙醇氨基。
3.下式之十二烷基二乙醇胺及其衍生物在體外淨化骨髓中的應用 其中，X為-CH2OH或者-CH2Y，而Y為親水性基團。
4.如權利要求3所述的應用，其中Y為羧基、取代或未取代的氨基。
全文摘要
本發明涉及十二烷基哌嗪和十二烷基二乙醇胺以及它們的衍生物在體外淨化骨髓中的應用,其提高了親溶酶體劑的選擇性,保護正常造血幹細胞不受損害。
文檔編號A61K31/133GK1374084SQ01109460
公開日2002年10月16日 申請日期2001年3月12日 優先權日2001年3月12日
發明者楊純正, 王軍, 劉健, 彭暉, 張廣宇, 朱惠芳, 薑蓉, 卓家才, 韓明哲 申請人:中國醫學科學院血液學研究所