分泌抗蘋果莖溝病毒單抗的雜交瘤細胞株、其分泌的抗體、其應用和由該單抗製備的試劑盒的製作方法
2023-11-05 06:20:52
分泌抗蘋果莖溝病毒單抗的雜交瘤細胞株、其分泌的抗體、其應用和由該單抗製備的試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種分泌抗蘋果莖溝病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其單抗的應用。本發明提供一種ASGV病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏名稱為：雜交瘤細胞株ASGV，保藏號為CCTCC NO:C201485。本發明的有益效果是：1)提供的雜交瘤細胞株ASGV分泌抗蘋果莖溝病毒特異性單克隆抗體，以該單克隆抗體為核心建立的TAS-ELISA和dot-ELISA等免疫學方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準確、靈敏的檢測蘋果莖溝病毒；2)利用本發明所製備的單克隆抗體檢測蘋果莖溝病毒，不需要昂貴的儀器及試劑；3)利用本發明所製備的單克隆抗體，可以有效地用於進口苗木及田間蘋果、梨等蘋果莖溝病毒寄主中蘋果莖溝病毒的檢測。
CCTCC NO:C201485
2014.04.26
【專利說明】分泌抗蘋果莖溝病毒單抗的雜交瘤細胞株、其分泌的抗體、 其應用和由該單抗製備的試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種單克隆抗體、分泌該抗體的細胞株及其應用。具體涉及一種可中 和ASGV病毒各種基因型的廣譜性單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的細胞株及該單克隆抗 體的用途。
【背景技術】
[0002] 蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus, ASGV)是一種重要的潛隱病毒，在 果樹體內病毒濃度很低，且一般不產生明顯症狀，常給果樹生產帶來嚴重經濟損失。該病 在世界各地普遍流行。蘋果莖溝病毒在蘋果樹上通常引起慢性衰退症，嚴重可減產45%? 73%，果實品質下降。當用感病材料嫁接時，往往導致急性衰退症，對生產造成毀滅性損 失；在梨樹上潛隱感染比較普遍，當砧木不耐病時，引起梨嚴重衰退。蘋果莖溝病毒可隨苗 木、接穗、砧木等無性繁殖材料嫁接傳播，可經種子傳播給昆諾藜及百合。能危害蘋果、梨、 杏、李、柑橘、稱猴桃、搜桃、百合等多種作物。
[0003] 由於該病毒危害嚴重，傳播方式多樣，寄主廣泛，因此目前仍為我國進境植物產品 禁止攜帶的有害生物之一，而該病毒的特性為潛隱病毒，在植物體內濃度極低，因此開發特 異性好，靈敏度高的檢測及富集方法對於該病毒的防控具有重要意義。
[0004] 目前，用於檢測蘋果莖溝病毒的方法有ELISA、IC-PCR、RT-PCR、IC/RT - PCR和TC/ RT - PCR等。其中ELISA方法通量大，成本低，但所用抗體為多抗，特異性較差，假陰性情 況較多，而基於PCR的檢測方法前處理要求高，成本也較高，特別是不適用於大量樣品的篩 選。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供ASGV病毒單克隆抗 體、雜交瘤細胞株及應用。為此，本發明的解決方案是：
[0006] 提供一種ASGV病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株保藏於中國典型 培養物保藏中心，保藏名稱為：雜交瘤細胞株ASGV，保藏號為CCTCC N0:C201485。保藏日期 為2014年4月26日，經檢測為存活。（中國典型培養物保藏中心地址：中國.武漢.武漢 大學，郵編：430072)。
[0007] 抗蘋果莖溝病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價達10'抗體類型及亞類為 IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與目前報導的常見蘋果莖溝病毒8個基因型（P-209分離 於日本蘋果，登錄號D14995;L分離於日本百合，登錄號D16681;Li-23分離於日本百合， 登錄號AB004063 ;Kumquatl分離於中國臺灣的金錢橘，登錄號AY646511 ;ASGV-K分離於 韓國的梨樹，登錄號AY596172 ;UV01分離於巴西蘋果，登錄號AF438409 ;Kiwifruit分離 於中國山西省的獼猴桃，登錄號AF522459;KRL-1分離於中國新疆的庫爾勒香梨，登錄號 AY886760)的外殼蛋白亞基有特異性免疫結合反應。
[0008] 蘋果莖溝病毒不同分離物核苷酸序列之間存在較大差異，尤其是0RF1編碼的靠 近CP區的284個胺基酸，序列變異更大，稱為可變區（V-region)，而該病毒MP基因與CP基 因相對保守，且CP基因的保守性更強。因此利用CP基因所編碼的蛋白進行動物免疫並制 備單克隆抗體可以廣譜性、特異性地檢測各種基因型的ASGV病毒。
[0009] 本發明的試劑盒、試劑或藥劑中，ASGV病毒CP選自已經報導ASGV 8個分離物中 的Kiwifruit (分離於中國山西省的稱猴桃，登錄號AF522459)的序列，該序列所表達的CP 蛋白所製備的抗原最終免疫小鼠獲得的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體能同時與常見的8 個基因型CP蛋白結合，具有良好的包容性。
[0010] 本發明的有益效果是：1)提供的雜交瘤細胞株ASGV分泌抗蘋果莖溝病毒特異性 單克隆抗體，以該單克隆抗體為核心建立的TAS-ELISA和dot-ELISA等免疫學方法及用這 些方法建立的試劑盒能高度特異、準確、靈敏的檢測蘋果莖溝病毒；2)利用本發明所製備 的單克隆抗體檢測蘋果莖溝病毒，不需要昂貴的儀器及試劑；3)利用本發明所製備的單克 隆抗體，可以有效地用於進口苗木及田間蘋果、梨等蘋果莖溝病毒寄主中蘋果莖溝病毒的 檢測。本發明提供的雜交瘤細胞株ASGV能大量分泌蘋果莖溝病毒單抗，且其分泌的單抗特 異性強、效價高、穩定性好。以該單抗為核心建立了檢測蘋果莖溝病毒的高通量的血清學方 法及其試劑盒，可成功應用於進境植物材料及田間的檢測，從而為預防蘋果莖溝病毒隨苗 木傳入我國及我國蘋果莖溝病毒早期監測和預警，科學指導防控提供物質和技術支持。
【具體實施方式】
[0011] 分泌抗病多莖溝病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株ASGV於2014年4月26日保藏 於中國典型培養物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，簡稱 CCTCC) (湖北省武漢市武昌珞珈山，武漢大學，保藏中心），保藏號為CCTCC No :C201485,它能分泌 抗蘋果莖溝病毒的單克隆抗體。
[0012] 抗蘋果莖溝病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價均達ΚΓ7,抗體類型及亞類均 為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與蘋果莖溝病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結合反 應。
[0013] 抗蘋果莖溝病毒的單克隆抗體僅與蘋果莖溝病毒有特異性免疫反應，而與蘋果 花葉病毒（Apple Mosaic Virus，ApMV)、蘋果鎊果類病毒（Apple Scar Skin Viroid， ASSVd)、蘋果綠皺果病毒（Apple Green CrinkleVirus，AgrCV)、蘋果褪綠葉斑病毒（Apple Chlomtie Leafspot Virus，ACLSV)、蘋果莖痘病毒（Apple Stem Pitting Virus，ASPV)均 不發生免疫反應。
[0014] 抗蘋果莖溝病毒單克隆抗體在該病毒檢測上的應用是以單克隆抗體為核心建立 的各種免疫學檢測方法和免疫學試劑盒。
[0015] 一、雜交瘤細胞獲得及其單克隆抗體的製備
[0016] 1.免疫原及檢測抗原的製備
[0017] 根據已報導的蘋果莖溝病毒編碼外殼蛋白基因序列（登錄號：AF522459)設計 一對特異引物：CPUP (5 ' - GGATCC ATGAGITTGGAAGACGTGCT-3 '，斜體部分為 BamH I 酶切位點和 CPNP (5 ' - GGATCC CTAACCCTCCAGTTCCAAGT-3 \ 斜體部分為 BamH I 酶 切位點），並由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。利用Trizol法提取蘋果病樣的總 RNA，以總RNA為模板，進行反轉錄，37 °C，15min逆轉錄反應後，98 °C 5min滅活酶後將 cDNA保存於4°C或者_20°C待用。以cDNA為模板進行PCR反應，即上述反轉錄的cDNA 模板 1μ l，5XPrimeSTARTM Buffer (含 Mg2+)10y 1，dNTP Mix 4μ 1，PrimeSTARTM DNA Polymerase(2. 5υ/μ L)0. 5μ 1，上下遊引物各1 μ 1，最後加無菌雙蒸水補足反應終體積 為50μ1。PCR反應參數如下：預變性94Κ，8π?η;變性溫度，94%，lmin;退火溫度， 48-52冗，lmin ;延伸溫度72 9C，lmin ;30個循環後，72 9C，延伸，最後72°C延伸8min。 擴增產物於〇. 8 %瓊脂糖凝膠進行電泳分析，並用PCR凝膠回收試劑盒（AxyGEN)回收DNA 片段，具體操作參照產品試劑盒說明書進行。將純化的PCR產物末端加 A並與克隆載體 PMD-19T simple vector連接，重組質粒命名為pMD19-T-CP，並轉化到大腸桿菌DH 5α的 感受態細胞中，用質粒提取試劑盒（TianGen)提取重組質粒，對提取的重組質粒進彳TPCR和 雙酶切鑑定，並通過測序驗證重組克隆載體PMD19-T-CP中所攜帶的CP基因序列及讀碼框 的正確性，序列分析軟體為DNAstar、NCBI-BLAST，所用的資料庫為GeneBank等。重組質粒 PMD19-T-CP中CP基因片段經BamH I酶切後定向插入經同樣酶切的pET-30a表達載體中。 PCR、酶切篩選陽性克隆，並通過測序驗證重組原核表達載體pET-30a-CP中所攜帶CP基因 序列未突變且讀碼框正確。並把原核表達質粒pET-30a-CP 42°C熱擊轉化入大腸桿菌表達 菌株BL-21 (DE3)中，挑取單菌落接種到含氨苄青黴素的LB液體培養基，37°C培養過夜，按1 :100的比例將培養物接種於含氨苄青黴素的新鮮LB培養基中，振蕩培養至0D600?0. 5， 加入終濃度為ImM IPTG誘導表達4h，離心收集菌體。部分菌體加入1 X SDS-PAGE上樣緩 衝液懸浮，沸水中變性5-10min，12000rpm離心後取上清10 μ 1進行12. 5% SDS-PAGE電泳 分析，其餘菌體經超聲波破碎，收集上清按照產品說明書進行用Ni2+-NTA親和層析柱純化 目的蛋白。SDS-PAGE電泳發現純化到了大小為27kD的重組蛋白條帶，純度達到90%以上。 以純化的重組CP蛋白作為免疫原和檢測抗原。
[0018] 2.免疫動物
[0019] 用純化的ASGV CP蛋白免疫四周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠：純化的CP蛋 白以生理鹽水稀釋與等體積弗氏完全佐劑混合，充分乳化後，經背腹部皮下多點注射0. 2ml 每隻，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化後，第二次腹腔注 射0. 2ml每隻，過3周後用加倍劑量的抗原進行腹腔注射，3天後取脾細胞進行融合。
[0020] 3.細胞融合
[0021] 取上述免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞（SP2/0)按6 :1的比例，在無血清的 RPMI-1640 (Gibco)培養基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養基，用50% PEG (Sigma，分子 量1500)作為融合劑，在37°C下水浴下加入lml，使其融合2min，用無血清的RPMI-1640培 養基終止融合後1500rpm離心5min，沉澱用HAT培養基懸浮，分裝到96孔含有飼養細胞的 細胞板中，37°C，5% C02的細胞培養箱中培養。
[0022] 4.雜交瘤細胞、陽性孔的篩選及其克隆
[0023] 細胞培養箱中培養5天後，用HAT培養基換液一次，第10天用HT培養基換液，等 到融合細胞覆蓋孔底10% -50%時，以ASGV CP重組蛋白和感病葉子汁液為檢測抗原包被 ELISA板，用常規間接ELISA方法篩選陽性孔，共獲100多個陽性孔。選擇7個呈強陽性反 應的細胞孔進行有限稀釋法克隆，獲得1株能分泌抗ASGV的特異性單抗的雜交瘤細胞株 ASGV。經6個月以上體外傳代和多次凍存復甦後，細胞株能良好生長，並穩定分泌抗體。經 擴大培養後，用於腹水製備和液氮保存。
[0024] 5.單克隆抗體的特異性檢測
[0025] 用感染蘋果花葉病毒（ApMV)、蘋果鏽果類病毒（ASSVd)、蘋果綠皺果病毒 (AgrCV)、蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV)、蘋果莖痘病毒（ASPV)的病葉汁包被ELISA板，以相 應的健葉提取液作陰性對照，以病毒分離於中國山西省的獼猴桃，登錄號AF522459病毒病 葉為陽性對照，用ACP-ELISA法測定單抗的特異性反應。ACP-ELISA方法具體為上述病毒 感染的病葉用液氮研磨成粉末，按l:30(w/v，g/mL)加入ELISA包被液研磨後100ul/孔包 被ELISA板，4°C過夜或37°C 2小時，使其吸附於聚苯乙烯ELISA板孔；PBST洗滌三次後用 3%的脫脂奶粉或1%BSA或4%牛血清封閉30-60min ;加入單抗lOOul/孔，37°C 1-2小時； PBST洗滌三次後加入稀釋10000倍的鹼性磷酸脂酶（AP)標記兔抗鼠 IgG二抗（Sigma公 司）100ul/孔，37°C 1-2小時，PBST洗滌四次後，用PNPP底物顯色，2mol/L氫氧化鈉終止反 應後，用酶標儀讀取0D405的值，以與陰性0D值比值大於2. 1為陽性。結果發現，ASGV單 抗對ASGV有特異性反應，而與染蘋果花葉病毒（ApMV)、蘋果鏽果類病毒（ASSVd)、蘋果綠皺 果病毒（AgrCV)、蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV)、蘋果莖痘病毒（ASPV)均無免疫反應。
[0026] 6.單克隆抗體腹水製備及純化
[0027] 取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0. 3-0. 5ml降植烷（Sigma)，7-10天後腹腔 注入6-10 X 105個雜交瘤細胞，注射後7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，採取腹水，3000rpm 離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取1倍體積腹水加2倍體積0. 06M pH4. 8 醋酸緩衝液稀釋，加辛酸（30ul/ml腹水），室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清1小時，12000rpm 離心20min，收集上清，再用50 %飽和硫酸銨沉澱免疫球蛋白，4°C放置2小時，3000rpm離 心20min，沉澱用2倍體積的PBS溶液溶解，在4°C流動透析24小時後即獲純化的腹水抗 體，-70°C保存。
[0028] 7.單克隆抗體的類型和亞類鑑定及其腹水效價測定
[0029] 將純化的單抗腹水與Sigma公司的標準抗BALB/C小鼠 IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、 IgM抗體作雙向瓊脂擴散試驗，結果發現上述單抗的抗體類型和亞類為IgGl、kappa鏈。用 間接ELISA方法檢測單抗腹水效價，結果為上述單抗腹水效價達到10'
[0030] 二、病毒免疫學檢測方法及其試劑盒
[0031] 1.檢測ASGV的TAS-ELISA檢測方法
[0032] 1. 1. TAS-ELISA方法的操作流程：
[0033] 1)抗ASGV的兔抗血清1:4000倍稀釋後（原核表達的ASGV CP重組蛋白免疫兔子 獲得）100ul/孔包被聚苯乙烯板，37°C，2-4h或4°C，過夜；
[0034] 2) PBST洗滌三次後加1-10 %的脫脂奶粉或1-3% BSA或3-6 %牛血清封閉200ul/ 孔於 37°C 封閉 30-60min ;
[0035] 3)加入檢測樣品lOOul/孔。以感染蘋果莖溝病毒（病毒為分離於中國山西省的 獼猴桃的毒株，CP蛋白基因登錄號AF522459)病葉為陽性對照，以相應的健康樣品為作陰 性對照，37°C l_2h ;
[0036] 4)洗滌後用封閉液稀釋5000倍的單抗腹水100ul/孔，37°C l_2h。
[0037] 5) PBST洗滌後加入10000倍稀釋的AP標記兔抗鼠 IgG二抗（Sigma) 100ul/孔， 37。。 l-2h。
[0038] 6) PBST洗滌後加 PNPP底物於室溫顯色5_30min，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色的 孔為陽性，2mol/L氫氧化鈉終止反應後，用680型酶聯免疫檢測儀測405nm的0D值，以P/ N>2. 1作為陽性判斷標準。
[0039] 1. 2. TAS-ELISA檢測方法最適條件的確定：
[0040] 採用TAS-ELISA方陣試驗進行，即橫向分別加用包被緩衝液從1 : 100至1 : 100000倍比稀釋的兔抗ASGV血清；加入ASGV病葉汁；縱向分別加用封閉液從1 : 5至1 :2000000倍比稀釋單抗腹水；AP標記的兔抗鼠 IgG二抗（Sigma公司產品）1 : 10000倍 稀釋；按TAS-ELISA方法流程進行操作。結果為ASGV的兔抗血清及單抗的最適稀釋度分別 為1 : 5000、1 : 8000。
[0041] 1. 3. TAS-ELISA方法檢測靈敏度的確定
[0042] 在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將ASGV病葉汁用PBS倍比稀釋後進行 TAS-ELISA測定，結果表明TAS-ELISA檢測病葉達到1:6000倍稀釋（w/v，g/mL)，說明本方 法具有很好的靈敏度。
[0043] 2. dot-ELISA方法的建立及田間檢測應用
[0044] 2. 1 dot-ELISA方法的操作流程：
[0045] 將蘋果葉片稱重後用液氮研磨成粉末，按1:10?30(w/v, g/mL)加入0· Olmol/ LPBS(pH7. 4)後研磨；病汁液5000rpm離心3min ;取3μ 1上清點到硝酸纖維素膜（NC)上， 同時設置健康和感病蘋果葉汁分別作為陰性和陽性對照；室溫乾燥10?20min ;NC膜浸 入到含5%脫脂奶粉的PBST(含0· 05% Tween-20的0· 01mol/L PBS)封閉液中室溫封閉 30min ;NC膜放入適度稀釋的單抗中室溫孵育30?60min ;用PBST洗膜3?4次，每次3min ; NC膜放入適度稀釋的AP酶標記羊抗鼠 IgG二抗中室溫孵育30?60min ;PBST洗膜4?5 次，每次3min ;66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物（Promega)加入到10ml底物緩衝液（0· lmol/ L Tris C1、0. lmol/L NaCl、0. 025mol/L MgCl、pH9. 5)混勻，膜放入底物液中反應，肉眼觀察 結果。待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時自來水漂洗終止反應，拍照記錄結果。
[0046] 2. 2用方陣試驗確定檢測蘋果病葉的dot-ELISA單抗和酶標二抗的最適工作濃 度，試驗表明ASGV單抗及酶標二抗的最適工作濃度分別為1:5000和1:8000倍稀釋。以上 述抗體的最適工作濃度建立檢測ASGV的dot-ELISA方法。靈敏度分析表明，當蘋果葉片稀 釋到1:640倍（w/v，g/mL)時，以ASGV單抗建立的dot-ELISA檢測均呈現紫色的陽性斑點， 即其檢測病葉的靈敏度達到1:640倍稀釋。
[0047] 2. 3建立的dot-ELISA方法的樣品檢測應用
[0048] 用建立的dot-ELISA方法對2012、2013年採自山東及山東口岸進境植物材料等樣 品進行檢測，結果發現，50個植物檢測樣品中有2個樣品產生紫色的陽性斑點。陽性樣品進 一步用RT-PCR分析，結果表明所有的dot-ELISA陽性樣品均檢測到ASGV特異性的PCR產 物，PCR產物核酸測序表明陽性樣品感染ASGV。說明該dot-ELISA方法能準確、可靠地用於 果樹類樣品中蘋果莖溝病毒的檢測。
[0049] 3蘋果莖溝病毒dot-ELISA檢測試劑盒
[0050] 1)試劑盒主要成分：
[0051] ASGV單克隆抗體1管 0.2 ml AP標記羊抗鼠 IgG二抗1管 0.1ml NBT/BCIP底物各1瓶 分別為2 ml和1ml 陽性對照（含ASGV蘋果葉片汁液） 1管 2 ml 陰性對照（健康蘋果葉片汁液）1管 2 ml 抗體稀釋液（10X) 1瓶 80ml
[0052] 以上試劑均保存於4°C下
[0053] 硝酸纖維素膜（NC) 15張
[0054] 2)檢測蘋果樣品的操作步驟：
[0055] a.將蘋果葉片稱重後用液氮研磨成粉末，按1:10?30 (w/v, g/mL)加入0· Olmol/ L PBS(pH7.4)後研磨；
[0056] b.病汁液 5000rpm 離心 3min ;
[0057] c.取3 μ 1上清點到NC上，同時設置健康和感病蘋果葉汁分別作為陰性和陽性對 照，室溫乾燥10_20min ;
[0058] d. NC膜浸入到含 5%脫脂奶粉的 PBST (含 0· 05% Tween-20 的 0· 01mol/L PBS)封 閉液中室溫封閉30min ;
[0059] e. NC膜放入1:2000倍稀釋的單抗中室溫孵育30_60min ;
[0060] f.用PBST洗膜3?4次，每次3min ;NC膜放入1:3000稀釋的AP酶標記羊抗鼠 IgG二抗中室溫孵育30?60min ;
[0061] g. PBST洗膜4?5次，每次3min ;66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10ml底 物緩衝液（〇· lmol/L Tris C1、0. lmol/L NaCl、0. 025mol/L MgCl、pH9. 5)混勻，膜放入底物 液中反應，肉眼觀察結果；
[0062] h.待陽性對照顯色明顯（紫色），而陰性沒有任何顯色時自來水漂洗終止反應，拍 照記錄結果。
[0063] 3)保存及有效期於2?8°C避光保存，有效期12個月。
[0064] 4)緩衝液配方：
[0065] 磷酸鹽緩衝液（PBS，0. 01mol/L，ρΗ7· 4):
[0066] NaCI 8 g KCI 0.2g KH2P04 0 2g Na2HP0412H20 3g 疊氮化鈉 0.2g 。
[0067] 還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本發明不限於以上 實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯 想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
【權利要求】
1. 一種分泌抗蘋果莖溝病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特徵在於：該雜交瘤細 胞株保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏名稱為：雜交瘤細胞株ASGV，保藏號為CCTCC N0:C201485。
2. -種由權利要求1所述的雜交瘤細胞株ASGV分泌的抗蘋果莖溝病毒的單克隆抗體， 其特徵在於該抗體腹水間接ELISA效價達到ΚΓ 7,抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈。
3. -種如權利要求2所述的抗蘋果莖溝病毒單克隆抗體在蘋果莖溝病毒檢測上的應 用。
4. 一種檢測蘋果莖溝病毒的方法，其特徵在於採用間接ELISA進行蘋果莖溝病毒抗原 的檢測，其中使用了權利要求2所述的單克隆抗體。
5. -種檢測蘋果莖溝病毒的試劑盒，其特徵在於：試劑盒中包含權利要求2所述的單 克隆抗體。
【文檔編號】C12N5/20GK104232591SQ201410483664
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月19日 優先權日:2014年9月19日
【發明者】魏曉棠, 尼秀媚, 白樺, 朱妍妍, 齊振華 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心