用於治療阿爾茨海默病的化合物和方法

2023-11-04 18:08:22 4

專利名稱：用於治療阿爾茨海默病的化合物和方法
技術領域：
本發明屬於醫藥領域。更具體地，本發明涉及用於治療哺乳動物(諸如人)中的阿爾茨海默病的藥物和醫學治療。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer' s disease)是人類中痴呆的一種最常見的原因。其是一種與患有該病的個體的腦中的神經細胞變性相關的慢性致死性疾病，其特徵在於，存在由澱粉狀蛋白β肽(Αβ-肽)的胞外沉積物組成的澱粉狀蛋白斑。由Αβ聚集引起的神經細胞萎縮導致乙醯膽鹼和其它信號傳導物質的匱乏。已知A β -肽，具有40-42個胺基酸殘基，由澱粉狀蛋白前體蛋白(APP)的加工產生，所述澱粉狀蛋白前體蛋白(APP)是一種主要由中樞神經系統的神經元表達的膜蛋白，但是不完全了解關於這種加工的原因。釋放的Αβ肽包含APP跨膜區的一部分(Αβ殘基四-40/42)，並且包括不一致的螺旋，S卩，由具有形成β-鏈的高度傾向的胺基酸組成的螺旋。當離開其穩定的膜環境時，Αβ傾向於錯誤摺疊和聚集。目前用於治療阿爾茨海默病的治療方法主要是涉及治療症狀，並且包括膽鹼能替換治療，例如，抑制乙醯膽鹼酯酶，與可溶的Αβ低聚物相互作用的小抑制劑，和防止已經形成的β-摺疊結構延長的所謂的β-摺疊中斷劑(breaker)。另一種提議的防止聚集的策略已經利用功能上定義為蛋白伴侶的分子。蛋白伴侶通過在複雜的細胞內環境中輔助蛋白正確摺疊而起重要作用。多種分子伴侶，諸如熱激蛋白(Hsp)，已知在摺疊過程中是重要的，並且已被廣泛研究。這些蛋白伴侶中的一些顯然能夠與某些多肽的澱粉狀蛋白原纖維形成相互作用並且對某些多肽的澱粉狀蛋白原纖維形成有影響。聚集被Hsp90或Hsp70/Hsp40組合抑制(CG Evans等，J Biol Chem(生物化學雜誌)281 :33182-33191，2006)。此外，已經表明細胞外蛋白伴侶簇蛋白(脫脂載脂蛋白 J)抑制包括 Αβ (Ε Matsubara 等，Biochem J(生物化學雜誌)316 (Pt 2) :671-679, 1996)和朊病毒蛋白的片段(S McHattie和N Edington,Biochem Biophys Res Commun(生物化學生物物理學研究通訊)259:336-340，1999)的多種多肽的原纖維形成。結構多樣的蛋白伴侶在預防澱粉狀蛋白病中的作用並不確定，並且一些報導甚至表明蛋白伴侶促進澱粉狀蛋白原纖維形成，參見，例如，SK DebBurman等.Proc NatAcad Sci USA(美國國家科學院學報)94:13938-13943，1997。除了分子蛋白伴侶，在錯配疾病的情形中已經研究了化學和藥學蛋白伴侶的作用。目前，對於任何澱粉狀蛋白疾病尚未找到使用蛋白伴侶或其它方式的有效治療。針對A β肽的單克隆抗體防止聚集成神經毒性原纖維，並且溶解已經形成的澱粉狀蛋白。然而，抗體治療成本非常高，並且與不同嚴重性的副作用相關。在轉基因小鼠阿爾茨海默病模型中用澱粉狀蛋白接種已經表現出澱粉狀蛋白斑數目和整體澱粉狀蛋白負荷的顯著減少以及甚至一些認知表現的改善。發明概述本發明的一個目的是減少A β -肽向澱粉狀蛋白原纖維的聚集。
本發明還有一個目的是減少哺乳動物腦中由A β -肽的胞外沉積物組成的澱粉狀蛋白斑的形成。本發明的另一個目的是提供用於治療包括人的哺乳動物中的阿爾茨海默病的新治療選擇。對於這些和其它將通過下述描述變得清楚的目的，本發明提供一種分離的蛋白， 其選自由下列各項組成的組⑴包含與來自人(SEQ ID NO :2)，牛(SEQ ID NO :5)，恆河猴 (SEQ ID NO :6)，小鼠(SEQ ID NO :7)，水貂(SEQ ID NO :8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQ ID NO 10)的肺表面活性蛋白C前體(CTproSP-C)的C端結構域具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白；和( )包含與來自人(SEQ ID N0:4)，牛(SEQ ID N0:12)，恆河猴(SEQ ID N0:13)，小鼠(SEQ ID NO: 14)，水貂(SEQ ID NO: 15)，兔(SEQ ID NO 16)或大鼠(SEQ ID NO 17)的CTproSP-C的Brichos結構域具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白，所述蛋白用作藥物。已經令人驚訝地發現這種分離的蛋白具有減少澱粉狀蛋白原纖維形成和減少Αβ-肽聚集的能力。考慮到在關於CTproSP-C蛋白伴侶活性的內源性靶標(SP-C和 proSP-C)和與阿爾茨海默病相關的Αβ-肽之間的結構不同性，這是特別令人驚訝的。由於proSP-C基因僅在肺組織中表達，這也是高度令人驚訝的。本發明基於本文公開的關於先前未知的CTproSP-C的底物特異性的令人驚訝的研究。在一個實施方案中，所述分離的蛋白選自由包含下述胺基酸序列的蛋白組成的組，所述胺基酸序列具有(a)哺乳動物CTproSP-C Brichos結構域的所有保守殘基(SEQ ID N0:18)，且(bl)與來自人(SEQ ID N0:2)，牛(SEQ ID N0:5)，恆河猴(SEQ ID NO :6)， 小鼠(SEQ ID NO :7)，水貂(SEQ ID NO :8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQ ID NO 10)的 CTproSP-C 具有至少 70% 同一性；或(b2)與來自人(SEQ ID N0:4)，牛(SEQ ID N0:12)， 恆河猴(SEQ ID NO :13)，小鼠(SEQ ID NO :14)，水貂(SEQ ID NO :15)，兔(SEQ ID NO 16) 或大鼠(SEQ ID NO 17)的CTproSP-C的Brichos結構域具有至少70%同一性。換一種方式，本實施方案暗示，在相對應的位置，所述具有哺乳動物CTproSP-C Brichos結構域的所有保守殘基(SEQ ID NO 18)的分離蛋白包含人CTproSP-C (SEQ ID NO :4) Brichos結構域的所有下述保守殘基:Phe-l,Gly-4, Ser-5, Thr-6, Gly-7, Val-9, Asp-12, Tyr-13, Gln-14， Leu-16,Leu-17，Ala-19，Tyr-20,Lys-21,Pro-22,Ala-23,Pro-24,Gly-25,Thr-26,Cys-28, Tyr-29,Met-31,Lys-32,Ala-34,Pro-35,Ile-38,Pro-39,Ser-40,Leu-41,Glu-42,Ala-43, Arg-46,Lys-47，Gln-70，Gly-73,Gly-77,Ser-81,Phe-87,Leu-88,Gly-89,Val-92,Thr-94, Leu-95, Cys-96, Gly-97, Glu-98，Pro-100, Leu-101 和 Tyr-103。在一個實施方案中，所述分離的蛋白選自由包含下述胺基酸序列的蛋白組成的組所述胺基酸序列具有(a)哺乳動物CTproSP-C的所有保守殘基(SEQ ID N0:11)，和(b) 與來自人(SEQ ID NO 2)，牛(SEQ ID NO 5),恆河猴(SEQ ID NO 6)，小鼠(SEQ ID NO -J), 水貂(SEQ ID N0:8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQ ID NO 10)的 CTproSP-C 具有至少 70%同一性。換一種方式，本實施方案暗示，在相對應的位置，所述具有哺乳動物CTproSP-C 的所有保守殘基(SEQ ID NO 11)的分離的蛋白包含人CTproSP-C(SEQ ID NO 2)的所有下述保守殘基:His-l, Met-2, Ser-3, Gln-4, Lys-5, His-6, Thr-7, Glu-8, Met-9, Val-10， Leu-ll,Glu-12,Met-13,Ser-14,Pro-18,Glu-19,Gln-21,Leu-24,Ala-25,Thr-32,Ala-34,Thr-35，Phe-36，Gly-39，Ser-40,Thr-41,Gly-42,Val-44,Asp-47,Tyr-48,Gln-49,Leu-51， Leu-52，Ala-54，Tyr-55,Lys-56,Pro-57,Ala-58,Pro-59,Gly-60,Thr-61，Cys-63,Tyr-64, Met-66,Lys-67，Ala-69，Pro-70，Ile-73,Pro-74,Ser-75,Leu—76，Glu—77，Ala—78，Arg-81， Lys-82, Gln-105, Gly-108, Gly-112, Ser-116, Phe—122， Leu—123， Gly-124, Val-127, Thr-129, Leu-130, Cys-131, Gly-132, Glu-133，Pro-135, Leu-136 和 Tyr-138。在一個實施方案中，所述分離的蛋白選自由下列各項組成的組(i)包含與人 CTproSP-C(SEQ ID NO 2)具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白；和(ii)包含與人 CTproSP-C的Brichos結構域(SEQ ID NO 4)具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白。在某些實施方案中，本發明所述的分離的蛋白由少於或等於500個，諸如少於或等於250個，諸如少於或等於200個，諸如少於或等於150個胺基酸殘基組成。在某些實施方案中，本發明所述的分離的蛋白由多於或等於90個，諸如多於或等於100個，諸如多於或等於150個胺基酸殘基組成。優選的大小範圍為90-200個胺基酸殘基，諸如100-150個胺基酸殘基。在一個實施方案中，所述分離的蛋白選自由下列各項組成的組(i)來自人(SEQ ID NO :2),41 (SEQ ID N0:5)，恆河猴(SEQ ID N0:6)，小鼠(SEQ ID N0:7)，水貂(SEQ ID N0:8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQID NO: 10)的 CTproSP-C，和(ii)來自人(SEQ ID NO :4)，牛(SEQ IDNO :12)，恆河猴(SEQ ID NO :13)，小鼠(SEQ ID NO :14)，水貂(SEQ IDNO 15)，兔(SEQ ID NO 16)或大鼠(SEQ ID NO 17)的 CTproSP-C 的 Brichos 結構域。在具體的實施方案中，所述分離的蛋白選自由人CTproSP-C(SEQ ID N0:2)，人 CTproSP-C 的 Brichos 結構域(SEQ ID NO :4)，和具有 SEQ ID NO :21 的來自人的 CTproSP-C 的延長的Brichos結構域組成的組。具有SEQ ID NO :21的延長的Brichos結構域的優點在於其比Brichos結構域更穩定，而Brichos結構域和延長的Brichos結構域二者具有與全長CTproSP-C蛋白相同的功能。在一個特定的實施方案中，所述分離的蛋白是人 CTproSP-C(SEQ ID NO :2)。在另一個特定的實施方案中，所述分離的蛋白是人CTproSP-C 的 Brichos 結構域(SEQ ID NO 4)。在一個實施方案中，與人proSP_C(SEQ ID NO 1)中亮氨酸_188相對應的位置不是穀氨醯胺。在另一個實施方案中，與人proSP-C(SEQ ID NO 1)中亮氨酸-188相對應的位置是嚴格保守的。按照一個實施方案，所述分離的蛋白適合用於治療包括人的哺乳動物中的阿爾茨海默病，包括阿爾茨海默型痴呆。按照一個實施方案，本發明提供選自由預防治療、減輕治療和治癒治療組成的組的治療。按照另一個方面，本發明提供一種藥物組合物，其包括治療有效量的本發明所述的分離的蛋白和對其適用的藥用載體。按照一個實施方案，所述藥物組合物用於治療包括人的哺乳動物的阿爾茨海默病。按照一個方面，本發明提供治療需要所述治療的哺乳動物(包括人)中的阿爾茨海默病的方法，所述方法包括給所述哺乳動物施用治療有效量的本發明所述的分離的蛋白或本發明所述的藥物組合物。
按照一個實施方案，本發明提供選自由預防治療、減輕治療和治癒治療組成的組的治療。按照另一個方面，本發明提供本發明所述的分離的蛋白用於製備用於治療包括人的哺乳動物中的阿爾茨海默病的藥物的應用。附圖簡述

圖1顯示proSP-C加工的示意圖，和已知的哺乳動物CTproSP-C胺基酸序列(SEQ ID NOS =2,5-11)的比對。圖2顯示CTproSP-CBH。h。s和CTproSP-C與在纖維素膜上SP-C衍生的肽斑點的結
口 O圖3顯示CTproSP-C與在纖維素膜上的肽斑點的結合，A β肽樣品的SDS-PAGE和 Αβ肽樣品的透射電子顯微照片。圖4顯示Αβ肽樣品的透射電子顯微照片。圖5顯示用或不用CTproSP-C溫育的可溶性A β肽級分的SDS-PAGE。圖6顯示關於單獨的A β肽或在存在CTproSP-C條件下的MALDI-MS圖像。圖7顯示用抗體4G8或S-蛋白探測的Aβ和Aβ +CTproSP-C的SEC級分的免疫印跡分析。圖8顯示在碳酸氫銨緩衝液中與A β混合的CTproSP-C的納米噴射ESI-MS光譜。圖9顯示CTproSP-C和CTproSP-C與A β的混合物的納米噴射ESI-MS光譜，以及該混合物的MS/MS光譜。圖10顯示在不存在和存在等摩爾量的CTproSP-C的條件下熱誘導的ADH聚集和還原誘導的胰島素聚集。圖11顯示靶標肽與CTproSP-C或截短的CTproSP-C的相對結合，其為靶標肽濃度的函數。圖12顯示存在和不存在CTproSP-C時的Aβ (1-40)和Αβ (1-42)在217nm隨時間變化的CD信號的幅度。所附序列的列表
SEQIDNO1 人 proSP-C
SEQIDNO:2 人 CTproSP-C
SEQIDNO3 人 SP-C
SEQIDNO4 A CTpro SP-CBrichos
SEQIDNO5 牛 CTproSP-C
SEQIDNO6 flMli (rhesus macaque) CTproSP-C
SEQIDNO7 小鼠 CTproSP-C
SEQIDNO8 水貂 CTproSP-C
SEQIDNO9 兔 CTproSP-C
SEQIDNO:10 大鼠 CTproSP-C
SEQIDNO11保守的哺乳動物CTproSP-C
SEQIDNO:12 牛 CTpro SP-CBrichos
SEQIDNO:13 恆河猴 CTpr。SP-CBrich。s
SEQIDNO:14 小鼠 CTpro SP-CBri chos
SEQIDNO:15 水貂 CTproSP-CBrich。s
SEQIDNO:16 兔 CTpro SP-CBrichos
SEQIDNO:17 大鼠 CTpro SP-CBri chos
SEQIDNO18保守的哺乳動物CTproSP-C1
SEQIDNO:19 人 Αβ 肽 H0
SEQIDNO:20S-標記的人 CTproSP-C
SEQIDNO:21 人 CTproSP-CBrich。s 86_197發明詳述已經令人驚訝地發現，CTproSP-C (也稱為「CTC」)，包含與哺乳動物CTproSP-C具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白，和包含與哺乳動物CTproSP-C的Brichos結構域具有至少70 %同一性的胺基酸序列的蛋白，具有減少澱粉狀蛋白原纖維形成和A β -肽聚集的能力。按照第一方面，本發明提供一種分離的蛋白，其選自由下列各項組成的組⑴包含與來自人(SEQ ID NO :2)，牛(SEQ ID NO :5)，恆河猴(SEQID NO :6)，小鼠 (SEQ ID NO :7)，水貂(SEQ ID NO :8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQ ID NO 10)的肺表面活性蛋白C前體(CTproSP-C)的C端結構域具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白，和(ii)包含與來自人(SEQ ID NO :4)，牛(SEQ ID NO 12)，恆河猴(SEQ ID NO :13)， 小鼠(SEQ ID N0:14)，水貂(SEQ ID N0:15)，兔(SEQID NO 16)或大鼠(SEQ ID NO 17) 的CTproSP-C的Brichos結構域具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白，所述分離的蛋白用作藥物。術語「％同一性」在用在整個說明書和後附的權利要求書中時是按下述計算的。將查詢序列與靶序列用 CLUSTAL W算法比對(Thompson, J. D.，Higgins，D. G. ^PGibson, Τ. J.， Nucleic Acids Research (核酸研究)，22 :4673-4680 (1994))。在與比對序列中最短的序列相對應的窗口進行比較。比較在每個位置的胺基酸殘基，並且將在所述查詢序列中具有與在靶序列中的相同的對應性的位置的百分數報導為％同一性。術語「％相似性」在用在整個說明書和後附的權利要求書中時是如關於「％同一性」一樣計算的，不同的是疏水殘基Ala，Val，Phe，Pr0，Leu，Ile，Trp，Met和Cys是相似的； 鹼性殘基Lys，Arg和His是相似的；酸性殘基Glu和Asp是相似的；並且親水、不帶電荷的殘基Gln，Asn, Ser, Thr和Tyr是相似的。在這種情形中，剩餘的天然胺基酸Gly不與任意其它胺基酸相似。在本說明書中，本發明所述的備選實施方案滿足相對應的相似性百分數，而不是指定的同一性百分數。其它備選的實施方案滿足指定的同一性百分數以及另一個更高的相似性百分數，其選白關於每種序列的優選的同一性百分數的組。例如，分離的蛋白序列可以與另一種蛋白序列70%相似；或其可以與另一種序列70%相同；或者其可以與另一種序列 70%相同並且90%相似。肺表面蛋白C(SP_C ；SEQ ID NO 3)是一種具有35個胺基酸殘基的疏水性、乙醯化的跨膜肽。其合成為197個胺基酸殘基的蛋白前體(在包括人的某些物種中存在191個胺基酸的變體)，即肺表面蛋白C前體(proSP-C ；SEQ ID NO :1)。ProSP-C僅在肺泡II型上皮細胞中表達，並且用其在ER腔內的C端錨定在內質網(ER)膜蛋白中。ProSP-C進行蛋白水解分解(見圖1A)，並且成熟的SP-C肽對應於人proSP-C的殘基對-58。SP-C和其它蛋白以及脂質成分分泌到肺泡中，並且負責降低在氣/液界面處的表面張力，由此防止在最終呼氣時肺泡破裂。如在圖IA中進一步所述，proSP-C的加工還產生C端片段，即肺表面蛋白C前體的C端結構域(CTproSP-C ；SEQ ID NOS =2,5-10 ；圖1B)。成熟的CTproSP-C蛋白對應於人proSP-C的殘基59-197。在某些實施方案中，本發明所述的分離的蛋白由少於或等於500個，諸如少於或等於250個，諸如少於或等於200個，諸如少於或等於150個胺基酸殘基組成。在某些實施方案中，本發明所述的分離的蛋白由多於或等於90個，諸如多於或等於100個，諸如多於或等於150個胺基酸殘基組成。優選的大小範圍是90-200個胺基酸殘基，諸如100-150個氨
基酸殘基。SP-C (SEQ ID NO 3)並且因此還有 proSP-C (SEQ ID NO 1)包含跨膜(TM) α-螺旋(對應於殘基9-34)，其僅由纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸組成(「聚-Val」區)，具有形成 β-鏈的高度傾向。其是非常保守的並且缺少已知的同源蛋白。因此，不一致的SP-C螺旋在溶液中是亞穩態的，並且可以白髮轉變成摺疊聚集物和澱粉狀蛋白原纖維。已經在肺泡蛋白質沉積症(pulmonary alveolar proteinosis) (PAP)患者的肺泡中觀察到SP-C 原纖維，但在健康的對照中沒有觀察到。此外，CTproSP-C(SEQID NO :2)並且因此以及 proSP-C(SEQ ID N0:1)包含已知為 Brichos 結構域(CTproSP-CBrichos ；SEQ ID NO 4)的結構域，其對應於人 proSP-C (SEQ ID NO 1)的殘基94-197。Brichos結構域包含約100個胺基酸，並且發現其存在於與變性和增殖性疾病相關的一些蛋白中，諸如Bri，存在於與澱粉狀蛋白形成和家族性英國和丹麥痴呆相關的一些蛋白中，和存在於與胃癌相關的CAll中。還已知，Brichos結構域中的突變與肺病、proSP-C錯誤摺疊和細胞內聚集體的形成相關。具有外顯子4缺失的 proSP-C(proSP-C"Exon4)的增加的表達產生C端變短的蛋白前體，導致轉基因小鼠中的肺畸形發生和轉染細胞中的ER壓力。Brichos結構域中的另一種突變，導致在蛋白前體位置188 的亮氨酸交換為穀氨醯胺(proSP-CU88Q)，其與顯性遺傳的間質性肺病(interstitial lung disease)相關。在來源於肺的A549細胞中或人胚腎(HEK) 293細胞中表達Brichos突變體 pr0SP-CAEx°n4或proSP-CU88Q導致增加的引起凋亡的不溶聚集體的形成。相反，位於Brichos 結構域和跨膜結構域(SP-C)之間的區域中的另外兩種突變，proSP-CI73T* proSP-CE66K，與改變的細胞內運輸相關而不是與聚集相關。因此，在proSP-C和CTproSP-C中的Brichos結構域參與防止(pro) SP-C聚集。在一個實施方案中，與人proSP-C中亮氨酸-188相對應的位置不是穀氨醯胺。在另一個實施方案中，與人proSP-C中亮氨酸-188相對應的位置嚴格保守。顯然，與人proSP-C中亮氨酸-188相對應的位置在CTproSP-C (在人中亮氨酸-130) 和CTproSP-CBH。h。s(在人中亮氨酸-%)以及在某些其它物種中具有不同的數字，參見圖IB 以及 SEQ IDNOS 1-2 和 4-18。CTproSP-C結合非螺旋SP-C的聚纈氨酸部分，並且這種結合導致組合的 CTproSP-C/SP-C系統的增加的螺旋含量。特別地，重組人CTproSP-C與全長非螺旋SP-C的結合導致SP-C的α -螺旋形成。重組人CTproSP-C與SP-C的結合通過在CTproSP-C Brichos結構域(人proSP-C94"197 ；SEQ ID NO 4)和在包含疏水殘基(Val, Leu, lie)的 SP-C 〃 聚-Val 〃 區 (Sp-C13-35)中存在的結合基序發生。ProSP-C還在其它哺乳動物物種中表達，並且提供相對應的SP-C和CTproSP-C分裂產物。來自牛、恆河猴、小鼠、水貂、兔和大鼠的相對應的CTproSP-C胺基酸序列顯示在 SEQ ID NO 3-8中。其高度保守性(超過70%的同一性)暗示與人CTproSP-C相同的功能， 其在天然環境中參與穩定SP-C和proSP-C，但是如本文所公開的，還包括穩定Αβ蛋白。如本文所示，CTproSP-C的這兩種功能在結構上是相關的，並且因此本發明包括包含與任何哺乳動物 CTproSP-C，特別是來自人(SEQ ID N0:2)，牛(SEQ ID N0:5)，恆河猴(SEQ ID NO: 6)，小鼠(SEQ ID N0:7)，水紹(SEQ ID N0:8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQ ID NO 10) 的CTproSP-C ；並且優選與來自人的CTproSP-C (人proSP_C59_197 ；SEQ ID NO 2)具有至少 70 %，優選至少80 %，優選至少90 %，更優選至少95 %同一性的胺基酸序列。哺乳動物CTproSP-C (SEQ ID NO :2，5-10)的高度保守性從圖IB清楚可見，其表現已知的哺乳動物物種之間的嚴格保守的胺基酸殘基(「嚴格的」；SEQ ID N0:11)。這些胺基酸殘基的保守性暗示這些胺基酸殘基在CTproSP-C中的功能。在一個優選的實施方案中，所述分離的蛋白與哺乳動物物種之間的保守胺基酸殘基相對應的這些胺基酸殘基與所述保守的胺基酸殘基相同，即，所述分離的蛋白包含SEQ ID N0:11的定義的胺基酸殘基。即，除了與特定CTproSP-C的整體同一性/相似性程度，所述分離的蛋白與哺乳動物物種之間的保守胺基酸殘基相對應的那些胺基酸殘基與本實施方案中所述的保守胺基酸殘基相同。換一種方式，本實施方案暗示，在相對應的位置，具有哺乳動物CTproSP-C所有保守殘基(SEQ ID NO 11)的分離的蛋白包含人CTproSP-C(SEQ ID NO 2)的所有下述保守殘基His-l，Met-2，Ser-3, Gln-4, Lys-5, His-6, Thr-7, Glu-8, Met-9, Val-10, Leu-11, Glu-12，Met-13，Ser-14,Pro-18，Glu-19，Gln-21，Leu-24，Ala-25，Thr-32,Ala-34,Thr-35, Phe-36，Gly-39，Ser-40,Thr-41,Gly-42,Val-44,Asp-47,Tyr-48,Gln-49,Leu-51，Leu-52， Ala-54,Tyr-55,Lys-56,Pro-57,Ala-58,Pro-59,Gly-60,Thr-61,Cys-63,Tyr-64, Met-66, Lys-67，Ala-69，Pro-70，Ile-73,Pro-74,Ser-75,Leu-76,Glu-77,Ala-78,Arg-81,Lys-82, Gln-105, Gly-108, Gly-112, Ser-116, Phe—122， Leu—123， Gly-124, Val-127, Thr-129, Leu-130, Cys-131, Gly-132, Glu-133，Pro-135, Leu-136 和 Tyr-138。來自圖IB的比對的另一種觀察在於，關於個體哺乳動物物種的序列，保守的哺乳動物序列包含缺口。因此，認為所述分離的蛋白與例如人CTproSP-C的比對可以包含一些缺口，例如，0-5個缺口或0-3個缺口。在人CTproSP-C中，在某些哺乳動物物種中缺少殘基88-93，101-103和115，而一種或多種哺乳動物物種在人CTproSP-C的殘基16-17和 115-116之間具有另外的殘基。在一個實施方案中，本發明包括作為哺乳動物CTproSP-C蛋白，特別是來自人 (SEQ ID NO :2)，牛(SEQ ID NO 5)，恆河猴(SEQ ID NO 6)，小鼠(SEQ ID NO -J),水貂(SEQ ID N0:8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQID NO 10)的CTproSP-C蛋白；並且優選是來自人的 CTproSP-C(人 proSP-C59—197 ;SEQ ID NO 2)的蛋白。表述「CTproSP-C」通常是指任何哺乳動物CTproSP-C，且優選是指人CTproSP-C。此外，CTproSP-C的Brichos結構域具有與全長CTproSP-C相同的結合能力。因此， 本發明包括包含這樣的胺基酸序列的蛋白，所述胺基酸序列與哺乳動物的Brichos結構域，優選與人(SEQ ID NO :2)，牛(SEQ ID NO :5)，恆河猴(SEQ ID NO :6)，小鼠(SEQ ID NO 7)，水貂(SEQ ID N0:8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQ ID NO 10)CTproSP-C 的 Brichos 結構域，更優選與人CTproSP-C的Brichos結構域(人proSP-C94-197 ；SEQ ID NO 2)具有至少70 %，優選至少80 %，優選至少90 %，並且優選至少95 %的同一性。在一個實施方案中，本發明包括這樣的蛋白，其包含哺乳動物的Brichos結構域，優選人、牛、恆河猴、小鼠、水貂、兔或大鼠的CTproSP-C的Brichos結構域，更優選人 CTproSP-C 的 Brichos 結構域(人 proSP_C9[197 ；SEQ ID NO 2)。表述「proSP-C 的 Brichos 結構域」，「pr0SP-CBH。h。s」，「CTpr0SP-C 的 Brichos 結構域」和「CTproSP-CBH。h。s」通常是指任何哺乳動物proSP-C的Brichos結構域，並且優選是指人proSP-C的Brichos結構域。在一個實施方案中，本發明包括作為哺乳動物CTproSP-C蛋白的Brichos結構域， 特別是來自人(SEQ ID N0:4)，牛(SEQ ID N0:12)，恆河猴(SEQ ID N0:13)，小鼠(SEQ ID NO: 14)，水貂(SEQ ID NO: 15)，兔(SEQ ID NO 16)或大鼠(SEQ ID NO: 18)的 CTproSP-C 蛋白的Brichos結構域；並且優選是人CTproSP-C的Brichos結構域(人proSP-C59—197 ；SEQ ID NO 4)的蛋白。哺乳動物CTproSP-C的Brichos結構域(SEQ ID NO :4，12-17)的高度保守性從圖 IB清楚可見，其表現已知的哺乳動物物種之間的嚴格保守的胺基酸殘基(「嚴格的」;SEQ ID N0:18)。這些胺基酸殘基的保守性暗示這些胺基酸殘基在CTpr0SP-CM。h。s中的功能。在一個優選的實施方案中，所述分離的蛋白與哺乳動物物種之間的保守胺基酸殘基相對應的這些胺基酸殘基與所述保守的胺基酸殘基相同，即，所述分離的蛋白包含SEQ ID N0:18的定義的胺基酸殘基。即，除了與特定CTproSP-CM。h。s的整體同一性/相似性程度，所述分離的蛋白與哺乳動物物種之間的保守胺基酸殘基相對應的那些胺基酸殘基與本實施方案中所述的保守胺基酸殘基相同。換一種方式，本實施方案暗示，在相對應的位置，具有哺乳動物 CTproSP-CBrichos結構域所有保守殘基(SEQ ID NO 18)的分離的蛋白包含人CTproSP-C Brichos 結構域(SEQ ID NO 4)的所有下述保守殘基Phe_l，Gly_4，Ser-5，Thr-6，Gly-7， Val-9, Asp-12, Tyr-13, Gln-14, Leu-16, Leu-17, Ala-19, Tyr-20, Lys-21, Pro-22, Ala-23, Pro-24,Gly-25,Thr-26,Cys-28,Tyr—29，Met—31，Lys-32,Ala-34,Pro-35,Ile-38,Pro-39, Ser-40,Leu-41，Glu-42，Ala-43，Arg-46，Lys-47,Gln-70, Gly-73,Gly-77, Ser-81, Phe-87, Leu-88, Gly-89, Val-92，Thr-94, Leu-95，Cys-96, Gly-97, Glu-98，Pro-100, Leu-101 和 Tyr-103。在一個實施方案中，本發明包括作為哺乳動物CTproSP-C蛋白Brichos結構域， 特別是來自人(SEQ ID N0:4)，牛(SEQ ID N0:12)，恆河猴(SEQ ID N0:13)，小鼠(SEQ ID NO: 14)，水貂(SEQ ID NO: 15)，兔(SEQ ID NO 16)或大鼠(SEQ ID NO: 18)的 CTproSP-C 蛋白的Brichos結構域；並且優選是來自人的CTproSP-C Brichos結構域(人proSP-C59—197 ； SEQID NO 4)的蛋白。在一個具體的實施方案中，所述分離的蛋白可以包含Brichos結構域和多個來自 CTproSP-C 非 Brichos 部分的殘基。例如，SEQ ID NO 21 包含人 CTproSP-C 的 Brichos 結構域和來自人CTproSP-C的非Brichos部分的8個另外的胺基酸殘基。功能得到保留，但是所得到的蛋白比單獨的Brichos結構域更穩定，並且因此可以有利地提供更高產量的非聚集蛋白。
在細胞膜內，多肽需要暴露非極性側鏈，並且隱藏極性骨架。因此，僅纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸促使插入到內質網(ER)膜中，並且形成α-螺旋是插入過程的重要部分。ProSP-C是具有單個α-螺旋跨膜結構域的完整的ER膜蛋白，所述α -螺旋跨膜結構域由多個纈氨酸和一些異亮氨酸和亮氨酸組成，並且該結構域產生成熟的SP-C(人 SP-C,SEQ ID NO :3)。由於纈氨酸和異亮氨酸殘基的高β -摺疊傾向性，也正是這一特徵在體外和活細胞中使得SP-C和proSP-C傾向於形成β -摺疊聚合物(澱粉狀蛋白原纖維)。存在內源性抗-澱粉狀蛋白功能，由此proSP-C的ER腔、C-端結構域(CTproSP-C) 通過尚未解決的機制防止ProSP-C和SP-C的跨膜片段聚集成β-摺疊。SP-C是高度保守的，缺少同源蛋白，並且其疏水性「聚-Val 」區包含纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸。然而，令人驚訝地，CTproSP-C的親和性不限於這三個疏水性胺基酸殘基。CTproSP-C識別具有空前特異性的5-7個殘基的片段。CTproSP-C結合纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或酪氨酸的片段，但不結合丙氨酸、色氨酸、甘氨酸、脯氨酸或蘇氨酸對應體。因此，CTproSP-C 按照生物學疏水性級別結合促使膜插入的殘基(Τ Hessa等，Nature (自然)433，377-381， 2005)並且結合酪氨酸。在生物學疏水性等級和通過與纖維素-結合的肽結合所揭示的 CTproSP-C底物特異性之間的例外在於CTproSP-C結合酪氨酸片段。這可以通過酪氨酸殘基在CTproSP-C中是暴露的並且結合疏水染料1，1』_二(4-苯胺-5，5』 -萘磺酸酯)進行解釋。此外，CTproSP-C專一地結合處於非螺旋構象的肽。CTproSP-C的底物特異性與Hsp70家族蛋白伴侶BiP和DnaK具有相似性，Hsp70 家族蛋白伴侶BiP在通過ER膜易位後結合所述疏水多肽片段。BiP識別具有交替模式的疏水殘基的7-殘基肽片段，其與延長的肽結構對結合的需要相容。然而，纈氨酸在與BiP結合的肽中是表現不足(under represent)的，而CTproSP-C不結合聚-Trp，聚-Trp是BiP 底物中最有利的殘基。同樣地，DnaK結合所需要的中間5個殘基的性質與CTproSP-C的底物特異性相似，但是對於CTproSP-C沒有觀察到對於側連鹼性殘基的DnaK需要。綜上所述，這些數據直接提示對CTproSP-C功能的解釋；其通過結合尚未達到 α-螺旋的、膜插入構象的ProSP-C候選物跨膜片段的任何部分而防止β-摺疊聚集。通過識別特定的胺基酸序列而靶向在ProSP-C跨膜結構域內的任何短片段將是不可能的。總之，CTproSP-C是一種SP-C蛋白伴侶，並且CTproSP-C關於SP-C的天然穩定、促進螺旋作用通過結合SP-C的疏水「聚-Val 」區(人SP-C的殘基13-35，SEQ ID NO 3)而發生，所述疏水「聚-Val 」區主要包含纈氨酸(10個殘基)、異亮氨酸和亮氨酸，但不包含苯丙氨酸。事實上，盡我們所知，CTproSP-C對於苯丙氨酸的親和力先前是未知的。此外，上述 CTproSP-C底物特異性，按定義來說，暗示其可以結合未能形成可以插入到膜內的緊湊的、 螺旋構象的其它候選跨膜片段。與SP-C相反，Αβ肽(SEQ ID 19)具有形成β _摺疊傾向的靶區域跨越殘基 16-23，並且包含兩個苯丙氨酸殘基，但是僅有一個纈氨酸殘基。因此，令人高度驚訝地是本發明所述的分離的蛋白具有減少澱粉狀蛋白纖維形成並且減少Αβ肽聚集的能力。在本發明中對CTproSP-C針對與阿爾茨海默病相關的澱粉狀蛋白β-肽(Αβ—SEQ ID NO 19) 的活性進行了實驗評估。當從膜釋放時，Αβ由其前體蛋白APP的TM片段分裂下來，聚集成澱粉狀蛋白原纖維，並且包含區域L17VFF2ci和I31IGLMVGGVV4ci，如果所述區域以非螺旋構象存在，它們匹配CTproSP-C底物特異性。事實上，CTproSP-C完全阻斷澱粉狀蛋白原纖維形成和Αβ的聚集。CTproSP-C捕獲除proSP-C的跨膜結構域之外的澱粉狀蛋白形成多肽的能力表明其識別的特性，即對於膜插入的充分的疏水性和非螺旋構象，通常推動澱粉狀蛋白形成。這與這樣的觀察相符，即，疏水性和摺疊傾向可以用來闡釋澱粉狀蛋白形成蛋白的聚集率。 CTproSP-C是發現聯繫proSP-C，SP-C和Αβ肽的未摺疊跨膜片段的識別和澱粉狀蛋白防止的第一種蛋白伴侶。因此，本發明特別提供選自由下列各項組成的組的分離的蛋白(i)包含與來自人(SEQ ID NO :2)，牛(SEQ ID NO :5)，恆河猴(SEQ ID NO :6)，小鼠(SEQ ID NO :7),/Κ 貂(SEQ ID N0:8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQID NO: 10)的肺表面活性蛋白C前體 (CTproSP-C)的C端結構域具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白；和(ii)包含與來自人(SEQ ID NO :4)，牛(SEQ ID NO :12)，恆河猴(SEQ ID NO :13)，小鼠(SEQ ID NO :14)，水貂(SEQ ID N0:15)，兔(SEQ ID NO 16)或大鼠(SEQ ID NO 17)的 CTproSP-C 的 Brichos 結構域具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白，所述分離的蛋白用作藥物，用於治療包括人的哺乳動物中的阿爾茨海默病，包括阿爾茨海默型痴呆。在具體的實施方案中，所述治療可以是預防治療。在其它具體的實施方案中，所述治療可以是減輕治療。在某些具體的實施方案中，所述治療可以是治癒治療。按照另一個方面，本發明提供一種藥物組合物，其包含治療有效量的本發明所述的分離的蛋白和對其適用的藥用載體。所述藥物組合物有效用於治療包括人的哺乳動物中的阿爾茨海默病，包括阿爾茨海默型痴呆。按照一個相關的方面，本發明提供本發明所述的分離的蛋白用於製備用於治療包括人的哺乳動物中的阿爾茨海默病(包括阿爾茨海默型痴呆)的藥物中的應用。本發明所述的分離的蛋白可以結合到藥物組合物中。所述組合物典型地包括候選化合物和適合的藥用載體。當用於本文時，「適合的藥用載體」包括溶劑、分散介質、包衣、等張和吸收延遲劑等，其與藥物施用相容。輔助的活性化合物也可以結合在所述組合物中。配製藥物組合物與其目的施用途徑相容。施用途徑的實例包括腸胃外(例如，靜脈內、皮內、皮下)、口服、鼻內(例如，吸入)、經皮、經黏膜、鞘內、腦室內(例如，使用具有內嵌的濾器的Omaya儲器-分流器，其被手術放置在腦池空間中)、和直腸施用。用於組合物的潛在有用的腸胃外遞送系統包括緩慢溶解的聚合物顆粒，可植入的輸注系統，和脂質體。用於腸胃外應用的溶液或混懸液可以包括下述成分無菌稀釋劑，諸如注射用水，鹽溶液，不揮發性油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成的溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，和用於調整張力的的試劑，諸如氯化鈉或葡萄糖。PH可以用酸或鹼調節，諸如用鹽酸或氫氧化鈉來調節。腸胃外製劑可以被封在由玻璃或塑料製成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。也可以通過將本發明所述的分離的蛋白直接遞送到中樞神經系統、優選遞送至腦而實行阿爾茨海默病的治療。適於注射用的藥物組合物包括無菌水溶液(在水溶性情形中)或分散液和用於即時製備無菌注射液或分散液的無菌粉劑。對於靜脈內施用，適合的載體包括生理鹽水，抑菌水，Cremophor EL 或磷酸緩衝鹽水(PBS)。在所有情形中，所述組合物必須是無菌的，並且在存在容易注射的程度上應該是流體。其在製備和儲存的條件下應該是穩定的，並且必須保存免受諸如細菌和真菌的微生物的汙染作用。所述載體可以是溶劑或分散介質，例如，其包含水、乙醇、多元醇(例如，甘油，丙二醇，和液態聚乙二醇等)、和它們的適當的混合物。 例如，可以通過利用在本發明所述的分離的蛋白顆粒上的塗層(例如，磷脂醯膽鹼)，在分散的情形中通過維持所需要的顆粒尺寸並且通過利用表面活性劑來保持適當的流動性。可以通過各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯，氯代丁醇，苯酚，抗壞血酸，硫柳汞等，實現微生物作用的防止。在許多情形中，優選地在所述組合物中包括等張劑。所述試劑的實例包括糖，多元醇，諸如甘露醇和山梨醇，和氯化鈉。可以通過在所述組合物中包含延遲吸收的試劑，例如，單硬脂酸鋁或明膠，來導致可注射組合物的延長的吸收。無菌注射液可以這樣製備通過將本發明所述的分離的蛋白以需要的量結合在適當的溶劑中，當需要時，與上述列舉的一種成分或成分組合一起結合在適當的溶劑中，然後過濾除菌。一般地，分散液通過將本發明所述的分離的蛋白結合到無菌賦形劑中而製備，所述無菌賦形劑包含基本的分散介質和上述列舉的那些中所需要的其它成分。在用於製備無菌注射液的無菌粉劑的情形中，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥，這產生本發明所述的分離的蛋白加來自其先前無菌過濾溶液的任何另外需要的成分的粉劑。口服組合物通常包含惰性稀釋劑或可食用的載體。為了口服治療施用的目的，本發明所述的分離的蛋白可以與賦形劑結合併且以片劑、藥片、或膠囊(例如，明膠膠囊)形式使用。可以包含藥物相容的結合劑、和/或輔助物質作為組合物的一部分。片劑、藥丸、 膠囊、藥片等可以包含任意下述成分、或相似性質的化合物結合劑，諸如微晶纖維素，西黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸，Primogel，或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或^erotes ；助流劑，諸如膠質二氧化矽；增甜劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷，水楊酸甲酯，或橙味調味劑。對於通過吸入施用，化合物以來自包含適當的推動劑(例如，氣體，諸如二氧化碳)的加壓容器或分散器、或噴霧器的氣霧劑噴霧的形式遞送。系統施用還可以通過經黏膜或經皮方式進行。對於經黏膜或經皮施用，在製劑中使用適於要被透過的屏障的滲透劑。所述滲透劑在本領域中通常是已知的，並且包括，例如，對於經黏膜施用，去汙劑，膽汁鹽，和梭鏈孢酸衍生物。經黏膜施用可以通過使用鼻噴霧或栓劑實現。對於經皮施用，將本發明所述的分離的蛋白配製成本領域通常已知的藥膏、軟膏、凝膠、或油膏。本發明所述的分離的蛋白也可以製備成栓劑(例如，具有常規的栓劑基質，諸如可可脂和其它甘油酯)或用於直腸遞送的滯留型灌腸劑(retention enemas)的形式。在一個實施方案中，本發明所述的分離的蛋白用保護所述化合物免受機體快速清除的載體製備，所述載體諸如可控釋放的製劑，包括植入物和微膠囊化的遞送系統。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，膠原，聚原酸酯(polyorthoesters)，和聚乳酸。製備所述製劑的方法是本領域技術人員所清楚的。脂質體混懸液(包括用單克隆抗體靶向特異性感染阿爾茨海默病的細胞的脂質體)也可以用作藥用載體。這些可以按照本領域技術人員已知的方法製備。為了施用容易和劑量均勻，便利地配製劑量單位形式的口服或腸胃外組合物。劑量單位形式用在本文中是指適合用作用於待治療的受試者的單一劑量的物理分開的劑量， 每個劑量包含與所需要的藥物載體聯繫的預定量的本發明所述的分離的蛋白，所述量被計算來產生需要的治療效果。本發明所述的分離的蛋白的毒性和治療效果可以通過在細胞培養物或實驗動物中的標準藥學步驟確定，例如，用於確定LD5tl(對50%的群體致死的劑量)和ED5tl(在50% 的群體中治療有效的劑量)。可以使用適當的動物模型，諸如在Murchler-Pierrat等， Rev Neurosci (神經學綜述)，10 :15-24,1999 ；Seabrook 等，Neuropharmacol (神經藥理學)38 :1-17,1999 ； DeArmond 等，Brain Pathology (腦病理學)5 :77-89,1995 ；Telling, Neuropathol Appl Neurobiol (神經病理學應用神經生物學)26 :209-220, 2000 ；和 Price 等，Science (科學)282 1079—1083，1998中關於澱粉樣變性病(amyloidoses)所述的那些。毒性和治療效果之間的劑量比率是治療指數，並且其可以表示為LD5tZED5tl比率。 優選表現出高治療指數的化合物。儘管可以使用表現出毒性副作用的化合物，但是應該慎重設計將所述化合物靶向感染組織部位的遞送系統，以將對未感染的細胞的潛在的傷害最小化並且由此減少副作用。由細胞培養物測定和動物研究獲得的數據可以用於配製一定範圍的用於人的劑量。化合物的劑量優選在一定範圍的循環濃度之內，所述濃度包括具有很少或沒有毒性的 FD劑量可以在該範圍內變化，這取決於所用的劑型和所用的施用途徑。對於本發明的方法中所用的任何化合物，最初可以由細胞培養物測定來估算治療有效劑量，其中例如， 在所述細胞培養物測定中，觀察到原纖維形成的速率或細胞死亡的速率。可以在動物模型中配製劑量，以獲得包括在細胞培養物中確定的IC5(I(即，獲得半最大症狀抑制的測試化合物的濃度)的循環血漿濃度範圍。這樣的信息可以用來更準確地確定在人中的有用劑量。 例如，可以通過高效液相色譜測量血漿中的水平。如本文定義的，本發明所述的分離的蛋白的治療有效量(即，有效劑量)在約 0. l-100mg/kg體重，更優選約l-100mg/kg體重，並且甚至更優選約l_50mg/kg體重的範圍內。所述化合物可以在延長的時間階段施用給受試者例如，在受試者的生命過程中。Img/ kg-100mg/kg的劑量通常是合適的，諸如在設計在腦中起作用的抗體的情形中是這樣。在一些情形中，所述化合物可以每周一次施用約1-10周，優選2-8周，更優選約 3-7周，並且甚至更優選約4，5，或6周。所述化合物還可以長期施用。專業技術人員應該理解，某些因素可能影響有效治療受試者所需要的劑量和時間，包括但不限於，疾病或病症的嚴重性，先前的治療，受試者整體健康和/或年齡，和存在的其它疾病。此外，用治療有效量的化合物治療受試者可以包括單次治療，或者優選地，可以包括一系列的治療。可以以多種方式製備本發明所述的重組分離的蛋白，其包括人CTproSP-C及其 Brichos結構域，用於施用給表達人APP的小鼠或人。所述重組蛋白可以按實施例1所述純化。為了增加蛋白通過血腦屏障(BBB)的可能性，考慮了一些方法。對於藥物通過BBB，已經出現了幾種主要的策略。它們利用內源性轉運系統，通過受體介導的胞轉作用或利用特定的受體(例如，用於葡萄糖、胺基酸或肽的特定受體)。作為用於攜帶多種貨物穿過BBB的載體，肽似乎是特別引人注意的。已經表明多種不同的肽引發胞吞作用(典型地通過LDL-受體)並且能夠遞送貨物穿過BBB。這些肽中的一些是兩性帶正電荷細胞穿過肽(CPI^s，例如，滲透素(penetratin)，ApoE衍生的肽以及其它)，但是這些在較高的劑量也可能是高度毒性的。如synB家族的其它物質也是帶正電荷的，但是不具有疏水部分。多種引發內吞作用的肽的缺點在於，為了有效，它們需要相對較大，從而形成似乎與有效的攝入相關的穩定的α-螺旋。通過胞轉作用遞送的優點在於，貨物可以非常大量並且非常可變化。其中已經表明通過可飽和轉運系統穿過BBB的特異性內源肽將作用為用於藥物遞送的載體的途徑也是可行的備選方案。這種類型的一些相對短的肽，如 MIF-I (Pro-Leu-Gly,來源於催產素)和肽T (8個殘基，來源於HIV包膜)，已經表明有效轉運穿過 BBB。參見，例如，de Boer AG 禾P Gaillard PJ, Clin Pharmacokinet.(臨床藥物動力學)46 :553-76,2007 ;de Boer AG 禾口 Gaillard PJ, Annu Rev Pharmacol Toxicol.(藥理學毒物學年度綜述)47 :323-55,2007 ；Pardridge WM, Drug Discov Today.(今日藥物發現)12:54-61,2007，關於穿過BBB遞送方法的描述。在現在的情形中，考慮所述肽或蛋白可以與CTproSP-C或其Brichos結構域混合，或者備選地，它們可以這樣表達以與CTproSP-C 或其Brichos結構域共價連接。在其它製劑中，CTproSP-C或其Brichos結構域可以與用於穿過BBB遞送的納米顆粒連接(Lockman PR 等·，Drug Dev Ind Pharm.(藥物開發和工業藥學)28 =1-13,2002 ； Tosi G 等·，Expert Opin Drug Deliv.(藥物遞送專家觀點)5 155-74，2008)。也可以利用修飾諸如脂質化來穩定蛋白並且增加攝入和組織滲透性(例如，滲透到腦)。用於抗體脂質化的方法由Cruikshank等，J Acquired Immune Deficiency Syndromes Hum Retrovirol (獲得性免疫缺陷症候群人反轉錄病毒雜誌)14 :193，1997所述。當本發明所述的分離的蛋白要施用給動物(例如，人)來治療阿爾茨海默病時，醫師、獸醫或研究人員可以，例如，先開相對低的劑量，隨後增加劑量直到獲得適當的響應。另外，應該理解，對於任何具體的動物受試者的特定的劑量水平取決於多種因素，包括所用的特定化合物的活性，受試者的年齡、體重、整體健康、性別和飲食，施用的時間，施用的途徑， 排洩速率，任何藥物組合，和表達或被調控的活性的程度。本發明的藥物組合物可以與施用說明書一起包含在容器、包裹、或分配器中。例如，說明書可以包括使用所述組合物來治療患有或有危險患有阿爾茨海默病的個體的指導。按照另一個方面，本發明提供治療需要其的哺乳動物(包括人)中的阿爾茨海默病(包括阿爾茨海默型痴呆)的方法，所述方法包括給所述哺乳動物施用治療有效量的本發明所述的分離的蛋白或本發明所述的藥物組合物。在具體的實施方案中，所述治療可以是預防治療。在其它具體的實施方案中，所述治療可以是減輕治療。在某些具體的實施方案中，所述治療可以是治癒治療。本發明提供治療有危險(或易於)患有阿爾茨海默病的受試者的預防性和治療性方法。當用於本文時，術語「治療」定義為給患者使用或施用本發明所述的分離的蛋白，或向來自患有阿爾茨海默病、具有疾病症狀或易患病體質的患者的分離的組織或細胞系使用或施用本發明所述的分離的蛋白，目的是治癒、癒合、緩和、減輕、改變、補救、改進、改善或影響所述疾病、疾病症狀或易患疾病的體質。
在一個方面中，本發明提供用於預防與由Αβ肽引起的原纖維形成相關的疾病或病況(即，減少感染(contracting)的危險，或減少出現與疾病或病況相關的症狀的速率) 的方法，所述方法通過向受試者施用本發明所述的分離的蛋白，所述分離的蛋白減少多肽聚集和/或穩定多肽的α-螺旋形式。例如，可以通過本領域已知的任何適當的診斷或預後測定或它們的組合來鑑定有危險患有阿爾茨海默病的受試者。施用預防劑可以在所述疾病特有的症狀顯現之前進行，以使所述疾病得到預防，或者備選地延遲其進展。本發明所述的分離的蛋白可以以治療有效的劑量施用給患者，從而預防、治療或改善涉及與阿爾茨海默病相關的原纖維形成的病症。治療有效劑量是指足以引起病症症狀改善的化合物的量。所述化合物的毒性和治療功效可以通過上述標準藥學步驟確定。還考慮本發明所述的蛋白可以通過基因治療施用，諸如使用表達載體、質粒或病毒來轉染神經系統中的細胞，優選腦中的細胞，以使所述分離的蛋白由中樞神經系統中的這些細胞表達。這有效用於阿爾茨海默病的治療。現在，將通過下述非限制性實施例進一步舉例說明本發明。
實施例實施例1-表達.和分離重組人 CTDroSP-CM。h。s (人 DroSP-C_ :SEQ ID NO :4)，重組人 CToroSP-C (ProSP-C5gzl3z :SEQ ID NO :2)和重組人 CTproSP-CL·。按照Johansson 等，J Biol Chem(生物化學雜誌)281 :21032_21039，2006 所述製備 CTproSP-C 和 CTproSP-CL188I^建體。由 CTproSP-C 構建體和下述引物(DNA technology AIS (DNA 技術 AIS)，Aarhus,丹麥)5，-GGTGCCATGGCTTTCTCCATCGGCTCCACT-3『(正向引物)和 5』 -CTCTAGAGGATCCGGATCCCTAGATGTAGTAGAGCGGCACCTCC-3'(反向引物)擴增 CTproSP-CBrichos構建體；下劃線序列分別是BamHI和NcoI分裂位點。將擴增的DNA片段用 BamHI和NcoI消化，並且連接到表達載體pET_32c (Novagen，Madison，WI)上。該載體包含硫氧還蛋白、六組氨酸和插入位點上遊S-標記的編碼區。為了表達 CTproSP-C 和 CTproSP-CBrichos,將轉化的大腸桿菌(E. coli)菌株 Origami (DE3) pLysS (Novagen, Madison, WI)在含有 100 μ g/ml 氨節青黴素的 Luria-Bertani培養基中在37°C在持續攪動下生長16小時。將溫度降低至25°C，並且在 0D600 = 1. 1時通過加入IPTG至0. 5mM而誘導表達，並且將細菌再生長4小時。然後，通過以6000xg離心20分鐘而收集細胞，用在20mM Tris-HCl, pH 8,2mM MgCl2中的溶菌酶和DNA酶溫育，並且將其進一步上樣到Ni-NTA瓊脂糖柱上。將該柱用IOOml 20mM Tris, pH 8洗滌，然後用20ml含有20mM咪唑的20mM Tris,pH 8洗滌。然後，用在20mM Tris,pH 8中的150mM咪唑洗脫靶蛋白。將洗脫的蛋白針對20mM Tris, pH 8透析，然後通過在8°C 以0. 002的酶/底物重量比率，用凝血酶分裂3小時而去除硫氧還蛋白和His標記。在這之後，將咪唑添加至15mM的濃度，並且將溶液再上樣到Ni-NTA瓊脂糖柱上，以去除釋放的硫氧還蛋白-His標記。按先前所述(Johansson等，J Biol Chem (生物化學雜誌)281: 21032-21039,2006)表達並且純化CTproSP-CU88Q。簡言之，將蛋白在大腸桿菌中表達為具有硫氧還蛋白/His6/S-標記的融合蛋白。使用固定的金屬親和和離子交換層析純化該蛋白。 將凝血酶用來去除硫氧還蛋白-標記和His6-標記。蛋白純度用SDS-PAGE和非變性PAGE 檢驗。
所有得到的蛋白都是S-標記的，例如，S-標記的人CTproSP-C(SEQ ID NO :20)。 除非另外指明，這些S-標記的蛋白用在下述實施例中。實施例2-分析 CTDroSP-CM。h。F, CTproSP-C 和 CTproSP-CL·與在纖維素膜上的 SP-C衍牛的肽斑點的結合SPOT 膜(Frank R，J Immunol Meth (免疫學方法雜誌)，洸7 1316，2002)，其含有來源於SP-C的10個-殘基的片段(proSP-C24—58)，購自Sigma Genosys (劍橋，英國)。將該膜在甲醇中浸泡 5 分鐘，然後用 T-TBS (50mM Tris, 137mM NaCl，2. 7mM KCl，pH 8，含有 0.05% 吐溫)洗滌 3x30 分鐘，接著在 22°C用在 T-TBS 中的 1 μ g/ml CTproSP-CBrichos, CTproSP-C 或CTproSP-Cu88e溫育1小時。然後，將膜用在TBS中的2% BSA封閉1小時。在用T-TBS 4x洗滌1小時後，將膜用在含有2% BSA的T-TBS中1 5000稀釋的HRP-綴合的S蛋白 (Novagen,Madison, WI)溫育。然後，將膜再次用T-TBS乜洗滌1小時，並且通過ECL按照供應商的使用說明顯現結合。如上述詳述，探測結合到纖維素膜上的具有與完整的SP-C胺基酸序列(SEQ ID NO 3)相對應的重疊序列的10個-殘基肽與CTproSP-C (SEQ ID NO 4)的結合。圖2A顯示CTproSP-C與含有來源於SP-C的10個-殘基片段的斑點的結合。肽斑點1-25覆蓋N-至C-端方向的SP-C序列(參見圖2B)，例外的是斑點8，9，11，12，17和 18 (見下述)。斑點7包含SP-C中的KRLLIVVVVV區段，而斑點8和9分別包含其Leu-置換的(KRLLLLLLLL)或Ala-置換的(KRAAAAAAAA)形式。以相同的方式，斑點10-12分別包含 RLLIVVVVVV (SP-C 中的位置 12-21)，RLLLLLLLLL,和 RAAAAAAAAA，斑點 16-18 分別包含 VVVVVLVVVV (SP-C 中的位置 17-26)，LLLLLLLLLL,和 AAAAAAAAAA。斑點 21 和 23 包含相同的肽(LWWIVGAL)。圖2B顯示CTproSP-C結合肽沿著SP-C序列的總結。虛線標記不與CTproSP-C結合的肽，而實線表示與CTproSP-C結合的肽。SP-C序列的下劃線部分對應於其跨膜區。編號1-35是指成熟的SP-C肽(SEQ ID NO :3)，在proSP-C (SEQ ID NO 1)中相對應的殘基是 24-58。因此，圖2A-B顯示結合基序存在於包含疏水殘基的區域中，即，來源於SP-C跨膜 「聚-Val」區的肽。在圖2A中分別比較斑點對7/8，10/11和16/17，用聚-Leu替換聚-Val 基序沒有導致結合變化。相反，在圖2A中分別比較斑點7/9，10/12和16/18，用聚-Ala替換聚-Val導致結合消除。將與用於分析CTproSP-C底物特異性相同的肽斑點膜用 CTproSP-CBrichos(proSP-C94-197)探測，其表現出與 CTproSP-C(proSP-C59—197)的結合模式非常相似的結合模式。如在圖2C中所示，Brichos結構域重現CTproSP-C結合特性。相反， CTproSP-CL188Q 不結合 SP-C 的任何片段(圖 2D)。因此，CTproSP-C 和 CTproSP-CBH。h。s 具有相同的底物特異性，而CTproSP-CU88Q表現出消除的底物結合。實施例3-CTproSP-C及其Brichos結構域的底物特異性為了研究重組人CTproSP-C及其Brichos結構域與所示殘基的纖維素-結合的十聚體的結合，將所示胺基酸殘基的十聚體共價附著到纖維素SPOT膜(Frank R，J Immunol Meth(免疫學方法雜誌)J67 =13-26,2002)上。按實施例1所述在大腸桿菌中生產重組人 S-標記的 CTproSP-C (SEQ ID NO 20)和人 CTproSP-C 的(S-標記的)Brichos 結構域。
19
將膜用在含有0. 05%吐溫的 50mM Tris, 137mM NaCl，2. 7mM KCl，pH 8 (T-TBS)中的1 μ g/ml CTproSP-C在22°C溫育1小時。在用2% BSA封閉1小時並且用T-TBS 4x洗滌1小時後，將膜用1 5000稀釋的HRP-綴合的S-蛋白(Novagen，Madison, WI)溫育。 然後，將膜按上述再次洗滌，並且通過增強的化學發光顯現結合的S-標記的CTproSP-C， 參見圖3A。CTproSP-C結合V，I，L，F，M，或Y的片段，但是不結合A，W，G，P，或T的對應體。因此，CTproSP-C按照生物學疏水性等級結合促進膜插入的殘基並且結合Y。突變的人 CTproSP-CL188Q用作對照，其不結合人Bri蛋白的SP-C和ER-腔部分，並且均不能結合任意膜結合的肽。人CTproSP-C的Brichos區重現人CTproSP-C的結合能力。(數據未顯示)實施例4-CTproSP-C的底物特異件為了研究CTproSP-C的結合特異性，將在非螺旋(靶標，非-α，第一泳道)或處於螺旋構象(靶標，α，第二泳道)的LLLLLLLLILLLILGALL肽，和非-靶標肽(第三和第四泳道)共價附著到纖維素SPOT膜(Frank R，J Immunol Meth (免疫學方法雜誌)，沈7 13-26， 2002)上。對於不同的構象，將肽由50%的水性甲酸印跡，在甲酸中所述肽以β-鏈構象存在，或由乙醇印跡，在乙醇中其是螺旋的。為了排除不同的溶劑引起CTproSP-C的假象結合的可能性，將非-靶標肽(IPCCPV)由50%的水性甲酸(第三泳道)或乙醇(第四泳道)吸附。使用PR 648 Slot Blot多孔過濾器(Amersham Biosciences (安瑪西亞生物科學)， 美國)將肽印跡到硝基纖維素膜(Whatman，德國)上。添加1 μ g/ml重組人CTproSP-C，並且在22°C溫育2小時。然後，將膜用Tris-緩衝鹽水，pH 7重複洗滌，並且通過如實施例3 的免疫檢測和增強的化學發光顯現結合的CTproSP-C。如在圖北中所示，CTproSP-C專一地結合採取非螺旋構象的肽。實施例5-CTproSP-C的抗-澱粉狀蛋白特性在實驗開始時和在37°C單獨(_)或與2. 5μΜ CTproSP-C(+)溫育7天後，可溶 Aβ ^40 (25 μ Μ)的量。電子顯微照片顯示來自單獨的Αβ的豐富的澱粉狀蛋白原纖維，對於 A β +CTproSP-C在6天溫育後缺少澱粉狀蛋白原纖維。在實驗開始時，在任何樣品中沒有觀察到原纖維。在將Αβ由儲液稀釋在DMSO中後，該實驗用在IOmM磷酸鈉緩衝液，pH 7.0， 150mM氯化鈉中的Aβ進行。將Αβ ^tl在37°C在攪動下用和不用2. 5 μ MCTproSP-C溫育。在實驗開始和在7天後，取出樣品以確定聚集水平。將樣品以16000Xg離心6 分鐘，取出上清，並且以16000Xg再離心2分鐘。然後，通過在非還原條件下在10-16% Tris-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tris-Tricine)凝膠上的SDS-PAGE並且用考馬斯染色而分析來自最後離心的上清。對於電子顯微鏡檢，將2μ1的等分試樣在200-目的銅柵格上吸附1分鐘，並且用2%乙酸雙氧鈾(uranyl acetate)染色30秒，然後使用在75kV操作的日立H7100顯微鏡(Hitachi H7100 microscope)檢驗並且照相。得到的SDS-PAGE凝膠和照片顯示在圖3c中。顯然CTproSP-C在體外完全阻斷 Αβ的澱粉狀蛋白原纖維形成和聚集。實施例6-CTproSP-C防止A β ^的原纖維形成Aβ ^(SEQ ID NO :19)購自Bachem(德國)並且以凍幹狀態保存在_70°C備用。 為了促進單體起始的溶液，將肽以lmg/ml在二甲亞碸(DMSO)中溶解、振蕩並且聲波處理， 然後稀釋在工作緩衝液中。
如實施例1所述表達並且純化人重組CTproSP-C(SEQ ID NO 20)。A β H。聚集和原纖維形成實驗用在含有10% (v/v) DMSO的IOmM磷酸鈉緩衝液，ρΗ 7. 0，150mM氯化鈉中的25μΜ的Αβ濃度進行。將A β ^tl用和不用25和2. 5 μ M CTproSP-C 在37°C在攪動下溫育。在不同的時間點，取出樣品確定聚集水平。將樣品以16000Xg離心6分鐘，取出上清並且以16000 Xg再離心2分鐘。然後，通過在非還原條件下在10-16% Tris-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tris-Tricine)凝膠上的SDS-PAGE並且用考馬斯染色而分析來自最後離心的上清。作為對照，將六日^用2.5μΜ雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑(MW 13. 3kDa)或人抗凝血酶(MW 58kDa)以與上述相同的方式溫育。為了確定原纖維形成的程度，將Αβ H。用或不用2. 5μ M CTproSP-C、以及25 μ M雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑或牛血清白蛋白按上述溫育。6天後，取出樣品，並且通過透射電子顯微鏡(TEM)分析，參見下文。為了研究CTproSP-C解離已經形成的原纖維的能力，將25 μ M A β ^40在37°C搖動條件下溫育6天，原纖維的存在通過TEM驗證，然後加入CTproSP-C至終濃度25 μ Μ。將樣品再溫育1-7天，並且然後再使用TEM估算原纖維的量。對於每份樣品，將2 μ 1的等分試樣在200-目的銅柵格上吸附1分鐘，並且用 2%乙酸雙氧鈾染色30秒，然後使用在75kV操作的日立Η7100顯微鏡(Hitachi H7100 microscope)檢驗並且照相。將A β !_40在存在和不存在CTproSP-C的條件下以1 1和10 1的摩爾比溫育。 圖4顯示在溫育6天後獲得的TEM照片。簡言之，圖4顯示由在37°C在具有10% DMSO (ν/ ν)的IOmM磷酸鈉緩衝液，pH 7.0,150mM氯化鈉中單獨溫育的25 μ M A β ^40 (A)，與25 μ M CTproSP-C (B)，2. 5 μ MCTproSP-C (C)，25 μ M BSA (D)或 25 μ M 雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑(E) 一起溫育的25 μ M Ai^Htl形成的16000xg沉澱物的透射電子顯微照片。標尺=lOOnm。在溫育6天後獲得的TEM照片顯示在存在CTproSP-C的條件下，甚至在小於等摩爾比例(圖4B-C)時，Αβ _的原纖維形成(圖4Α)完全被消除。相對於Aβ υ等摩爾量的雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑和BSA均不防止A β ^原纖維形成(圖4D-E)，這表明CTproSP-C 和Αβ Htl之間相互作用的特異性。將預先形成的Aii1,的澱粉狀蛋白原纖維與CTproSP-C以相對於用來形成原纖維的A β !_40濃度為1 1摩爾比例溫育。在用CTproSP-C溫育多至7天後，在通過TEM觀察到的原纖維的量或表現上沒有變化(數據未顯示)。這些實驗表明，CTproSP-C不具有解離已經形成的原纖維的能力，而是與在原纖維形成途徑上的物質(species)相互作用。實施例7-CTproSP-C防止A β ^聚集將Αβ H。用CTproSP-C以及對照蛋白雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑或人抗凝血酶以 Αβ/蛋白摩爾比例10 1進行溫育。7天後，通過SDS-PAGE分析在以16000 Xg離心後的可溶A β _的量。圖5顯示將25μΜ Aβ ^tl在具有10 % DMSO(ν/ν)的IOmM磷酸鈉緩衝液，ρΗ 7. 0，150mM氯化鈉中在存在或不存在2. 5 μ M CTproSP-C (CTC)，雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑 (Cyst)或人抗凝血酶(HAT)的條件下溫育O和7天的16000 Xg可溶級分的SDS-PAGE(A)； 和將25 μ M A β ^tl在具有10% DMSO (ν/ν)的IOmM磷酸鈉緩衝液，ρΗ 7. 0，150mM氯化鈉中在存在或不存在2. 5μΜ CTproSP-C的條件下溫育O或20天的16000Xg可溶級分的SDS-PAGE(B)。對於所有混合物，在t = 0時Αβ的量是相等的，但是7天後，從具有單獨的Aβ 或與雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑共同溫育的樣品沒有觀察到Αβ。在與抗凝血酶共同溫育的樣品中觀察到少量的可溶Αβ，而含有CTproSP-C的樣品表現出與在t = O時觀察到的幾乎等量的可溶Αβ (圖5A)。甚至在將CTproSP-C和Αβ共同溫育20天後，仍發現可溶的 A β (圖 5Β)。如在圖5中所示，CTproSP-C能夠保持A β可溶狀態多至20天，並且相似尺寸的對照蛋白不能做到這樣進一步表明CTproSP-C作用是基於特定的相互作用。實施例8-CTDroSP-C防丨h A β 」聚集將Αβ ^溶解在DMSO中至濃度231 μ Μ,並且用或不用在50mM乙酸銨緩衝液，pH 7. O中的25 μ M CTproSP-C稀釋至濃度25 μ Μ。立即取出來自每份混合物的樣品進行MALDI 分析。然後將溶液在37°C攪動下溫育2天，然後在22°C不搖動再溫育4天。對於基質-輔助的雷射解吸離子化(matrix-assisted laser desorption ioisation) (MALDI)分析，將樣品稀釋在具有0. 1 %的三氟乙酸(TFA)的30%乙腈中至 A β !_40濃度4 μ Μ，將0. 5 μ 1的每種樣品與在30 %乙腈，0. 1 % TFA中的0. 5 μ 1的0. 8 μ M 的促生長素抑制素混合。將混合物上樣在由在丙酮中的20mg/ml溶液預先結晶在MALDI靶標板上的芥子酸層頂部，並且與溶解在50%乙腈，0. TFA中的Iy 1芥子酸(20mg/ml) 共結晶。在以利用延遲的提取的線性模型操作的Bruker Autoflex (Bruker Daltonics, Billerica, MA)質譜儀上獲得在2000-10000質量/電荷比例(m/z)的數據。對於每種樣品自動獲得1000次發射；對於50個不同的位置，使用預先確定的發射模式，平均每個位置 20次雷射發射的各個批次。當將25μΜ Aii1^用或不用等摩爾量的CTproSP-C在37°C在攪動條件下溫育2 天並且在22°C再溫育4天時，CTproSP-C對Aii1^聚集的抑制作用是明顯的。通過MALDI MS分析樣品中單體、可溶Aii1,的存在，使用促生長素抑制素作為內部非聚集標準以獲得關於肽的可靠的濃度估算。使用對於每種MALDI靶標的一些不同點的自動收集，以最小化人為的誤差和偏見。圖6顯示使用促生長素抑制素(理論質量3149. 6IDa)作為內部標準在通過MALDI MS估測的溶液中A β ^(理論質量43 . 86Da)的定量。組(A)和(B)顯示單獨的25 μ M A β η。，而(C)和(D)顯示25 μ M A β !_40+25 μ M CTC0 (A)和(C)中的樣品在溫育前分析， 並且(B)和(D)中的樣品在pH7. O的50mM乙酸銨緩衝液中，在37°C攪動下溫育2天且在 22 °C再溫育4天後進行分析。使用這一方法，獲得在促生長素抑制素和Aii1,濃度之間的良好的相關性(R2 > 0.9)。單獨溫育的Αβ H。表現出相對於促生長素抑制素的可溶肽的80%減少(圖6Α和 6Β)，而在含有A β H0和CTproSP-C的樣品中，可溶的A β ^40的量隨著分析的時間階段保持不變(圖6C和6D)。因此，MALDI質譜證實CTproSP-C具有對A β 1-40聚集的抑制性作用， 即，保持A β υ處於可溶的、單體狀態。實施例9-使用大小-排阻層析(SEC)和免疫印跡分析進行CTproSP-C與A β， 的相互作用研究利用與免疫印跡偶聯的SEC來研究A β卜40與CTproSP-C之間的相互作用。在附在FPLC儀器(Amersham Biosciences (安瑪西亞生物科學))上的Superdex 200柱 (Amersham Biosciences (安瑪西亞生物科學)，Uppsala，瑞典)上進行SEC。將柱用IOmM 磷酸鈉緩衝液PH 7.0，150mM氯化鈉平衡，並且記錄在214nm的吸光度。將該柱最初用凝血因子I(340kDa)，醛縮酶(158kDa)，牛血清白蛋白(67kDa)和雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑 (13. 3kDa)校準。對於相互作用研究，在IOmM磷酸鈉緩衝液，pH 7. 0，150mM氯化鈉，10% (v/v)DMSO 中製備三種不同的樣品:( )34μΜ Αβ^, (ii) 34 μ MCTproSP-C禾口 (iii)各 34 μ M 的 A β ^ 和CTproSP-C。在製備後將所有的樣品直接應用到柱上，並且用與用於平衡相同的緩衝液以 0.7ml/分鐘的流速洗脫。從所有的運行中收集1.2ml的級分，並且使用I3R 648 Slot Blot 多孔過濾器(Amersham Biosciences (安瑪西亞生物科學)，美國)將100 μ 1/級分印跡到硝基纖維素膜(Whatman，德國)上。對於包含A β ^和CTproSP-C 二者的樣品，分析兩組印跡，以允許檢測兩種肽。為了檢測A β ρ-將膜在磷酸緩衝鹽水(PBS)，pH 7. 4中煮沸5分鐘，並且允許在TBS-吐溫 (0.1%)中冷卻，然後用5%脫脂奶粉封閉。將膜用單克隆抗體4G8(1 2000,Signet,UK) 探測，然後用抗-小鼠HRP-綴合的二級抗體(1 5000,GE Healthcare (GE衛生保健)，UK) 探測。為了檢測S-標記的CTproSP-C，將膜用5%脫脂奶粉封閉，並用HRP-綴合的S-蛋白 (1 5000，NOVagen，美國)探測。使用增強的化學發光(Millipore)來檢測兩種情形中的抗體結合。照片J用來測量斑點的強度。圖7顯示用抗體4G8或S-蛋白探測的Αβ和A0+CTproSP-C(〃 CTC〃)的SEC 級分的免疫印跡分析。圖7A顯示與洗脫體積85-89ml相對應的SEC級分的免疫印跡分析。 左側顯示上樣到柱上的樣品中的多肽內容物。上面兩排用識別Aβ ^的抗體4G8探測，並且下面兩排用S-蛋白探測以檢測S-標記的CTproSP-C (SEQ ID NO 20)。圖7Β和7C顯示用抗體4G8(B)或S-蛋白(C)探測的SEC級分(洗脫體積75_110ml)的免疫印跡的強度。 含有A β+CTproSP-C的樣品由實線表示，而單獨的A β (B)和單獨的CTproSP-C (C)由虛線表示。箭頭標記由具有已知質量的蛋白的洗脫位置估測的分子質量。該附圖代表三次獨立的運行。AeLWZHnm吸光度模式表明與存在以外水體積洗脫的低數目寡聚體物質和少量的較大物質相容的模式(未顯示)，這表明存在前纖維(pre-fibrillar)可溶的寡聚體。在Αβ ii+CTproSP-C樣品中，不存在較大的Αβ，這進一步支持來自聚集測定的結果。CTproSP-C自身表現為兩組低聚物。明顯的主導峰在與三聚體-五聚體大小相對應的位置洗脫，並且另一個峰在與十二聚體相對應的位置洗脫。這一結果與分析式超離心和 ESI質譜數據充分一致，表明CTC三聚體及其寡聚體是主要物質(C Casals等，Febs J，275: 536-547,2008)。與單獨的CTproSP-C洗脫相比較，關於A β i^+CTproSP-C的SEC的吸光度模式表明與CTproSP-C三聚體-五聚體相對應的峰增加約30 %，這表明A β結合併且穩定 CTproSP-C三聚體-五聚體。與A β /CTproSP-C複合物相對應的特有的峰無一能夠通過吸光度測量檢測到，這可能是由於單獨的CTproSP-C的相當大的洗脫體積。然而，Αβ⑷和CTproSP-C的混合物的SEC，然後進行級分的斑點印跡分析，清楚地表現與單獨的多肽相比較的特有的峰(圖7)。這表示Αβ和CTproSP-C相互作用並且
23形成穩定的複合物。所觀察到的新的峰與約IlOkDa的複合物相對應，並且伴有與 52kDa 相對應的A β峰的損失(圖7Β和C)。暗示地，因此新的物質可以是與CTC三聚體(55kDa) 結合的 A β Htl(SZkDa)的 12-mer。因此，SEC表明兩種分子相互作用並且形成在層析過程中穩定的複合物。似乎所形成的複合物由與Aβ 12-mer相互作用的CTproSP-C三聚體組成。這些發現與存在Αβ寡聚體相容，A β寡聚體是可能的膠囊樣結構，其能夠在SEC和SDS-PAGE過程中保持完整無損並且能夠與CTproSP-C締合。實施例10-使用電霧化電離質譜(ESI-MS)講行的CTproSP-C和A β ^相互作用研究為了進一步研究A β /CTproSP-C複合物形成，使用ESI質譜分析A β ^40和 CTproSP-C的混合物以及單獨的多肽。將以1. ImM的濃度在_20°C保存在20mM磷酸鈉緩衝液，pH 7. 0，30mM氯化鈉中的 CTproSP-C (理論平均分子量1擬64. 89Da)在IOmM乙酸銨緩衝液，pH 6. 9中稀釋至10 μ Μ, 僅用於分析。將Αβ ^(理論平均分子量43 . 9Da)溶解在具有(ν/ν)氨水的IOmM碳酸氫銨緩衝液，ρΗΙΟ. 8中至A β濃度為100 μ Μ,並且保存在_20°C備用。當CTproSP-C和A β ^40 在一起分析時，在終PH為7-8的IOmM碳酸氫銨緩衝液中製備10 μ M CTC和50 μ MA β ^40的混合物。在MassLynx 4. 1程序的控制下以陽離子模式操作的裝備有Z-霧化源的QTOF Ultima API 質譜儀(Waters, Milford, ΜΑ)上獲得數據，1000_5000m/z，每次掃描 2 秒， 掃描間時間間隔0.1秒。樣品通過來自金屬-包被的硼矽酸鹽玻璃毛細狀針(Proxeon Biosysten^Odense，丹麥)的納米流點霧化界面引入，並且源溫度設定為80°C。霧化條件用1. 2-1. 9kV的毛細管電壓調諧，並且錐形和RF透鏡能量分別為100和38V。限制ES界面區的抽吸，使得在背襯式皮拉尼真空壓力計(backing pirani vacuum gauge)上的讀數由1. 8到1. 95mbar,並且使用5. 85 X IO^mbar的分析器壓力，其使用氬氣作為碰撞氣體。在 MS模式中，碰撞電壓設定為10V，並且在MS/MS模式中，CTproSP-C/A β ^40複合物通過將碰撞電壓增加至80V而分裂。該裝置以解析度為10，000(FWHM定義)的V-模式(單反射鏡模式)操作，並且質量等級針對PEG-3400校正。圖8顯示在IOmM碳酸氫銨緩衝液，pH 7-8中與50 μ MA β ^40混合的10 μ M CTproSP-C(CTC)的納米-霧化ESI-MS光譜。標記的峰對應CTproSP-C和具有不同電荷狀態的A β H0的異聚體，其由單獨的CTC或A β H0的光譜推測而來。比較由單個的肽和混合樣品獲得的峰模式表明在Αβ H。和CTproSP-C之間形成複合物。發現CTproSP-C寡聚體(圖8，未註解的峰)。對於所述混合物，出現一些不與 CTproSP-C或Αβ的同聚體相對應但是可能另外指定為CTproSP-C/A β異聚體的峰(圖8)。 發現與具有9個(m/z 2511)或10個(m/z 2260)電荷的一個A β _結合的一個CTproSP-C 相對應的低信號強度的峰。觀察到對應於與一個A β ^肽複合的CTproSP-C三聚體的具有 16-23 個電荷(m/z 3696-2572)的完整電荷狀態的包膜(charge stateenvelope)。選擇m/z 3485的峰(圖8)用於MS/MS，以驗證其表示兩種肽的複合物，即，通過 MS/MS分裂CTproSP-C/Αβ複合物，所述m/z 3485的峰不在單獨的CTproSP-C光譜中存在，並且對應於[3CTproSP-C+Ai3 ]17+。圖9顯示(A)在IOmM碳酸氫銨緩衝液，pH 7-8中的10 μ M CTproSP-C(CTC)和(B)在碳酸氫銨緩衝液，ρΗ 7-8中與50 μ M A β ^tl混合的 10 μ MCTproSP-C納米霧化ESI-MS光譜。在圖9C中，選擇在圖9Β中混合樣品中m/z 3484 觀察到的離子進行MS/MS，所用的碰撞電壓為80V。圖9D是圖9C 1000-1600的m/z範圍的放大，其中標記對應於由CTproSP-C/Αβ複合物釋放的Aβ ^的峰。將碰撞電壓由IOV增加至80V，這明顯足以分裂複合物的部分。這產生多個子離子，主要對應於CTproSP-C和A β ^40單體，但是也對應於CTproSP-C三聚體(圖9C和9D)。 有趣的是，在所述子離子中，發現CTproSP-C的六聚體，這表明至少所選離子的一部分實際上對應於WCTpr0SP-C+2Ai3]34+或更大的異聚體。在碰撞後的光譜中還存在由二聚體 CTproSP-C和具有10 (m/z 4087)和9 (m/z 4541)電荷的單體A β 1_40組成的異聚體，其在 MS模式中沒有發現(圖9C和9D)。因此，使用ESI質譜法，所發現的主要的複合物是與單體Αβ相互作用的 CTproSP-C三聚體(圖8)。CID實驗證實所述複合物的A β /CTproSP-C性質(圖9)。 CTproSP-C/Αβ複合物的化學計量在SEC和ESI-MS數據之間明顯不同。在破壞A β膠束或類似的聚集物方面，ESI-MS可能比SEC更有效，而不破壞直接的CTproSP-C/Αβ相互作用。 將SEC和ESI-MS數據合併表明CTproSP-C三聚體能夠結合一個以近似十二聚體組件存在的Αβ分子。實施例11-蛋白伴侶測定為了評估CTproSP-C作用為經典蛋白伴侶的能力，S卩，防止不穩定的蛋白聚集的能力，使用用醇脫氫酶(ADH)或胰島素的測定。通過在Cary 3分光光度計(Varian Techtron，Mulgrave，澳大利亞)中測量光散射(在360nm的表觀吸光度)，將有和無CTproSP-C存在的來自麵包酵母的ADH的熱誘導的聚集在50°C追蹤15分鐘。所有的實驗用分別為6. 25 μ M的ADH和CTproSP-C濃度進行，並且在20mM磷酸鈉緩衝液，ρΗ 7. 4，150mM氯化鈉中製備樣品。圖IOA顯示在不存在(虛線)和存在(實線)等摩爾量的CTproSP-C(CTC)的條件下熱誘導的ADH的聚集。在50°C，ADH在5分鐘內開始聚集。加入等摩爾量的CTproSP-C 導致ADH聚集之前遲滯期的較小延長。與蛋白伴侶的作用相比，例如，導致完全防止ADH聚集的 sHsp α-晶體蛋白(JI Clark & QL Huang,Proc Natl Acad Sci USA(美國國家科學院學報)93 15185-15189，1996)，這種作用是小的。有和無CTproSP-C的胰島素β -鏈的還原-誘導的聚集同樣通過測量360nm的表觀吸光度進行監測。將包含在50mM磷酸鈉緩衝液，ρΗ 7.0，IOOmM氯化鈉中的40 μ M胰島素(Sigma，瑞典)的溶液，用或不用摩爾比例1 1的CTproSP-C在41°C預先溫育5分鐘。 然後加入二硫蘇糖醇(DTT)至終濃度20 μ Μ,並且在41°C監測360nm處吸光度的變化達15 分鐘。圖IOB顯示在不存在(虛線)和存在(實線)等摩爾量的CTproSP-C(CTC)的條件下還原-誘導的胰島素聚集。在41°C胰島素的還原導致在約3分鐘後開始聚集。以1 1 摩爾比例加入CTproSP-C完全不影響胰島素聚集。這些結果似乎表明，CTproSP-C不能防止ADH和胰島素聚集。這表明CTproSP-C不具有傳統的蛋白伴侶(諸如Hsp70或sHsps)的典型特性。實施例12-CTproSP-C及其Brichos結構域的底物結合特異性
按實施例1所述生產截短的人CTproSP-C。與原始Brichos結構域構建體的位置 94相比較，該蛋白在proSP-C中的位置86起始，導致人CTproSP-C的Brichos結構域的延長形式。延長的CTproSP-CBH。h。s蛋白的序列為SEQ ID N0:21。在存在不同濃度的三肽VVV和LLL的條件下，通過ESI-MS研究延長的 CTproSP-CBrichos和CTproSP-C的底物結合特異性。由解卷積的光譜(deconvolution spectra)確定蛋白-三肽異聚體[PL]和蛋白(即，延長的CTproSP-Cfcich。s或CTproSP-C) [P]的相對濃度。將[PL]/[P]的比率以三肽濃度的函數繪圖，以獲得關於兩種蛋白和兩種配體的結合曲線。如在圖11中所示，發現延長的CTpr0SP-CM。h。s(〃 BRICH0S 「)和 CTproSP-CC CTC")以相似的方式結合兩種三肽LLL(圖11A)和VVV(圖11B)。因此，延長的Brichos結構域具有與全長CTproSP-C相同的底物結合模式。^MM 13- #用A β Wtm CTC講行的圓二色(CD)光i普研究Αβ形成導致其聚集並且最終形成原纖維的摺疊結構。我們的目的是確定 CTproSP-C是否能夠穩定隨機捲曲狀態的A β肽，因此防止Αβ肽形成β-摺疊和原纖維。 CTproSP-C是一種已經發現與A β肽相互作用的蛋白。我們利用⑶光譜使用A β (1-40)以及Αβ (1-42)來研究其與CTproSP-C的相互作用。將A β肽預先用TFA和HFIP處理，然後通過振蕩和聲波處理在20mM NaOH中溶解至200 μ M的濃度。然後，將該肽溶液用IOmM磷酸緩衝液，ρΗ 7稀釋至最終肽濃度20 μ Μ。 CTproSP-C 以 20 μ M 的濃度使用。用 Jasco J-810-150S 分光偏振儀(Jasco, Tokyo,日本)， 使用Inm的帶寬和2秒的響應時間，在22°C記錄遠紫外區(190-260nm)的⑶光譜，並且收集10個數據點/nm。以波長的函數繪製以mdeg為單位的CD信號。在數個小時後，Aβ (1-40)和Αβ (1-42)已經由時間=O時的主要的隨機二級結構轉變為主要為β-摺疊的結構。與單獨的Αβ (1-40)或Αβ (1-42)的行為相反，以等摩爾量存在CTproSP-C保持A β構象至少5小時基本上不變。從CTproSP-C與A β (1-40)或 A β (1-42)的混合物的CD光譜中，減去CTproSP-C的貢獻。所得到的光譜表示，在觀察時間期間中，兩種Αβ肽保持主要的隨機構象，由此避免β-摺疊聚集。表示相同數據的備選方式是繪製關於有和無CTproSP-C" CTC〃的Aβ (1-40)和 Αβ (1-42)的217nm⑶信號(β-摺疊含量的量度)幅度隨時間的變化，如圖12所示。這表明，儘管對於Αβ (1-40)(圖12Α)或Αβ (1-42)(圖12Β) ,CD21ta信號幅度隨時間增加(正方形)，但是存在(1 DCTproSP-C(圓形)很大程度消除了這種增加。這些結果表明人CTproSP-C對Αβ (1-40)和Αβ (1-42)具有相似的結構影響。實施例14-細胞培養物實驗Αβ多聚化產生對培養物中的細胞有毒的組件(assemblies)。使用MTT(3_(4， 5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯基四唑鐺溴化物)來監測用在不存在或存在CTproSP-C 或CTproSP-CM。h。s條件下聚合的A β ^42處理後的PC12細胞的氧化能力。將PC12細胞在補充了 10%胎牛血清和青黴素/鏈黴素(National Veterinary hstitute (國立獸醫研究所)，瑞典)的DMEM培養基中，在5%二氧化碳中培養。將細胞以適當的密度接種在96-孔Cell+板(Sarstedtj^W)中。次日，將培養基更換為無酚紅的補充了 10%胎牛血清和青黴素/鏈黴素的DMEM(45 μ 1/孔)。典型地，直接G小時處理實驗)或在37°C單獨或用等摩爾或5倍摩爾過量濃度的CTproSP-C或CTproSP-Cm。h。s預先溫育4小時(18小時處理實驗)後，加入10 μ M的A β !_42 (5 μ 1/孔)，產生1 μ M的終濃度。 將具有用於A β製備的等量的溶劑的PBS用作對照處理。將細胞用處理溫育4或18小時， 然後加入以0. 6mg/ml溶解在無酚紅DMEM中的MTT (50 μ 1/孔)，產生0，3mg/ml MTT的終濃度，並且在37°C用所述細胞溫育2小時。使用包含在水中的50%二甲基甲醯胺和20% SDS 的溶解緩衝液溶解紫色甲 晶體，直接加入到細胞培養基中(ΙΟΟμΙ/孔)。記錄在575nm 的吸光度，並且將對照處理設定為100%存活的細胞。實施例15-在轉基因小鼠中的實騎將表達具有與人中的阿爾茨海默相關的一個或多個突變的人A β前體(APP)的小鼠典型地用來評估治療策略。向僅表達具有Swedish突變的APP(APP K670N/M671L)或具有 Swedish 突變加 Arctic 突變(APP E693G) (Lord A 等.，Neurobiol Aging (神經學衰老)27 :67-77, 2006)的APP的小鼠，靜脈內、腹膜內、鼻內、或顱骨內施用3_15mg/kg劑量的 CTproSP-C或CTproSP-CBH。h。s，每周1_3次，持續10-30周。儘管也使用其它量度，諸如可溶的和不溶的A β的量和行為參數，但是通過與假-或未處理的對照相比較組織學檢驗在CNS 中的斑沉積而評估治療的作用。實施例16-施用給人給健康的個人和患有阿爾茨海默病的個人靜脈內、腹膜內、鼻內、或顱骨內施用劑量為 3-15mg/kg 的 CTproSP-C 或 CTproSP-Cteiehtjs, —周 1-3 次，持續 10-30 周。通過與假-或未處理的對照相比較組織學檢驗在CNS中的斑沉積而評估治療的作用。也使用其它量度， 諸如可溶的和不溶的Αβ的量和行為參數。
權利要求
1.一種分離的蛋白，其選自由下列各項組成的組包含與來自人(SEQ ID NO :2),41 (SEQ ID N0:5)，恆河猴(SEQ ID N0:6)，小鼠(SEQ ID N0:7)，水貂(SEQ ID N0:8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQ ID NO 10)的肺表面活性蛋白C前體(CTproSP-C)的C端結構域具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白，和包含與來自人(SEQ ID NO :4)，牛(SEQ ID NO :12)，恆河猴(SEQ ID NO :13)，小鼠(SEQ ID NO :14)，水貂(SEQ ID NO :1 ，兔(SEQ ID NO 16)或大鼠(SEQ ID NO 17)的 CTproSP-C 的Brichos結構域具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白，所述分離的蛋白用於治療包括人的哺乳動物中的阿爾茨海默病。
2.按照權利要求1所述的分離的蛋白，其選自由包含下述胺基酸序列的蛋白組成的組，所述胺基酸序列具有哺乳動物CTproSP-C的Brichos結構域的所有保守殘基(SEQ ID NO 18)，並且與來自人(SEQ ID N0:2)，牛(SEQ ID N0:5)，恆河猴(SEQ ID N0:6)，小鼠(SEQ ID N0:7)，水貂(SEQ ID N0:8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQ ID NO 10)的 CTproSP-C 具有至少70%同一性；或與來自人(SEQ ID NO :4)，牛(SEQ ID NO :12)，恆河猴(SEQ ID NO 13)，小鼠(SEQID N0:14)，水貂(SEQ ID N0:15)，兔(SEQ ID NO 16)或大鼠(SEQ ID NO: 17)的CTproSP-C的Brichos結構域具有至少70%同一性。
3.按照權利要求2所述的分離的蛋白，其選自由包含下述胺基酸序列的蛋白組成的組，所述胺基酸序列具有哺乳動物CTproSP-C的所有保守殘基(SEQ ID NO 11)，並且與來自人(SEQ ID N0:2)，牛(SEQ ID N0:5)，恆河猴(SEQ ID N0:6)，小鼠(SEQ ID NO :7)，水貂(SEQ ID NO :8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQ ID NO 10)的 CTproSP-C 具有至少70%同一性。
4.按照權利要求1-3中任一項所述的分離的蛋白，其選自由下列各項組成的組 包含與人CTproSP-C(SEQ ID NO 2)具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白，和包含與人CTproSP-C的Brichos結構域(SEQ ID NO 4)具有至少70 %同一性的胺基酸序列的蛋白。
5.按照權利要求1-4中任一項所述的分離的蛋白，其由少於或等於200個胺基酸殘基組成。
6.按照權利要求5所述的分離的蛋白，其由少於或等於150個胺基酸殘基組成。
7.按照權利要求1-6中任一項所述的分離的蛋白，其由多於或等於90個胺基酸殘基組成。
8.按照權利要求7所述的分離的蛋白，其由多於或等於100個胺基酸殘基組成。
9.按照權利要求1-8中任一項所述的分離的蛋白，其選自由下列各項組成的組 來自人(SEQ ID NO :2)，牛(SEQ ID NO :5)，恆河猴(SEQ ID NO :6)，小鼠(SEQ ID NO 7)，水貂(SEQ ID NO :8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQ ID NO 10)的 CTproSP-C,來自人(SEQ ID N0:4)，牛(SEQ ID NO: 12)，恆河猴(SEQ ID N0:13)，小鼠(SEQ ID NO: 14)，水貂(SEQ ID NO: 15)，兔(SEQ ID NO 16)或大鼠(SEQ ID N0:17)的 CTproSP-C 的Brichos結構域，和來自人的CTproSP-C的延長的Brichos結構域，所述延長的Brichos結構域具有SEQID NO :21ο
10.按照權利要求9所述的分離的蛋白，其選自由下列各項組成的組人 CTproSP-C (SEQ ID NO :2)，人 CTproSP-C 的 Brichos 結構域(SEQ ID NO :4)，和具有 SEQ ID NO 21的人CTproSP-C的延長的Brichos結構域。
11.按照前述權利要求中任一項所述的分離的蛋白，其中與人proSP-C(SEQID NO 1) 中亮氨酸-188相對應的位置不是穀氨醯胺。
12.按照權利要求11所述的分離的蛋白，其中與人proSP-C(SEQID NO 1)中亮氨酸-188相對應的位置是嚴格保守的。
13.一種藥物組合物，其包括治療有效量的權利要求1-12中任一項所述的分離的蛋白，和對其適合的藥用載體，所述藥物組合物用於治療包括人的哺乳動物中的阿爾茨海默病。
14.治療在需要其的哺乳動物中的阿爾茨海默病的方法，所述哺乳動物包括人，所述方法包括給所述哺乳動物施用治療有效量的權利要求1-12中任一項所述的分離的蛋白或權利要求13所述的藥物組合物。
15.按照權利要求14所述的方法，其中所述治療選自由預防治療、減輕治療和治癒治療組成的組。
16.權利要求1-12中任一項所述的分離的蛋白用於製備用於治療包括人的哺乳動物中的阿爾茨海默病的藥物的應用。
17.一種由少於或等於150個胺基酸殘基組成的分離的蛋白，其選自由下列各項組成的組包含與來自人(SEQ ID N0:2)，牛(SEQ ID N0:5)，恆河猴(SEQ ID N0:6)，小鼠(SEQ ID NO :7)，水貂(SEQ ID NO :8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQ ID NO 10)的肺表面活性蛋白C前體(CTproSP-C)的C端結構域具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白，和包含與來自人(SEQ ID NO :4)，牛(SEQ ID NO :1 ，恆河猴(SEQ ID NO ，小鼠(SEQ ID NO :14)，水貂(SEQ ID NO :15)，兔(SEQ ID NO 16)或大鼠(SEQ ID NO 17)的 CTproSP-C 的Brichos結構域具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白，所述分離的蛋白用作藥物。
18.按照權利要求17所述的分離的蛋白，其選自由包含下述胺基酸序列的蛋白組成的組，所述胺基酸序列具有哺乳動物CTproSP-C的Brichos結構域的所有保守殘基(SEQ ID NO 18)，並且與來自人(SEQ ID NO 2)，牛(SEQ ID NO 5)，恆河猴(SEQ ID NO 6)，小鼠(SEQ ID NO 7)，水貂(SEQ ID Ν0:8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQ ID NO 10)的 CTproSP-C 具有至少 70% 同一性；或與來自人(SEQ ID NO: 4)，牛(SEQ ID NO 12)，恆河猴(SEQ ID NO: 13)， 小鼠(SEQ ID N0:14)，水貂(SEQ ID N0:15)，兔(SEQ ID NO 16)或大鼠(SEQ ID NO 17) 的CTproSP-C的Brichos結構域具有至少70%同一性。
19.按照權利要求18所述的分離的蛋白，其選自由包含下述胺基酸序列的蛋白組成的組，所述胺基酸序列具有哺乳動物CTproSP-C的所有保守殘基(SEQ ID NO 11)，並且與來自人(SEQ ID N0:2)，牛(SEQ ID N0:5)，恆河猴(SEQ ID N0:6)，小鼠(SEQ ID NO :7)，水貂(SEQ ID NO :8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQ ID NO 10)的 CTproSP-C 具有至少70%同一性。
20.按照權利要求17-19中任一項所述的分離的蛋白，其選自由下列各項組成的組 包含與人CTproSP-C(SEQ ID NO 2)具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白，和包含與人CTproSP-C的Brichos結構域(SEQ ID NO 4)具有至少70%同一性的胺基酸序列的蛋白。
21.按照權利要求17-20中任一項所述的分離的蛋白，其由多於或等於90個胺基酸殘基組成。
22.按照權利要求21所述的分離的蛋白，其由多於或等於100個胺基酸殘基組成。
23.按照權利要求17-22中任一項所述的分離的蛋白，其選自由下列各項組成的組 來自人(SEQ ID NO :2)，牛(SEQ ID NO :5)，恆河猴(SEQ ID NO :6)，小鼠(SEQ ID NO 7)，水貂(SEQ ID N0:8)，兔(SEQ ID NO 9)或大鼠(SEQ ID NO: 10)的 CTpro SP-C，來自人(SEQ ID N0:4)，牛(SEQ ID N0:12)，恆河猴(SEQ ID N0:13)，小鼠(SEQ ID NO: 14)，水貂(SEQ ID NO: 15)，兔(SEQ ID NO 16)或大鼠(SEQ ID NO: 17)的 CTproSP-C 的Brichos結構域，和來自人的CTproSP-C的延長的Brichos結構域，所述延長的Brichos結構域具有SEQ ID NO :21ο
24.按照權利要求23所述的分離的蛋白，其選自由下列各項組成的組人 CTproSP-C (SEQ ID NO :2)，人 CTproSP-C 的 Brichos 結構域(SEQ ID NO :4)，和具有 SEQ ID NO 21的人CTproSP-C的延長的Brichos結構域。
25.按照權利要求17-24中任一項所述的分離的蛋白，其中與人proSP-C(SEQID NO: 1)中亮氨酸-188相對應的位置不是穀氨醯胺。
26.按照權利要求25所述的分離的蛋白，其中與人proSP-C(SEQID NO 1)中亮氨酸-188相對應的位置是嚴格保守的。
27.一種藥物組合物，其包括治療有效量的權利要求17-26中任一項所述的分離的蛋白和對其適合的藥用載體。
全文摘要
本發明公開一種分離的蛋白，其選自由下列各項組成的組(i)包含與來自哺乳動物的肺表面活性蛋白C前體(CTproSP-C，″CTC″)的C端結構域具有至少70％同一性的胺基酸序列的蛋白；和(ii)包含與來自哺乳動物的CTproSP-C的Brichos結構域具有至少70％同一性的胺基酸序列的蛋白，所述分離的蛋白用於治療包括人的哺乳動物中的阿爾茨海默病。
文檔編號C07K14/785GK102300582SQ201080005669
公開日2011年12月28日 申請日期2010年1月29日 優先權日2009年1月30日
發明者伊恩·約翰森 申請人:阿爾法貝塔公司