一種O型口蹄疫病毒人工重組抗原及其製備與應用的製作方法
2023-11-07 05:00:33 2
本發明屬於生物製劑領域，具體地，涉及一種O型口蹄疫病毒人工重組抗原及其製備與應用。
背景技術：
口蹄疫(Food and Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Food and Mouth Disease Virus,FMDV)引起的偶蹄動物急性、熱性、高度接觸性、烈性傳染病，其臨床表現以口腔黏膜、舌面、鼻鏡、蹄部、乳房皮膚發生水泡和潰爛為特徵。世界動物衛生組織(OIE)和我國政府均將該病列為A類動物傳染病之首。由於該病的爆發影響國際貿易，常造成巨大的經濟損失和政治影響，因此，口蹄疫防治工作始終受到世界各國政府的高度重視。
在FMD防治工作中，診斷、監測是至關重要的環節。準確可靠的診斷監測、結果是制定正確防制措施的依據。由於FMDV有7個血清型、65個亞型、型間不能交互免疫保護，不同亞型、不同分離株的抗原性也有不同程度的差異，給FMD的診斷工作帶來困難。特別是在注射FMD疫苗的國家和地區，原有的一些檢測技術失去了應用價值。因此，正確鑑別FMD滅活疫苗免疫動物和自然感染動物是FMD防治工作中的一項重要內容，也是OIE判斷一個國家或地區有無FMD的重要依據之一。
隨著分子生物學技術的快速發展，利用基因工程技術為FMD鑑別診斷提供一種特異、穩定、安全、高效的重組抗原，已經成為該項研究的首選。FMDV非結構蛋白(Nonstructural proteins,NSP)是病毒在複製過程中產生的蛋白，在自然感染的情況下，動物會產生抗NSP抗體，而滅活疫苗在純化過程中除去了大部分非結構蛋白，免疫動物不會產生所有的非結構蛋白抗體，故通過檢測血清中抗NSP抗體，可以區分自然感染動物與滅活疫苗免疫的動物，從而確定動物群體中FMDV的感染情況。
在FMDV幾種非結構蛋白中，3D和2C非結構蛋白已經被證明不能用於區分感染動物和免疫動物。Mackay等和Bergmann等研究發現，應用3ABC作為鑑別自然感染動物和疫苗免疫動物是最好的選擇。利用基因工程表達3ABC或3AB重組蛋白作為抗原研製的ELISA試劑盒，在無口蹄疫國家應用效果較好。原因是在這些國家、所檢動物沒有接種滅活疫苗，或者即使進行了免疫接種，由於其生產的滅活疫苗質量較高，免疫動物不易產生非結構蛋白抗體。然而這種試劑盒在我國的應用效果不是很理想(口蹄疫鑑別診斷，見江鵬斐等：2000年湖北襄樊第八次家畜口蹄疫學術研討會論文集)。據分析，主要原因是由於國內所用口蹄疫滅活疫苗所含的成份比較複雜，尤其是培養病毒的細胞成份含較高，加之口蹄疫滅活疫苗在注射時劑量被人為加大，以及多次反覆免疫，容易使免疫動物產生非結構蛋白抗體。故，獲得敏感、特異性好的非結構蛋白抗原是目前需解決的首要問題。
3ABC是口蹄疫病毒的一種非結構蛋白，參與病毒RNA複製，是高保守區，3ABC蛋白是由3A、3B和3C組成，其中3B多肽是由編碼區3個串聯重複的非等同基因編碼的，因而可以產生3種不同的3B蛋白(VPg)，這是RNA病毒基因組中少見的信息重複現象(King A M Q,ET AL.,1980)，而且VPg基因的拷貝數與RNA病毒的感染力有關(Falk M M.,ET AL.,1992)。插入或者缺失一個VPg基因並不影響病毒RNA的複製(Falk M M.,ET AL.,1992)。攜帶有pUpU結構的VPg蛋白可以與3`端的Poly(A)結合作為病毒RNA合成時的引物蛋白，這種特殊的RNA複製方式與宿主細胞mRNA轉錄不同，因而在宿主RNA合成受到抑制時，並不影響病毒RNA的合成。上述研究表明VPg蛋白的確與病毒感染有關。
田克恭、孫明等人於2007年對3B進行了相關研究，發現，3B抗原用於健康牛群、免疫牛群和未免疫感染牛群的鑑別診斷特異性、敏感性較好，只是仍然存在一定的漏檢或者假陽性。
本領域亟需開發一種更可靠、更準確的抗原用於檢測O型口蹄疫病毒。
技術實現要素：
根據上述領域現有抗原存在漏檢、假陽性等不足，以及亟需開發新抗原的需求，本發明提供一種敏感、特異性好的口蹄疫病毒非結構蛋白重組抗原及其製備方法，本發明重組抗原可用於鑑別口蹄疫病毒自然感染動物和疫苗免疫動物。
本發明的技術方案如下：
一種O型口蹄疫病毒人工重組抗原，其胺基酸序列包含如Seq ID No.4所示的肽段。
所述O型口蹄疫病毒人工重組抗原，其胺基酸序列如Seq ID No.5所示。
編碼所述O型口蹄疫病毒人工重組抗原的基因片段。
表達所述O型口蹄疫病毒人工重組抗原的重組表達載體，其特徵在於，包含編碼Seq ID No.4所示的肽段的核苷酸序列。
一種轉化體，其特徵在於，包含所述的重組表達載體。
所述O型口蹄疫病毒人工重組抗原的製備方法，其特徵在於，包括：
將所述的重組表達載體轉化宿主細胞獲得工程菌，進行工程菌培養、誘導表達獲得重組蛋白。
所述重組表達載體為PGEX-20T-VPg1；
所述宿主細胞為大腸桿菌ER2566菌株；
所述培養指，用添加了100μg/mL AMP的LB培養液在37℃下振蕩培養所述轉化後的宿主細胞；
所述誘導表達指，在所述培養液OD450＝0.6-0.8時，加入終濃度為1mmol/L的IPTG。
所述製備方法還包括對工程菌的誘導表達產物進行如下純化步驟：
(1)超聲破碎
8000g離心所述工程菌10min，棄上清收集沉澱；所述沉澱用粗提緩衝液懸浮，用超聲波破碎處理，16000g離心20min，取上清棄沉澱；
所述粗提緩衝液為0.05mol/L pH8.5Tris-HCl緩衝液；
(2)粗提層析
將所述上清以16ml/min流速穿過DEAE-FF柱；上樣完畢後用粗提緩衝液衝洗上樣峰至基準線；用粗提洗脫液衝洗柱子到出峰，收集洗脫峰；
所述DEAE-FF柱在使用前先用所述粗提緩衝液平衡10個柱床體積；
所述粗提洗脫液為0.02mol/L pH6.8磷酸鹽緩衝液；
(3)精提層析
將上一步中收集的樣品用精提緩衝液3倍稀釋後以16ml/min流速穿過CM-FF柱；上樣完畢後用精提緩衝液衝洗上樣峰至基準線；用精提洗脫液衝洗柱子到出峰，收集洗脫峰；
所述精提緩衝液為0.05mol/L pH5.5醋酸鹽緩衝液；
所述CM-FF柱在使用前先用所述精提緩衝液平衡15個柱床體積；
所述精提洗脫液為0.1mol/L氯化鈉溶液；
(4)樣品透析
精提層析中收集的樣品用樣品保存緩衝液以內外體積1:20的比例進行透析，每隔4h換透析液一次，共換透析液3次，然後用0.22μ的微孔濾膜除菌過濾，獲得的所述重組抗原-20℃保存；
所述樣品保存緩衝液為0.02mol/L pH8.0磷酸鹽緩衝液。
用於檢測O型口蹄疫病毒和/或鑑別O型口蹄疫病毒自然感染動物和疫苗免疫動物的試劑盒，其特徵在於，包括：
所述O型口蹄疫病毒重組抗原；和/或
所述核苷酸序列；和/或
所述重組表達載體；和/或
所述轉化體。
所述O型口蹄疫病毒重組抗原的工作濃度為0.5μg/mL-5μg/mL。
本發明提供一種O型口蹄疫病毒人工重組抗原，其胺基酸包括如Seq ID No.4所示的肽段。本發明的口蹄疫病毒非結構蛋白重組抗原可用於鑑別診斷自然感染動物和疫苗接種動物，具有特異性好、敏感性強等優點。Seq ID No.4所示的肽段即VPg1重組蛋白，該蛋白僅由23個胺基酸組成，為僅有少數的抗原決定簇的小片段多肽，以有效區分感染動物的單決定簇抗原或寡決定簇抗原，鑑別口蹄疫病毒疫苗免疫動物和自然感染動物。
在本發明一些具體的實施例中，所述人工重組抗原的胺基酸序列如Seq ID No.5所示。
基於本領域公知的密碼子理論，本發明還請求保護所有能夠編碼上述O型口蹄疫病毒重組抗原的核苷酸序列。
基於分子生物學實驗操作理論，連接有編碼Seq ID No.4所示肽段的核苷酸序列的重組表達載體，經適當的分子生物學實驗操作，例如，轉化、培養、誘導表達等，也可以表達上述O型口蹄疫病毒人工重組抗原，因此本發明請求保護包含編碼Seq ID No.4所示肽段的核苷酸序列的重組表達載體。在具體的實施例中，所述編碼Seq ID No.4所示肽段的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。
同樣地，基於分子生物學實驗操作理論，將上述重組表達載體轉化至合適的宿主細胞，可得到一種轉化體，該轉化體經培養和/或誘導表達亦可獲得本發明所述的O型口蹄疫病毒重組抗原，因此本發明還請求保護包含所述的重組表達載體的轉化體。在一些具體的實施例中，所述宿主細胞優選大腸桿菌ER2566菌株，所得到的轉化體是包含有連接了Seq ID No.1所示的VPg1核苷酸序列的上述重組表達載體的工程菌。
本發明的另一些實施例還提供了所述O型口蹄疫病毒重組抗原的製備方法，包括：將Seq ID No.1所示的核苷酸序列擴增的連接表達載體、轉化宿主細胞獲得工程菌進行培養、誘導表達獲得重組蛋白；和/或，將所述的重組表達載體轉化宿主細胞，獲得工程菌進行培養，誘導表達獲得重組蛋白；和/或，將所述的轉化體進行培養，誘導表達獲得重組蛋白。
在進一步的實施例中，所述方法還包括純化所述重組蛋白。純化這一步的優點在於可提高重組蛋白的純度、質量及反應活性，使其符合用於檢測的使用要求。
上述方法的各個步驟：連接、轉化、誘導表達和/或純化，均為本領域常規操作方法，在基於對上述VPg1蛋白的胺基酸序列或其對應的VPg1核苷酸序列的了解下，本領域技術人員可以按照《分子克隆實驗指南》等技術手冊獲得與本發明所述O型口蹄疫病毒重組抗原作用相同的重組蛋白。
在本發明一個最為具體的實施例中，所述口蹄疫病毒非結構蛋白重組抗原的製備方法是以O型口蹄疫病毒RNA為模板，用Seq ID No.2和Seq ID No.3所示的核苷酸序列為引物擴增得到目的基因擴增產物，將擴增產物插入載體pGEX-20T，得到重組質粒pGEX-20T-VPg1，載將其轉到大腸桿菌ER2566菌株，在37℃，含氨苄青黴素(100ug/mL)的LB培養基中培養，用IPTG誘導表達重組蛋白，再將誘導的重組蛋白進行純化。
為了完善本發明的便捷度，本發明還提供一種用於檢測O型口蹄疫病毒和/或鑑別O型口蹄疫病毒自然感染動物和疫苗免疫動物的試劑盒，其包括：所述的O型口蹄疫病毒重組抗原；和/或所述重組抗原對應的核苷酸序列；和/或連接有VPg1核苷酸序列的重組表達載體；和/或包含所述重組表達載體的轉化體。根據上面的原理敘述，以VPg1蛋白為核心的所述O型口蹄疫病毒重組抗原、連接有VPg1核苷酸序列的重組表達載體、和/或包含所述重組表達載體的轉化體都能實現檢測O型口蹄疫病毒的效果，也均可起到鑑別診斷O型口蹄疫病毒自然感染動物和疫苗免疫動物的作用，因此上述幾種物質的任意一種或幾種都可用於製備檢測O型口蹄疫病毒的試劑盒和/或鑑別口蹄疫病毒自然感染動物和疫苗免疫動物的免疫學診斷試劑盒；所述試劑盒可以是酶聯診斷試劑，膠體金免疫試紙條等。
在一些優選的實施例中，本發明所述O型口蹄疫病毒重組抗原在所述試劑盒中的工作濃度為0.5μg/mL-5μg/mL。採用該工作濃度的重組抗原進行檢測，效果最優。
在一些國家專利法允許的情形下，本發明還請求保護所述O型口蹄疫病毒重組抗原，和/或所述重組抗原對應的核苷酸序列，和/或連接有VPg1核苷酸序列的重組表達載體，和/或包含所述重組表達載體的轉化體，和/或所述試劑盒在檢測O型口蹄疫病毒，和/或鑑別診斷O型口蹄疫病毒自然感染動物和疫苗免疫動物方面的用途。
經質量鑑定檢測證實，本發明所述的O型口蹄疫病毒重組抗原純度高、反應活性好、特異性好；並且經口蹄疫陰性群體牛血清、口蹄疫滅活疫苗免疫群體牛血清和口蹄疫病毒人工感染牛血清試驗，說明本發明利用原核表達系統表達的口蹄疫病毒非結構蛋白VPg1具有良好的反應原性，能夠與口蹄疫病毒陽性血清反應，且能很好的鑑別自然感染動物血清和滅活疫苗免疫血清；更為重要的是，本發明還對比了本發明的重組抗原與現有的幾種已知抗原在各類陰性群體、陽性群體、免疫群體的血清樣本中的檢測效果，發現本發明所提供的O型口蹄疫病毒重組抗原在檢測中的準確率更高。
採用本發明所述的口蹄疫病毒非結構蛋白VPg1重組抗原對O型口蹄疫病毒進行檢測，特異性好、安全、成本低，有較好的反應活性，且抗原製備操作簡便，能很好的鑑別自然感染動物和人工免疫動物血清，與現有已知的抗原相比較，漏檢率大大降低，檢測的特異性和敏感性達到了很高的水平。
附圖說明
圖1為VPg1基因擴增，泳道1：VPg1；M：DL2000Marker。
圖2為VPg1重組蛋白誘導表達的SDS-PAGE鑑定，泳道1：未誘導對照；泳道2：誘導菌；泳道3：菌體裂解沉澱；泳道4：菌體裂解上清；M為低分子量蛋白Marker。
圖3為蛋白純化SDS-PAGE鑑定，泳道1：純化的VPg1；M為低分子量蛋白Marker。
圖4為用口蹄疫病毒陰陽性血清對純化的重組蛋白進行Western-bloting鑑定，泳道1：O型口蹄疫病毒標準陽性血清；泳道2：豚鼠A型口蹄疫病毒標準陽性血清；泳道3：豚鼠Asia I型口蹄疫病毒標準陽性血清；泳道4：豚鼠C型口蹄疫病毒標準陽性血清；泳道5：豬水泡病陽性血清；泳道6：牛病毒性腹瀉病毒陽性血清；M：低分子量蛋白Marker。
具體實施方式
提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發明，並不局限於所述最佳實施方式，不對本發明的內容和保護範圍構成限制，任何人在本發明的啟示下或是將本發明與其他現有技術的特徵進行組合而得出的任何與本發明相同或相近似的方法和產品，均落在本發明的保護範圍之內。
生物材料來源
1.疫苗和血清：
實施例2中使用的O型口蹄疫活疫苗，購自乾元浩生物股份有限公司。牛O型口蹄疫病毒標準陽性血清、豚鼠A型口蹄疫病毒標準陽性血清、豚鼠C型口蹄疫病毒標準陽性血清、豚鼠Asia I型口蹄疫病毒標準陽性血清由中國農業科學院蘭州獸醫研究所惠贈。豬水泡病標準陽性血清和牛病毒性腹瀉標準陽性血清由農業部獸醫診斷中心保存。O型口蹄疫野毒株感染牛陽性血清由農業部獸醫診斷中心製備保存，O型口蹄疫疫苗株免疫牛陽性血清和口蹄疫病毒人工感染牛血清由內蒙古生藥廠和農業部獸醫診斷中心製備保存，口蹄疫陰性群體牛血清由北京進出境檢驗檢疫局提供。
實施例4中使用的10份口蹄疫陰性群體牛血清，由北京進出境檢驗檢疫局提供；口蹄疫滅活疫苗免疫群體牛血清和口蹄疫病毒人工感染牛血清各20份，由內蒙古生藥廠和農業部獸醫診斷中心共同製備並保存；10份口蹄疫病毒自然感染牛血清，由農業部獸醫診斷中心製備並保存；
實施例5中使用的O型口蹄疫自然感染陽性血清(20份)、O型口蹄疫人工感染陽性血清(20份)、口蹄疫滅活疫苗免疫陽性血清、疫苗免疫攻毒組陽性血清(10份)和口蹄疫陰性血清(20份)，均由農業部獸醫診斷中心保存提供。
2.載體和菌株：
pGEX-T-Easy載體購自Promega公司。Dh5a感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。pGEX-20T載體和E.coli ER2556菌株由廈門大學腫瘤與細胞工程實驗室夏寧邵教授惠贈。
主要試劑
總RNA提取試劑盒為Qiagen公司產品。AMV、Rnasin、DNTPs、Taq DNA聚合酶、T4連接酶、pGEM-T-Easy均購自Promega公司，膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒為Omega產品，Bgl II和Sal I為Takara產品。
實施例1、本發明所述重組抗原的獲得
本實施例提供一種O型口蹄疫病毒重組抗原，其包括VPg1蛋白；編碼所述VPg1蛋白的核苷酸序列由下述引物RT-PCR擴增O型口蹄疫病毒RNA獲得。
所述RT-PCR擴增引物如下：
引物1：AGATCTATGGGACCCTACGTCGGG(Seq ID No.2)
引物2：GTCGACTTACTCTTGCTGTGGTAGC(Seq ID No.3)
1.口蹄疫病毒總RNA的提取
用Qiagen公司的RNA提取試劑盒說明書從O型口蹄疫活疫苗中提取總RNA。
2.VPg1片段RT-PCR擴增
用步驟2得到的RNA作模板，用引物1和引物2進行RT-PCR擴增，25ul反應體系如下：純化水12μL，5XPCR buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)2.5μL，上下遊引物(10pmol)各1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)1μL，反轉錄酶0.3μL，RNA酶抑制劑0.2μL，RNA 2μL。擴增程序：42℃反轉錄45min，95℃熱啟動3min，95℃30s，50℃30s，72℃30s，35個循環後，72℃延伸10min。擴增產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑑定。結果顯示，得到大小為80bp左右的目的條帶，即VPg1蛋白的核苷酸序列，如Seq ID No.1及圖1所示。
3.VPg1DNA片段的純化回收
經凝膠電泳後，切下目的片段，進行膠回收純化，具體方法步驟詳見Omega膠回收試劑盒說明書。純化回收後的DNA放-20℃備用。
4.T-Easy-VPg1重組質粒的構建
連接體系10μL：pGEM-T-easy載體1μL，回收DNA 4μL，10X連接Buffer 1μL，純化水4μL，混勻後，16℃反應4h。然後進行轉化，具體方法如下：
1)從-70℃冰箱拿出一隻DH5a感受態細胞，迅速放入，實現準備好的冰水浴盒中，待感受態細胞融化，將連接產物輕輕加入並混勻。冰浴30min。
2)42℃熱擊：將上述加入連接產物的感受態細胞放進42℃水浴鍋中，熱擊45s，熱擊後迅速放入冰浴中3min。
3)在操淨臺中向熱擊好的管中加入無菌LB培養基500μL。37℃200轉，復甦細胞1小時。
4)取上述復甦好的轉化菌200μL，加入LB/AMP瓊脂板中，塗勻後，37℃溫箱中倒置培養16小時。
5.T-Easy-VPg1重組質粒的鑑定及提取
待步驟4中的菌板第二天長出單菌後，挑取10個單菌，分別接種於LB/AMP培養基中，37℃搖床220r培養12小時，用PCR方法鑑定陽性質粒。
PCR鑑定方法與體系如下：無菌水9.8μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，5X Buffer 4μL，上下遊引物(10pmol)各1μL，DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，最後加對應菌液2μL。擴增程序：95℃熱啟動3min，95℃30s，50℃30s，72℃30s，35個循環後，72℃延伸10min。擴增產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑑定。將鑑定陽性的菌樣送上海英俊生物工程有限公司測序。
測序結果顯示獲得編碼所述VPg1蛋白的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。所述VPg1蛋白的胺基酸序列如Seq ID No.4所示。
將測序正確的陽性菌液，提取質粒。質粒提取方法按照Promega質粒提取試劑盒方法進行。最後回收的質粒放-20℃保存備用。
6.所述重組表達載體PGEX-20T-VPg1的構建
用BamH I和Sal I雙酶切表達載體PGEX-20T，Bgl II和Sal I雙酶切T-Easy-VPg1重組質粒，回收目的基因片段，與表達載體PGEX-20T連接。並轉化到DH5a大腸桿菌中(方法步驟見方法5)，塗LB/AMP培養板37℃過夜培養。第二天無菌挑取平板上大小均勻的單菌落接種LB/AMP液體培養基中，並編號，37℃震蕩培養，12小時。按照步驟5中的菌液PCR方法進行鑑定。
將PCR鑑定為陽性的菌液，進行小量質粒提取，並進行雙酶切鑑定。酶切體系如下：Bgl II 0.5μL，Sal I 0.5μL，10X H Bufer 1μL，質粒DNA 4μL，無菌水4μL，37℃酶切3h。酶切反應結束後，取酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，將陽性質粒命名為PGEX-20T-VPg1。
7.所述轉化體的獲得
將上一步獲得的所述重組表達載體PGEX-20T-VPg1轉化至宿主細胞中，即可獲得本發明所述的轉化體。
具體地，所述宿主細胞為E.coli ER2556菌株。
轉化後獲得含有PGEX-20T-VPg1重組表達載體的工程菌，可以通過誘導表達獲得本發明所述的重組抗原。
8.VPg1的誘導表達及鑑定
將單菌接種4mL LB/AMP培養基中，37℃過夜震蕩培養。按1：100的比例將搖好的菌液接種到新的LB/AMP培養基中，37℃震蕩培養，當培養液OD450＝0.6～0.8時，加入終濃度為1mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，繼續培養6小時，收菌。將菌體用粗提緩衝液(pH8.5 50mmol/L Tris-HCL溶液)懸浮，超聲破碎處理，16000r/min離心20min，取上清和沉澱，進行SDS-PAGE電泳，結果顯示獲得了與預期大小相等的蛋白，分子量大小為29KDa左右(圖2)，重組蛋白存在於裂解上清和裂解沉澱中，即以可溶性形式存在於裂解上清中和以包涵體的形式存在裂解沉澱中，此步所得的重組蛋白即本發明所述的O型口蹄疫病毒重組抗原，其胺基酸序列為如Seq ID No.5所示。
為了保證所述重組抗原的純度和質量，還可對其進行進一步的純化。
9.重組蛋白純化
1)VPg1基因工程菌處理
將誘導的VPg1基因工程菌培養液8000g離心10min，棄上清收集沉澱。沉澱用粗提緩衝液(pH8.5 50mmol/L Tris‐HCl緩衝液)懸浮，用超聲波破碎處理，16000g離心20min，取上清棄沉澱。
2)粗提層析
用粗提緩衝液平衡DEAE‐FF柱，流速為16mL/min，平衡10個柱床體積。將上清用粗提緩衝液10倍稀釋，然後以16mL/min流速穿過DEAE‐FF柱。上樣完畢後用粗提緩衝液衝洗上樣峰至基準線。用粗提洗脫液(0.02mol/L pH6.8磷酸鹽緩衝液)衝洗柱子到出峰，收集洗脫峰。
3)精提層析
用精提緩衝液(50mmol/L pH5.5醋酸鹽緩衝液)平衡CM-FF柱，流速為16mL/min，平衡15個柱床體積後，將粗提層析中收集的樣品用精提緩衝液3倍稀釋，以16mL/min流速穿過CM-FF柱。上樣完畢後用精提緩衝液衝洗上樣峰至基準線。用精提洗脫液(100mmol/L氯化鈉溶液)衝洗柱子到出峰，收集洗脫峰。
4)樣品透析
精提層析中收集的樣品用樣品保存緩衝液(0.02mol/L pH8.0磷酸鹽緩衝液)以內外體積1:20的比例進行透析，每隔4h換透析液一次，共換透析液3次，然後用0.22μm的微孔濾膜除菌過濾，純化樣品進行蛋白含量測定，-70℃保存。
蛋白純化的這一過程，採用了重組蛋白通過粗提層析(DEAE-FF柱)和精提層析(CM-FF柱)兩步法，去掉一些與VPg1等電點比較接近的雜蛋白，使得目的蛋白更為純淨，最後用保存緩衝液進行透析，使得蛋白能更好的保存以保存其活性。
實施例2、本發明所述重組抗原的質量檢測
1)SDS-PAGE電泳鑑定
取測定濃度的純化蛋白20uL，加5×上樣緩衝液，煮沸5min，12000r離心10min，備用。按照表1中的配方配製分離膠和積層膠。
表1 SDS-PAGE電泳膠的配方
按照常規方法配製12％膠進行SDS-PAGE鑑定，以檢測VPg1純化率，電泳結果顯示，通過粗提，精提和透析，獲得了較純的重組蛋白，純化率在95％以上(見圖3)。
3)蛋白濃度與純度測定
用紫外光分光光度計測定純化的VPg1在260nm和280nm波長的光吸收值，按照以下公式計劃樣品中的蛋白濃度：蛋白質濃度(mg/mL)＝(1.45×A280-0.74×A260)×稀釋倍數。測定結果顯示純化的VPg1蛋白濃度為2.13mg/mL。蛋白質純度測定使用SDS-PAGE電泳檢查純化的蛋白樣品，並用薄層分析目的蛋白的純度。結果顯示蛋白樣品純度約為95％。符合使用要求。
3)反應活性鑑定
將純化的VPg1進行Western Blot鑑定：將純化的VPg1進行SDS-PAGE電泳，並轉移到NC膜上，分別用牛O型口蹄疫病毒標準陽性血清、豚鼠A型口蹄疫病毒標準陽性血清、豚鼠C型口蹄疫病毒標準陽性血清、豚鼠Asia I型口蹄疫病毒標準陽性血清、豬水泡病陽性血清和牛病毒性腹瀉病毒陽性血清進行Western Blot分析，封閉液為PBS配製的0.2％酪蛋白，10％馬血清，2％明膠溶液，其他按常規方法進行。結果顯示，牛O型口蹄疫病毒標準陽性血清、豚鼠A型口蹄疫病毒標準陽性血清、豚鼠C型口蹄疫病毒標準陽性血清、豚鼠Asia I型口蹄疫病毒標準陽性血清均與表達的VPg1重組蛋白在29KDa左右位置出現陽性條帶。豬水泡病陽性血清和牛病毒性腹瀉病毒陽性血清與表達的VPg1蛋白呈陰性反應。結果見圖4。
4)抗原特異性檢測
包被：用純化的VPg1抗原樣品作為包被抗原，將其用碳酸鹽緩衝液(0.05mol/L，PH9.6)稀釋成0.5μg/mL、1.0μg/mL及2.0μg/mL.向96孔酶聯反應板孔加100μL，在2～8℃下包被18-24h，取出，棄孔中抗原包被液。
封閉：加封閉液(100g Tris，50g酪蛋白，500g蔗糖，加水至30L，PH7.5)至包被的酶聯反應板各孔中，330μL/孔，室溫下封閉1h，棄去封閉液，洗板5次。
加樣：用牛口蹄疫標準陽性血清、牛口蹄疫標準陰性血清、豬水泡病陽性血清和牛病毒性腹瀉病陽性血清用樣品稀釋液(含10％馬血清的PBS緩衝液)稀釋10倍，加入酶聯反應板反應，100μL/孔，37℃孵育60min，棄去反應液，洗板5次。
加酶標記物：每孔加入100μL HRPO標記SPA(1：10000稀釋)，37℃孵育30min。棄去反應液，洗板5次。
顯色：每孔加入100μL TMB底物液，37℃孵育15min。每孔加入終止液100μL，並且輕輕震蕩混勻。
OD值測定：在450nm波長下測定各孔OD值。
結果顯示，牛口蹄疫標準陽性血清在0.5μg/mL、1.0μg/mL及2.0μg/mL VPg1抗原均呈陽性反應，牛口蹄疫標準陰性血清、豬水泡陽性血清和牛病毒性腹瀉病陽性血清均呈陰性反應，OD450值均小於0.2.結果見表2。
表2 VPg1抗原ELISA特異性檢測結果
實施例3、本發明所述的試劑盒及重組抗原間接ELISA檢測方法建立
本實施例提供一種用於檢測O型口蹄疫病毒和/或鑑別O型口蹄疫病毒自然感染動物和疫苗免疫動物的試劑盒，包括：
實施例1所提供的Seq ID No.1所示的核苷酸序列；和/或O型口蹄疫病毒重組抗原；和/或重組表達載體；和/或轉化體(具體為所述工程菌)。
進一步地，為了確定所述重組抗原在試劑盒中的工作濃度，以及為檢測各類血清樣本中FMDV建立ELISA檢測方法，進行如下試驗：
按照方陣滴定法分別確定VPg1重組抗原的最佳包被濃度、一抗血清的最佳稀釋倍數、酶標二抗兔抗牛IgG的最佳稀釋濃度及最佳反應時間等。基本方法如下：
包被：將VPg1抗原樣品用碳酸鹽緩衝液(0.05mol/L，pH9.6)稀釋成0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL和5μg/mL。向96孔酶聯反應板各孔中加入l00μL，在2～8℃下包被18～24h，取出，棄去孔中的抗原包被液，洗板5次。
封閉：用封閉液(100g Tris，50g Casein，500g sucrose；加水至30L，pH7.5)加入已包被的酶聯反應板各孔內，每孔330μL，在37℃溫箱封閉30min，棄去封閉液，洗板5次。
加樣：將牛口蹄疫標準陽性血清用樣品稀釋液(含10％馬血清的PBS緩衝液)按l:2、l:5、1:10的比例稀釋，加入包被酶聯反應板各孔內反應，每孔100μl，37℃孵育60min～120min。棄去反應液，洗板5次。
加酶標記物：每孔加入100μL HRPO標記兔抗牛IgG(1:10000稀釋)，37℃孵育30min～60min，棄去反應液，洗板5次。
顯色：每孔加入100μL TMB底物液。37℃孵育15min。每孔加入100μL終止液，並輕輕振蕩混勻。
OD值測定：在450nm波長下測定各孔OD值。
計算臨界值：用優化後的ELISA實驗體系分別檢測FMDV抗體陰性群體，計算陰性樣本OD450平均值和標準差，按照公式：陰陽性臨界值＝樣本OD450平均值+3倍的標準差。
結果顯示，經方陣滴定法確定重組抗原包被濃度為0.5μg/mL，血清稀釋度為10倍稀釋、辣根過氧化物酶標記羊抗牛IgG工作濃度為1:10 000，反應時間分別為血清樣品反應時間為30min、酶標記物反應30min，顯色10min。
陰陽性臨界值為0.235。
由此可以確定，本發明所述試劑盒中，所述O型口蹄疫病毒重組抗原的工作濃度範圍為：0.5μg/mL-5μg/mL，優選為0.5μg/mL。
實施例4、採用本發明所述的試劑盒檢測牛血清
採用實施例1所述的重組抗原VPg1和/或實施例3所述的試劑盒，以及所建立的ELISA檢測方法，對背景清楚的實驗牛血清和臨床上背景清楚的牛血清進行檢測，包括10份口蹄疫陰性群體牛血清、口蹄疫滅活疫苗免疫群體牛血清和口蹄疫病毒人工感染牛血清各20份、以及10份口蹄疫病毒自然感染牛血清。以OD450值/陰性對照血清OD450值≥2.0為判定陽性的標準。分析檢測結果，計算試劑盒敏感性。
臨床樣品檢測結果顯示，用VPg1重組抗原ELISA檢測20份口蹄疫陽性血清(10份自然感染病例和10份人工感染病例)均為陽性，敏感性100％，10份陰性血清和10份疫苗免疫血清均為陰性。
實施例5、本發明所述重組抗原與現有抗原的對比試驗
採用實施例1所述的重組抗原VPg1和/或實施例3所述的試劑盒，以及所建立的ELISA檢測方法(以下簡稱VPg1-ELISA)與現有技術中的VPg1-2和VPg2-3純化蛋白建立的間接ELISA(以下分別簡稱VPg1-2-ELISA和VPg2-3–ELISA)同時對背景清楚的O型口蹄疫自然感染陽性血清(30份)、O型口蹄疫人工感染陽性血清(30份)、口蹄疫滅活疫苗免疫陽性血清(30)、疫苗免疫攻毒組陽性血清(20份)和口蹄疫陰性血清(30份)進行檢測。
檢測結果見表3。檢測結果顯示，雖然VPg1-2-ELISA和VPg2-3–ELISA對於健康牛群、滅活疫苗免疫牛群的特異性和敏感性可達到100％，但它們對自然感染牛群、人工活病毒感染牛群和疫苗免疫後攻毒牛群有一定程度的漏檢，尤其是對疫苗免疫後攻毒牛群的漏檢率高達50％左右，而本發明所述的重組抗原對於健康牛群、自然感染牛群、疫苗免疫後未感染牛群以及人工活病毒感染牛群特異性和敏感性達到100％，不存在漏檢；只有疫苗免疫後攻毒牛群有一定的漏檢，但漏檢率控制在10％以下。
表3 對比試驗結果
SEQUENCE LISTING
北京世紀元亨動物防疫技術有限公司
中國動物疫病預防控制中心
一種O型口蹄疫病毒重組抗原及其製備與應用
P160207/SJY
5
PatentIn version 3.5
1
69
DNA
artificial sequence
O型口蹄疫病毒（Food and Mouth Disease Virus）VPg1蛋白對應的核苷酸序列
1
ggaccctacg tcgggccgct cgagcgtcag aaacctctta aagtgagagc agagctacca 60
cagcaagag 69
2
24
DNA
artificial sequence
O型口蹄疫病毒（Food and Mouth Disease Virus）VPg1蛋白RT-PCR擴增引物1
2
agatctatgg gaccctacgt cggg 24
3
25
DNA
artificial sequence
O型口蹄疫病毒（Food and Mouth Disease Virus）VPg1蛋白RT-PCR擴增引物2
3
gtcgacttac tcttgctgtg gtagc 25
4
23
PRT
artificial sequence
O型口蹄疫病毒（Food and Mouth Disease Virus）VPg1蛋白
4
Gly Pro Tyr Val Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Arg
1 5 10 15
Ala Glu Leu Pro Gln Gln Glu
20
5
252
PRT
artificial sequence
O型口蹄疫病毒（Food and Mouth Disease Virus）重組抗原
5
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
210 215 220
Gly Ser Arg Ser Met Gly Pro Tyr Val Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys
225 230 235 240
Pro Leu Lys Val Arg Ala Glu Leu Pro Gln Gln Glu
245 250