含有腫瘤細胞和提取物的組合物及其使用方法

2023-11-07 15:30:07

專利名稱：含有腫瘤細胞和提取物的組合物及其使用方法
技術領域：
本發明涉及含有經半抗原修飾的腫瘤細胞及其提取物的組合物，和通過給需要治療的受試者施用治療有效量的組合物以治療癌症的方法，所述組合物含有腫瘤細胞或腫瘤細胞提取物。本發明還涉及可用於誘導癌症患者的抗腫瘤反應的有效免疫接種方案。
Fujiwara等，免疫學雜誌，1984,132,1571表明只要首先在缺乏半抗原-特異性的抑制性T細胞時用半抗原致敏小鼠，某些半抗原化的腫瘤細胞，即與半抗原三硝基苯基(TNP)綴合的腫瘤細胞即能在鼠系統中誘導針對未經修飾的腫瘤細胞的全身性免疫力。得自經治療小鼠的脾細胞能完全和特異性地防止未經治療的受體動物中的腫瘤生長。Flood等，免疫學雜誌，1987,138,3573表明用與TNP-綴合併經紫外光-誘導的「消退性」腫瘤免疫的小鼠能排斥與TNP-綴合的，原本為非免疫性的「進行性」腫瘤。另外，這些小鼠隨後能抗未綴合的「進行性」腫瘤的攻擊。在另一個實驗系統中，Fujiwara等，免疫學雜誌，1984,133,510闡明經環磷醯胺預治療之後被三硝基氯苯(TNCB)致敏的小鼠能通過腫瘤細胞的原位半抗原化來消除大(10mm)腫瘤；隨後，這些動物能特異性地抗未綴合的腫瘤細胞的攻擊。
因包括下列方面的幾個原因，Fujiwara等人的教導與本發明的有所不同A.Fujiwara所述組合物中所用的細胞得自經誘導的可移植鼠腫瘤，而不是自發性的人腫瘤；B.Fujiwara所述組合物用於免疫預防，本發明用於免疫治療；C.Fujiwara所述組合物作為局部治療被施用，本發明的組合物通過全身性接種被施用；和D.Fujiwara所述組合物不會導致腫瘤消退，本發明的組合物能導致腫瘤消退和/或能使接受治療的至少大部分患者的生存期延長。
最近已闡明了能與未經修飾的組織發生交叉反應的T細胞的存在。Weltzien及其同事闡明用經TNP-修飾的同系淋巴細胞免疫的小鼠所產生的Ⅰ類MHC-限制的T細胞克隆能與MHC-相關的，經TNP-修飾的「自身」肽反應。Ortmann,B等，免疫學雜誌，1992,148,1445。另外，已證實用經TNP-修飾的淋巴細胞免疫小鼠會導致產生脾T細胞，所述細胞在體外表現出針對經TNP-修飾之細胞的細胞毒應答和再次增殖。Shearer,G.M.歐洲免疫學雜誌，1974,4,527。用經DNP-或TNP-修飾的自身細胞進行免疫所產生的淋巴細胞應答未經修飾的自身細胞的潛力相當重要，因為它與兩個臨床難題相關1)藥物-誘導的自身免疫病，和2)癌症免疫治療。關於前者，有人建議將攝取的藥物用作半抗原，該藥物與正常的組織蛋白質聯合形成能由T細胞識別的免疫原性複合物，Tsutsui,H等，免疫學雜誌，1992,149,706。隨後，會產生諸如全身性紅斑狼瘡的自身免疫病，甚至在停止服用令人不舒服的藥物之後仍會繼續發病。也就是暗示最後產生了與未經修飾的組織交叉反應的T淋巴細胞。
這些實驗的共同特徵是在抑制性細胞未被誘導的環境中用半抗原致敏。得自用環磷醯胺預治療並經TNCB-致敏之小鼠的脾細胞表現出抗輻射的「放大輔助細胞功能」，即它們能特異性增強體外抗-TNP細胞毒性的產生。另外，一旦這些放大的輔助細胞通過體外暴露於與TNP綴合的自身淋巴細胞而被激活，它們也能增強針對不相關的抗原(包括腫瘤抗原)的細胞毒性(Fujiwara等，1984)。Flood等(1987)，文獻同上表明該放大輔助細胞活性是由具有Lyt-1+,Lyt-2-,L3T4+,I-J+表型的T細胞介導的，該文獻認為這些細胞是一類新的免疫調節性T細胞，即反抑制細胞。
對黑素瘤患者的免疫治療表明施用高劑量(1000mg/M2)或低劑量(300mg/M2)的環磷醯胺，3天後用初始抗原匙孔嘁血藍蛋白致敏，可顯著增強針對該抗原的遲髮型超敏反應的獲得(Berd等，癌症研究，1982,42,4862；癌症研究，1984,44,1275)。低劑量環磷醯胺預治療使轉移型黑素瘤患者對注射的自身黑素瘤疫苗作出反應，針對自身黑素瘤細胞產生了遲髮型超敏反應(Berd等，癌症研究，1986,46,2572；Cancer Invest.,1988,6,335)。施用環磷醯胺導致外周血淋巴細胞非特異性T抑制功能降低(Berd等，癌症研究，1984,44,5439；癌症研究，1987,47,3317)，這可能是通過耗盡CD4+,CD45R+抑制型誘導性T細胞來實現的(Berd等，癌症研究，1988,48,1671)。這一免疫治療方式的抗腫瘤效果似乎受開始施用疫苗至產生針對腫瘤細胞的遲髮型超敏反應之間過長的時間間隔所限制(Berd等，美國癌症研究協會進展(Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.),1988,29,408(#1626))。因此，仍需要增強上述疫苗的治療效力，使其免疫原性更強。
目前，大多數腫瘤免疫學家同意下列觀點，即免疫系統破壞腫瘤的前提條件是負責腫瘤免疫力的T淋巴細胞白細胞浸潤至腫瘤塊。因此，大量注意力集中於由Stephen Rosenberg博士在NCI開創的「TIL」療法。Rosenberg博士和其他研究人員從人轉移癌中提取到一些天然存在的T淋巴細胞，通過在體外用T淋巴細胞生長因子白介素2(IL-2)培養，所述細胞的數目大大提高，Topalian等，臨床腫瘤雜誌(J.Clin.Oncol.),1988,6,839。然而，由於注射的T細胞「定居」於腫瘤位點的能力有限，此療法不是非常有效。
已在多項研究中治療性地利用了高濃度的IL2將淋巴細胞誘導成為非特異性細胞毒殺傷細胞的能力(Lotze等，生物反應雜誌，1982,3,475；west等，新英格蘭醫學雜誌，1987,316,898)。然而，高劑量靜脈內IL2的嚴重毒性使得該方法具有局限性。人們很少注意到下列觀察結果即較低濃度的IL2能通過誘導能抗原激活的T細胞的擴展而用作免疫佐劑(Talmadge等，癌症研究，1987,47,5725；Meuer等，柳葉刀，1989,1,15)。因此，仍需要了解並嘗試利用IL2作為免疫佐劑的用途。
據信，人黑素瘤能表達獨特的表面抗原，所述抗原可被T淋巴細胞識別，Old,L,癌症研究，1981,41,361；Van der Bruggen,P等，科學，1991,254,1643；Mukherji,B等，免疫學雜誌，1986,136,1888；和Anichini,A等，免疫學雜誌，1989,142,3692。然而，體內誘導針對該抗原的有效的T細胞-介導之反應的困難限制了在本發明人所做工作之前的免疫治療方法。
人們提出幾個模型用於解釋什麼情況下對人腫瘤-相關抗原似乎具有耐受性，它們包括1)下調早期抗腫瘤反應的腫瘤抗原-特異性抑制細胞，Mukherji等，文獻同上；Berendt,M.J和R.J.North.,實驗醫學雜誌，1980,151,69。
2)人腫瘤細胞無法引發T輔助細胞或為所述T細胞提供共刺激信號，Fearon,E.R等，細胞，1990,60,397；Townsend,S.E和J.P.Allison,科學，1993,259,368；和3)腫瘤細胞上主要組織相容性產物的表面表達減少，從而限制T細胞對它們的識別，Ruiter,D.J.,癌症生物學研討會，1991,2,35,上述假說無一在臨床系統中被證實。
對腫瘤進行活性免疫治療的目的是產生生產性的全身性T細胞介導的腫瘤特異性免疫力。腫瘤特異性的免疫力可在原發性的腫瘤位點起作用，也可用於清除遠離位點的小轉移病灶。已證實T細胞免疫力的產生是受高度調節的反應，所述反應需要細胞-細胞相互作用和產生大量細胞因子。最近，對大量人和鼠系統的研究表明T細胞反應可分為兩類，即Ⅰ和Ⅱ型(Mossman等，免疫學雜誌，1986,136:2348)。Ⅰ型反應是產生遲髮型超敏反應(DTH)所必需的，並與巨噬細胞激活和γ-幹擾素(IFNγ)的產生相關，已證實Ⅰ型反應與人麻風病(Yamamura,M等，科學，1991,254:277-279)和鼠利什曼原蟲病(Scott,P等，免疫學評論，1989,112:161-182)的消除相關。Ⅱ型反應與IL4和IL10的產生相關，主要支持抗體反應，並與麻風病(Yamamura,M等，文獻同上)和利什曼原蟲病(Yamamura等，文獻同上；和Scott,P等，文獻同上)的漸進形式相關。除了產生DTH外，預期Ⅰ型反應還能通過上調MHC和腫瘤相關抗原以及增強抗原呈遞(其繼發於局部IFNγ的產生)來增強腫瘤特異性CTL的產生。最近，已證實Ⅰ型和Ⅱ型反應能夠交叉調節IFNγ抑制Ⅱ型反應，而IL4和IL10抑制Ⅰ型反應(Scott，免疫學雜誌，1991,147:3149-3155；和Fiorentino等，免疫學雜誌，1991,146:3444-3451)。在利什曼原蟲屬系統中，損害位點處細胞因子的調製能使Ⅱ型轉變為Ⅰ型反應，因此，從漸進性感染變為能根除疾病(Scott,1991，文獻同上)。
Pisa等，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)199289:7708-7712在卵巢癌活檢樣品而不是卵巢癌細胞系中檢測到IL10mRNA；他們認為IL10來源於腫瘤浸潤淋巴細胞。Gastl等，國際癌症雜誌，1991,55:96-101發現48個腫瘤細胞系中有16個將IL10釋放至培養上清液；只有3-8個黑素瘤細胞係為陽性。最後，據Chen等，國際癌症雜誌，1994,56:755-760報導，得自轉移黑素瘤的9個細胞系中有6個表達IL10mRNA。然而，據本發明人所知，本發明首次報導了轉移黑素瘤活檢樣品中的IL10mRNA。
不知道這些觀察結果是否適用於人腫瘤-宿主關係，即T細胞浸潤腫瘤產生細胞因子的模式是否是免疫應答有效性的指徵。用自身性的，經DNP修飾之疫苗治療的轉移黑素瘤患者在腫瘤位點產生了炎症反應，Bred等，1991，文獻同上。從組織學上看，這些發炎損害的特徵在於有時與腫瘤細胞破壞相關的T細胞浸潤。本發明發現經DNP-疫苗治療的患者的腫瘤含有Ⅰ型T淋巴細胞，而在施用疫苗之前切下的腫瘤中未檢測到這種細胞。
治療人類癌症的常規嘗試尚未成功或僅僅部分成功，經常有不合乎需要的副作用。基於多種免疫學理論治療癌症的嘗試也尚未成功。儘管申請人使用與半抗原綴合的黑素瘤細胞成功地治療了某些黑素瘤患者，但癌症治療領域仍需要其它的和改良的誘導抗腫瘤反應的方法。目前，申請人發現了使用經半抗原修飾的腫瘤細胞或提取物的有效免疫接種方案。
發明簡述本發明涉及含有經半抗原修飾的腫瘤細胞和腫瘤細胞提取物的組合物，和通過施用本發明的組合物在癌症患者中誘導抗腫瘤反應的方法。
本發明一方面涉及分離的經半抗原修飾的哺乳動物，優選為人的腫瘤細胞或腫瘤細胞提取物。
另一方面，本發明涉及含有經半抗原修飾的哺乳動物腫瘤細胞或提取物的組合物。
另一方面，本發明提供了含有治療有效量的經半抗原修飾的哺乳動物，優選為人的腫瘤細胞或提取物的疫苗組合物。
另一方面，本發明涉及治療癌症的方法，所述方法包括給哺乳動物，優選為人施用含有治療有效量的經半抗原修飾的人腫瘤細胞或提取物的組合物，其中所述哺乳動物患有與所述腫瘤細胞膜相同類型的惡性腫瘤。
另一方面，本發明涉及根據每周一次的接種時間表治療癌症的方法。
附圖簡述

圖1顯示了針對經DNP-修飾的自身PBL和黑素瘤細胞產生DTH的動力學。用經DNP-修飾的PBL(LY)或經DNP-修飾的解離於轉移腫瘤塊的黑素瘤細胞(MEL)對經DNP-疫苗治療的轉移黑素瘤患者進行一系列皮膚檢測。每個條形表示患者組在各個時間點的平均DTH反應；誤差條形=標準誤差。在第119天僅測定了對PBL的反應。樣品規模第0,14,63天，N=84；第119天，N=57；第175天，N=42；第231天，N=35。
圖2顯示出對DNP的抗體反應。使用ELISA檢測在不同時間點所得血清中的抗DNP抗體(總免疫球蛋白)。滴度被定義為(樣品的OD峰值)×(稀釋度的倒數)，所述稀釋度給出的OD值等於陽性對照OD峰值的一半。
圖3是針對經DNP修飾的自身淋巴細胞的PBL增殖反應圖。在接受DNP-疫苗的4個患者的DTH反應達到峰值時，從患者體內得到PBL。以未經修飾的自身PBL為對照(autol LY)，檢測細胞對經DNP修飾的自身PBL的增殖能力(autol LY-DNP)。在第6天用125IUDR脈衝標記培養物。
圖4顯示了針對經DNP修飾的淋巴細胞的增殖反應動力學。從接受DNP疫苗的患者DM2體內連續收集PBL。深低溫保藏所述PBL，然後同時檢測所有樣品對經DNP修飾的自身PBL的增殖反應(autolLY-DNP)。在第6天用125IUDR脈衝標記培養物。
圖5顯示了針對經DNP修飾的細胞的增殖反應特異性。檢測得自兩個患者的PBL針對未經修飾的(autol LY)，經DNP修飾的(autolLY-DNP)，或經TNP修飾的(autol LY-TNP)的自身性PBL的增殖反應，和針對未經修飾的(MEL)或經DNP修飾的(MEL-DNP)經培養自身黑素瘤細胞的增殖反應。在第6天用125IUDR脈衝標記培養物。
圖6是擴展的T細胞的特異性分析。在IL2中擴展患者DM2的PBL，並重複地用自身性的經DNP修飾的B類淋巴母細胞進行刺激。檢測它們針對未經修飾的(autol LY)，經DNP修飾的(autol LY-DNP)，或經TNP修飾的(autol LY-TNP)的自身性PBL的增殖反應；針對未經修飾的(MEL)或經DNP修飾的(MEL-DNP)經培養自身黑素瘤細胞；和同種異體PBL(Allo LY)的增殖反應。在第6天用125IUDR脈衝標記培養物。
圖7顯示了針對經DNP修飾的自身細胞的CD8+和CD4+T細胞反應。通過正淘選將擴展的T細胞分為富含CD8或富含CD4的群體。然後檢測它們針對未經修飾的(autol LY)，經DNP修飾的(autol LY-DNP)的自身性PBL的增殖反應，和針對未經修飾的(MEL)或經DNP修飾的(MEL-DNP)經培養自身黑素瘤細胞的增殖反應。在第6天用125IUDR脈衝標記培養物。
圖8顯示了DNP-反應性T細胞的細胞因子產生情況。將通過以有限稀釋的方式鋪板得到的DNP-反應性T細胞系(「親代」)和3個傳代培養物(2F8,1D7,1C2)與自身性的經DNP修飾的B類淋巴母細胞保溫18小時；收集上清液並檢測其中的γ幹擾素(IFN)和IL4。
圖9顯示了通過抗-MHCⅠ類單克隆抗體封閉T細胞反應。用自身性的經DNP修飾的B類淋巴母細胞刺激擴展的CD8+T細胞，18小時後檢測培養物中的γ幹擾素。將刺激細胞與下列之一預保溫無抗體(無)，非特異性小鼠IgG(非-特異性)，單克隆抗體W6/32(Ⅰ類)，或單克隆抗體L243(Ⅱ類)。
圖10顯示出MHC對T細胞反應的限制。檢測擴展的CD8+T細胞(HLA-A1,A2,B8,Bw6)對經DNP修飾的自身性PBL，和得自其它4個患者並經DNP修飾的同種異體PBL作出反應而獲得的增殖能力。如圖所示，同種異體刺激細胞中的3個在一個或多個Ⅰ類位置處匹配，而第4個完全不匹配(A24,A26,B44,B63)。在第6天用125IUDR脈衝標記培養物。
圖11顯示了DNP-反應性T細胞的細胞毒性圖。在6-小時「Cr分析試驗中將自身性的(autol)或同種異體Ⅰ類-不匹配(allo)的黑素瘤細胞用作靶。效應細胞是擴展的CD8+,DNP-反應性T細胞。圖11A-用不同濃度的DNBS或TNBS使靶細胞半抗原化。效應細胞靶細胞的比例為20∶1。圖11B-以一系列效應細胞靶細胞(E∶T)的比例，將用2.5mg/ml DNBS或TNBS半抗原化的靶細胞與效應細胞混合。
圖12圖示了在手術後的月份裡，經DNP疫苗和非-半抗原化的對照疫苗治療後腫瘤消失的患者所佔的百分比。
圖13顯示了HPLC級分，所述級分被合併為各為10個級分的5組。在第2組中，得自經二硝基苯基修飾的黑素瘤細胞(DNP-MEL)或經二硝基苯基修飾的B細胞(DNP-LY)的肽具有刺激性。
圖14A-14B顯示了得自經DNP-疫苗免疫之患者的發炎的皮下黑素瘤結節能表達IFNγ和IL10的mRNA。圖14A顯示出經RT-PCR測定的細胞因子mRNA(泳道1=大小標記物；2=β-肌動蛋白；3=IFNγ；4=IL4；5=IL10)；圖14-B是皮下損害經HE染色的切片(400×)。
圖15A-15B顯示出得自未經免疫之患者的淋巴結轉移表達IL10mRNA而不是IFNγ mRNA。圖15A顯示出經RT-PCR測定的細胞因子mRNA(泳道1=大小標記物；2=β-肌動蛋白；3=IFNγ；4=IL4；5=IL10)；圖15-B是淋巴結轉移經HE染色的切片(400×)。
圖16是人黑素瘤轉移中表達的IL10 mRNA凝膠。經RT-PCR測定細胞因子mRNA(泳道1=大小標記物；C=IL10 cDNA對照；1-7=患者樣品)。
圖17是黑素瘤細胞表達的IL10 mRNA凝膠。圖17通過RT-PCR顯示了代表性的腫瘤活檢樣品和衍生細胞系中的IL10 mRNA表達(泳道1=大小標記物；2=IL10 cDNA；3=腫瘤活檢樣品；4=腫瘤細胞系)。
圖18A-18B是未發炎的黑素瘤活檢樣品的石蠟切片的原位RT-PCR(A=100×,B=400×)。
發明詳述本發明涉及癌症免疫治療。本發明範圍中包括腫瘤組合物和治療癌症的方法。本發明還涉及根據每周一次的接種時間表誘導抗腫瘤反應的方法。本發明意義上的抗腫瘤反應指的是下述中的至少一個腫瘤壞死，腫瘤消退，腫瘤炎症，腫瘤被激活的T淋巴細胞浸潤，遲髮型超敏反應和患者生存期的延長。本發明的腫瘤細胞和提取物及其組合物能引發T淋巴細胞，該T淋巴細胞具有浸潤哺乳動物腫瘤的特性；能引發針對哺乳動物腫瘤的炎性免疫應答；引發針對哺乳動物腫瘤的遲髮型超敏反應和/或在體外刺激T淋巴細胞。
由根據本發明的治療引起的抗腫瘤反應可以是轉移性腫瘤或穩定疾病的部分或完全消退。「完全」消退指的是在至少1個月內，更優選在至少3個月內約100％消退。「部分」消退指的是在至少1個月內，更優選在至少3個月內約50％以上的腫瘤消退。「穩定」疾病指的是經疫苗治療之後沒有顯著腫瘤生長的病症。經本發明的治療之後可以觀察到的另一個抗腫瘤反應是生存期的延長。
根據本發明可以治療任何惡性腫瘤，其中包括轉移的和原發性癌症以及實體和非實體腫瘤。實體腫瘤包括癌，非實體腫瘤包括血液惡性腫瘤。癌包括但不限於腺癌和上皮細胞癌。血液惡性腫瘤包括白血病，淋巴瘤和多發性骨髓瘤。以下是根據本發明的方法可用分離的經修飾腫瘤細胞膜治療之癌症的非限制性例子卵巢癌，包括晚期卵巢癌，白血病，包括但不限於急性骨髓性白血病，結腸癌，包括已轉移至肝臟的結腸癌，直腸癌，結腸直腸癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌，腎癌和前列腺癌。卵巢癌可以是腺癌或上皮細胞癌。結腸癌和前列腺癌是腺癌。白血病可源自髓樣骨髓或淋巴結。白血病可以是急性的，其表現為初級發展階段的成熟抑制，也可以是慢性的，其表現為成熟淋巴樣或髓樣細胞的過量增長。根據本發明可以治療Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ或Ⅳ期癌症，優選Ⅲ和Ⅳ期，甚至更優選Ⅲ期癌症。根據本發明可治療任何哺乳動物，優選可治療人。
可由腫瘤細胞或腫瘤細胞提取物製備本發明的組合物。腫瘤細胞可以是任一癌症類型的惡性細胞或惡變前的細胞。根據本發明，「惡變前細胞」指的是具有癌細胞跡象，但尚不是癌細胞的任何異常細胞；例如但不限於最終會導致頸癌的頸細胞發育異常變化，和發育異常的痣，所述痣是導致黑素瘤的異常皮膚細胞。優選腫瘤細胞和提取物源自欲被治療的癌症類型。例如，使用黑素瘤細胞或細胞提取物治療黑素瘤類癌症。腫瘤細胞和提取物可以是，但不限於解離於活檢樣品或組織培養物的自身細胞和同種異體細胞，以及幹細胞和得自這些來源的提取物。在一個優選的實施方案中，細胞和提取物是自身性的。然而，可使用任何非-同種異體的細胞，包括分離自患者腫瘤的自身性細胞培養物中產生的腫瘤細胞。在基因水平上，腫瘤細胞不需要與接受治療的患者的腫瘤細胞或非-腫瘤的體細胞完全(即100％)相同。腫瘤細胞和患者之間MHC分子的基因同一性一般是足夠的。另外，黑素瘤細胞上的特定抗原和患者腫瘤細胞上存在的抗原之間具有基因同一性。根據本領域已知的方法可測定基因同一性。對本發明來說，一種通過(使用例如重組DNA技術)改變基因後，使之在例如患者的特定MHC分子和/或患者癌細胞上的特定抗原方面遺傳上相同腫瘤細胞屬於「非-同種異體」的細胞，包括在本發明的範圍中。這種細胞也被稱為「MHC-相同的」或「MHC-相容的」細胞。
本發明的腫瘤細胞提取物可以是分離自經半抗原修飾的癌細胞的肽，或者是分離自經半抗原修飾的癌細胞的細胞膜。提取物也可以首先分離自腫瘤細胞，然後再對其進行半抗原修飾。
對本發明而言，肽是含有兩個或多個胺基酸的化合物，包括蛋白質。優選肽為低分子量，約為1,000kD至約10,000kD，更優選約為1,000至約5,000，所述肽分離自半抗原化的腫瘤細胞，並可刺激T細胞淋巴細胞以產生γ幹擾素。T細胞是淋巴細胞，它可介導兩種類型的免疫功能，即效應子和調節功能，能分泌蛋白質(淋巴因子)並殺死其它細胞(細胞毒性)。效應子功能包括反應性，例如遲髮型超敏，同種異體移植排斥，腫瘤免疫力，和移植物-抗-宿主反應性。由T細胞效應子功能表現淋巴因子的產生和細胞毒性。T細胞的調節功能表現在它們能放大由其它T細胞所發揮的細胞介導性細胞毒性，和B細胞產生的免疫球蛋白。調節功能也需要淋巴因子的產生。T細胞對包括但不限於促分裂原，抗原或凝集素的誘導刺激物作出反應而產生γ幹擾素(IFNγ)。除了優選肽為半抗原化的肽外，還優選肽約為8至約20個胺基酸。肽可分離自細胞表面，細胞內部或這兩個部位的任意組合。提取物可以是癌細胞(與正常細胞相對)類型所特定的提取物。本發明的肽包括但不限於與主要組織相容性複合體結合的肽，細胞表面-相關蛋白，由癌症癌基因或突變的抗-癌基因編碼的蛋白質。
本發明的癌細胞膜可以是分離自半抗原化癌細胞膜的全部或部分。根據本發明所述癌細胞膜的定義，可分離癌細胞膜然後使其半抗原化，或者，可使癌細胞半抗原化，隨後分離其細胞膜。
細胞提取物能刺激T細胞，本發明意義上的刺激指的是對細胞提取物反應所致的T細胞增殖以及由T細胞產生細胞因子。分離自經半抗原修飾的腫瘤細胞和蛋白質的膜和蛋白質各自獨立地具有刺激T細胞的能力。通過T細胞對經修飾的核酸，例如但不限於3H胸苷，125IUDR(碘化脫氧尿苷)；和染料，例如染色活細胞的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)的攝取觀察到T細胞增殖。另外，還產生了細胞因子，例如但不限於IFNγ，腫瘤壞死因子(TNF)和IL-2。所產生細胞因子的量優選大於15pg/ml，更優選約為20至約30pg/ml，甚至更優選約為50pg/ml。
優選地，腫瘤細胞提取物含有細胞材料，所述材料是特定癌症類型所特有的，或者基本上特異於所述癌症類型。本發明的腫瘤細胞可以是活細胞。在一個優選的實施方案中，本發明的腫瘤細胞和提取物在注射後不能在患者體內生長。防止細胞生長的方法是本領域技術人員所熟知的。例如，使用前可照射腫瘤細胞。在一個實施方案中，以約2500cGy的量照射腫瘤細胞或提取物以防止細胞在注射後生長。
本發明的組合物可單獨或與其它化合物聯合用於本發明的方法中，所述化合物包括但不限於本發明的其它組合物。因此，癌細胞和癌細胞提取物可以單獨或者共同使用。本發明意義上的共同使用包括一起和連續施用。另外，癌細胞膜可以與肽共同使用。另外，癌細胞和/或提取物可以與其它化合物共同使用，所述化合物包括但不限於細胞因子，例如白介素2，白介素-4，γ幹擾素，白介素-12,GM-CSF。本發明的腫瘤細胞和提取物也可與其它癌症療法聯合使用，所述療法包括但不限於化學療法，放射，抗體，寡核苷酸序列和反義寡核苷酸序列。
本發明的組合物可以與藥物可接受的載體混合施用，可根據想用的給藥途徑和標準的藥學實踐來選擇這些載體。劑量可根據患者的體重和臨床病症來確定。活性成分與載體的比例一般取決於組合物的化學特性，溶解性和穩定性以及所期望的劑量。本發明的腫瘤細胞和提取物的使用量取決於化合物與癌細胞的親和力，所存在的癌細胞量和組合物的溶解性。
本發明的組合物可以與免疫佐劑和/或藥物可接受的載體混合。任何已知可用於藥物傳遞的含水載體，例如但不限於鹽水都可用作本發明的載體。另外，本領域技術人員已知的任何佐劑都可用於本發明的傳遞。佐劑具有增強針對本發明腫瘤細胞製品的免疫應答的特性。代表性的佐劑例子是BCG，或合成佐劑，含有純化自Quillaja saponaria樹皮的均質皂苷的QS-21，小棒桿菌(Corynebacterium parvum)(McCune等，癌症，1979,43:1619)，一般的皂苷，解毒的內毒素和細胞因子，例如白介素-2，白介素-4，γ幹擾素(IFN-γ)，白介素-12，白介素-15,GM-CSF及其組合。
當細胞和細胞提取物被輻照和半抗原化時，可使細胞與半抗原綴合，然後再輻照。或者，可輻照細胞然後再與半抗原綴合。在任一種情況下，隨後可純化提取物，然後再進行照射和/或半抗原化。為了輻照和半抗原化提取物，首先可進行其中一種方法，接著再進行另一種方法。
或者，可在抗原呈遞細胞中加入腫瘤細胞或腫瘤細胞提取物。可同時使用癌細胞提取物和另一種細胞類型的抗原呈遞細胞來治療癌症，所述抗原呈遞細胞選自自身性的經培養巨噬細胞和自身性的經培養樹突狀細胞。不用究其來源，巨噬細胞是任何大的阿米巴樣單核細胞，諸如但不限於組織細胞和單核細胞，所述細胞吞噬，即吞食和破壞其它細胞，死組織，退化細胞等。巨噬細胞是抗原呈遞細胞，它將抗原，包括腫瘤抗原呈遞至包括T細胞的細胞。樹突狀細胞也是抗原呈遞細胞，它似乎與巨噬細胞密切相關，然而，相對於巨噬細胞而言，樹突狀細胞是更加有效的抗原呈遞細胞。它們是強有力的T細胞刺激物，可分離自多個身體器官和組織，包括但不限於血液，皮膚(其中樹突狀細胞指的是朗氏細胞)，淋巴樣組織。
可使用例如，其上結合有肽或膜的抗原呈遞細胞免疫患者。得到患者的血液，從中提取巨噬細胞或樹突狀細胞。將高濃度的肽(約為1ng/ml至約1μg/ml，優選約為10ng/ml至約100ng/ml)或膜(約105至約107個細胞當量(c.e.)，細胞當量與起始細胞數目相關，是得自所示數目之細胞的細胞提取物的量)與細胞保溫過夜或保溫約8小時。當與膜保溫時，膜被巨噬細胞或樹突狀細胞吞噬。使用吞噬膜的巨噬細胞或樹突狀細胞免疫患者，Grabbe,S等，今日免疫學，1995,16:117-121,其全文列入本文作為參考。
每個劑量的本發明疫苗組合物可含有例如至少104個腫瘤細胞或等細胞當量的腫瘤細胞提取物(例如分離的膜或肽)，優選含有至少105個細胞/細胞當量提取物，最優選含有至少106個細胞/細胞當量提取物。劑量是單次給藥所施用疫苗組合物的量。在一個實施方案中，每劑量疫苗組合物含有約105至約2.5×107個細胞/細胞當量提取物，更優選含有約5×106個細胞/細胞當量。在一個優選的實施方案中，疫苗組合物最多含有7.5×106個細胞/細胞當量提取物。本發明所用腫瘤細胞和腫瘤細胞膜的量一般取決於化合物與癌細胞的親和力，所存在的癌細胞量和組合物的溶解性。劑量可根據患者的體重和臨床病症來確定。
本發明的疫苗組合物可包裝成適於真皮內，靜脈內，腹膜內，肌內和皮下給藥的劑量形式。或者，劑量形式可含有本發明的製品(例如腫瘤細胞，膜，肽)，給藥時可用例如適當的稀釋劑重建該製品。
可通過任何適當的途徑施用本發明的腫瘤細胞，腫瘤細胞提取物及其組合物，所述途徑包括接種和注射，例如真皮內，靜脈內，腹膜內，肌內和皮下給藥。每次疫苗治療有多個給藥位點，例如，每次給藥可通過真皮內注射至少2個，優選為3個鄰接的位點以施用疫苗組合物。在本發明的一個實施方案中，將疫苗組合物施用於上臂或腿。
在施用本發明的疫苗組合物之前，通過在皮膚上使用半抗原而用其免疫受試者，所述半抗原將用於修飾腫瘤細胞和膜。例如，可使用二硝基氟苯(DNFB)。在本發明的一個實施方案中，在施用疫苗之前未用半抗原免疫患者。隨後(例如，大約2周後)，用腫瘤細胞或提取物組合物注射受試者。在總共至少3次，優選為至少6次的治療中(通過例如再次注射)施用組合物。在一個實施方案中，給藥的總數(包括最初的給藥)可以是8次，而在另一個實施方案中可以是10次。主管醫生可設計接種時間表以適合特定受試者的病症。疫苗注射的間隔可以是例如4周，優選為2周，最優選為1周。在一個優選的實施方案中，每周注射一次疫苗，總共注射6次。可交替使用半抗原化的和非半抗原化的疫苗。在一個優選的實施方案中，所有疫苗都含有經半抗原修飾的腫瘤細胞或提取物。可以施用加強疫苗，優選施用一種或兩種加強疫苗。可在初次給藥後約6個月或約1年之後施用加強疫苗。
可在每次施用疫苗的前幾天(約3天)施用藥物環磷醯胺(CY)以增強針對腫瘤細胞的免疫應答。在一個優選的實施方案中，僅在首次注射疫苗之前施用CY。
本發明的疫苗可以是半抗原化的或非-半抗原化的。疫苗的半抗原化或化學-連接的形式包括例如與二硝基苯基(DNP)半抗原化的腫瘤細胞。其它半抗原包括但不限於三硝基苯基，N-碘代乙醯基-N』-(5-磺酸-1-萘基)乙二胺，三硝基苯磺酸，異硫氰酸螢光素，異硫氰酸砷酸苯，三硝基苯磺酸，對氨基苯磺酸，對氨苯基砷酸，二硝基苯-S-芥。也可使用半抗原組合。類似地，可使腫瘤細胞提取物疫苗半抗原化。對半抗原化的癌細胞提取物而言，提取物，肽和癌細胞膜分離自半抗原化的癌細胞。本發明還包括腫瘤細胞和/或細胞提取物的非-半抗原化疫苗。
在本發明的一個實施方案中，治療被懷疑患有癌症之患者的方法可包括，施用藥物可接受量的環磷醯胺和藥物可接受量的組合物，所述組合物選自活的腫瘤細胞，腫瘤細胞提取物，和腫瘤細胞和腫瘤細胞提取物的混合物。當組合物是癌細胞提取物時，提取物可以是分離自半抗原化癌細胞的肽或膜。組合物可與免疫佐劑和/或藥物可接受的載體混合。施用半抗原化疫苗之後，任選再施用藥物可接受量的非-半抗原化疫苗。也可根據本發明的方法施用非半抗原化的疫苗。
在本發明的另一個實施方案中，每周施用本發明的組合物，總共達至少6周，首次給藥之前先施用藥物可接受量的環磷醯胺。優選組合物最多含有約7.5×106個細胞或細胞當量提取物。在施用疫苗之前不必用半抗原免疫患者。
本發明的疫苗組合物可含有腫瘤細胞和/或腫瘤細胞提取物。可按下述製備本發明所用的腫瘤細胞按Berd等(1986)，文獻同上(全文列入本文作為參考)所述處理腫瘤塊。通過用膠原酶和DNA酶酶促解離並通過機械解離提取細胞，在控速凍幹儀中凍幹，儲存於液氮中待用。在患者接受皮膚檢測或治療的當天，融化，洗滌細胞，並用約2500R照射。再次洗滌細胞，然後懸浮於不含酚紅的Hanks平衡鹽溶液中。通過Miller和Claman，免疫學雜誌，1976,117,1519(全文列入本文作為參考)的方法使製備的細胞與DNP綴合，所述方法包括在無菌條件下將腫瘤細胞與DNFB保溫30分鐘，接著用無菌鹽水洗滌細胞。
通過分離膜並修飾膜或在首先不分離膜的情況下使細胞與半抗原綴合而使患者的癌細胞與半抗原綴合。
通過從患者未經修飾的癌細胞製品中分離膜來製備癌細胞膜。將細胞懸浮於約5倍體積的約30mM碳酸氫鈉緩衝液中，所述緩衝液中含有約1mM苯甲基磺醯氟，用玻璃勻漿器破碎細胞。在約1000g下離心以除去殘留的完整細胞和核。通過在100,000g下離心90分鐘以沉澱膜。將膜重新懸浮於約8％蔗糖中，在約-80℃下冷凍待用。在膜懸浮液(約5,000,000個細胞當量/ml)中加入約0.5ml 1mg/ml二硝基氟苯(DNFB)維持約30分鐘。類似地，也可使用其它半抗原，例如但不限於三硝基苯基和N-碘代乙醯基-N』-(S磺酸-1-萘基)乙二胺。通過使膜對著約0.15M PBS透析約3天以除去過量的DNP。使膜沉澱下來。
或者，通過用諸如二硝基苯基的半抗原修飾患者的癌細胞，然後由所述細胞製備膜，即可製備出癌細胞提取物，肽或膜。在活檢過程中得到患者的癌細胞，冷凍待用。將約100mg DNFB(Sigma Chemical公司,St.Louis,MO)溶解於約0.5ml 70％乙醇中。加入約99.5ml PBS。DNFB的濃度應為約152mg/0.1ml。在37℃水浴中攪拌溶液過夜。溶液的貨架壽命約為4周。融化細胞，將細胞沉澱物重新懸浮於5×細胞/ml Hanks平衡鹽溶液中。在每ml細胞中加入約0.1ml DNFB溶液，室溫下保溫約30分鐘。類似地，也可使用其它半抗原，例如但不限於三硝基苯基，N-碘代乙醯基-N』-(5-磺酸-1-萘基)乙二胺，三硝基苯磺酸，異硫氰酸螢光素，異硫氰酸砷酸苯，對氨基苯磺酸，對氨苯基砷酸，二硝基苯-S-芥及其組合。然後用Hanks平衡鹽溶液將細胞洗滌2次。將細胞懸浮於約5倍體積的約30mM碳酸氫鈉緩衝液中，所述緩衝液中含有約1mM苯甲基磺醯氟，用玻璃勻漿器破碎細胞。在約1000g下離心以除去殘留的完整細胞和核。通過在100,000g下離心90分鐘以沉澱膜。將膜重新懸浮於約8％蔗糖中，在約-80℃下冷凍待用。
從經DNP修飾的細胞中提取肽，其中的一些肽因修飾細胞的結果而被DNP修飾。可在本領域技術人員已知的蛋白質提取技術之後進行抗原分析以分離能對患者進行有效治療的抗原。分離細胞提取物的方法是本領域技術人員眾所周知的。簡單地說，從腫瘤中分離出癌細胞並在體外培養。根據上述方法在經培養的細胞中加入二硝基苯基。根據Rotzschke等，自然,1990,348,252(其全文列入本文作為參考)建立的技術從細胞中分離肽。用弱酸處理細胞，然後離心得到上清液，通過HPLC得到含有小肽的級分，濃縮並冷凍。通過使級分與自身性B類淋巴母細胞結合，然後檢測所述細胞刺激黑素瘤-特異性T淋巴細胞的能力即可篩選所述級分的免疫活性。
用例如但不限於三氟乙酸(TFA)的弱酸處理細胞，然後離心細胞得到上清液。通過凝膠過濾(G25 Sepharose,Pharmacia)從上清液中除去分子量大於5,000的化合物。在處於0.1％三氟乙酸(TFA)中的反相HPLC柱(Superpac Pep S,Pharmacia LKB)上，使用濃度漸增的乙腈梯度分離其餘上清液；流速=1ml/分鐘，級分大小=1ml。根據Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(1989)的方法，通過HPLC得到含有小肽的級分，濃縮並冷凍級分。通過使級分與自身性B類淋巴母細胞結合，然後檢測所述細胞刺激腫瘤(黑素瘤)-特異性T淋巴細胞的能力即可篩選所述級分的免疫活性。
在培養中的B類淋巴母細胞中加入EB病毒(EBV,ATCC CRL-1612,B95-8 EBV轉化的白細胞，棉頂絨猴，Saguinus oedipus)。將B類淋巴母細胞轉化至得自患者自身淋巴細胞的B細胞腫瘤。在RPMI1640+10％胎牛血清或10％合併的人血清中培養轉移的黑素瘤。用RPMI培養基洗下未貼壁的細胞。當細胞長至鋪滿時，用0.1％EDTA使其脫附並分成兩瓶。持續該過程，其中不斷地將鋪滿的細胞分瓶。為了檢測T細胞產生γ幹擾素的情況，得到患者血液中的淋巴細胞。將經半抗原(例如DNP)修飾的患者自身腫瘤細胞與淋巴細胞混合以刺激T細胞。每隔7天加入白介素-2。通過按上述進行分瓶來擴展T細胞。然後用經半抗原修飾的細胞重新刺激T細胞。產生了富集的T細胞群體，該細胞群體對經半抗原修飾的細胞發生反應。
很多研究人員研製並檢測了人類癌症疫苗。儘管他們有時誘導了針對患者之癌症的微弱免疫力，但很少能導致腫瘤消退。令人驚奇地是，本發明的DNP-疫苗可在轉移腫瘤中引起炎症反應。腫瘤發紅，變得溫暖而柔軟。最終，在某些情況下，在肉眼和顯微鏡下看來，腫瘤消退到消失的程度。在顯微鏡下觀察到T淋巴細胞浸潤至腫瘤塊。因此，能增強炎症反應和增加進入腫瘤的淋巴細胞數目和能力的此方法是本領域中的顯著進步。
通過加入多種生物反應修飾劑可改善疫苗的效力。這些修飾劑通過直接或間接刺激免疫應答來發揮作用。本發明的生物反應修飾劑包括但不限於白介素-12和γ幹擾素。在此實施方案中，可在每次注射疫苗之後施用IL12。據信，給具有炎症反應的患者施用IL12能導致腫瘤塊中的T淋巴細胞增殖，並且更具活性。增加的T細胞數目和功能性導致對腫瘤的免疫破壞。可根據上述劑量指示確定IL12的劑量。
使用具有下列成分的免疫治療方案治療轉移性黑素瘤患者1)由與DNP綴合的自身性腫瘤細胞組成的疫苗；和2)預先用低劑量的環磷醯胺治療。評價患者以確定是否發生腫瘤消退，監測腫瘤炎症反應，和測定針對自身性黑素瘤細胞，DNFB(用於致敏皮膚的DNP形式)，DNP-綴合的自身性淋巴細胞，稀釋劑(Hanks溶液)，純化的蛋白質衍生物(PPD)，和回憶抗原(念珠菌，髮癬菌和腮腺炎病毒)的遲髮型超敏反應。讓據認為已從治療中獲取(臨床或免疫學)好處的患者繼續接受免疫治療，隨後施用不含環磷醯胺的疫苗。在類似的實驗中，發現與聚乙二醇連接的白介素2無效。
在另一個實施方案中，使用的疫苗含有與半抗原綴合的癌細胞化學提取物，其中混合有免疫佐劑，如卡介菌(BCG)。
在本發明中，使用RT-PCR檢查人轉移性黑素瘤活檢樣品中細胞因子mRNA的表達。在施用DNP疫苗之後的發炎轉移中發現了IFNγ的mRNA，而在治療前的轉移，甚至在含有大量殘留淋巴結淋巴細胞的轉移中很少發現IFNγ的mRNA。另外，在幾乎所有的黑素瘤轉移中都發現了Ⅱ型細胞因子IL10，它們似乎是由黑素瘤細胞自身產生的。
用自身性的經DNP修飾的疫苗治療的轉移性黑素瘤患者在腫瘤位點產生了炎症反應。從組織學上看，這些發炎損害的特徵在於T細胞浸潤，所述浸潤有時與腫瘤細胞破壞相關。在本發明中，有8個皮下轉移經疫苗治療之後產生炎症，檢測其活檢樣品中IFNγ,IL4,TNF和IL10的mRNA表達情況。施用疫苗之後發炎的活檢樣品含有IFNγ(5/8),IL4(4/8)或這兩者(3/8)和TNF(4/7)的mRNA。相反，在對照樣品(治療前的淋巴結轉移或未發炎的皮下轉移)中，僅在1/17中檢測到IFNγmRNA,2/16中檢測到TNF mRNA。在24/25黑素瘤轉移中檢測到具有抗炎症特性的細胞因子IL10的mRNA，它不依賴於淋巴內容物；原位PCR證實黑素瘤細胞是主要來源。這些發現提供了新的參數，通過這些新參數可測定癌症免疫治療的效果。
本發明的目的在於分析新近得到的轉移性黑素瘤活檢樣品中是否存在與腫瘤位點生產性免疫應答相關的細胞因子mRNA。IFNγ或IL4mRNA的表達是黑素瘤轉移的特徵，所述黑素瘤轉移在施用經DNA修飾的自身性疫苗之後產生了炎症反應。另一方面，IL10 mRNA的表達不依賴於炎症反應，在幾乎所有的黑素瘤活檢樣品中都能觀察到其表達。檢查得自黑素瘤活檢樣品的細胞系並進行原位PCR分析，結果表明IL10的來源是黑素瘤細胞自身而不是相關的淋巴細胞。
此項工作最重要的發現可能是相反的結果在未經治療的患者的黑素瘤轉移中一般未發現IFNγ和IL4的mRNA，在含有大量淋巴結淋巴細胞的轉移腫瘤塊中也未發現上述mRNA。這提供了低背景的原位細胞因子生產活性，籍此對抗通過免疫治療其T細胞群體已經改變的黑素瘤組織。另外，它強調了重要的生物學論點提取自黑素瘤結節轉移的T細胞可能代表著原始淋巴結群體的殘留，而不是實際上已通過對黑素瘤抗原的識別而浸潤至腫瘤的淋巴細胞。由於它們不是抗原-激活的，它們未接受產生IFNγ或IL4的刺激物。
相反，施用DNP-疫苗之後得到的活檢樣品一般能表達IFNγ的mRNA。然而，DNP-疫苗-誘導的炎症反應不能被鑑定為Ⅰ型，因為其中一些樣品也含有IL4。如果基於PCR的mRNA分析的敏感性較好，通過主要產生IFNγ的T細胞浸潤液當中的一小片產生IL4的T細胞可產生上述模式。另一方面，IFNγ和IL4 mRNA的存在能預示產生這兩種細胞因子的T細胞(所謂的THo細胞)的存在(Lee等，歐洲免疫學雜誌，1992,22:1455-1459)。解決這一問題需要分析mRNA表達與形態學(例如原位PCR)的相關性。不論結果如何，這些發現都表明腫瘤內細胞因子的產生是測定接受免疫治療之患者的重要參數。
本發明特別提出IL10 mRNA來源於黑素瘤細胞自身，而不是相關的淋巴細胞。在24/25活檢樣品中檢測到強的IL10 mRNA帶，其表達不依賴於相關淋巴細胞的數目或DNP-疫苗-誘導的炎症的存在。另外，原位PCR清楚地表明黑素瘤細胞中的IL10 mRNA。得自活檢材料的細胞系表達IL10 mRNA，通過ELISA測定，它能產生IL10。
黑素瘤組織中產生IL10的生理學意義尚不清楚。已知IL10是抗炎症細胞因子，它可能通過降低巨噬細胞的共刺激功能來抑制T細胞增殖和IL12的產生(Jinquan,T等，免疫學雜誌，1993,151:4545-4551)以及遲髮型超敏反應(Lee，文獻同上)。因此，IL10能抑制已浸潤至腫瘤位點的黑素瘤-反應性T細胞的激活和增殖。然而，最近已闡明IL10是CD8+T細胞的化學吸引劑(Jinquan，文獻同上)；這一特性即為經DNP-疫苗-誘導之淋巴浸潤液中CD8+細胞佔優勢的原因所在。在任一種情況下，調製腫瘤位點的IL10產生將對腫瘤-宿主關係產生重要後果。
本發明的範圍還包括篩選腫瘤的細胞因子產生以確定自身性的，經照射的，與半抗原綴合的細胞組合物在懷疑患有癌症之患者中的效力的方法，所述方法包括給所述患者施用所述的與半抗原綴合的組合物；得到含有患者組織樣品之核酸的樣品；擴增特異於細胞因子的核酸或擴增通過使探針特異性地與所述組織樣品中的細胞因子特異性核酸雜交而產生的信號；檢測擴增核酸或擴增信號的存在，其中擴增核酸或擴增信號的存在表示癌症，其中得自所述患者組織樣品的擴增核酸或擴增信號的存在表示所述的與半抗原綴合的組合物的效力。
組織樣品可以是惡性或惡變前的腫瘤，例如黑素瘤腫瘤，或皮下炎性轉移的黑素瘤。另外，組織樣品可以是實體或液體組織樣品，例如但不限於懷疑患有癌症之患者的全部或部分腫瘤，唾液，痰，粘液，骨髓，血清，血清，血液，尿液，淋巴或眼淚。
核酸，如DNA(包括cDNA)和RNA(包括mRNA)得自患者組織樣品。優選RNA得自組織樣品。通過本領域已知的任何方法，例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)(其全文列入本文作為參考)所述的方法提取總RNA。
提取核酸之後，可通過本領域已知的任何技術擴增該核酸。擴增步驟包括使用至少一個引物序列，所述序列與細胞因子特異性序列部分互補。本發明意義上的細胞因子特異性序列包括(但不限於)編碼IFNγ,TNF,IL-2,IL-12和IL-13之序列的全部或部分。一般說來，引物序列的長度約為21個核苷酸至約33個核苷酸，優選約為21個核苷酸，約為31個核苷酸，32個核苷酸和約為33個核苷酸。
用於擴增方法的引物序列包括但不限於β肌動蛋白，SEQ ID NO:1和2；IFNγ,SEQ ID NO:3和4；IL4,SEQ ID NO:5和6；IL10,SEQ IDNO:7和8；和TNF,SEQ ID NO:9和10。
當依賴於模板的擴增方法使用一對引物時，引物對中的一個引物可含有與編碼細胞因子特異性蛋白質的核酸序列互補的寡核苷酸。引物對中的一個引物可選自SEQ ID NO:1至10。
或者，引物對中的兩個寡核苷酸都特異於編碼細胞因子的核酸序列。引物可被設計成與例如細胞因子序列分開的區域互補。分開的區域指的是第一個引物與細胞因子序列的3』區域互補，第二個引物與細胞因子序列的5』區域互補。優選引物與不同的分開的區域互補，並且彼此不互補。引物SEQ ID NO:1至10僅是可用於本發明的引物的例子。
當擴增方法包括使用兩個引物，例如聚合酶鏈反應，第一個引物可選自SEQ ID NO:1,3,5,7和9，第二個引物可選自SEQ ID NO:2,4,6,8和10。根據本發明的方法，可使用任何引物對，所述引物對可互相轉錄核酸並且特異於細胞因子。
優選進行總RNA提取。本文所用術語「擴增」指的是依賴於模板的方法和載體-介導的增殖，它可導致特異性核酸分子濃度相對於其初始濃度而言有所增加，或者導致可測信號濃度的增加。本文所用術語「依賴於模板的方法」指的是包括依賴於模板延伸引物分子的方法。術語「依賴於模板的方法」指的是RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸鏈的序列遵守眾所周知的互補鹼基配對規則(例見Watson,J.D等，基因分子生物學，第4版，W.A.Benjamin公司，MenloPark,Calif(1987)，全文列入本文作為參考)。通常，載體介導的方法學包括將核酸片段導入DNA或RNA載體，克隆擴增載體，回收擴增的核酸片段。所述方法學的例子由Cohen等(美國專利4,237,224),Maniatis,T等，分子克隆(實驗室手冊)，冷泉港實驗室，1982提供(皆全文列入本文作為參考)。
多種依賴於模板的方法可用於擴增樣品中存在的所需靶序列，一個最著名的擴增方法是聚合酶鏈反應(PCR)，其詳細描述於美國專利4,683,195,4,683,202和4,800,159和Innis等，PCR方法，Academic出版公司，San Diego CA,1990(皆全文列入本文作為參考)。簡單地說，在PCR中，製備的兩個引物序列與靶序列相反互補鏈上的區域互補。在反應混合物中加入過量的脫氧核苷三磷酸以及DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)。如果靶序列存在於樣品中，引物會與靶結合，通過添加核苷酸，聚合酶會導致引物沿著靶序列延伸。通過提高和降低反應混合物的溫度，延伸的引物會從靶上解離下來以形成反應產物，過量的引物會與靶和反應產物結合而重複上述過程。優選進行逆轉錄酶PCR擴增以確定所擴增的mRNA量。聚合酶鏈反應的方法學是本領域眾所周知的。
另一種擴增方法是連接酶鏈反應(也稱為LCR)，其公開於EPA320,308(其全文列入本文作為參考)。在LCR中，製備了兩個互補的探針對，當存在靶序列時，每對與靶的相反互補鏈結合以使它們鄰接。當存在連接酶時，兩個探針對會連接形成單個單位。通過溫度循環(例如PCR中的溫度循環)，結合的連接單位從靶上解離，然後用作「靶序列」以連接過量的探針對。美國專利4,883,750(全文列入本文作為參考)中描述了另一種擴增方法，該方法類似於使探針對與靶序列結合的LCR。
PCT申請PCT/US87/00880(全文列入本文作為參考)中描述的Qβ複製酶也可用作本發明的另一種擴增方法。在此方法中，在RNA聚合酶的存在下在樣品中加入RNA的複製序列，所述序列具有與靶序列互補的區域。聚合酶會拷貝複製序列，然後檢測該複製序列。
本發明也可使用等溫擴增方法擴增核酸，所述方法中使用限制性內切核酸酶和連接酶擴增靶分子，所述靶分子在限制性位點的一條鏈上含有核苷酸5』-[α-硫代]三磷酸(Walker,G.T等，Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A.)1992,89:392-396，全文列入本文作為參考)。
鏈置換擴增(SDA)是另一種等溫擴增核酸的方法，所述方法包括多輪鏈置換和合成，即切口平移。被稱為修復鏈反應(RCR)的類似方法是另一種可用於本發明的擴增方法，所述方法包括貫穿擴增所靶向的區域退火幾個探針，接著進行修復反應，所述反應中僅存在4個鹼基中的兩個。其它兩個鹼基可作為生物素化的衍生物被加入以易於檢測。SDA中也使用了類似的方法。
也可使用循環探針反應(CPR)檢測細胞因子特異性序列。在CPR中，具有非-細胞因子特異性DNA的3』和5』序列和細胞因子特異性RNA的中間序列的探針與樣品中存在的DNA雜交。雜交後，用RNA酶H處理反應，探針的產物被鑑定為不同的產物，所述不同的產物能產生消化後被釋放的信號。使最初的模板與另一個循環探針退火併重複反應。因此，CPR包括擴增通過使探針與細胞因子特異性核酸雜交而產生的信號。
根據本發明，可使用另一種擴增方法，其描述於GB申請2202328和PCT中請PCT/US89/01025(皆全文列入本文作為參考)。在前一申請中，在PCR類依賴於模板和酶的合成中使用了「經修飾的」引物。可通過用捕獲組成成分(如生物素)和/或檢測組成成分(如酶)標記來修飾引物。在後一申請中，在樣品中加入過量的經標記探針。當存在靶序列時，探針與之結合，並被催化裂解。裂解之後，靶序列被完整地釋放以與過量的探針結合。經標記探針的裂解是靶序列存在的信號。
其它核酸擴增方法包括基於轉錄的擴增系統(TAS)(Kwoh D等，美國國家科學院院報1989,86:1173,Gingeras T.R等,PCT申請WO88/10315，全文列入本文作為參考)，包括基於核酸序列的擴增(NASBA)和3SR。在NASBA中，可通過標準的苯酚/氯仿提取，熱變性臨床樣品，用裂解緩衝液和微型自旋柱處理以分離DNA和RNA，或用鹽酸胍提取RNA來製備擴增所用的核酸。這些擴增技術包括退火具有前列腺特異性序列的引物。聚合化之後，用RNA酶H消化DNA/RNA雜合體，並且再次熱變性雙鏈DNA分子。在任一種情況下，通過加入第二個前列腺特異性引物，接著進行聚合化而使單鏈DNA完全變為雙鏈。然後通過諸如T7或SP6的聚合酶成倍轉錄雙鏈DNA分子。在等溫循環反應中，RNA被逆轉錄成雙鏈DNA，使用諸如T7或SP6的聚合酶再次轉錄雙鏈DNA。所得產物無論是截短的還是完整的都表示前列腺癌特異性序列。
Davey,C等，歐洲專利申請329,822(全文列入本文作為參考)中公開了一種核酸擴增方法，所述方法包括循環合成單鏈RNA(「ssRNA」),ssDNA和雙鏈DNA(dsDNA)，根據本發明可使用該方法。ssRNA是第一個引物寡核苷酸的第一個模板，通過逆轉錄酶(依賴於RNA的DNA聚合酶)可使其延長。然後通過核糖核酸酶H(RNA酶H，特異於DNA-RNA或RNA-RNA雙鏈體中的RNA的RNA酶)的作用從所得DNA:RNA雙鏈體中除去RNA。所得ssDNA是第二個引物的第二個模板，它也包括位於其模板同源序列之5』方向的RNA聚合酶啟動子序列(例如T7 RNA聚合酶)。然後通過DNA聚合酶(例如大腸桿菌DNA聚合酶I的大「Klenow」片段)延伸該引物，導致產生雙鏈DNA(「dsDNA」)分子，所述分子在引物之間具有與原始RNA相同的序列，在一個末端還另外具有啟動子序列。適當的RNA聚合酶可使用此啟動子序列製備出DNA的很多RNA拷貝。這些拷貝可重新進入循環，導致很迅速的擴增。選擇適當的酶之後，可以進行等溫擴增而不必在每個循環中加入酶。由於這一方法的循環特性，可以選擇DNA或RNA形式的起始序列。
Miller,H.I等，PCT申請WO89/06700(全文列入本文作為參考)中公開了一種核酸序列擴增方案，該方案基於啟動子/引物序列與單鏈靶DNA(「ssDNA」)的雜交以及隨後轉錄出序列的很多RNA拷貝。該方案不是循環的；即新的模板不由所得RNA轉錄物產生。其它擴增方法包括「race」(其描述於Froman,M.A.:PCR方法方法和應用指南，1990,Academic出版社，紐約)，和「one-Sided PCR11」(Ohara,O等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)1989,86:5673-5677)(全文皆列入本文作為參考)。
在本發明的擴增步驟中也可使用基於下述的方法，即兩個(或多個)寡核苷酸在具有所得「雙-寡核苷酸」之序列的核酸存在下進行連接，籍此擴增雙-寡核苷酸(Wu,D.Y等，基因組學1989,4:560，全文列入本文作為參考)。
擴增之後，可檢測擴增產物的存在或缺乏。可通過本領域已知的任何方法測定擴增產物的序列，所述方法包括但不限於Maxam和Gilbert法，例見Sambrook，文獻同上。然後將經測序的擴增產物與在用疫苗治療之前切下的組織所得的結果相比較。接受疫苗治療之前所得的組織樣品應該不含細胞因子序列，尤其是IFNγ,TNF,IL2,IL12和IL13。可使核酸片段化以形成不同大小的不連續片段。例如，可通過例如但不限於經瓊脂糖凝膠基質電泳的方法，根據分子量分離DNA片段。然後通過Southern雜交分析凝膠。簡單地說，將凝膠中的DNA轉移至雜交底物或基質上，例如但不限於硝酸纖維素膜和尼龍膜。在選定的雜交條件下將經標記的探針應用於基質以與位於基質上的互補DNA雜交。探針的長度應能形成穩定的雙鏈體。探針長度的大小範圍約為200至約10,000個核苷酸，優選長度約為200個核苷酸。一旦擁有此處公開的內容，例如但不限於具有類似親水性和疏水性之序列的錯配將是本領域技術人員已知的。觀察或檢測所用的多種標記物是本領域技術人員已知的，例如但不限於螢光染色，例如溴化乙錠染色，親和素/生物素，放射性標記，如32P標記等。優選在瓊脂糖凝膠上電泳產物，例如PCR產物，並使用染色，例如溴化乙錠染色觀察產物。例見Sambrook等，文獻同上。然後通過放射自顯影分析基質以定位與探針雜交的特定片段。
篩選自身性的，經照射的，與半抗原綴合的細胞組合物的診斷試劑盒在一個或多個容器中含有一對引物，其中所述引物對中的一個引物與細胞因子特異性序列互補，其中所述引物選自SEQ ID NO:1,SEQID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10，所述試劑盒中還含有觀察擴增DNA所用的工具；所述試劑盒可用於測定所述組合物的效力。
利用下列實際實施例1-8和11以及預測實施例9-10和12-14可進一步闡明本發明，提供所述實施例僅為了闡明本發明而不是將本發明限制於這些特定的實施方案。
施用環磷醯胺之後，治療的毒性局限於注射位點的局部炎症反應和輕度噁心和嘔吐。有40個可評價的具有可測轉移的患者；其中5個有反應，其中4個是完全反應，1個是部分反應。出現反應的中間時限是10個月(7-84+月)。一個患者的病情在11年內持續減輕。腫瘤消退不僅發生在皮膚和結節轉移，也發生在肺和肝臟轉移。在其它6個患者中，觀察到抗腫瘤反應，所述反應看上去象是該疫苗治療所特有的，即轉移性損害的消退似乎在免疫治療開始之後才出現。在3個患者中，這一「延遲型」消退出現在兩個或多個腫瘤中。
治療前，僅在16％的患者中檢測到針對自身性的，經機械-解離的黑素瘤細胞的遲髮型超敏反應(DTH)，而在治療49,161和217天之後，分別在46％,56％和73％的患者中檢測到DTH。經非-獨立的t-試驗證實，免疫治療之後遲髮型超敏反應的增強具有顯著的統計學意義；第0天對第49天，p＜0.001；第0天對第161天，p＜0.001；第0天對第217天，p=0.021。總的說來，26/43患者(61％)在某些時間點表現出針對自身性黑素瘤細胞的陽性遲髮型超敏反應(≥5mm)。患者也對製備腫瘤細胞懸浮液所用的酶產生了強的遲髮型超敏反應在兩次疫苗治療之後，用膠原酶和DNA酶(各為1mg/ml)的混合物檢測24個患者的遲髮型超敏反應，其中的21(88％)個患者具有＞5mm的反應。針對疫苗的抗腫瘤反應與針對經機械解離的自身性黑素瘤細胞的遲髮型超敏反應密切相關，這一點可由下列3個觀察結果所證實1)8/10表現出腫瘤消退的患者具有陽性遲髮型超敏反應；2)在手術後的用含佐劑的疫苗治療的患者中，針對自身性黑素瘤細胞的遲髮型超敏反應的強度與腫瘤復發的時間之間具有很顯著的相關性(r=0.680,p＜0.001)；3)針對最初的疫苗中的自身性黑素瘤細胞(「老」腫瘤)產生遲髮型超敏反應的9個患者體內出現新的轉移(「新」腫瘤)，所述新腫瘤未能引發遲髮型超敏反應或只能引發很小的反應。將患者的病症與用疫苗治療之前的病症相比較。在開始疫苗研究之前的1至2個月，從治療中剔除在疫苗研究之前已經治療過的患者。因此，在開始疫苗研究時，患者尚未經過治療。
在3種情況下，我們能切下消退的腫瘤以進行組織學檢查；這種腫瘤的特徵在於淋巴細胞的大量浸潤。相反，從免疫治療前的患者體內切下的腫瘤由均勻的惡性細胞塊組成，而不存在顯著的淋巴細胞浸潤。
這一研究表明使用環磷醯胺能在患有癌症的患者體內產生針對黑素瘤-相關抗原的免疫應答。
圖12比較了在手術後的月份裡，經DNP疫苗和非-半抗原化的對照疫苗治療後腫瘤消失的患者所佔的百分比。此項研究檢查的是DNP-疫苗對經手術切除轉移且未表現出轉移疾病之臨床症狀的患者的治療效果。使所有患者對半抗原DNFB(二硝基氟苯)致敏，然後皮內注射自身性的，經照射的與DNP綴合的黑素瘤細胞以治療患者。每過28天再注射1次疫苗，總共進行8次治療。周期性地檢測所有患者對自身性黑素瘤細胞，與DNP綴合的自身性淋巴細胞和微生物抗原的遲髮型超敏反應，DTH。用經深低溫保藏的，提取自黑素瘤腫瘤和/或分離自外周血的淋巴細胞進行體外研究。
表黑素瘤的DNP-疫苗治療
CY(環磷醯胺)=僅在施用前2次疫苗之前靜脈內施用環磷醯胺大丸劑300mg/M2疫苗=與BCG混合的5×106到20×106自身性的，經照射的黑素瘤細胞DNFB SENS=10mg DNFB溶於0.1ml丙酮-玉米油中，用於腹側上臂DNFB CHALL=200微克DNFB溶於0.1ml丙酮-玉米油中，用於前臂進行皮試=自身性的黑素瘤細胞，外周血淋巴細胞(PBL)，與DNP綴合的外周血淋巴細胞(PBL-DNP)，純化的蛋白質衍生物(PPD)(結核皮膚試驗)，微生物回憶抗原*第0天僅施用PBL,PBL-DNP
讀出皮試結果=硬塊的平均直徑得到PBL=100cc肝素化的血液常規實驗室分析=完全血液計數(CBC)，示差血液計數(diff)，血小板計數(血小板)，SMA-12(一系列常規的實驗室試驗，血尿氮(BUN))針對DNP的致敏-最初使患者按照下述方式針對DNP致敏在第-17天，快速靜脈內灌注施用環磷醯胺，300Mg/M2。三天後，在第-14和-15天，用DNFB(二硝基氟苯)致敏將1mg DNFB溶解於丙酮-玉米油，在2cm直徑的鋼環範圍內以0.1ml體積局部應用。兩周後，局部應用200pg DNFB和真皮內注射綴合有DNP的自身PBL，測試患者對DNP的反應性。將環磷醯胺在無菌水中重構，通過快速靜脈內灌注施用適當劑量。
疫苗製備-處理腫瘤塊。通過膠原酶和DNA酶酶解和機械解離提取細胞，在控速冷凍儀中冷凍，在液氮中儲藏待用。到患者接受治療的時候，使細胞解凍，漂洗，在2500R照射處理。然後再次清洗，懸浮於無酚紅的Hanks平衡鹽溶液。
使黑素瘤細胞和DNP綴合。該步驟包括將腫瘤細胞與二硝基氟苯(DNFB)在無菌條件下保溫30分鐘，然後用無菌鹽水衝洗。
疫苗由懸浮於0.2ml Hanks溶液中的5-20×106活腫瘤細胞組成。當加入BCG，它由0.1ml 1∶10稀釋度的Tice BCG組成。每次疫苗治療為在上臂或腿鄰近部位的三次注射，不要在與淋巴結解剖同側的肢體進行注射。
研究方法-在第0天，患者接受環磷醯胺300Mg/M2快速靜脈內灌注。三天後，在+3天，給他們真皮內注射自身黑素瘤疫苗。以後每四周再次進行疫苗注射，總共治療八次。環磷醯胺僅在前兩次注射之前使用。所有疫苗均為DNP-綴合的，並與卡介菌(BCG)混合。BCG是從Organon Teknika Corporation,Durham,NC得到的Tice株系(Pasteur研究所株系的亞株系)。冷凍乾燥材料用1ml無菌水重構，在磷酸鹽-緩衝鹽水，pH7.2中以1∶10稀釋；然後吸取0.1ml，與疫苗混合，然後注射。所有疫苗在同一部位(上臂或腿)注射。
免疫原性評價-在前臂真皮內注射0.1ml實驗材料，進行皮膚試驗，在48小時，通過測定硬化的平均直徑評價遲髮型超敏反應。將陽性反應拍照。下列材料接受測試1)1×106照射的自身黑素瘤細胞；2)3×106與DNP綴合和不綴合的自身外周血淋巴細胞，；3)Hanks溶液；4)PPD-中等強度；和5)微生物回憶抗原-假絲酵母，毛癬菌，和腮腺炎病毒。給上臂皮膚應用200μg,48小時檢查硬化區的面積，測試針對DNFB的接觸致敏性。
採集所有患者的血液，用於分離和低溫貯藏淋巴細胞，對各時間皮膚試驗血清進行實驗(參見表1採血方案)。定期測試1)針對自身黑素瘤細胞的增殖性和細胞毒性應答；和2)針對DNP-結合的自身淋巴細胞的增殖反應。
研究時間1)用八個療程的疫苗治療患者，約需要八個月。然後停止治療。監測這些患者，直到從他們最初手術後至少過去五年時間。
2)八次治療完成之前，發生區域性復發或遠距離轉移的患者，取消該研究，接受如臨床說明的治療(化療或手術)。
對照組由黑素瘤轉移到區域淋巴結的22位患者組成。當無黑素瘤轉移的臨床跡象時，手術切除他們的病灶。然後，用非-半抗原化的自身疫苗對他們進行治療。首先，給他們施用環磷醯胺，300Mg/M2。三天後，給他們真皮內注射疫苗，該疫苗為與BCG混合的10×106到25×106經照射的、自身黑素瘤細胞。每28天重複一次環磷醯胺疫苗治療。總共治療八次。每兩個月患者接受臨床評價。
到兩年時，僅20％對照患者無癌症。相比較而言，用本發明DNP-疫苗治療的患者無癌症生存期顯著較長，如前面的闡述。
對於接受半抗原化疫苗的患者，其黑素瘤均轉移到區域性淋巴結，但沒有遠距離轉移的證據。在該狀況下的患者一般接受患病淋巴結的手術切除。手術切除使患者臨床上無疾病，但兩年內他們有80-85％的機率形成轉移性黑素瘤。
對照組中的患者，處於相同的臨床狀況，以與半抗原化疫苗組可比較。因此，對照組也由黑素瘤轉移到區域淋巴結的患者組成，但無遠距離轉移的證據，他們也接受疾病淋巴結的手術切除。當用非-半抗原化疫苗開始治療時，對照患者臨床不表現疾病，但就象以前提到的，80％形成遠距離轉移。
手術不能治癒黑素瘤的患者不選擇作為對照，因為這些患者痊癒速率接近0，他們比具有可切除的淋巴結轉移的患者的生存時間甚至更短。而且，在這些患者中，不可能測定無疾病生存期，它是本發明的疫苗顯著延長的指標。
如下對數據進行統計學分析描繪無疾病生存期和總生存期的Kaplan-Meir圖。DNP-疫苗接種患者和對照患者之間的差異通過Mantel log-rank(級)實驗分析。它們是分析這些數據的標準統計學方法。差異高度顯著，p＜0.01。
另外十七位患者按照前面列出的方案接受隨後治療(按照前面闡述的理由，沒有增加對照組的數量)。無疾病生存期和總生存期的結果存在統計學顯著差異。
按照Berd.D.等(1986，同上，將其全文列入本文作為參考)的方法，從轉移腫瘤塊中酶法提取黑素瘤細胞，然後深低溫保藏。從這些懸浮液得到細胞系，在含10％胎牛血清的RPMI-1640中維持。通過用從美國典型培養物保藏中心得到的一系列單克隆抗體(HB82=HLA-A2,HB122=HLA-A3,HB164=HLA-A1124)進行的流式細胞計量術分析確定的MHCⅠ類差異，區分由本研究所用患者得到的黑素瘤細胞系。半抗原綴合分別按照Miller,S.D.和H.N.Claman，免疫學雜誌，1976,117,1519和Geczy,A.F.和A.Baumgarten，免疫學，1970,19,189(將其全文列入本文作為參考)的方法，將PBL與水性DNFB或DNBS保溫30分鐘，對PBL進行DNP-修飾；這兩種方法得到相同的結果。對於特異性對照，分別按照Fujiwara,H.等，免疫學雜誌，1980,124,863和Boerrigter,G.H.和R.J.Scheper,J.Invest.Dermatol.,1987,88,3(其全文列入本文作為參考)的方法，通過與TNBS，或與噁唑酮保溫，用TNP修飾細胞。用黑素瘤細胞重複半抗原綴合。遲髮型-超敏反應(DTH)將深低溫保藏的PBL解凍，漂洗，重懸浮於Hanks平衡鹽溶液。將細胞分成三組未修飾組、與DNP綴合組、和與TNP綴合組。漂洗後，將1×106黑素瘤細胞或3×106PBL懸浮於0.1ml Hanks溶液，在前臂真皮內注射。到48小時，通過測定硬化的平均直徑，確定DTH。用黑素瘤細胞重複DTH分析。
所有患者均對DNP-修飾的自身PBL形成DTH(圖1)。局部應用DNFB後兩周(第14天)DTH反應明顯，之後在每月疫苗給藥期間的全過程保持穩定。與DNP-綴合的自身黑素瘤細胞懸浮液誘導比DNP-PBL更強的DTH(平均SE∶PBL=13.3mm±1.3mm，黑素瘤細胞=21.9 mm±3.6mm；p＜0.01)。DTH特異於經DNP-修飾的「自體」，因為綴合有TNP的自身PBL在50位受試患者中均未誘導應答。抗-DNP抗體用與DNP-綴合的PBL包被微滴板的孔，進行ELISA。發現該方法對於用與DNP-綴合的白蛋白包被平板是優選的，因為對於預免疫患者的血清，其產生較低的背景讀數。將與DNP-綴合的PBL(5×105在0.1ml中)加入96孔平底平板的每個孔中。通過乾燥，然後暴露於100％甲醇5分鐘，來固定細胞。然後，用磷酸鹽緩衝鹽水+0.05％Tween-20衝洗平板五次。將連續稀釋的實驗血清加入孔中，在潮溼培養箱中於37℃保溫平板1小時。保溫後，清洗平板五次，然後加入預先確定的最佳稀釋度的與辣根過氧化物酶-綴合的山羊抗-人免疫球蛋白(Cappel Laboratories,Malvern,PA)。為了檢測IgG或IgM抗體，分別使用與過氧化物酶-綴合的山羊抗-人IgG或IgM。在37℃保溫1小時後，清洗平板五次，向各孔中加入0.1ml底物(-苯二胺，SigmaChemical Co.,St.Louis,MO)，然後每孔中加入50pl,0.12Oi過氧化氫。在ELISA平板讀數儀上讀取平板。
用鼠抗-DNP單克隆抗體(克隆SPE-7；Sigma ImmunoChemicals)，和一種與過氧化物酶-綴合的抗鼠免疫球蛋白抗體作為第二步反應物，驗證該分析的有效性。隨後，由來自接受多次DNP-疫苗注射的患者的血清樣品構成陽性對照。如下測定各血清樣品的抗-DNP抗體滴度(樣品的OD峰值)X(OD等於陽性對照OD峰值一半的稀釋度的倒數)Butler,J.E.,酶學方法，1981,73,482。
在27位受試患者中，24位形成抗-DNP抗體。與DTH相比，DNFB局部應用(第14天)沒有誘導抗體。在19位患者中，兩次真皮內注射與DNP-綴合的黑素瘤細胞後(第63天)，滴度增加到預免疫水平以上；在另外5位患者中，到4至6次接種後，才發現明顯的滴度。檢測所有患者的IgG抗體；僅在三位患者中發現抗-DNP IgM。與TNP交叉反應的抗-DNP抗體，顯示與TNP-修飾細胞結合，但不與無關半抗原，噁唑酮結合。T細胞系的形成將PBL(1×106)與自身性的，與DNP-綴合的B類淋巴母細胞(1×105)在24孔平底平板中在淋巴細胞培養基中混合。培養7天後，加入IL2 100U/ml(Cetus Oncology贈送，Emeryville,CA)。擴展的T細胞培養物在培養基+IL2中維持，然後按照需要分開，以維持在22mm直徑孔中約2×106個細胞的濃度。每隔14天，加入自身性的，與DNP-綴合的B類淋巴母細胞，再次刺激培養物。用一系列單克隆抗體(Becton-Dickinson,San Jose,CA)通過流式細胞計量術確定表型。按照Wysocki,L.J.和V.L.Sato,(美國國家科學院院報1978,75,2844，其全文列入本文作為參考)的方法，利用標準技術，通過間接淘選分離CD8+和CD4+T細胞，其中被抗-CD8和抗-CD4單克隆抗體包被的T細胞粘附於被抗免疫球蛋白包被的平皿；分離粘附細胞，用DNP-修飾的刺激物和IL2進行擴展。
通過在圓底微滴板的孔的含2×105照射處理的同種異體飼餵細胞，200U/ml IL2，和植物凝集素的淋巴細胞培養基中進行有限稀釋培養，得到表型均一的T細胞亞群。在生長淋巴細胞克隆的孔中篩選對DNP-修飾的B類淋巴母細胞應答的增殖能力。將陽性孔在IL2中擴展，用自身性的，與DNP-綴合的B類淋巴母細胞每隔14天重新刺激。淋巴細胞增殖反應-將PBL作為應答細胞進行測試。將它們懸浮於淋巴細胞培養基(RPMI-1640，10％合併人AB+血清，添加胰島素-鐵傳遞蛋白-亞硒酸鹽介質(Sigma Chemical Co.)2mM L-穀氨醯胺、1％非必需胺基酸，25mM HEPES緩衝液，青黴素+鏈黴素)，加入96孔、圓底微滴板，1×105個細胞/孔。刺激細胞包括；1)自身或同種異體PBL,2)用Epstein-Bar病毒轉染製備的自身或同種異體B類淋巴母細胞系，3)自身的培養的黑素瘤細胞；將它們輻照(5000R)滅活。在大多數實驗中，應答物刺激物的比值為1∶1。將平板在CO2培養箱中於37℃培養5天；然後用121I-標記的IUDR(ICNRadiochemical,Costa Mesa,CA)對孔脈衝標記6小時，用自動收穫裝置收穫，在γ計數儀上計數。計算三個孔樣本的平均值。也按照上述方法測試培養的T細胞的淋巴增殖反應。
從對DNP-修飾的自身細胞表現最大DTH反應時的四位患者中得到並低溫保藏的PBL，解凍該PBL，測試體外增殖反應。來自所有四位患者的PBL對DNP-修飾細胞的刺激均表現增殖(圖3)。其中一位患者(DM2)的增殖反應的發展動力學如圖4所示。單獨應用DNFB(第14天)不會產生可檢測數目的循環應答細胞。兩次注射DNP-疫苗後(第63天)檢測到反應性PBL，在疫苗治療期的8個月內始終能檢測到。
對DNP-修飾細胞的增殖反應是特異性的，因為未綴合PBL或用TNP修飾的PBL均未誘導反應(圖5)。接種後，當用來源於自身腫瘤組織的DNP-修飾黑素瘤細胞系刺激時，PBL也活動地增殖。當用同種異體淋巴細胞刺激時，PBL表現預期的混合淋巴細胞反應，其比DNP反應高3到5倍。
來自這些患者中的一位(DM2)的循環T淋巴細胞在體外在IL2中培養擴展，然後用自身DNP-修飾的B類淋巴母細胞重複刺激。擴展四周後，T細胞有70％CD3+,CD8+和30％CD3+,CD4+。當用DNP-修飾的自身B類淋巴母細胞或DNP-修飾的、培養的黑素瘤細胞刺激時它們增殖，但未結合的自身細胞刺激時不增殖(圖6)。通過正淘選將它們分成富含CD8和富含CD4的群體，它們經流式細胞計量術分析確定純度為98％。如圖7所示，富含CD4-和富含CD8-T細胞均對DNP-修飾的自身B類淋巴母細胞表現增殖反應。然而，僅富含CD8+T細胞對經DNP-修飾的自身黑素瘤細胞應答。該結果可能因為黑素瘤細胞系的Ⅱ類MHC的低組成型表達(＜5％)造成。
當用自身的、DNP-修飾的B類淋巴母細胞刺激時，測試擴展的T細胞產生細胞因子的能力。如圖8所示，它們產生γ幹擾素，但不產生IL4。為了確定CD4+和CD8+T細胞是否都參與細胞因子應答，分析以限制稀釋度的T細胞鋪板增殖得到的亞系。這些培養物對於CD4和CD8的表達是相同的。測試了這些亞系中的三種(兩種CD4+，一種CD8+)對DNP-修飾的B類淋巴母細胞的細胞因子應答。三種產生的全部是γ幹擾素，但不產生IL4(圖8)。細胞因子的產生-將T細胞以1×105個細胞/孔加入圓底微滴板。加入等量刺激物(經DNP-修飾的自身B類淋巴母細胞)，保溫18小時後，收集上清液。使用商業提供的ELISA試劑盒測定γ幹擾素(Endogen,Boston,MA；靈敏度=5 pg/ml)和IL4(RG Systems,Minneapolis,MN；靈敏度=3pg/ml)。
為了檢測MHC-依賴性反應，將刺激細胞與濃度為10μg/ml的抗Ⅰ類MHC(W6/32)或Ⅱ類MHC(L243)單克隆抗體預保溫1小時，然後加入反應細胞。將同濃度的非-特異性小鼠免疫球蛋白作為陰性對照進行測試。
通過對大批量淘選得到的DNP-反應性CD8+T細胞，能夠在含IL2的培養基中通過用DNP-修飾的自身B類淋巴母細胞重複刺激，維持長期培養(＞3個月)；它們保持穩定的表型，CD3+,CD8+。這兩種細胞系的證據表明它們的反應是Ⅰ類MHC限制性的1)刺激細胞與抗-Ⅰ類構架抗體而不是與抗-Ⅱ類抗體的預培養，阻斷γ幹擾素的產生(圖9)，和2)T細胞能夠對在一個或兩個HLA-A基因座上匹配的同種異體DNP-修飾的刺激物應答，但不能對HLA-A錯配的刺激物產生反應。如圖10所示，經對用DNP-修飾的自身PBL(HLA-A1、A2、B8+、Bw6)和表達A1或A2(或二者均表達)的DNP-修飾的同種異體PBL的刺激T細胞增殖；而對A1和A2陰性的DNP-修飾的同種異體刺激物不誘導反應。細胞毒性-用51Cr(Amersham Corp,Arlington Heights,IL)標記黑素瘤目的物兩小時，將2500個細胞加入圓底微滴板的孔。然後加入效應細胞，獲得一系列E∶T比值。37℃培養6小時後，除去上清液，在γ計數儀上計數。溶胞作用被定義為[CPM實驗-CPM自發]/[CPM總量-CPM自發]*100。在51Cr-釋放分析中，用自身黑素瘤細胞作為目的物，測試CD8+T細胞系的細胞毒性。為了使自發51Cr-釋放最小化，用DNBS而不是用DNFB進行DNP修飾。T細胞裂解DNP-修飾的自身黑素瘤細胞，但不裂解同種異體(Ⅰ類-錯配)黑素瘤細胞(圖11a,11b)。在細胞裂解的易感性和DNP修飾程度之間存在直接關係，如使用的DNBS的濃度所確定。用TNP修飾的自身或同種異體目的物均未被裂解。
對於PCR擴增，將5μl各cDNA加入含有PCR反應緩衝液，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2mM,1.25U AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elimer)，確定為各引物最適宜濃度的MgCl2(終濃度為15-6.0mM)，終體積為50μl的各適當引物對0.5mM的MicroAmp反應管(Perkin Elmer,Norwalk,CT)。該研究中應用的引物對包括β-肌動蛋白、TNF-α、IL-4、IFNγ(South San Francisco,CA)和IL10(Clontech,Palo Alto,CA)。將P-肌動蛋白作為比較樣品間相對mRNA表達的標準品，以及RT和PCR反應的對照。應用GeneAmp System9600熱循環儀(Perkin Elmer)擴增PCR樣品。各樣品在94℃變性37秒，55℃退火45秒，72℃延伸60秒，循環39次，然後在72℃延伸10分鐘。
在20％瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts,Rockland,ME)中分離PCR產物和分子量標記(Novagen,Madison,WI)。用溴化乙錠染色凝膠，顯色，在UV燈下照相。PCR產物的電泳顯示了相應於各組引物的預期片段分子量的條帶。使非逆轉錄RNA作為基因組DNA的汙染物對照進行PCR擴增。
發現深低溫保藏、酶分散的黑素瘤組織細胞懸浮液不適於RNA分析。這些樣品通常表達所有待測細胞因子的mRNA，可能是解離過程激活的結果。組織學和原位RT-PCR-由病理學系(Department of Pathology)進行代表性樣品的常規HE染色。按照Bagasra,O.,等，免疫學方法雜誌，1993 158:131-145的方法，用蛋白酶K滲透石蠟切片，用逆轉錄酶和應用上述相同引物擴增得到的IL10 DNA處理進行原位RT-PCR。免疫接種後發炎的活檢樣品中的細胞因子mRNA-當轉移性黑素瘤的特徵為少量淋巴細胞性浸潤(Elder等，「皮膚惡性黑素瘤的外科病理學」，在:W.H.Clark,Jr.,等(編)，人惡性黑素瘤，pp.100,New York:GruRe和Stratton 1979)時，施用DNP疫苗誘導T細胞向轉移腫瘤塊浸潤(Berd等，1991，同上)。對疫苗治療後已形成炎症的八個(8)皮下轉移性病灶(來自4位患者)進行研究，與從接種前切除的3個皮下轉移性病灶和4個沒有形成炎症反應的接種後轉移病灶相比較。接種後、發炎的活檢樣品含有IFNγ(5/8)、IL4(4/8)或二者(3/8)的mRNA。相比較而言，在7個對照樣品中，既沒有檢測到IFNγmRNA也沒有檢測到IL4mRNA。這15個組織中除了1個之外其餘全部表達IL10mRNA。圖14顯示了代表性、T細胞-浸潤的、接種後的活檢樣品的細胞因子mRNA的表達以及相應的組織結構。淋巴結轉移-還研究了一組黑素瘤淋巴結轉移的活檢樣品。從組織學上看，這些損傷的特徵在於含有大量被認為是腫瘤浸潤的淋巴結淋巴細胞的殘留物的淋巴細胞(圖15B)(Cardi,等，癌症研究，1989 49:6562-6565)。對於10個研究的淋巴結活檢樣品中，僅一個表達IFNγmRNA；該樣品和另外一個樣品含有ILA的mRNA。然後，所有10個樣品均含有IL10的mRNA。圖15顯示了代表性淋巴結轉移性病灶的細胞因子mRNA表達，以及相應的組織結構。黑素瘤轉移性病灶和細胞系的IL10產生-如前面的說明，在24/25黑素瘤轉移性病灶中看到IL10 mRNA表達(圖16)。因為它獨立於IFNγmRNA或IL4 mRNA的表達，而且與T細胞浸潤不相關，因此可能是黑素瘤細胞而不是淋巴細胞產生IL10。應用兩種方法驗證該推測。首先，檢查了來源於上述兩個轉移性腫瘤的細胞系。如圖17A所示，該細胞系和其來源的組織均表達IL10mRNA。
兩個細胞系均產生IL10，如72小時培養後的培養上清液的分析所確定(IL10的濃度分別為760pg/ml和10pg/ml)。接著，用原位RT-PCR研究了黑素瘤轉移病灶的組織切片中的IL10mRNA表達。如圖17B所示，IL10mRNA與黑素瘤細胞有關，而與非腫瘤成分無關。TNF mRNA在黑素瘤轉移病灶中的表達-應用原位雜交(Naylor,M.S.等，癌症研究，1990 50:4436-4440)和TNF抗性發現人結腸癌活檢樣品中的TNF mRNA與體內腫瘤生長相關(Lattime,E.C.和Stutman,O.,免疫學雜誌，1989 143:4317-4323)。在6/23黑素瘤樣品中檢查到TNF mRNA。它與DNP疫苗-誘導的炎症有關4/7 T細胞-浸潤的疫苗接種後的活檢樣品是陽性的，而2/16疫苗接種前的樣品或非浸潤的疫苗接種後樣品是陽性。
將Epstein barr病毒(EBV)加入培養中的B類淋巴母細胞。將B類淋巴母細胞轉化至來自患者自身淋巴細胞的B細胞腫瘤。來自轉移性病灶的黑素瘤在RPMI1640+10％胎牛血清或10％混合人血清中培養。用RPMI培養基衝洗出未-粘附細胞。當細胞鋪滿時，用0.1％EDTA使它們分離下來，傳代到兩個瓶中。該過程持續約10到約30代。為了檢測T細胞產生的γ幹擾素，從一位患者的血液得到淋巴細胞。將約1,000,000個淋巴細胞與DNP修飾的自身黑素瘤細胞混合，以刺激T細胞。每隔7天，加入100U/ml白介素-2。如前面的描述通過傳代擴展T細胞。然後再次用DNP修飾的自身黑素瘤細胞刺激T細胞。產生大量T細胞，它們對DNP修飾的自身黑素瘤細胞有反應。通過T細胞產生的γ幹擾素的量確定刺激作用。通常認為產生的γ幹擾素大於15pg/ml。然後用這些T細胞檢驗肽。
從4種細胞中提取小肽，這些細胞均從一個患者中得到1)B類淋巴母細胞，2)二硝基苯基(DNP)修飾的B類淋巴母細胞，3)培養的黑素瘤細胞，4)DNP修飾的培養的黑素瘤細胞。將細胞懸浮於0.1％三氟乙酸，dounced，超聲，然後在100,000xg離心90分鐘。通過Centricon10濾器將上清液中分子量＞10,000的物質除去。將留下的物質在反相HPLC柱上分離。收集各級分，乾燥，重懸浮於培養基，然後加入結合和呈遞肽的自身B類淋巴母細胞。檢驗這些肽脈衝標記的B細胞刺激針對經DNP-修飾的自身黑素瘤細胞特異性致敏的T淋巴細胞系的能力。
前50個HPLC級分(每個樣品10μ1)混合成5組，每組十個級分。如圖13所示，僅來源於DNP修飾的黑素瘤細胞(DNP-MEL)或經DNP-修飾的B細胞(DNP-LY)的肽具有刺激性，僅#2匯合物為陽性。
通過對#2匯合物中各級分進行T細胞刺激實驗，分析#2匯合物的各單獨級分；僅#17和#18級分發現有活性，DNP-MEL肽刺激產生的γ幹擾素是DNP-LY的二倍多。
這些結果表明低分子量肽產品的單一HPLC級分含有一種或多種刺激針對經DNP修飾的黑素瘤細胞致敏的T細胞的肽。
本實驗與實施例8描述的實驗相同，除了一點例外。在將肽加入B類淋巴母細胞後，和在加入反應的T細胞之前，將向不同樣品中加入不同濃度(1-100μl/ml)的抗-DNP抗體。抗-DNP抗體可以從ATCC，雜交瘤#CRL-1968，或類似抗體得到。如果刺激是由DNP修飾的肽導致，那麼該抗體將抑制它。期望級份17和18將被該抗體抑制。
本實驗與實施例8描述的實驗相同，除了一個例外。在將反應T細胞加入肽脈衝標記的B類淋巴母細胞之前，將反應T細胞分成亞組。這將通過將T細胞與用抗-CD4或抗-CD8抗體(從Immunotech,Inc.,Westbrook,Maine作為商品得到)包被的磁性小珠混合實現。然後用磁鐵取出小珠和與它們結合的細胞。未-結合細胞在組織培養液(RPMI+10％混合人血清)中漂洗，計數，然後加入微滴板的孔中用於測定刺激作用。
按照Heike等，免疫治療雜誌(J.Immunotherapy)1994 15:165-174(其全文列入本文作為參考)的方法，從來自一位患者的培養的黑素瘤細胞製備細胞膜。按照Miller和Claman,免疫學雜誌1976 117:1519-1526(其全文列入本文作為參考)的方法，使黑素瘤細胞綴合於二硝基苯基(DNP)。將該細胞懸浮於5體積含1mM苯基甲基磺醯基氟化物的30mM碳酸氫鈉緩衝液，然後用玻璃勻漿器勻漿。殘存的完整細胞和核通過1000g離心除去。然後通過100,000g離心90分鐘使細胞膜沉澱。將細胞膜重懸浮於8％蔗糖中，在-80℃冷凍直到使用。同樣製備黑素瘤細胞，用於結合二硝基苯。
檢驗這些DNP修飾的黑素瘤細胞膜刺激已針對DNP修飾的完整黑素瘤致敏的自身T淋巴細胞的能力。通過將約100,000個T淋巴細胞/孔與相當於約10,000-約100,000個細胞的DNP修飾的細胞膜/孔共同保溫，然後檢測產生的γ幹擾素(大於15pg)實現該檢驗。將T淋巴細胞與經DNP修飾的黑素瘤細胞共同保溫重複該過程。結果表明完整黑素瘤細胞和來自它們的細胞膜對刺激T細胞同樣有效。
已經重複若干次的本實驗(應用相同的患者樣品)均具有相似結果，表明在誘導T細胞反應方面，經DNP修飾的黑素瘤細胞膜能夠替代經DNP修飾的完整黑素瘤細胞。實施例12實施例12將確定附加自身單核細胞或樹突狀細胞是否增強T細胞對腫瘤細胞膜的反應。
自身單核細胞將如下分離。按照Boyum,A.,斯堪地那維亞臨床實驗室研究雜誌(Scand.J.Clin.Lab.Invest),21,1968 Suppl.97:77-89(其全文列入本文作為參考)的方法，通過梯度離心從外周血中分離外周血淋巴細胞。將它們懸浮於組織培養基(RPMI-1640+10％混合人血清)，然後加入塑料微滴板的孔中保持2小時，以使單核細胞粘附。然後用培養基衝洗掉未粘附細胞。加入各種濃度的GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，從Immunex,Seattle,WA作為商品得到)，用來刺激單核細胞的生長。約2-3周後，單核細胞，現在認為是巨噬細胞，將被用0.1％EDTA從塑料微滴板的孔中轉移出來，以分級數目(約100到約10,000/孔)加入新的微滴板的孔中。將分級數目的從DNP修飾的自身腫瘤細胞製備的細胞膜(定量為細胞數當量)加入粘附的巨噬細胞單層。約6到約24小時後，將DNP特定自身T細胞加入其中，再保溫24小時。然後收集上清液，檢驗細胞因子的產生，例如但不限於γ幹擾素、IL2、腫瘤壞死因子；或者檢驗T細胞的增殖或刺激，例如被胸腺嘧啶脫氧核苷，或用染料例如MTT。例如，將125IUDR加入其中，在一種自動收穫裝置上收集細胞，檢驗T細胞增殖。對照由未刺激的T細胞和用無巨噬細胞的細胞膜刺激的T細胞組成。以同樣方式檢驗自身樹突狀細胞增強對細胞膜反應的能力。按照O』Doherty,U.等，實驗醫學雜誌，1993 178:10678-1078(其全文列入本文作為參考)的方法，從外周血單核細胞中分離樹突狀細胞，然後在組織培養基中生長。
本研究的對象將是接受重複劑量的DNP修飾的黑素瘤疫苗的患者。將如上述從自身DNP修飾的黑素瘤細胞中製備細胞膜。將分級數目的細胞膜(相當於約100到約10,000個細胞)在PBS中清洗，重懸浮於PBS，然後注射到上臂真皮內。約48小時後，通過測定皮膚硬化區的直徑確定DTH。對照由未結合的自身黑素瘤細胞膜和從自身血液淋巴細胞製備的細胞膜構成。
本方法將類似於實施例12描述的方法，除了由與DNP綴合的同種異體黑素瘤細胞製備刺激細胞膜。該推測為來自患者A的巨噬細胞或樹突狀細胞能夠在體外加工從患者B的黑素瘤細胞製備的細胞膜。其導致對患者A的T細胞的刺激。該實驗可能產生一種同種異體免疫的方法。從單一同種異體黑素瘤細胞系，或同種異體細胞系的匯合物製備的DNP修飾的細胞膜將在體外被患者的巨噬細胞加工或被樹突狀細胞加工。這些細胞將被用於免疫接種。
令人驚奇的是，與更強烈的方案B和C相比，劑量-方案A和D誘導顯著較高的針對autol-MEL的DTH(p=0.001,Mann-Whiten U檢驗)。針對autol-MEL產生DTH反應(≥5mm)的患者的百分率如下方案A:45％(總共44位患者中22人產生反應，即20/44)，方案B:11％(3/27)，方案C:18％(4/22)，方案D:59％(16/27)(p＜0.01,x方)。相比較而言，所有四個劑量方案誘導類似的針對PPD的DTH反應。到目前為止的隨訪表明在誘導針對autol-MEL的DTH方面最有效的兩個劑量方案(A和D)比免疫效果較差的兩個方案(B和C)形成較長的無疾病復發的生存期，甚至在為適應標準預後症狀變量作出調整之後仍然如此。因此，人腫瘤疫苗的給藥劑量和方案可能對於誘導具有臨床意義的免疫是重要的。
本文中引證或描述的每個專利、專利申請和專利公開文本的公開將其全文插入本文作為參考。
除了本文顯示和描述的、其它各種對本發明的修改將對前面描述領域的技術人員是顯而易見的。這些修改也將落入所附權利要求的範圍內。
任何對圖11的引用應認為不存在(見14條第2款)。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人Berd,David；Eisenlohr,Lawrence；和Lattime,Edmund(ⅱ)發明名稱含有腫瘤細胞提取物的組合物和使用該組合物的方法(ⅲ)序列數目10(ⅳ)通訊地址(A)聯繫人Woodcock Washburn Kurtz Mackiewicz Norris(B)街道One Liberty Place-46th Floor(C)城市philadelphia(E)國家美國(F)郵政編碼19103(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質類型3.5英寸軟盤，容量1.44兆(B)計算機IBM PS/2(C)作業系統PC-DOS(D)軟體WORDPERFECT 5.1(ⅵ)目前的申請資料(A)申請號未知(B)申請日1995年6月7日(C)分類號未知(ⅶ)在先申請資料(A)申請號08/203,004(B)申請日1994年2月28日(ⅷ)代理人/代理資料(A)姓名Lori Y.Beardell
(B)登記號34,293(C)資料/文檔號T JU-1582(ⅸ)電訊資料(A)電話(215)568-3100(B)電傳(215)568-3439(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度21個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:ATGGATGATG ATATCGCCGC G21(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅲ)假設否(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2
CTAGAAGCAT TTGCGGTGGA CGATGGAGGG GCC33(2)SEQ ID NO:3的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度21個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3ATGAAATATA CAAGTTATAT C 21(2)SEQ ID NO:4的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅲ)假設否(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4TTACTGGGAT GCTCTTCGAC CTCGAAACAG CAT 33(2)SEQ ID NO:5的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度21個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5ATGGGTCTCA CCTCCCAACT G 21(2)SEQ ID NO:6的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅲ)假設否(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6TCAGCTCGAA CACTTTGAAT ATTTCTCTCT CAT 33(2)SEQ ID NO:7的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7AAGCTGAGAA CCAAGACCCA GACATCAAGG CG 32(2)SEQ ID NO:8的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅲ)假設否(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8AGCTATCCCA GAGCCCCAGA TCCGATTTTG(2)SEQ ID NO:9的資料(ⅱ)序列特徵(A)長度21個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9ATGAGCACTG AAAGCATGAT C 21(2)SEQ ID NO:10的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10TCACAGGGCA ATGATCCCAA AGT 2權利要求
1．在患有腫瘤的哺乳動物患者中誘導抗腫瘤反應的方法，所述方法包括給所述患者施用含有治療有效量的腫瘤細胞或腫瘤細胞提取物的組合物，所述腫瘤細胞或腫瘤細胞提取物(ⅰ)與半抗原綴合；(ⅱ)其腫瘤類型與患者腫瘤的類型相同；(ⅲ)對所述患者而言，不是同種異體的，且(ⅳ)注射後不能在患者體內生長；且以每周為間隔重複給藥。
2．權利要求1的方法，其中所述組合物至少給藥3次。
3．權利要求1的方法，其中所述組合物至少給藥6次。
4．權利要求1的方法，其進一步包括在施用所述組合物之前施用治療有效量的環磷醯胺。
5．權利要求4的方法，其中僅在第一次施用所述組合物之前施用環磷醯胺。
6．權利要求4的方法，其中所述治療有效量的環磷醯胺包括施用劑量約為300mg/M2的環磷醯胺。
7．權利要求1的方法，其中所述腫瘤細胞或提取物選自黑素瘤、肺癌、結腸癌、乳腺癌、腎臟癌、前列腺癌、卵巢癌和白血病腫瘤細胞或提取物。
8．權利要求7的方法，其中所述腫瘤細胞或提取物是黑素瘤腫瘤細胞或提取物。
9．權利要求1的方法，其中所述半抗原選自二硝基苯基、三硝基苯基、N-碘代乙醯基-N』-(5-磺酸-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、異硫氰酸螢光素、異硫氰酸砷酸苯、三硝基苯磺酸、對氨基苯磺酸、對氨苯基砷酸、二硝基苯-S-芥及其組合。
10．權利要求9的方法，其中所述半抗原是二硝基苯基。
11．權利要求1的方法，其中所述組合物與佐劑一起施用。
12．權利要求11的方法，其中所述佐劑選自卡介菌，QS-21，脫毒內毒素和細胞因子。
13．權利要求1的方法，進一步包括在施用所述組合物之前用治療有效量的半抗原致敏患者。
14．權利要求1的方法，其中在施用所述組合物之前未用所述半抗原致敏所述哺乳動物。
15．權利要求1的方法，其中所述哺乳動物是人。
16．權利要求1的方法，其中每個劑量的所述組合物最多含有約7.5×106個腫瘤細胞或等細胞當量的提取物。
17．權利要求1的方法，其中所述抗腫瘤反應是下列中的至少一個腫瘤壞死、腫瘤消退、腫瘤炎症、腫瘤被激活的T淋巴細胞浸潤、穩定的疾病和患者生存期的延長。
18．在患有腫瘤的哺乳動物患者中誘導抗-腫瘤反應的組合物，所述組合物含有治療有效量的腫瘤細胞或腫瘤細胞提取物，所述腫瘤細胞或腫瘤細胞提取物(ⅰ)與半抗原綴合；(ⅱ)其腫瘤類型與患者腫瘤的類型相同；(ⅲ)對所述患者而言，不是同種異體的，且(ⅳ)注射後不能在患者體內生長；所述治療有效量的腫瘤細胞或提取物的每個劑量最多含有約7.5×106個腫瘤細胞或等細胞當量的提取物。
19．權利要求18的組合物，其中所述腫瘤細胞或提取物選自黑素瘤、肺癌、結腸癌、乳腺癌、腎臟癌、前列腺癌、卵巢癌和白血病腫瘤細胞或提取物。
20．權利要求18的組合物，其中所述半抗原選自二硝基苯基、三硝基苯基、N-碘代乙醯基-N』-(5-磺酸-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、異硫氰酸螢光素、異硫氰酸砷酸苯、三硝基苯磺酸、對氨基苯磺酸、對氨苯基砷酸、二硝基苯-S-芥及其組合。
21．權利要求20的組合物，其中所述半抗原是二硝基苯基。
22．權利要求18的組合物，其進一步含有佐劑。
23．權利要求22的組合物，其中所述佐劑選自卡介菌，QS-21，脫毒內毒素和細胞因子。
全文摘要
本發明涉及含有經半抗原修飾的腫瘤細胞及其提取物的組合物,以及通過給需要治療的受試者施用治療有效量的組合物以治療癌症的方法,所述組合物含有腫瘤細胞或腫瘤細胞提取物。本發明的腫瘤細胞和提取物及其組合物能引發T淋巴細胞,該T淋巴細胞具有浸潤哺乳動物腫瘤的特性;能引發針對哺乳動物腫瘤的炎性免疫應答;引發針對哺乳動物腫瘤的遲髮型超敏反應和/或在體外刺激T淋巴細胞。本發明還涉及有效接種方案,該方案可通過誘導下列中的至少一個而用於誘導患有癌症的哺乳動物患者的抗腫瘤反應:腫瘤壞死,腫瘤消退,腫瘤炎症,腫瘤被激活的T淋巴細胞浸潤,遲髮型超敏反應和患者生存期的延長。
文檔編號A61K39/385GK1309569SQ99807512
公開日2001年8月22日 申請日期1999年5月4日 優先權日1998年5月4日
發明者D·伯德 申請人:託馬斯傑斐遜大學