用於確定抗病毒藥物敏感性和抗性和篩選抗病毒藥物的組合物和方法

2023-09-23 15:19:40

專利名稱：用於確定抗病毒藥物敏感性和抗性和篩選抗病毒藥物的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及用於鑑定用於治療病毒感染的有效藥物方式的抗病毒藥物敏感性和抗性的測試。本發明進一步涉及用於進行這些新的抗病毒藥物的敏感性和抗性測試的新的載體，宿主細胞和組合物。本發明還涉及對候選藥物的抑制選定的病毒序列和/或病毒蛋白質的能力進行篩選。更具體地說，本發明涉及利用重組DNA技術首先構建含有病人起源的區段和指示基因的抗性測試載體，然後將抗性測試載體導入宿主細胞，並確定在存在抗病毒藥物時靶宿主細胞中指示基因產物的表達和抑制。本發明也涉及鑑定當與現存的抗病毒藥物比較時具有明顯的抗性圖譜的抗病毒藥物的手段和方法。本發明也涉及用於鑑定和評估潛在的治療化合物的生物學效力的方法和組合物。更具體地說，本發明涉及用於提供用於治療各種病毒疾病例如包括HIV/愛滋病和肝炎的最佳治療方式的藥物敏感性和抗性測試。發明背景病毒藥物抗性在傳染病領域中，特別是當與50多年的抗細菌抗生素的經驗比較，將抗病毒化物用於病毒疾病化學治療和化學預防是相當新的發展領域。抗病毒化合物的設計途徑並不是平坦的，因為病毒存在許多獨特的問題。病毒必須在細胞內複製並且常常利用宿主細胞的酶，大分子，和細胞器用於合成病毒顆粒。所以，安全和有效的抗病毒化合物必須能夠以高效率地區別細胞特異性的和病毒特異的功能。另外，由於病毒複製的特性，對病毒分離株對抗病毒化合物的體外敏感性的評估必須在含有活細胞(如，組織培養物)的複合培養系統中進行。由於所用的組織培養細胞的類型和測試的條件不同，從這樣的測試系統獲得的結果變化很大。儘管存在這些複雜性，九種藥物已被同意用於愛滋病治療，它們是五種逆轉錄酶抑制劑AZT,ddI,ddC,d4T,3TC，一種非核苷逆轉錄酶抑制劑，nevirapine,和三種蛋白酶抑制劑saquinavir,ritonavir和indinovir，並且最近已經開發了另外幾種抗病毒候選藥物如nelfinavir,delaviridine,VX-478和1592。
病毒藥物抗性是由高速率的病毒複製和突變頻率產生的具體問題。首先識別出了對氨硫脲的痘病病毒的(Appleyard和Way(1966)Brit.J.Exptl.Pathol.47,144-51)，對胍的脊髓灰質炎病毒的(Melnick等(1961)科學134,557)，對金剛烷胺的A型流感病毒的(Oxford等(1970)自然226,82-83；Cochran等(1965)Ann.NY Acad Sci 130,423-429)和對碘苷的單純皰疹病毒的(Jawetz等(1970)Ann.NY Acad Sci 173,282-291)藥物抗性突變體。目前已經鑑定了大約75種抗各種抗病毒試劑的HIV藥物抗性突變體(Mellors等(1995)Intnl.Antiviral News,supplement和condra,J.H.等(1996)病毒學雜誌70,8270-8276)。
病毒的小而有效的基因組可使人們對大多數重要的人病毒致病原的分子遺傳學、結構和複製循環進行廣泛的研究。結果，將它們用於對抗病毒藥物的活性和抗性的位點和機制的定性比任何其它類別的藥物更為精確(Richman(1994)微生物學趨勢2,401-407)。出現抗性突變體可能性與至少四種因素有關1)病毒突變頻率；2)有關特異性抗病毒的病毒靶位點的突變能力；3)抗病毒藥物的選擇壓力；和。4)病毒複製的倍數和速度。關於到第一個因素，對於單鏈RNA病毒來說，其基因組複製缺乏校對讀碼機制，突變頻率約為每複製循環每鹼基對3×10-5次(Holland等(1992)當前的微生物免疫論壇176,1-20；Mansky等(1995)病毒學雜誌69,5087-94；Coffin(1995)科學267,483-489)。所以單個10kb基因組，如人免疫缺陷病毒(HIV)，將有望平均在每三代病毒基因組中平均含有一個突變。關於第二個因素，在響應特異性抗病毒試劑時，病毒靶位點的內在突變能力可以明顯地影響產生抗性突變體的可能性。例如，zidovudine(AZT)比其它可行的胸苷類似物d4T(stavudine)在體外和體內更容易篩選出HIV的逆轉錄酶中的突變。
抗病毒藥物的作用的可能的一個不可避免的結果是它對病毒複製給出足夠的選擇性壓力，從而篩選出藥物抗性突變體(Herrmann等(1977)AnnNY Acid Sci 284,632-7)。關於第三個因素，隨著藥物接觸的增加，對複製病毒群落的選擇性壓力提高了，從而促進更快速地出現藥物抗性突變體。例如，較高劑量比較低劑量的AZT趨向於能更快速地選出藥物抗性病毒(Richman等(1990)愛滋病雜誌3,743-6)。只要保持顯著水平的病毒複製，這一抗性突變體的選擇性壓力增加了突變體產生的可能性。
第四個因素，病毒群落的複製的倍數和速度，對於出現抗性突變體的可能性有重要的影響。許多病毒感染的特徵是高水平的病毒複製和高速度的病毒產生。這一點對於HIV以及B肝和丙型嗜肝DNA病毒的慢性感染尤其正確。在具有與HIV複製水平的提高相關的CD4淋巴細胞數目減少的HIV感染病人中出現的AZT抗性的可能性提高。
較高水平的病毒增加了預先存在突變體的可能性。已經顯示抗性群落的出現產生於預先存在的亞群落的存活和選擇性增殖，而該亞群落是在缺乏選擇性壓力的情況下任意出現的。所有病毒有一個基本突變速度。計算在HIV感染過程中每天出現的約1010個新病毒粒子(Ho等人，(1995)自然373,123-126)，每核苷酸10-4到10-5的突變速度保證了在HIV感染過程中在任何時間點差不多預存在任何突變。藥物抗性突變體確實存在於HIV感染個體的HIV的亞群落中的證據正在積累(Najera等(1994)愛滋病研究人反錄病毒10,1479-88；Najera等(1995)病毒學雜誌69,23-31)。同時有文獻記載藥物抗性細小核糖核酸病毒突變體以約為10-5的比率預存在(Ahmad等(1987)抗病毒研究8,27-39)。
人免疫缺陷病毒(HIV)獲得性免疫缺陷綜合症(愛滋病)是致命的人類疾病，通常認為是至今影響人類的較嚴重的疾病之一。就全球來說，人免疫缺陷病毒(HIV)感染個體和愛滋病病例的數目無情地增加，並且一些人確信治療這種疾病的努力的效果有限。現已認識到有兩種類型的HIV:HIV-1和HIV-2。到1994年1月31日，世界衛生組織已經報導了總數為1,025,073例愛滋病病例。這只是總病例的一部分，WHO估計，在1994年後期，包括未診斷的，未報告的，和推遲報告的，並根據HIV感染的估計數目，在世界範圍累計已經有超過4.5百萬的愛滋病病例(Mertens等(1995)愛滋病9(Suppl A),S259-S272)。由於HIV開始傳播於北美，歐洲和亞沙哈拉非洲，估計超過19.5百萬男人，婦女和兒童已經被感染(出處同上)。愛滋病流行的一個明顯的特徵是它在近20年中全球傳播，今天大約190個國家有愛滋病病例報導。WHO的世界範圍的HIV感染項目才剛剛起步。據推測，到2000年成年人愛滋病病例總數將累計近1千萬。到2000年，成年人中HIV相關的累計死亡人數將從目前的約3百萬總數上升到超過8百萬。
HIV-1和HIV-2是含有兩個相同的RNA分子的二倍體基因組的帶被膜的逆轉錄病毒。HIV的分子結構是(5』)U3-R-U5-gag-pol-env-U3-R-U5(3』)，如

圖1a所示。U3,R和U5序列形成長的末端重複(LTR)，它是促進病毒基因表達的調節元件，有時靠近感染寄主的細胞基因。病毒RNA的內部區域編碼結構蛋白gag(p55,p17,p24和p7核心蛋白質)，pol(p10蛋白酶，p66和p51逆轉錄酶和p32整合酶)和env(gp120和gp41被膜糖蛋白)。Gag編碼多聚蛋白質前體，該前體被病毒蛋白酶切割成3個或4個結構蛋白；pol編碼逆轉錄酶(RT)和病毒蛋白酶和整合酶；env編碼病毒的跨膜和外層糖蛋白。gag和pol基因被表達為基因組RNA，而env基因被表達為拼接亞基因組RNA。除了env基因，還存在其它拼接亞基因組RNA產生的HIV基因，而對病毒的複製和生物學活性起作用。這些基因包括編碼激活病毒和一些細胞基因的表達的蛋白質的tat；編碼促進未拼接或單個拼接的病毒mRNA的表達的蛋白質的rev；編碼似乎是在某些條件下調節病毒繁殖的肉豆蔻醯化蛋白質的nef；編碼影響病毒顆粒感染靶細胞的能力但似乎不影響病毒的表達或通過細胞與細胞接觸而傳播的蛋白質的vif；編碼與病毒顆粒相關的蛋白質的vpr；和編碼似乎是促進細胞外釋放病毒顆粒的蛋白質的vpu。
沒有比愛滋病更好的疾病可以舉證病毒藥物抗性的問題。已經鑑定出對核苷和非核苷逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的藥物抗性HIV分離物。對AZT抗性的HIV分離物的出現並不令人驚訝，因為AZT和其它逆轉錄酶抑制劑只使病毒複製降低約90％。在存在藥物治療的選擇性壓力時高速度的病毒複製提供了出現藥物抗性突變體出現的理想條件。用AZT處理具有高水平病毒複製的感染後期病人比早期感染病人能更快發展出抗性病毒(Richman等(1990)愛滋病雜誌3,743-6)。對AZT的抗性的出現的最初描述是識別出了進行性的和逐步的藥物敏感性的減弱(Larder等人，(1989)科學243,1731-1734)。通過在編碼逆轉錄酶的基因中識別出的多個突變來解釋這一敏感性的降低(Larder等人(1989)科學246,1155-1158)，這些突變對降低的敏感性的表現型有附加的甚至增效的作用。(Kellam等(1992)Pro.Natl.Acad.Sci.89,1934-1938)。這種突變的累積導致敏感性的進行性降低。用非核苷逆轉錄酶抑制劑已經看到了同樣的效果(Nunberg等(1991)，病毒學雜誌65,4887-4892；Sardanna等(1992)，生物化學雜誌267,17526-17530)。對蛋白酶抑制劑的研究已經發現具有減弱的藥物敏感性的HIV菌株的選擇發生在幾星期內(Ho等(1994)，病毒學雜誌68,2016-2020；Kaplan等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91,5597-5601)。最近的研究顯示蛋白酶抑制劑比逆轉錄酶抑制劑更具有效力，儘管已經產生了抗性。(Condra等，同上，逆病毒和隨機感染的第三次會議的報告，1996年3月)。由劑量減少，藥物反應，吸收障礙，或其它因素引起的生物可獲得性引起的亞治療藥物水平或自身原因的藥物停用，都使病毒複製增加和突變和抗性機率的提高。
藥物治療的選擇性壓力使預存在的突變體生長超出。隨著在缺乏完全抑制性抗病毒藥物活性時病毒複製的繼續，長時間內可獲得多重突變的累積，正如已經對AZT和HIV的蛋白酶抑制劑敘述過的。確實已經觀察到對不同的藥物有多重抗性的病毒突變體(Larder等(1989)科學243,1731-1734；Larder等(1989)科學246,1155-1158；Condra等(1995)自然374,569-71)。由於在許多病毒感染中不可避免地出現抗性，正如HIV，面對抗性病毒群落必須設計最佳的治療方案。確定藥物失敗對藥物抗性的作用是困難的，因為更容易發展藥物抗性的病人更容易有其它混淆的因素，這些因素將使他們先傾向於更小的預診斷可能性(Richman(1994)愛滋病研究人反錄病毒10,901-905)。另外，病人含有具有不同敏感性的病毒的混合物。
B型肝炎(HBV)HBV是急性和慢性肝炎的致病因子，世界範圍內約2億人被感染。Zuckerman A.J.Trans.R.Soc.Trop.Med.Hygiene(1982)76,711-718。成人被HBV感染在臨床上常常是不明顯的，大多數急性感染病人能從疾病中完全恢復並清除病毒。但是，少數情況下，急性肝病可以嚴重到使病人死於爆發性的肝炎。小部分，也許只有5到10％的急性感染病人變成永久性地被病毒感染並發展成各種嚴重程度的慢性肝病。但是，新生兒傳染的HBV感染，很少能清除，並且超過90％的這樣的兒童變成慢性感染。由於在人口密度高的地區，非洲和亞洲，HBV通常是通過感染的母親傳播給新生兒，全世界幾億人的肝被HBV永久性地感染並遭受各種程度的慢性肝病，這大大地增加了發展成肝硬化和肝細胞癌(HCC)的危險。確實，在具有慢性肝炎的病人中HCC的危險增加100倍，在出生時感染的男性中HCC的生命危險達到40％。Beasley RP等，Lancet(1981)2,1129-1123。因此，大部分世界人口遭受和死於HBV感染的這些後來的併發症。開發抗HBV藥物已經足眾望所歸，但是這受到HBV特別狹窄的寄主範圍的限制HBV主要在人和黑猩猩的肝中而不是實驗動物或培養細胞中複製。Tiollais,P等自然(倫敦)(1985)317,489-495。
乙型嗜肝DNA病毒是具有緊密基因組結構的DNA病毒，它的小的，環形的，3200鹼基對的HBV DNA編碼四套病毒產物並具有複雜的，多重顆粒結構。HBV依靠從四個重疊基因S,C,P，和X編碼蛋白質的有效的方案獲得它的基因組機制。HBV是動物病毒，嗜肝DNA病毒，家族中的一個，並且被分類成1型嗜肝DNA病毒。相似的病毒感染北美土拔鼠，地下的和樹上的松鼠，和北京鴨子的某些種類。所有的嗜肝DNA病毒，包括HBV，具有下面的特徵1)存在三個明顯的形態學特徵，2)所有成員具有與HBV的被膜和核衣殼抗原的相應的功能和結構的蛋白質，3)它們在肝內複製但也能存在於肝外位點，4)它們含有依賴RNA和DNA的DNA聚合酶活性的內源DNA聚合酶，5)它們的基因組是部分雙鏈環形DNA分子，6)它們與急性和慢性肝炎和肝癌相關，和7)它們的基因組的複製是以類似於在逆轉錄病毒中看到的方式利用病毒內源的RNA依賴性DNA聚合酶活性通過一個逆轉錄成DNA的RNA中間產物進行的。在感染的肝細胞的核中，通過依賴於DNA的DNA聚合酶將部分雙鏈DNA轉化成共價環形雙鏈DNA(cccDNA)。通過寄主RNA聚合酶完成了病毒DNA的轉錄並產生幾個起始位點有區別但都終止在共同的多聚腺苷酸化信號的RNA轉錄物。它們中最長的RNA的作用是病毒的前基因組以及一些病毒蛋白質的信息RNA。由前基因組RNA翻譯成病毒蛋白質，蛋白質和RNA前基因組被包裝進入病毒顆粒，並從肝細胞中分泌出來。儘管在體外難於培養HBV，用HBV DNA已經成功地轉染了幾個細胞導致體外產生HBV顆粒。
存在幾種HBV的特定形式非感染的22納米的顆粒，它顯示為橢圓形或長絲狀體形式，和42納米的雙殼的球形顆粒，它代表了完整的感染的乙型嗜肝DNA病毒顆粒。被膜蛋白質，HBsAg，是HBV的S基因的產物，並發現存在於病毒粒子的外表面和更小的球形和管形結構上。S基因開放讀碼框架的上遊是前-S基因開放讀碼框架，前-S1和前S2，它們編碼前S基因產物，包括用於聚合人血清球蛋白的HBV表面的受體和肝細胞受體的附著位點。採用溫和的去汙劑可以分解完整的42納米的病毒粒子並分離出27納米的核被膜核心顆粒。該核心包括兩個C基因編碼的核衣殼蛋白質。該C基因有兩個確定核心和前核心區域的起始密碼子。核心區域編碼的核衣殼核心表面上表達的主要抗原被稱為B型肝炎核心抗原(HBcAg)。通過在前核心ATG開始從同樣的C基因產生B型肝炎e抗原(HBeAg)。
同時被包裝在核衣殼核心內的是DNA聚合酶，它指導HBV DNA的複製和修復。P基因，第三個和最大的HBV基因，編碼DNA聚合酶。該酶具有依賴於DNA的DNA聚合酶和依賴於RNA的逆轉錄酶活性，並且也是有效地給前基因組RNA安裝衣殼所必須的。第四個基因X編碼小的、非顆粒相關的蛋白質，已經證明該蛋白質能夠反式激活病毒和細胞基因的轉錄。
儘管對HBV的複製了解很多，HBV感染的早期步驟還沒有很好的確定。沒有適當的組織培養測試，不能研究病毒粒子上的細胞受體或附著位點。為解決這一問題，已經研製了某些細胞系，用於評估抗HBV藥物的人肝胚細胞瘤細胞Huh(HB 611)(Ueda,K.等，病毒學(1989)169,213-216)和HepG2細胞(Galle,PR.和Theilmann,L.Arzneim-Forsch.DrugRes.(1990)40,1380-1382)。
最近，注意力已經集中到HBV的分子突變體。在整個HBV基因組中存在著各種變化，已經可以將不表達病毒蛋白質的HBV的臨床分離物歸功於在個體中甚至多個基因定位中的突變。例如，已經描述了缺乏核衣殼蛋白質，被膜蛋白質，或兩者的突變體。已經有兩種突變體引起了注意。第一個是在患有嚴重慢性HBV感染的某些病人中發現的。發現這些感染的病人具有HBV突變體，這些突變體含有變化的前核心區域，使病毒不能編碼HBeAg。在這些病人中最通常遇到的突變是從G到A的單鹼基替代，它存在於核苷酸1896的前C基因的最後的密碼子的第二個鹼基。這一替代導致終止密碼子(TAG)替代了TGG色氨酸密碼子，阻止了HBeAg的翻譯。不能分泌HBeAg的具有這樣的前核心突變體的病人趨向於具有嚴重的快速發展成肝硬化，並且不容易對抗病毒治療應答的肝病。第二類HBV突變體包括逃逸突變體，其中從甘氨酸到精氨酸的單個胺基酸的替代發生於所有HBsAg的亞型共有的免疫決定簇的145位置。HBsAg的這種變化導致關鍵性的構型變化，構型的變化導致抗HBs抗體的中和活性的損失。
目前可得的病毒抗性測試通常將病毒藥物敏感性定義為在給定的病毒複製抑制百分數的抗病毒試劑的濃度(如，抗病毒劑的IC50即是在該濃度下50％的病毒複製受抑制)。所以，病毒藥物敏感性的下降是該抗病毒劑已經篩選出了抵抗該抗病毒藥物的突變體病毒的公用標記。病毒藥物抗性通常定義為在一定時間內給定病人中病毒藥物敏感性的下降。在臨床上，抗病毒藥物效力減小或不再具有臨床效力證實了病毒藥物抗性。
目前，研究工作人員和臨床工作人員可得到的評估抗病毒藥物敏感性和抗性的工具是不夠的。用於確定HIV對抗病毒試劑的抗性和敏感性的臨床測試是複雜的，耗時的，昂貴的，並且是危險的，因為它需要培養來自各個和每個病人的致病病毒(Barre-Sinoussi等(1983)科學220,868-87l；Popovic等(1984)科學224,497-500)。在這個過程中，首先培養病人的外周血單核細胞(PBMC)以便建立感染複數(moi)已知的病毒原種，並將由此產生的病毒原種用於感染靶指示細胞系。然後通常通過確定細胞培養物中病毒抗原的產生，在存在和缺乏抗病毒試劑時測量獲得的病毒複製的爆發。這樣的測試只能依賴於專家研究者的手操作，並且每個病人，每種測試的試劑需要兩到三個月，花費成千美元。另外，由於具有足夠感染複數的病毒原種不能從一些HIV病人的PBMC建立，不能對所有HIV感染個體進行經典的HIV抗性測試。更為重要的是，在通過病毒培養產生病毒原種的傳代過程中，病毒本身的特徵可以改變，可能會掩蓋病人的病毒的真正特性。所以，經典的測試已被局限於關於臨床測試趨勢的信息的收集，並且不用於對給定病人按個別需要進行抗病毒治療的前景分析。儘管有這些限制，經典測試具有兩個重要的優點他在評估時特異於該試劑，和它提供病人自身病毒的表現型的信息，即是，50％抑制病毒複製的藥物的濃度(IC50)。
已經作了許多努力對經典測試加以改善，但其中各有嚴重的缺點。這些測試的第一種類型可以描述為非特異性，因為它們完全不能確定病人本身的病毒的特徵，但是卻提供了感染過程的獨立測量方法。這些測試是測量病人的CD4+T細胞數，HIV疾病進展的公用標記(Goedert等(1987)JAMA 257,331-334)，測量病毒抗原水平(如，p24核心抗原(Allain等(1987)N.Engl.J.Med.317,1114-1121))，和測量病毒RNA和DNA水平(如，定量的聚合酶鏈式反應和支鏈DNA測試(Piatak等(1993)科學259,1749-1754；Urdea(1993)臨床化學39,725-726))。這些非特異測試最初的缺點是它們不提供病毒藥物抗性的任何信息，而試圖從病人疾病的表觀過程中推斷這一信息。另外，除病毒藥物抗性外的許多因素可以影響所考慮的參數的水平。用另一句話說，在疾病期間，除了藥物抗性以外的原因可以使CD4+T細胞計數，p24抗原水平和HIV病毒RNA水平發生變化。
另一個改良的經典測試是擴增病毒基因，該基因是抗病毒試劑的靶。在這一測試中，擴增了來自給定病人的病毒基因，然後被重組進入HIV的生物學活性原病毒克隆。將這一原病毒克隆轉染進入人細胞以便產生隨後可以用於感染靶指示細胞系的已知感染複數的病毒原種。在經典測試的方式中，在存在或缺乏抗病毒試劑時可以確定病毒抗原的生產。Kellam和Larder(1994)抗微生物試劑和Chemo.38,23-30，敘述的這樣一個測試包括將來自病人的逆轉錄酶編碼序列進行PCR擴增，然後通過同源重組將其導入原病毒DNA克隆以便重新構建含有缺失的逆轉錄酶基因的完全的病毒基因組。然後在T-細胞系培養從這樣的克隆產生得到的重組病毒，並且在HeLa CD4+噬菌斑減弱測試中測試該藥物的敏感性。但是，這類測試仍然需要培養病毒以便確定藥物的抗性，因而是困難的，耗時的和昂貴的，並需要實驗室研究者操作危險的病毒培養物。另外，考慮到培養過程中的病毒本身伴隨著變化，結果相應地可能是不精確的。
第二類測試試圖提供關於病人的HIV的基因型的信息，而最終的目的是將這一基因型信息與病毒的藥物抗性表現型相聯繫。事實上，已經證明在病毒基因如逆轉錄酶和蛋白酶基因內的特定的胺基酸替代分別對應於病毒對逆轉錄酶和蛋白酶抑制劑抗性的特定水平(Larder等(1994)病毒遺傳學雜誌75,951-957)。與這一分析相關的主要的缺點是，它是間接的，並且可以被第二次突變掩蓋，該第二次突變已顯示出可增加或抵銷第一個突變的效果。正是在給定病毒多肽內的所有胺基酸殘基的複雜的相互作用最終確定了在存在或缺乏抑制劑時基因產物的活性。所以，鑑於HIV基因組中的潛在的胺基酸變化，需要巨大的和不同尋常比例的資料庫來說明給定基因型的藥物抗性或敏感性狀況。
第三類測試，最新開發的基於細菌的測試，利用了分子克隆的病毒基因(具體地說是逆轉錄酶基因)，該基因已經插入細菌表達載體。在轉化了其中細菌DNA聚合酶Ⅰ有缺陷的大腸桿菌的特殊菌株之後，克隆的逆轉錄酶基因可以在選擇性生長條件下挽救細菌的生長。使大腸桿菌的生長依賴於逆轉錄酶之後，我們就確定某些逆轉錄酶抑制劑對該病毒基因的活性的效果(PCT申請號WO 95/22622)。但是，這一途徑的一個主要的缺點是該抑制劑可以穿過細胞膜並通過細菌進行不同於人細胞的代謝，結果，逆轉錄酶的真正的代謝抑制劑的濃度在細菌中與在相關的感染的人細胞靶中可以完全不同，或者真正的抑制劑可能完全缺乏。確實，已知核苷代謝在人和細菌細胞中明顯不同。這一途徑的另一個明顯的缺點是這一測試方法測量了逆轉錄酶的依賴於DNA的DNA聚合酶活性而不是依賴於RNA的DNA聚合酶活性，逆轉錄酶的鏈轉移或RNA酶H活性。所以，在這一測試中至少部分地對這些其它活性起作用的抗病毒化合物將不具有它的整個抑制活性。這一途徑的另一個難點是它是生長基礎上的測試；所以如果抑制劑(如核苷類似物)由於對逆轉錄酶的影響外的原因阻止細菌的生長，它就不能在這一系統中得到充分的測試。
病毒載體由於逆病毒載體高效率感染靶細胞和整合進靶細胞基因組的能力，已經將病毒載體，特別是逆病毒載體用於修飾哺乳動物細胞。由於它們插入哺乳動物基因組的能力，更多的關注集中在用於基因治療的逆病毒載體。在包括歐洲專利申請EPA0178220，美國專利4,405,712,PCT申請WO92/07943，美國專利4,980,289，美國專利5,439,809和PCT專利WO89/11539的專利和專利公開物中可以發現逆病毒載體和它們的用途的詳細情況。這些專利和公開物的內容引入本文作為參考。
把重點放在逆病毒載體技術上的一個結果是已經開發了包裝細胞系。使用逆病毒的一個主要的問題是可能傳播有能力複製的逆病毒。所以需要生產不能加工成病毒粒子的輔助載體。結果開發出了包裝缺陷載體和包裝細胞系。在包括美國專利5,124,263，歐洲專利申請公開號0386882,PCT申請號WO91/19798,PCT申請號WO88/08454,PCT申請號WO93/03143，美國專利號4,650,764，美國專利4,861,719和美國專利5,278,056的專利和專利公開物中可以發現包裝缺陷的載體和包裝細胞系的詳細情況，這些公開物引入本文作為參考。
本發明的一個目的是提供一種能夠顯示病人中的病毒群落是否對給定的藥物有抗性的藥物敏感性和抗性測試。本發明的另一個目的是提供一種能夠使醫生在先期治療後，對治療方法中給定的藥物產生抗性的病人替換一種或多種藥物的測試。本發明的另一個目的，是提供一種能夠對用於治療病毒感染的有效治療方式進行選擇的測試。本發明的另一個目的是提供一種對用於臨床和研究的藥物的敏感性和抗性進行測試的安全、標準、經濟、快速、精確和可靠的測試。本發明的另一個目的是提供一種用於評估候選藥物化合物的生物學效力的測試和方法，就病毒藥物抗性和交叉抗性而言該化合物特定地作用於特異的病毒基因和/或病毒蛋白質。提供一種用於評估病毒藥物的抗性和敏感性的組合物和手段也是本發明的一個目的。根據整個說明書，本發明的這些和其它目的將是顯而易見的。發明概述通過用於確定抗病毒藥物的敏感性的新測試達到本發明的目的，該測試包括(a)在宿主細胞中導入含有起源於病人的區段和抗性指示基因的抗性測試載體；(b)培養來自步驟(a)的宿主細胞；(c)測量靶宿主細胞中指示基因的表達；和(d)比較來自步驟(c)的指示基因的表達與在缺乏抗病毒藥物時進行步驟(a)到(c)時測量的指示基因的表達，其中，抗病毒藥物以測試濃度存在於步驟(a)到(c)；步驟(b)到(c)；或步驟(c)。
本發明也提供了一種用於確定病人中抗病毒藥物抗性的方法，包括(a)作出抗病毒藥物的藥物敏感性的標準曲線；(b)利用如上所述的敏感性測試確定病人中的抗病毒藥物敏感性；和(c)比較步驟(b)中的抗病毒藥物的敏感性和步驟(a)中確定的標準曲線，其中，抗病毒敏感性的下降表明病人產生了對抗病毒藥物抗性。
本發明還提供了一種用於確定病人的抗病毒藥物抗性的方法，包括(a)根據上面的方法在第一個時間確定病人對抗病毒藥物的敏感性，其中起源於病人的區段是在所述時間從病人得到的；(b)在後一個時間確定同一病人的抗病毒藥物敏感性；和(c)比較步驟(a)和(b)中確定的抗病毒藥物敏感性，其中第一個時間與後一個時間相比較抗病毒藥物敏感性的下降表明病人產生了或加重了對抗病毒藥物的抗性。
本發明的測試使醫生能夠評估編碼病毒蛋白或功能性病毒序列的病毒基因，其中的每一個可以是抗病毒劑的靶，是否已經突變而使藥物效力更小。更具體地說，本發明的新測試使人們可以確定病毒是否已經變成對特定的抗病毒藥物有抗性了。而且，本發明使醫生能夠評估聯合治療的藥物敏感性和抗性。另外，該測試使人們能夠通過測試特定的藥物或藥物的組合，並確定這些藥物，單獨的或聯合的，是否能夠抑制一個或多個病毒基因和/或病毒蛋白質，來改變治療的方法。本發明比現有測試具有明顯的優點，它提供了一種更安全、更經濟、更可靠、更快速、和更有效的藥物敏感性和抗性測試來評估抗病毒藥物或藥物的聯合的治療效力，便醫生能夠優化治療方案。本發明的測試所具有的明顯優點是能夠在藥物開發的任何時期評估抗性和敏感性，這些時期包括1)在候選化合物的預臨床評估時期；2)在新藥的臨床評估時期；3)在病人的治療時期，從而能夠設計出有效的治療方法以克服藥物抗性問題；和4)作為流行病監測的一部分，在已批准和試驗藥物的使用期間評估藥物的抗性的流行性。
本發明涉及用於評估藥物敏感性和抗性的方法和組合物，包括a)確定病人起源的區段對抗病毒藥物的敏感性和抗性的測試方法；(b)包括含有病人起源的區段和指示基因的抗性測試載體的組合物；和c)含有抗性測試載體的宿主細胞。本發明還涉及構建用於本發明的藥物敏感性和抗性測試的載體和宿主細胞的組合物和方法。
本發明一方面提供了一種用於確定抗HIV藥物的敏感性的方法，包括(a)在宿主細胞中導入含有病人起源的區段和指示基因的抗性測試載體；(b)培養來自(a)步驟的宿主細胞；(c)測量指示基因在宿主細胞中的表達；和(d)將來自步驟(c)的指示物基因的表達與在缺乏抗HIV藥物時進行步驟(a)到(c)時測量的指示基因的表達進行比較，其中抗HIV藥物以測試濃度存在於步驟(a)到(c)；步驟(b)到(c)；步驟(c)。
本發明另一方面，提供了一種用於測定抗HIV藥物的敏感性的方法，包括(a)在寄主中導入含有病人起源的區段和指示基因的抗性測試載體；(b)培養來自步驟(a)的宿主細胞；(c)測量靶宿主細胞中的指示基因，其中所述的指示基因是DNA或RNA結構；和(d)將來自步驟(c)的指示物的測量結果與當缺乏抗HIV藥物時進行步驟(a)到(c)時指示物的測量結果進行比較，其中抗HIV藥物以測試濃度存在於步驟(a)到(c)；步驟(b)到(c)；或步驟(c)。
本發明又一方面，提供了一種用於測定抗HBV藥物的敏感性的方法，包括(a)將含有起源於病人的區段和指示基因的抗性測試載體導入宿主細胞；(b)培養來自步驟(a)的宿主細胞；(c)測量靶宿主細胞中指示基因的表達；和(d)將來自步驟(c)的指示基因的表達與當步驟(a)-(c)在沒有抗HBV藥物時測量到的指示基因的表達進行比較，其中抗-HBV藥物以測試濃度存在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)。
本發明又一方面，提供了一種用於確定抗HBV藥物的敏感性的方法，包括(a)在宿主細胞中導入含有病人起源的區段和指示基因的抗性測試載體；(b)培養來自步驟(a)的宿主細胞；(c)測量靶宿主細胞中的指示物，其中所述的指示物是DNA或RNA結構；和(d)比較來自步驟(c)的指示物的測量結果與在缺乏抗HBV藥物時進行步驟(a)-(c)時指示物的測量結果，其中測試濃度的抗HBV藥物存在於步驟(a)到(c)；步驟(b)到(c)；或步驟(c)。
本發明還提供了一種用於確定病人的抗HIV藥物抗性的方法，包括(a)作出抗HIV藥物的藥物敏感性的標準曲線；(b)利用如上所述的敏感性測試確定病人的抗HIV藥物敏感性；和(c)將步驟(b)中的抗HIV藥物敏感性與步驟(a)中確定的標準曲線進行比較，其中，抗HIV敏感性的下降表明病人產生了抗HIV藥物抗性。
本發明也提供了一種用於確定病人的抗HBV藥物抗性的方法，包括(a)作出抗HBV藥物的藥物敏感性的標準曲線；(b)利用如上所述的敏感性測試確定病人的抗HBV藥物敏感性；和(c)比較步驟(b)中的抗HBV藥物敏感性與步驟(a)中確定的標準曲線，其中抗HBV敏感性的下降表明病人產生出了抗HBV藥物抗性。
本發明也提供了一種用評估候選抗病毒藥物化合物的生物學效力的方法，包括(a)在宿主細胞中導入含有病人起源的區段和指示基因的抗性測試載體；(b)培養來自步驟(a)的宿主細胞；(c)測量靶宿主細胞中指示基因的表達；和(d)將來自步驟(c)的指示基因的表達與當缺乏候選抗病毒藥物化合物時進行步驟(a)到(c)時測量的指示基因的表達進行比較，其中，測試濃度的候選抗病毒藥物化合物存在於步驟(a)到(c)；步驟(b)到(c)；步驟(c)。
本發明還提供了一種用於評估候選抗病毒藥物化合物的生物學效力的方法，包括(a)在宿主細胞中導入含有病人起源的區段和指示基因的抗性測試載體；(b)培養來自步驟(a)的宿主細胞；(c)測量靶宿主細胞中的指示物，其中所述的指示物是DNA或RNA結構；和(d)將來自步驟(c)的指示物的測量結果與當缺乏候選抗病毒藥物化合物時進行步驟(a)到(c)時指示物的測量結果進行比較，其中測試濃度的候選抗病毒藥物化合物存在於步驟(a)到(c)；步驟(b)到(c)；或步驟(c)。
含有病人起源病毒區段(如，HIV,HBV等等)和指示基因的抗性測試載體可以還包括一個或更多非病人起源的區段。在一個實施方案中，抗性測試載體是從可能包括一個或更多的基因中的缺失的基因組病毒載體構建的。例如，在HIV的情況下，抗性測試載體中缺失了env而保留了完整的病毒mRNA表達和加工特性。或者，抗性測試載體是從亞基因組病毒載體構建的，它可以僅包括一個或幾個通常是抗病毒藥物靶的病毒基因。例如在HBV的情況下，編碼HBV DNA複製和病毒顆粒形成所需要的某些結構和酶功能的一個或多個HBV基因(即C,S和X基因)可以從抗性測試載體中缺失，但保留完整的病毒的mRNA表達和加工特性。抗性測試載體將還包括用於抗病毒靶基因的表達的特定病毒的天然增強子/啟動子或外源增強子/啟動子。
靶細胞內抗性測試載體中的指示基因的表達最終依賴於病人起源的區段的序列的作用。指示基因可以是有功能的或非功能的。在非功能的指示基因的情況下，指示基因在抗性測試載體轉染的宿主細胞中是不能有效地表達的，除非它通過一個或多個病人起源的區段的產物的作用轉化成功能性指示基因。在一個實施方案中，通過使用置換啟動子，即一種雖然與指示基因處於相同的轉錄方向，但它跟隨而不是引導指示基因編碼序列的啟動子，使指示基因成為非功能性。另外，非功能性指示基因的定向與病毒啟動子或LTRs相反。所以，非功能的指示基因的編碼序列既不能通過置換啟動子轉錄也不能通過病毒啟動子轉錄。在HIV的情況中，指示基因是通過逆轉錄而進行重排，使置換啟動子現在處於指示基因序列的前面，它因此可以進行功能性地表達。在HBV的情況中，在HBV複製的過程中，基因組環化的結果使指示基因重排。在第二個實施方案中，通過使用置換編碼區域，即指示基因編碼區中編碼區的5』部分跟隨而不是引導3』編碼區部分而使指示基因成為非功能性的。在這一構型中，沒有表達可產生功能指示基因產物的mRNA。在HIV的情況中，指示基因由於逆轉錄的結果而進行了重排，使指示基因的5』編碼區現在引導3』編碼區，並由此指示基因可以功能性地表達。在HBV的情況中，指示基因是在HBV複製過程中由於基因組環化的結果而進行重排。在第三個實施方案中，通過使用反向內含子，即一種以與指示基因呈相反的轉錄方向插入指示基因編碼序列的內含子，使指示基因成為非功能性。另外，指示基因本身含有一種整個轉錄單位與病毒啟動子方向相反的功能啟動子。所以，在HIV或HBV增強子一啟動子的情況中，非功能指示基因是在被病毒的LTR轉錄的錯誤方向上，並且它不能通過它本身的啟動子功能性地轉錄，因為反向內含子不能通過拼接被適當地切除。但是，在逆病毒和嗜肝DNA病毒，具體地說HIV和HBV的情況中，病毒啟動子的轉錄導致mRNA的形成，其中可以通過拼接除去反向內含子。在逆病毒中，作為得到的拼接轉錄物進行逆轉錄和得到的原病毒在宿主細胞染色體中整合的結果，指示基因現在可以功能性地通過它自身的啟動子轉錄。在HBV中，作為在宿主細胞中所產生的拼接轉錄物的逆轉錄和基因組DNA的環化的結果，現在指示基因可以通過它自身的啟動子功能性地轉錄。
含有非功能性的指示基因的抗性測試載體可被用於基於顆粒的或非顆粒的測試中的抗性測試。基於顆粒的測試是以抗性測試載體病毒顆粒為基礎的，它是複製缺陷的，是由抗性測試載體宿主細胞產生的。用於產生抗性測試載體病毒顆粒所必須的反式激活作用因子是由轉染進包裝宿主細胞的包裝表達載體提供的。相反，基於非顆粒的抗性測試是在缺乏包裝表達載體時用抗性測試載體轉染單個宿主細胞而進行的。
在功能性指示基因的情況中，功能指示基因在由抗性測試載體轉染的第一個宿主細胞(本文稱為抗性測試載體宿主細胞)中高效地表達。所以，在抗性測試載體宿主細胞中指示基因的功能是不依賴於病人起源的區段。但是，在第二個宿主細胞(本文稱為靶宿主細胞)中指示基因被表達的能力依賴於在抗性測試載體的宿主細胞中功能性抗性測試載體病毒顆粒的產生。所以，在靶宿主細胞中指示基因的活性依賴於病人起源的區段的活性。
另一方面，本發明涉及HIV/愛滋病或HBV的抗病毒藥物的敏感性和抗性測試。識別出了本發明的用於HIV/愛滋病的抗病毒藥物的敏感性和抗性測試的特定的抗性測試載體以及抗性測試載體的宿主細胞。另一方面，本發明涉及對於肝炎的抗病毒藥物敏感性和抗性測試。同樣在HBV的情況中，鑑別出了本發明的用於HBV抗病毒藥物敏感性和抗性測試的特定的抗性測試載體(本文也稱為抗性測試載體系統)以及測試載體的宿主細胞。
再一方面，本發明提供了對用於治療病毒疾病的潛在的治療性抗病毒化合物的生物學效力進行鑑定和評估的方法。另一方面，本發明涉及用於藥物敏感性的評估的被一個或更多載體轉染的宿主細胞。另一方面，本發明涉及含有病人起源的病毒基因和指示基因的新的抗性測試載體。
附圖的簡要說明圖1.A．圖解說明HIV-1的DNA基因組的結構。病毒蛋白質是在三個讀碼框架的每一個中由gag,pol.vif,vpr,tat,rev,vpu,env和nef基因編碼的。RNA是從病毒DNA轉錄的，並通過病毒和細胞酶加工，產生基因組病毒RNA和mRNA。標明了病毒長末端重複(LTR)的U3,R和U5元件。
B．概括性地圖解說明在5』到3』方向含有下面的元件的HIV基因組病毒載體1)HIV-LTR U3區，2)HIV-LTR R區，3)HIV-LTR U5區，4)HIVgag-pol,vif,vpr,tat,rev,vpu，缺失的env，和nef基因的編碼區，和5)3』HIV-LTR。
C．概括性地圖解說明含有下面5』到3』方向的HIV基因組病毒載體1)CMV IE增強子-啟動子，2)HIV-LTRR區，3)HIV-LTRU5區，4)HIVgag-pol,vif,vpr,tat,rev,vpu，缺失的env，和nef基因的編碼區，和5)3』HIV-LTR。
D．概括性地圖解說明含有下面5』到3』方向的元件的HIV亞基因組病毒載體1)HIV-LTR U3區，2)HIV-LTR R區，3)HIV-LTRU5區，4)HIV gag-pol基因的編碼區，和5)3』HIV-LTR。
E．概括性地圖解說明含有下面5』到3』方向的元件的HIV亞基因組病毒載體1)CMVIE增強子-啟動子，2)HIV-LTRR區，3)HIV-LTR U5區，4)HIV gag-pol基因的編碼區，和5)3』HIV-LTR。
圖2.A．圖解說明HIV-1的DNA基因組結構。
B．圖解說明含有非功能性指示基因的抗性測試載體，該非功能性指示基因含有一種置換啟動子，它在5』至3』方向上具有以下元件1)HIV-LTR U3區(pLG-lucPP-HS和pLG-lucPP-PB)或CMV IE增強子-啟動子(pCG-lucPP-HS和pCG-lucPP-PB)，2)HIV-LTR R區，3)含有以與LTR相反的轉錄方向插入的T7噬菌體RNA聚合酶啟動子(本文稱為T7啟動子)的HIV-U5區，4)HIV gag-pol,vif,vpr,tat,rev,vpu，缺失的env，和nef基因的編碼區，5)插入在病人序列接受位點的病人起源的區段，6)插入在缺失的env基因中的指示基因盒，和7)3』HIV-LTR。
C．圖解說明通過逆轉錄酶將在2(a)中敘述的抗性測試載體中的非功能性的指示基因(置換啟動子)變換成功能性的指示基因。功能性指示基因的變換是T7啟動子相對於指示基因的編碼區的再定位產生的。
圖3.A．圖解說明HIV-1的DNA基因組結構。
B．圖解說明提供vif,vpr,tat,rev,vpu和nef基因的包裝表達載體pLTR-HIV3』，這些基因中的每一個以從HIV-LTR U3區轉錄的拼接的亞基因組mRNA得到表達。
C．圖解說明提供vif,vpr,tat,rev,vpu和nef基因的包裝表達載體pCMV-HIV3』，這些基因中的每一個以從CMVIE增強子-啟動子轉錄的拼接亞基因組mRNA得到表達。
D．圖解說明包裝表達載體pVL-env4070A[pCXAS(4070A env)]，它通過從CMV IE增強子-啟動子轉錄提供兩親性的MLV env基因產物。
圖4.A．圖解說明HIV-1的DNA基因組結構。
B．概括性地圖解說明包括一種非功能性指示基因的抗性測試載體，該載體在5』到3』方向含有下面的元件1)HIV-LTR U3區(pLG-lucPC-HS和pLG-lucPC-PB)或第一CMV IE增強子-啟動子(pCG-lucPC-HS和pCG-lucPC-PB),2)HIV-LTR R和U5區，3)HIVgag-pol,vif,vpr,tat,rev,vpu，缺失的env，和nef基因的編碼區，4)插入在病人序列的受體位點的病人起源的區段，5)含有插入在缺失的env基因中的螢光素酶基因的5』編碼區的第一指示基因盒，6)含有插入在缺失的3』HIV-LTR U3區中的螢光素酶的3』編碼區的第二指示基因盒，和7)3』HIV-LTR R和U5區。
C．圖解說明通過逆轉錄酶將在4(a)中敘述的抗性測試載體中的非功能指示基因(置換編碼區)變換成功能性指示基因，在逆轉錄和鏈轉移之後，螢光素酶3』編碼區被從3』LTR拷貝成5』LTR，從而允許可以拼接產生功能性螢光素酶編碼區的mRNA的轉錄。
圖5A．圖解說明HIV-1的DNA基因組結構。
B．概括性地圖解說明具有非功能的指示基因的抗性測試載體，該非功能性指示基因含有一個反向內含子，它在5』-3』方向含有以下元件1) HIV-LTR U3區(pLG-lucⅡ-HS和pLG-lucⅡ-PB)或第一CMV IE增強子-啟動子(pCG-lucⅡ-HS和pCG-lucⅡ-PB),2)HIV-LTR R和U5區，3)HIVgag-pol,vif,vpr,tat,rev,vpu，缺失的env，和nef基因的編碼區，4)插入在病人序列接受位點的病人起源的區段，5)插入在缺失的env基因中的指示基因盒，和5)3』HIV-LTR。
C．圖解說明通過逆轉錄酶將描述於5(a)的在抗性測試載體中的非功能性指示基因(反向內含子)變換成功能性指示基因。整個指示基因盒的轉錄方向與第一CMV增強子-啟動子和病毒LTR的相反，而人工內含子的方向與後面的元件相同。通過第二CMV增強子-啟動子的指示基因的轉錄並不產生功能性轉錄物，因為反向內含子不能以這一方向拼接。但是，通過5』病毒LTR或第一CMV IE增強子-啟動子的指示基因的轉錄導致反向內含子通過RNA拼接而除去，儘管指示基因仍然沒有功能性地表達，因為得到的轉錄物具有反義方向。在這一轉錄物的逆轉錄和得到的原病毒的DNA的整合之後，通過第二CMV增強子-啟動子可以功能性地轉錄指示基因，因為反向內含子已經在前面除去了。
圖6.A．圖解說明HIV-1的DNA基因組結構，如上面(a)和(b)所示。
B．概括性地圖解說明含有功能性的指示基因的抗性測試載體，它在5』到3』方向含有下面的元件1)HIV-LTR U3區(pLG-luc-HS-1和pLG-luc-PB-1)或第一CMV IE增強子-啟動子(pCG-luc-HS-1和pCG-luc-PB-1)，2)HIV-LTR R和U5區，3)HIV gag-pol,vif,vpr,tat,rev,vpu,缺失的env，和nef基因的編碼區，4)以相反於病毒LTR的方向插入在缺失的env基因中的功能性指示基因盒，和5)3』HIV-LTR。
C．概括性地圖解說明含有功能性的指示基因盒的抗性測試載體(pLG-luc-HS-2,pLG-luc-PB-2,pCG-luc-HS-2和pCG-luc-PB-2)，其中指示基因盒的轉錄方向與病毒LTR的相同。
圖7.A．利用抗性測試載體pCG-CXCN(F-lucP)2-AA和pCG-CXAT(F-lucP)2-AA的藥物敏感性的證明。數據由缺乏AZT或存在5毫摩爾AZT時靶宿主細胞中螢光素酶基因活性以相對光單位(RLU)表示。
B．利用含有AZT處理前和AZT處理後的「測試」病人起源的區段的抗性測試載體pCG-CXCN(F-lucP)2-AA進行藥物敏感性和抗性測試。抗性測試載體起源於基因組指示基因病毒載體，pCG-CXCN(F-lucP)2-AA.數據表示為靶宿主細胞中螢光素酶基因活性的抑制百分數對AZT濃度(log10)的關係。pCGCXCN(F-lucP)2-AA描繪為實心盒。含有在AZT處理之前病人起源的區段的pCG-CXCN(F-lucP)2-AA描繪為實心圓環，和AZT處理後的描繪為實心三角。
C．利用含有起源於生物學活性原病毒克隆，pNL4-3，的逆轉錄酶區段的抗性測試載體，pCG-CXCN(F-lucP)2-AA，進行的藥物敏感性和抗性測試。數據表示為靶宿主細胞中的螢光素酶基因活性的抑制百分數對nevirapine濃度(log10)關係，並描繪為實心盒。
D．利用含有起源於生物學活性原病毒克隆，pNL4-3，的蛋白酶區段的抗性測試載體，pCG-CXCN(F-lucP)2-AA，進行的藥物敏感性和抗性測試。數據表示為靶宿主細胞中的螢光素酶基因活性的抑制百分數與indinavir濃度(log10)的關係並被描繪為實心盒。
圖8.A．圖解說明HBV的RNA前基因組結構。將前基因組RNA表示為實線。直接重複序列(DR)表示為閉合的矩形。衣殼化的信號序列的位置表示為(。C,P,S，和X基因表示為開放的矩形。標出了終端蛋白(TP)，間隔，DNA聚合酶/逆轉錄酶(pol/RT)，和P基因的RNA酶H區。由陰影三角表示了C,P,S和X翻譯起始位點。
B．概括性地圖解說明含有指示基因盒和含有反向內含子的亞基因組指示基因病毒載體，pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ-(PSAS-)，抗性測試載體系統的一個成份，它在5』-3』方向含有以下元件(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)HBV基因組的5』區和DR1和5』((刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)非功能性指示基因盒，其中指示基因ORF含有反向內含子，(4)含有DR2,DR1*,3』ε，和3』HBV多聚腺苷酸化(pA)信號區的HBV基因組的區。
C．圖解說明含有由於HBV病毒複製而組裝的功能性指示基因盒的亞基因組指示基因病毒載體，pCS-HBV(F-IG)Ⅱ(PSAS-)，的共價閉合環形DNA(cccDNA)形式。
D．圖解說明包裝載體的一個例子，pPK-CPX，它是一個包括病人起源區段的抗性測試載體系統的一個成份，它在5』-3』方向含有以下元件(1)CMVIE增強子-啟動子區，(2)跨越C ORF翻譯起始密碼子到3』pA信號並包括C,P,S，和X基因的HBV基因組的區域。將包裝載體pPK-CPX的C基因進行修飾使其不含有前-C ORF序列並不表達S蛋白質(由翻譯起始位點處X表示)。
E．圖解說明提供S基因蛋白質的附加的包裝載體pPK-S，它是與含有指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ-(PSAS-)的抗性測試載體系統，和包裝質粒pPK-CPX共轉染的。
F．概括性地圖解說明包括含有反向內含子非功能性指示基因的抗性測試載體pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ-(PSAS+)，它在5』-3』方向含有以下元件(1)CMVIE增強子-啟動子區，(2)HBV基因組的5』區和DR1和5』((刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)含有病人起源的P基因區段的HBV基因組區域內的指示基因盒(含有反向內含子)。(4)含有DR2,DR1*,3』ε，和3』HBVpA信號區的HBV基因組的區域。
G．圖解說明含有由於HBV病毒複製而組裝的功能性的指示基因盒和病人起源的P基因區段的抗性測試載體，pCS-HBV(F-IG)Ⅱ-(PSAS+)，的共價閉合環形DNA(cccDNA)形式。
H．圖解說明提供C,S和X基因蛋白質的包裝載體pPK-CSX，它是與抗性測試載體，pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ-(PSAS+)，共轉染的。
圖9.A．圖解說明HBV的RNA前基因組結構。
B．圖解說明含有非功能性的指示基因盒的HBV指示基因病毒載體。顯示了用於靶DNA序列的擴增的引物結合位點。正向引物(Pf)和反向引物(Pr)結合位點的定位和定向不構成用於轉染包裝宿主細胞的線性形式載體中的功能性擴增單位。將Pr結合位點設計成跨越通過將前基因組RNA的拼接產生的連接序列。
C．圖解說明10B中敘述的指示基因病毒載體的rc-DNA形式。顯示了用於靶DNA序列的擴增的引物接合位點。Pf和Pr引物結合位點的定位和定向構成了載體中的rc-DNA形式的正鏈DNA成份和cccDNA形式的正和負鏈DNA成份中的功能性的擴增單位，該載體是通過在包裝宿主細胞中產生的病毒顆粒內的HBV DNA複製產生的。通過前基因組RNA的拼接組裝Pr接合位點。
D．圖解說明含有非功能性的指示基因盒的HBV指示基因病毒載體。顯示了用於靶DNA序列的擴增的引物結合位點。Pf和Pr結合位點的定位和定向構成了用於轉染包裝宿主細胞的線性形式載體中的功能性擴增單位，但是在非拼接線性形式的載體中，Pf結合位點不與外切核酸酶檢測探針(probe)的結合位點鄰接。Pf,Pr，和探針結合位點的這一安排不構成有效的外切核酸酶的檢測單位。
E．圖解說明圖9D敘述的指示基因病毒載體的rc-DNA形式。顯示了用於靶DNA序列的擴增的引物結合位點。Pf和Pr引物結合位點的定位和定向構成了通過在包裝宿主細胞中HBV DNA的複製而產生的rc-DNA和cccDNA形式的載體中的功能性擴增單位。在rc-DNA和cccDNA形式的載體中Pf結合位點的定位與外切核酸酶檢測探針(probe)的結合位點緊緊鄰接。Pf,Pr，和探針結合位點的這一安排構成了有效的外切核酸酶檢測單位。
F．圖解說明HBV指示基因病毒載體。顯示了用於靶DNA序列的擴增的引物結合位點。正向引物(Pf)和反向引物(Pr)結合位點的定位和定向不構成用於轉染包裝宿主細胞的線性形式的載體中的功能性擴增單位。
G．圖解說明10F中描述的指示基因的病毒載體的rc-RNA形式。顯示了用於靶DNA序列的擴增的引物結合位點。Pf和Pr引物結合位點的定位和定向在載體的rc-DNA形式的正鏈的DNA成份和cccDNA形式的正和負鏈DNA成份中構成了功能性擴增單位，該載體是通過包裝宿主細胞中產生的病毒顆粒內的HBV DNA的複製產生的。
圖10.A．圖解說明HBV的RNA前基因組結構。
B．概括性地圖解說明亞基因組指示基因病毒載體，pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS-)，含有具有置換啟動子的非功能性指示基因的抗性測試載體系統的一個成份，它在5』-3』方向含有下面的元件(1)CMVIE增強子-啟動子區域，(2)HBV基因組的5』區和DR1和5』((刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)其組裝使啟動子區定位於指示基因ORF的3』，即下遊，的非功能性指示基因盒，(4)含有DR2,DR1*，3』ε，和3』HBVpA信號區的HBV基因組的3』區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)。圖8D顯示了含有病人起源的P基因區段的抗性測試載體系統的一個成份，包裝載體pPK-CPK，圖8E顯示了S包裝載體pPK-S。
C．圖解說明含有由於HBV病毒複製而組裝的功能性指示基因盒的亞基因組指示基因病毒載體pCS-HBV(F-IG)PP(PSAS-)的共價閉合環形DNA(cccDNA)形式。
D．概括性地圖解說明含有具有置換啟動子的非功能性指示基因的抗性測試載體pCS-HBV(NF-IG)PP(PSAS+)，它在5』-3』方向含有下面的元件(1)CMVIE增強子-啟動子區，(2)HBV基因組的5』區和DR1和5』拷貝(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)增強子-啟動子區(置換啟動子)，(4)含有病人起源的區段的P基因，(5)指示基因ORF,(6)內部核糖體進入位點(IRES)，和(7)含有DR2,DR1*,3』ε，和3』HBV pA信號區的HBV基因組的3』區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)。如圖8H所示，提供C,S和X基因的包裝載體pPK-CSX是與抗性測試載體pCS-HBV(NF-IG)PP(PSAS+)共轉染的。
E．圖解說明含有由於HBV病毒複製而組裝的功能性指示基因盒和病人起源的P基因區段的抗性測試載體，pCS-HBV(F-IG)PP(PSAS+)的共價閉合環形DNA(cccDNA)形式。
圖11.A．圖解說明HBV的RNA前基因組結構。
B．概括性地圖解說明亞基因組指示基因病毒載體，pCS-HBV(NF-IG)PPTIS-(PSAS-)，它是含有具有置換啟動子和翻譯起始位點的非功能性指示基因的抗性測試載體系統的一個成份，它在5』-3』方向含有下面的元件(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)包括DR1和5』的HBV基因組的5』區((刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)缺乏翻譯起始位點的指示基因ORF,(4)增強子-啟動子區(置換啟動子)，(5)含有DR2,前-C ORF翻譯起始密碼子，DR1*,3』ε,3』HBV pA信號區的HBV基因組的3』區。圖8D顯示了含有病人起源的區段的抗性測試載體系統的一個成份，包裝載體pPK-CPX，圖8E顯示了S包裝載體pPK-S。
C．圖解說明含有由於HBV病毒複製而組裝的功能性指示基因的亞基因組指示基因病毒載體pCS-HBV(F-IG)PPTIS(PSAS-)的共價閉合環形DNA(cccDNA)形式。
D．概括性地圖解說明包括具有置換啟動子的非功能性指示基因的抗性測試載體pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS+)，它在5』-3』方向含有下面的元件(1)CMV IE增強子一啟動子區，(2)包括DR1和5』的HBV基因組的5』區((刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)缺乏翻譯起始位點的指示基因ORF，(4)含有病人起源的區段的P基因，(5)增強子-啟動子區域(置換啟動子)，(6)含有DR2，前-C ORF翻譯起始密碼子，DR1*,3』ε，和3』HBV pA信號區的HBV基因組的3』區。如圖8H所示，提供C,S和X基因的包裝載體pPK-CSX是與抗性測試載體pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS+)共轉染的。
E，圖解說明含有由於HBV病毒複製而組裝的功能性指示基因盒和病人起源的P基因區段的抗性測試載體pCS-HBV(F-IG)PPTIS(PSAS+)的共價閉合環形DNA(cccDNA)形式。
圖12A，概括性地圖解說明HBV的RNA前基因組結構。
B．概括性地圖解說明亞基因組指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PCR-(PSAS-)，它是包括具有置換編碼區的非功能性指示基因的抗性測試載體系統的一個成份，它在5』-3』方向含有下面的元件(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)含有DR1和5』(的HBV基因組的5』區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)其組裝使啟動子區和編碼區的5』部分定位於剩餘的編碼區3』部分的3』，即下遊，的非功能性指示基因盒，(4)含有DR2,DR1*,3』ε，和3』HBVpA信號區的HBV基因組的3』區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)。圖8D顯示了含有病人起源的P基因區段的抗性測試載體系統的一個成份，包裝載體pPK-CPX，圖8E顯示了S包裝載體，pPK-S。
C．圖解說明了含有由於HBV病毒的複製而組裝的功能性指示基因盒的亞基因組指示基因病毒載體pCS-HBV(F-IG)PCR(PSAS-)的共價閉合環形DNA(cccDNA)形式。
D．概括性地圖解說明包括具有置換編碼區的非功能性指示基因的抗性測試載體pCS-HBV(NF-IG)PCR(PSAS+)，它在5』-3』方向含有下面的元件(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)包括DR1和5』(的HBV基因組的5』區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)以反向的拼接受體序列開始的指示基因ORF的3』部分，(4)含有病人起源的區段的P基因，(5)增強子-啟動子區，(6)以反向的拼接供體序列為末端的指示基因ORF的5』部分，(7)含有DR2,DR1*,3』ε,3』HBVpA信號區的HBV基因組的3』區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)。如圖8H所示，提供C,S和X基因的包裝載體pPK-CSX是與抗性測試載體pCS-HBV(NF-IG)PCR(PSAS+)共轉染的。
E．圖解說明了含有由於HBV病毒的複製而組裝的功能性指示基因盒和病人起源的P基因區段的抗性測試載體，pCS-HBV(F-IG)PCR(PSAS+)的共價閉合環形DNA(cccDNA)形式。
圖13.A．圖解說明了HBV的RNA前基因組的結構。
B．概括性地圖解說明亞基因組指示基因病毒載體成份pCS-HBV(F-IG)(PSAS-)，它是含有功能性指示基因盒的抗性測試載體系統的一個成份，它在5』-3』方向含有下面的元件(1)CMV IE增強子-啟動子區域，(2)包括DR1和5』(的HBV基因組的5』區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)功能性指示基因盒，(4)含有DR2，DR1*,3』ε,3』HBV pA信號區的HBV基因組的3』區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)。圖8D顯示了含有病人起源P基因區段的抗性測試載體系統的一個成份，包裝載體pPK-CPX，圖8E顯示了S包裝載體，pPK-S。
C．圖解說明含有功能性指示基因的亞基因組指示基因病毒載體pCS-HBV(F-IG)(PSAS-)的共價閉合環形DNA(cccDNA)形式。
D．概括性地圖解說明包括功能性指示基因的抗性測試載體pCS-HBV(F-IG)(PSAS+)，它在5』到3』方向含有下面的元件(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)包括DR1和5』(的HBV基因組的5』區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)功能性指示基因盒，(4)含有病人起源的區段的P基因，(5)含有DR2,DR1*,3』ε，和3』HBV pA信號區的HBV基因組的3』區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)。如圖8H所示，提供C,S和X基因的包裝載體pPK-CSX是與抗性測試載體pCS-HBV(F-IG)(PSAS+)共轉染的。
E．圖解說明含有功能性指示基因的抗性測試載體pCS-HBV(F-IG)(PSAS+)的共價閉合環形DNA(cccDNA)的形式。發明的詳細說明為了可以更充分地理解本文敘述的發明，下文進行詳細說明。
本發明提供了新的藥物敏感性和抗性測試，包括步驟(a)在宿主細胞中導入含有病人起源區段和指示基因的抗性測試載體；(b)培養來自步驟(a)的宿主細胞；(c)測量靶宿主細胞中的指示基因的表達；和(d)將來自步驟(c)的指示基因的表達與在缺乏抗病毒藥物時進行步驟(a)到(c)時測量的指示基因的表達進行比較，其中試驗濃度的抗病毒藥物存在於步驟(a)到(c)；步驟(b)到(c)；或步驟(c)。
本發明一方面提供了用於確定抗病毒藥物的敏感性的方法，包括(a)在宿主細胞中導入包括病人起源的區段和指示基因的抗性測試載體；(b)培養來自步驟(a)的宿主細胞；(c)測量靶宿主細胞中的指示物，其中所述的指示物是DNA或RNA結構；和(d)將來自步驟(c)的指示物的測量結果與在缺乏抗病毒藥物時進行步驟(a)到(c)時指示物的測量結果進行比較，其中試驗濃度的抗病毒藥物存在於步驟(a)到(c)，步驟(b)到(c)；或步驟(c)。
本發明也提供了用於確定病人的抗病毒藥物抗性的方法，包括(a)作出抗病毒藥物的藥物敏感性的標準曲線；(b)利用上述敏感性測試之一確定病人的抗病毒藥物的敏感性；和(c)將步驟(b)中的抗病毒藥物的敏感性與步驟(a)中確定的標準曲線進行比較，其中抗病毒敏感性的下降表明病人產生了抗病毒藥物抗性。
本發明也提供了確定病人的抗病毒藥物的抗性的方法，包括(a)根據上面的方法之一，在第一個時間確定病人中的抗病毒藥物的敏感性，其中病人起源的區段是在大約所述的時間從病人得到的；(b)在後來的一個時間，確定同一個病人的抗病毒藥物的敏感性；和(c)比較在步驟(a)和(b)確定的抗病毒藥物的敏感性，其中與第一個時間比較在後來的時間抗病毒藥物的敏感性的下降表明病人產生或增加了抗病毒藥物的抗性。
本發明的測試可以用於任何與抗病毒藥物敏感性和抗性相關的病毒疾病，包括例如，HIV，單純皰疹病毒，巨細胞病毒，水痘帶狀皰疹病毒，其它的人皰疹(HIV)病毒，流感A病毒，肺結核病毒，甲，乙和丙型嗜肝DNA病毒，鼻病毒，人乳頭瘤病毒。前面是某些病毒的代表，對於它們目前存在可得的抗病毒化學治療，並代表了病毒家族逆病毒，皰疹病毒，正粘病毒，肺病毒，和嗜肝DNA病毒。本發明的測試將用於由於這些家族內的其它病毒的感染產生的其它的病毒感染以及從其它病毒家族中的病毒產生的病毒感染。另外，本發明的藥物敏感性和抗性測試可用於篩選治療病毒疾病的化合物，對於這些疾病目前還沒有治療方法。
在本發明的藥物敏感性和抗性測試中可以測試的病毒的結構，生命周期和遺傳元件將是本領域的普通技術人員已知的。了解逆病毒的生命周期，以及逆病毒的生存和感染性所必需的病毒基因對於本發明的實施來說是有用的。逆病毒感染的細胞排出含有二倍體RNA基因組的膜病毒。該病毒上密布著被膜糖蛋白(它的作用是確定感染的寄主宿主)，附著於待感染的細胞的質膜中的細胞受體。在受體結合後，病毒被內在化並脫去包衣，穿過宿主細胞的細胞質。在它走向核的途中或在核內，存在於病毒核心的逆轉錄酶分子驅動雙鏈DNA原病毒的合成，這是一種由tRNA分子與基因組病毒RNA結合引發的合成。隨後，雙鏈DNA原病毒整合於宿主細胞的基因組中，在這裡它可以充當編碼病毒蛋白質的mRNA和病毒顆粒基因組RNA的轉錄模板，該病毒顆粒基因組RNA將被包裝進病毒核心顆粒。在它們離開感染細胞的過程中，核心顆粒穿過細胞質，附著於新感染的細胞的質膜的內側，並開始頂出，伴隨它們的是含有病毒編碼的被膜糖蛋白基因產物的大片膜。這一感染周期——逆轉錄、轉錄、翻譯、病毒粒子的組裝、和頂出——在感染的傳播中一遍又一遍地重複著。
結果，病毒RNA和原病毒DNA編碼幾個對成功地完成病毒生命周期至關重要的順式作用元件。病毒粒子RNA在它的3』末端攜帶病毒啟動子。複製的特技將病毒啟動子置於原病毒基因組的5』末端，因為基因組是逆轉錄的。只有逆病毒LTR的3』到5』存在病毒的包裝位點。逆病毒的生命周期需要存在病毒編碼的反式激活因子。同時在病毒核心內也含有依賴於病毒RNA的DNA聚合酶(pol)-逆轉錄酶，並且對病毒生命循環是至關重要的，因為它負責基因組RNA到整合中間體原病毒DNA的轉換。病毒附著於非感染的細胞和病毒傳播需要病毒被膜糖蛋白env。也存在轉錄反式活化作用因子，稱為反式活化子，它能調節整合親本原病毒的轉錄水平。通常，有能力複製(非缺陷型)的病毒是整套裝在一起的，因為它們編碼所有這些反式激活作用因子，它們的缺陷型不是自給自足的。
在DNA病毒的情況中，如嗜肝DNA病毒，了解其生命周期和感染所必需的病毒基因對於實施本發明是有用的。對於HBV的進入的過程還了解得不多。HBV的複製利用了RNA中間模板。在感染細胞中，複製的第一步是將不對稱的鬆弛的環形DNA(rc-DNA)變換成共價閉合環形DNA(cccDNA)。發生在感染的肝細胞的核中的這一過程，包括完成DNA正鏈合成和DNA末端的連接。第二步，通過寄主RNA聚合酶將cccDNA轉錄以產生一個3.5kB RNA模板(前基因組)。這一前基因組在病毒核心中是蛋白質複合的。第三步包括利用病毒編碼的P蛋白質逆轉錄酶拷貝前基因組RNA合成第一個反義DNA鏈。P蛋白質也具有作為負鏈DNA引物的作用。最後，利用P蛋白質DNA聚合酶活性和病毒RNA的低聚物作為引物通過拷貝第一個DNA鏈合成第二個正向意義的DNA鏈。前基因組也轉錄主要的結構核心蛋白的mRNA。
下面的流程說明了可以用於本發明的某些載體和宿主細胞。但並沒有包括全部。載體指示基因盒+病毒載體(功能性/非功能性指示基因)(基因組或亞基因組)↓指示基因病毒載體(功能性/非功能性指示基因)↓+ 病人序列接受位點↓+ 病人起源區段抗性測試載體(病人起源區段+指示基因)宿主細胞包裝宿主細胞-用包裝表達載體轉染抗性測試載體宿主細胞-利用抗性測試載體轉染的包裝宿主細胞靶宿主細胞-由抗性測試載體宿主細胞產生的抗性測試載體病毒顆粒感染的宿主細胞抗性測試載體「抗性測試載體」指一個或多個載體，它們組合在一起含有病人起源區段和指示基因的DNA或RNA。在抗性測試載體含有超過一個載體的情況中，病人起源的區段可以包含在一個載體中而指示基因包含在一個不同的載體中。為了清楚起見，這樣的含有超過一個載體的抗性測試載體本文稱為抗性測試載體系統，但仍然理解為抗性測試載體。所以抗性測試載體的DNA或RNA可以包含於一個或多個DNA或RNA分子中。在一個實施方案中，通過在指示基因病毒載體中插入病人起源的區段製備抗性測試載體。在另一個實施方案中，通過在包裝載體中插入病人起源的區段產生抗性測試載體而指示基因包含於第二個載體中，例如指示基因病毒載體。如本文所用，「病人起源的區段」是指利用各種手段直接從病人得到的一個或更多病毒區段，例如，利用從存在於感染病人的細胞(如，外周血液單核細胞，PBMC)、血清或其它體液的病毒RNA製備的病毒DNA或互補的DNA(cDNA)的病人起源的區段，並使用這樣製備的病人起源的區段通過分子克隆或聚合酶鏈式反應擴增(PCR)而得到。當從病人「直接得到」病毒區段是指沒有通過培養的病毒傳代過程，或如果病毒被培養，則通過了最小數目的傳代過程，從而基本上排除了培養中對突變的篩選。術語「病毒區段」指任何編碼一個基因產物(如，蛋白質)的功能性病毒序列或病毒基因，該基因產物是抗病毒藥物的靶。本文所用的術語「功能性病毒序列」指具有功能活性的任一種核酸序列(DNA或RNA)，如增強子，啟動子，多聚腺苷酸化位點，反式活化因子的作用位點，如tar和RRE，包裝序列，整合序列，或拼接序列。如果一種藥物是針對一個以上的功能性病毒序列或病毒基因產物的，那麼對應於每個所述病毒基因的病人起源的區段將被插入在抗性測試載體中。在聯合治療的情況中，其中要評估靶擊兩個不同的功能性病毒序列或病毒基因產物的兩個或多個抗病毒藥物，對應於每個功能性病毒序列或病毒基因產物的病人起源的區段將被插入在抗性測試載體中。根據如上所述所用的特定的構建體，病人起源的區段被插入在指示基因病毒載體或例如包裝載體中的獨特的限制性位點或特異位置，被稱為病人序列接受位點。
如本文所用，「起源於病人的區段」包括起源於人和各種動物種類的區段。這樣的種類包括，但不限於黑猩猩，馬，小牛，貓和狗。
也可使用幾種克隆技術中的任何一種將病人起源的區段摻入抗性測試載體中。例如，通過在質粒主鏈和病人起源的區段導入Ⅱ類限制性位點的克隆或通過尿嘧啶DNA糖基化酶引物的克隆(refs)。
可採用分子克隆或基因擴增，或其改良方法中的任何一種，通過在待導入抗性測試載體的病人起源的區段的末端導入如下所述的病人序列接受位點，可以得到病人起源的區段。例如，在基因擴增方法，(如PCR)中，可在用於PCR反應的引物的末端導入對應於病人序列的受體位點的限制性位點。同樣，在分子克隆方法如cDNA克隆中，可以在用於第一或第二鏈cDNA合成的引物的末端導入所述的限制性位點，或在如DNA的引物修復的方法中，不管克隆或未克隆的DNA，可以在用於修復反應的引物中導入所述的限制性位點。將病人序列接受位點和引物設計成提高病人起源的區段的呈現。已經設計了病人序列接受位點的一系列抗性測試載體提供了將在單獨的一個抗性測試載體中呈現不足的病人起源的區段的呈現。
抗性測試載體是通過在指示基因病毒載體中導入病人序列接受位點(如下所述)進行修飾，擴增或克隆病人起源的區段並將該擴增的或克隆的序列在病人序列接受位點插入指示基因病毒載體來製備。抗性測試載體是從指示基因病毒載體構建的，指示基因病毒載體起源於基因組病毒載體或亞基因組病毒載體和指示基因盒(如下所述)。然後將抗性測試載體導入宿主細胞。或者，通過在包裝載體中導入病人序列接受位點，擴增或克隆病人起源的區段，並在包裝載體中的病人序列接受位點精確地插入該擴增的或克隆的序列，並與指示基因病毒載體共轉染這一包裝載體來製備抗性測試載體(也稱為抗性測試載體系統)。
在一個優選的實施方案中，如下面所述，抗性測試載體可以與包裝表達載體一起被導入包裝宿主細胞，以便產生用於藥物抗性和敏感性測試的抗性測試載體病毒顆粒，本文稱為「基於顆粒的測試」。在另一個的優選實施方案中，抗性測試載體可在缺乏包裝表達載體的情況下被導入宿主細胞中，以便進行藥物抗性和敏感性測試，本文稱為「基於非顆粒的測試」。如本文所用，「包裝表達載體」提供複製缺陷型逆病毒或嗜肝DNA病毒所需要的因子，如包裝蛋白(如核心和被膜多肽的結構蛋白)，反式激活因子，或基因。在這一情況下，以它本身不能複製的方式使能複製的病毒基因組衰弱。這意味著雖然包裝表達載體能產生挽救存在於含有衰弱的基因組的細胞中的缺陷型病毒基因組所需要的反式激活作用或失去的基因，衰弱的基因組不能挽救它本身。
指示物或指示基因「指示物或指示基因」是指一種核酸，它編碼可直接或通過反應產生可測量的或可注意的指標，如產生顏色和可測量波長的光的蛋白質、DNA或RNA結構，或在DNA或RNA被用作指示物的情況中，特異DNA或RNA結構的變化或產生。優選的指示基因的例子是編碼β-半乳糖苷酶的大腸桿菌lacZ基因，編碼來自photonis pyralis(螢火蟲)或renilla reniformis(海產三色堇)的螢光素酶的luc基因，編碼鹼性磷酸酶，綠色螢光蛋白的大腸桿菌phoA基因和編碼氯黴素乙醯轉移酶的細菌CAT基因。其它優選的指示基因的例子是容易通過測驗，如放射性免疫測驗(RIA)，或螢光活性細胞分類(FACS)測量的分泌蛋白質或細胞表面蛋白，包括例如生長因子，細胞因子和細胞表面抗原(如分別為生長激素，Ⅱ-2或CD4)。將「指示基因」理解為也包括選擇基因，也被稱作可選擇性標記。哺乳動物細胞的適當的可選擇性標記的例子是二氫葉酸還原酶(DHFR)，胸苷激酶，潮黴素，新黴素，zeocin或大腸桿菌gpt。在前面的指示基因的例子的情況中，指示基因和病人起源的區段是分離的，即完全不同的和分離的基因。在某些情況中，病人起源的區段也可以用作指示基因。在一個這樣的實施方案中，其中病人起源的區段對應於超過一個以上的抗病毒藥物的靶的病毒基因，所述的病毒基因中的一個也可以作為指示基因。例如，藉助於切割色原底物，或活化失活的酶原而切割色原底物以在各種情況下產生顏色反應的能力，病毒蛋白酶基因可以作為指示基因。在所有上面的指示基因的例子中，指示基因可以是「功能性的」或「非功能性的」，但在每種情況下，靶細胞中指示基因的表達最終依賴於病人起源的區段的作用。
功能性指示基因在「功能性指示基因」的情況中，指示基因可以是能夠在如下所述的「包裝宿主細胞/抗性測試載體宿主細胞」中表達，而不依賴於病人起源的區段，但是，沒有功能性抗性測試載體顆粒的產生和它們對靶宿主細胞的有效的感染，指示基因不能在靶宿主細胞中表達，如下所述。在功能性指示基因的一個實施方案中，將包括反應控制元件和編碼指示蛋白的基因的指示基因盒以與病毒載體的天然或外源增強子/啟動子同樣的或相反的轉錄方向插入在指示基因病毒載體中。在HIV或HBV的情況中的功能性指示基因的一個例子是將指示基因和它的啟動子(CMV IE增強子/啟動子)以分別與HIV-LTR或HBV增強子-啟動子，或與病毒載體相關的CMVIE增強子/啟動子相同或相反的轉錄方向放置。
非功能性指示基因指示基因也可以是「非功能性的」，其中指示基因不能在用抗性測試載體轉染的包裝宿主細胞中有效地表達，該細胞隨後被稱為抗性測試載體宿主細胞，直到它通過一個或更多的病人起源區段產物的作用被轉換成功能性指示基因。通過本發明的遺傳操作使指示基因變成非功能性的。
1．置換啟動子在一個實施方案中，由於啟動子的定位，使指示基因變成非功能性，因為，雖然啟動子是在與指示基因相同的轉錄方向，它在指示基因編碼序列的後面而不是前面。這一錯位的啟動子稱為「置換啟動子」。除了置換啟動子，非功能性指示基因的定向是與病毒載體的天然或外源啟動子/增強子相反的。所以，非功能性指示基因的編碼序列既不通過置換啟動子也不通過病毒啟動子轉錄。通過一個或多個病毒蛋白質的作用使非功能性指示基因和它的置換啟動子變成功能性的。在HIV的情況中的一個具有置換啟動子的非功能性的指示基因的例子是將5』LTR的T7噬菌體RNA聚合酶啟動子(本文稱為T7啟動子)放置於與指示基因相同的轉錄方向上。通過T7啟動子不能轉錄指示基因，因為指示基因盒處於T7啟動子的上遊。在感染靶細胞之後，通過逆轉錄酶的相對於指示基因編碼區來說從5』LTR到3』LTR的拷貝導致T7啟動子的再定位，使抗性測試載體中的非功能性指示基因被轉換成功能性指示基因。在HIV整合酶將修復的指示基因整合進靶細胞染色體後，由靶細胞表達的T7 RNA聚合酶轉錄該指示基因。在HBV的情況中的具有置換啟動子的非功能性指示基因的例子是將增強子-啟動子區放置於指示基因的下遊或3』末端，兩者具有同樣的轉錄方向。通過增強子-啟動子不能轉錄指示基因，因為指示基因盒定位於上遊。通過HBV指示基因病毒載體的逆轉錄和環化，使指示基因編碼區增強子一啟動子再定位於上遊，從而將抗性測試載體中的非功能性指示基因轉換成功能性指示基因。
置換啟動子可以是可在靶宿主細胞中轉錄的任一種真核或原核生物的啟動子。優選啟動子的大小是小的從而使其能夠插入病毒基因組而不影響病毒複製。更優選使用小的，並能通過導入靶宿主細胞的單個RNA聚合酶亞單位進行轉錄的啟動子，如噬菌體啟動子。這樣的噬菌體啟動子的例子和它們的同族RNA聚合酶包括噬菌體T7,T3和Sp6的那些。一種核定位序列(NLS)可以附著於RNA聚合酶上，以便將RNA聚合酶的表達限於核內，在核內，可能需要它們轉錄修復的指示基因。這樣的NLS可以從任何如SV40 T抗原的核運輸蛋白獲得。如果利用噬菌體RNA聚合酶，為了通常沒有加帽的轉錄物的翻譯，在指示基因的前面應加上內部核糖體進入位點(IRES)，如EMC病毒5』未翻譯區(UTR)。在HIV的情況中，置換啟動子本身可以導入在逆轉錄過程中拷貝成3』LTR的5』LTR內的任何位置，只要LTR的功能不被破壞，優選在LTR的U5和R部分，最優選在U5和R的功能重要和高度保守的區域的外面。在HBV的情況中，置換啟動子可以置於不打亂HBV DNA複製所必需的順式作用元件的任何位置。如果由於轉染的人工效應(DNA連鎖)非功能性指示基因有不適當的表達，可將封閉序列加在抗性測試載體的末端。在上面給出的置換T7啟動子的HIV例子中，這樣的封閉序列可以由T7轉錄終止子組成，其定位阻止由DNA連鎖造成的閱讀轉錄，但不阻止逆轉錄過程中從5』LTR到3』LTR的置換T7啟動子的再定位造成的轉錄。
2．置換編碼區在第二個實施方案中，由於指示基因的5』和3』編碼區的相對定位使指示基因變成非功能性，因為3』編碼區在5』編碼區的前面而不是後面。這樣錯位的編碼區稱為「置換編碼區」。非功能性指示基因的定向可以與病毒載體的天然或外源的啟動子/增強子的定向相同或相反，因為編碼功能性指示基因的mRNA將在任一定向狀況中產生。一個或多個病人起源的區段產物的作用使非功能性指示基因和它的置換編碼區成為功能性的。在HIV的情況中具有置換編碼區的非功能性指示基因的第二個例子是將具有相關的啟動子的5』指示基因編碼區放置於3』LTR U3區，和將3』指示基因編碼區放置於HIV基因組的上遊位置，而每個編碼區具有同樣於病毒LTR的轉錄方向。在兩個例子中，5』和3』編碼區也可以分別具有相關的拼接供體和受體序列，它們可以是異種的或人工的拼接信號。指示基因不能通過相關的啟動子或病毒啟動子功能性地轉錄，因為置換編碼區阻止了功能性拼接轉錄物的形成。在感染靶細胞之後，通過逆轉錄酶將3』LTR拷貝成5』LTR，導致5』和3』指示基因編碼區相互之間重新定位，使抗性測試載體中的非功能性指示基因變換成功能性指示基因。由5』編碼區相關的啟動子轉錄後，RNA拼接可以將5』和3』編碼區連接，產生出功能性指示基因產物。在HBV的情況中，具有置換編碼區的非功能性指示基因的一個例子是將3』指示基因編碼區放置於增強子-啟動子和指示基因的5』編碼區的上遊或5』末端。指示基因的5』和3』編碼區的轉錄定向相同，並與指示基因病毒載體相同。但是，由於指示基因的5』和3』編碼區在抗性測試載體中置換(即，5』編碼區在3』編碼區的下遊)，沒有轉錄出可以拼接產生功能性指示基因編碼區的mRNA。在指示基因病毒載體的逆轉錄和環化後，指示基因3』編碼區定位於增強子-啟動子和5』編碼區的下遊或3』末端，從而允許可以拼接生產功能性指示基因編碼區的mRNA的轉錄。
3．反向內含子在第三個實施方案中，通過使用「反向內含子」，即以相反於指示基因的轉錄的方向插入在指示基因的編碼序列中的內含子，使指示基因變成非功能性。包括它自身、連接啟動子的指示基因盒的整個轉錄定向是與病毒控制元件相反的，而人工內含子的定向是與病毒控制元件相同的。指示基因通過它自身連接的啟動子的轉錄不產生功能性轉錄物，因為反向內含子不能在這一定向中拼接。但是，通過病毒控制元件的指示基因的轉錄確實導致通過RNA拼接使反向內含子除去，雖然指示基因仍然不是功能性地表達，因為得到的轉錄物是反義方向的。在這一轉錄物的逆轉錄和產生的逆病毒DNA的整合，或嗜肝DNA病毒DNA的環化後，指示基因可以利用它自身連接的啟動子功能性地轉錄，因為反向內含子已經在前面除去。在這種情況下，指示基因本身可以含有與病毒控制元件定向相反的整個轉錄單位的它本身的功能性啟動子。所以，非功能性指示基因是在通過病毒控制元件轉錄的錯誤方向，並且它不能通過自身的啟動子功能性地轉錄，因為反向內含子不能通過拼接適當地切除。但是，在逆病毒特別是HIV，嗜肝DNA病毒，特別是HBV的情況中，通過病毒啟動子(HIVLTR或HBV增強子-啟動子)的轉錄導致反向內含子通過拼接而除去。作為產生的拼接轉錄物的逆轉錄和產生的這一原病毒整合進宿主細胞染色體或HBV載體的環化的結果，現在指示基因可以通過它自身的啟動子功能性地轉錄。為了打亂指示基因的翻譯，含有拼接供體和受體位點以便除去內含子的反向內含子，優選定位於指示基因的編碼區。拼接供體和受體可以是任何拼接供體和受體。優選的拼接供體-受體是CMV IE拼接供體和人α-球蛋白基因(「內含子A」)的第二個外顯子的拼接受體。
指示基因病毒載體-構建如本文所用，「指示基因病毒載體」是指含有指示基因和它的控制元件和一個或多個病毒基因的載體。指示基因病毒載體是從指示基因盒和下文定義的「病毒載體」組裝的。另外指示基因病毒載體還可以包括增強子，拼接信號，多聚腺苷酸化序列，轉錄終止子，或其它調節序列。另外，指示基因病毒載體可以是功能性的或非功能性的。在作為抗病毒藥物的靶的病毒區段沒有包括在指示基因病毒載體中的情況下，它們存在於第二個載體中。「指示基因盒」包括指示基因和控制元件。「病毒載體」指含有一些或所有下面基因的載體編碼一種基因產物的病毒基因，控制序列，病毒包裝序列，和在逆病毒的情況中的整合序列。另外，病毒載體還可以包括一個或更多的病毒區段，它們中的一個或更多可以是抗病毒藥物的靶。本文將含有病毒基因的病毒載體的兩個例子稱為「基因組病毒載體」和「亞基因組病毒載體」。「基因組病毒載體」是可以包括一個或多個病毒基因的缺失以致使不能進行病毒複製，但保留完全病毒的mRNA表達和完全的病毒的加工特徵的載體。在一個用於HIV藥物敏感性和抗性測試的實施方案中，基因組病毒載體含有HIVgag-pol,vif,vpr,tat,rev,vpu和nef基因(一些，大部分，或所有的env可以缺失)。「亞基因組病毒載體」是指包括一個或多個可以編碼作為抗病毒藥物的靶的蛋白質的病毒基因的編碼區的載體。在HIV的情況中，一個優選的實施方案是一種含有HIV gag-pol基因的亞基因組病毒載體。在HBV的情況中，優選的實施方案是含有HBV P基因的亞基因組病毒載體。在HIV的情況中，兩個用於病毒載體構建的原病毒克隆的例子是HXB2(Fisher等，(1986)自然，320,367-371)和NL4-3(Adachi等，(1986)病毒學雜誌，59,284-291)。在HBV的情況中，已經鑑定了大量的全長基因組序列並可以用於HBV病毒載體的構建GenBankNos.M54923,M38636,J02203和X59795。病毒編碼基因可以在天然增強子/啟動子或外源病毒或細胞增強子/啟動子的控制下。一個用於HIV的藥物敏感性和抗性測試的優選的實施方案是將基因組或亞基因組病毒編碼區放置於HIV-LTR U3區的天然增強子/啟動子或CMV即早期(IE)增強子/啟動子的控制下。一個用於HBV藥物敏感性和抗性測試的優選的實施方案，是將基因組或亞基因組病毒的編碼區放置於CMV的即早期(IE)的增強子/啟動子的控制下。在含有一個或多個是抗病毒藥物的靶的，或編碼是抗病毒藥物的靶的蛋白質的病毒基因的指示基因病毒載體的情況中，所述的載體含有病人序列接受位點。將病人起源的區段插入在指示基因病毒載體中的病人序列接受位點中，在下文中被稱為抗性測試載體。
「病人序列接受位點」是用於病人起源的區段插入的載體中的位點，並且所述的位點可以是1)通過位點特異的誘變在載體中引入的獨特的限制性位點；2)天然存在於載體中的獨特限制性位點；或3)選擇位點，利用可選擇的克隆方法(如，UDG克隆)可以將病人起源的區段插入其中的選擇位點。在一個實施方案中，在指示基因病毒載體中導入病人序列接受位點。病人序列接受位點優選地定位於抗病毒藥物的靶的病毒蛋白的編碼區內或附近。選用的用於引入病人序列接受位點的病毒序列最好使那個位點存在的胺基酸編碼序列中沒有產生變化，或保守變化。優選地病人序列接受位點定位於病毒基因組的相對保守區域以便於病人起源的區段的導入。或者，病人序列接受位點定位於功能重要的基因或調節序列之間。病人序列接受位點可以定位於病毒基因組中相對保守的區域中或其附近，以便於使用引物在病人起源的區段中導入相應的限制性位點。為了進一步改善病人起源的區段的呈現，可以簡併庫的形式設計引物以便適應病毒序列的異質性，或可以摻入如具有多重鹼基配對能力的脫氧肌苷(I)的殘基。可以在藥物抗性和敏感性測試中一起使用具有定義同樣或重疊限制位點間隔的病人序列接受位點的一系列抗性測試載體，以便提供含有相同於給定病人序列接受位點的中間限制性位點的病人起源區段的呈現，並且在每一個單獨的抗性測試載體中亞呈現。
宿主細胞在宿主細胞中導入抗性測試載體。適當的宿主細胞是哺乳動物細胞。優選的宿主細胞來源於為病毒感染的主要靶的人組織的細胞。在HIV的情況中，它們包括人細胞如人T細胞，單細胞，巨噬細胞，樹突細胞，胰細胞，造血幹細胞或前體細胞，和其它細胞。在HBV的情況中，適當的宿主細胞包括肝瘤細胞系(HepG2,Huh7)，初級人肝細胞，可以由假型HBV感染的哺乳動物細胞，和其它細胞。人起源的宿主細胞將保證抗病毒藥物有效地進入細胞並通過細胞的酶機制轉換成抗病毒抑制劑的相關代謝形式。本文將宿主細胞稱為「包裝宿主細胞」，「抗性測試載體宿主細胞」，或「靶宿主細胞」。「包裝宿主細胞」是指提供本文所用的複製缺陷病毒載體，如抗性測試載體，所需要的反式激活作用因子和病毒包裝蛋白以產生抗性測試載體病毒顆粒的宿主細胞。包裝蛋白可以通過抗性測試載體本身，包裝表達載體，或兩者內含有的病毒基因的表達來提供。包裝宿主細胞是指用一個或多個包裝表達載體轉染的宿主細胞，並且當用抗性測試載體轉染時，在本文中將被稱為「抗性測試載體宿主細胞」，有時被稱為包裝宿主細胞/抗性測試載體宿主細胞。用作HIV的包裝宿主細胞的優選的宿主細胞包括293人胚胎腎細胞(293,Graham,F.L等，病毒遺傳學雜誌36:59,1977)，BOSC23(Pear等，Proc,Natl.Acad.Sci.90,8392,1993),tsa54和tsa201細胞系(Heinzel等，病毒學雜誌62,3738,1988)，對於HBV優選的是，HepG2(Galle和Theilmann,L.Arzheim.-Forschy Drug Res.(1990)40,1380-1382)。(Huh,Ueda,K等，病毒學*(1989)169,213-216)。「靶宿主細胞」指由抗性測試載體病毒顆粒感染的細胞，該顆粒是由抗性測試載體宿主細胞產生的，在該宿主細胞中發生了指示基因的表達或抑制。用作靶宿主細胞的優選的宿主細胞包括人T細胞白血病細胞系，該細胞系包括Jurkat(ATCC T1B-152),H9(ATCC HTB-176),CEM(ATCC CCL-119),HUT78(ATCCTIB-161)和它們的衍生物。
藥物敏感性和抗性測試本發明的藥物敏感性和抗性測試可以在一個或多個宿主細胞中進行。病毒藥物敏感性確定為抗病毒試劑的濃度，在該濃度給定百分數的指示基因表達被抑制(如，抗病毒試劑的IC50是50％的指示基因的表達受抑制的濃度)。對於標準實驗室病毒區段或來自首次用藥物做實驗的病人(即，沒有接受過任何抗病毒藥物的病人)的病毒區段可利用本發明的方法可以作出給定的抗病毒藥物的藥物敏感性的標準曲線。相應地，對於給定病人來說病毒藥物抗性是病毒藥物敏感性的下降，這是通過將藥物敏感性與給定標準相比較或者通過在一定時間內對同一病人作出一系列的測試，這是通過對指示基因表達的抑制的提高(即指示基因表達的降低)來確定的。在第一種類型的藥物敏感性和抗性實驗中，抗性測試載體病毒顆粒是由第一宿主細胞(抗性測試載體宿主細胞)產生的，該細胞是通過用抗性測試載體和包裝表達載體轉染包裝宿主細胞而製備的。然後將抗性測試載體病毒顆粒用於感染第二個宿主細胞(靶宿主細胞)，其中指示基因的表達得到測量。在功能性或非功能性指示基因的情況中利用了這種兩細胞系統，該兩細胞系統包括一個包裝宿主細胞，該細胞被抗性測試載體轉染，隨後被稱為抗性測試載體宿主細胞，和靶細胞。在轉染包裝宿主細胞之後，功能性指示基因被有效地表達並將需要用抗性測試載體宿主細胞上清液感染靶宿主細胞，以便進行本發明的測試。在包裝宿主細胞轉染之後，具有置換啟動子，置換編碼區，或反向內含子的非功能性指示基因不被有效地表達，這樣靶宿主細胞的感染可通過將抗性測試載體宿主細胞與靶宿主細胞共培養或通過利用抗性測試載體宿主細胞上清液感染靶宿主細胞來達到。在第二類型的藥物敏感性和抗性測試中，單個的宿主細胞(抗性測試載體宿主細胞)也充當靶宿主細胞。包裝宿主細胞被轉染並產生抗性測試載體病毒顆粒並且一些包裝宿主細胞也變成抗性測試載體顆粒感染的靶。利用含有具有置換啟動子，置換編碼區或反向內含子的非功能性指示基因的病毒抗性測試載體使應用單個宿主細胞類型的藥物敏感性和抗性測試成為可能。在第一個細胞轉染之後，這樣的指示基因不被有效地表達，但只在第二個細胞的感染之後才被有效地表達，這樣提供了一個測量待測抗病毒試劑的效果的機會。在利用含有功能性指示基因的抗性測試載體的藥物敏感性和抗性測試的情況中，共培養方法或者利用單個細胞類型的抗性與敏感性測試都不能用於靶細胞的感染。含有功能性指示基因的抗性測試載體需要利用來自抗性測試載體宿主細胞的過濾的上清液感染靶宿主細胞的兩細胞系統。
在本發明的一個實施方案中，對於HIV的情況，利用起源於與包裝表達載體pVL-ENV4070A(也稱為pCXAS-4070Aenv)共轉染的基因組病毒載體，即pLG-lucPP-HS,pCG-lucPP-HS,pLG-lucPP-PB,pCG-lucPP-PB,pLG-lucPC-HS,pCG-lucPC-HS,pLG-lucPC-PB,pCG-lucPC-PB,pLG-lucⅡ-HS,pCG-lucⅡ-HS,pLG-lucⅡ-PB,pCG-lucⅡ-PB和pCG-CXCN(F-lucP)2-AA的抗性測試載體進行基於顆粒的抗性測試。或者，利用起源於與包裝表達載體pVL-env4070A和，pLTR-HIV3』和pCMV-HIV3』兩者之一，共轉染的亞基因組表達載體，即pLS-lucPP-HS,pCS-lucPP-HS,pLS-lucPP-PB,pCS-lucPP-PB,pLS-lucPP-HS,pCS-lucPC-HS,pLS-lucPC-PB,pCS-lucPC-PB,pLS-lucⅡ-HS,pCS-lucⅡ-HS,pLS-lucⅡ-PB和pCS-lucⅡ-PB的抗性測試載體進行基於顆粒的抗性測試。在本發明的另一個實施方案中，在HIV的情況中，通過在缺乏包裝表達載體時的選定宿主細胞的轉染，利用如上所述的抗性測試載體之一進行基於非顆粒的抗性測試。
在基於顆粒的敏感性和抗性測試中，抗性測試載體病毒顆粒是通過第一宿主細胞(抗性測試載體宿主細胞)產生的，該細胞是通過利用抗性測試載體和包裝表達載體轉染包裝宿主細胞來製備的。然後將抗性測試載體病毒顆粒用於感染第二宿主細胞(靶宿主細胞)，測量其中的指示基因的表達。在第二類型的基於顆粒的敏感性和抗性測試中，單個宿主細胞類型(抗性測試載體宿主細胞)用於兩個目的給定培養物中的一些包裝宿主細胞被感染並產生抗性測試載體病毒顆粒，在同一培養物中的一些宿主細胞是這樣產生的抗性測試載體顆粒感染的靶。利用含有具有置換啟動子的非功能性指示基因的抗性測試載體進行應用單個宿主細胞類型的抗性測試是可能的，因為在許可的宿主細胞感染之後這樣的指示基因得到有效的表達，在同樣的宿主細胞類型感染之後它們不被有效地表達，這樣提供了一個測量待測抗病毒試劑的效果的機會。基於同樣的原因，通過兩種細胞類型的共轉染可以進行利用兩種細胞類型的抗性測試，作為使用從第一個細胞類型的上清液得到的病毒顆粒感染第二個細胞類型的可選擇的一種方法。
在基於非顆粒的敏感性和抗性測試的情況中，通過利用在缺乏包裝表達載體時的抗性測試載體轉染單個宿主細胞進行抗性測試基於非顆粒的抗性測試是利用含有具有置換啟動子，置換編碼區，或反向內含子的非功能性指示基因的抗性測試載體進行的。基於非顆粒的抗性測試是通過在缺乏包裝表達載體時的各個抗性測試載體對單個宿主細胞類型的轉染進行的。雖然包含在這些抗性測試載體內的非功能性指示基因在宿主細胞的轉染之後不被有效地表達，存在著由基於非病毒顆粒的逆轉錄產生的可檢測的指示基因的表達。逆轉錄和鏈轉移導致置換的非功能性指示基因與非置換的功能性指示基因的轉變。由於逆轉錄完全依賴於每個抗性測試載體內的pol基因的表達，可以測試抗病毒試劑抑制包含在抗性測試載體內的病人起源的區段編碼的pol基因產物的能力。在HIV的情況中，逆轉錄和鏈轉移導致非功能性指示基因變換成功能性指示基因。由於逆轉錄完全依賴於包含在每個抗性測試載體內的病人起源的區段的表達，可以測試抗病毒試劑抑制包含在抗性測試載體內的病人起源的區段編碼的基因產物的能力。
利用抗性測試載體和適當的包裝表達載體轉染包裝宿主細胞以產生抗性測試載體宿主細胞。將包括逆轉錄酶抑制劑AZT,ddI,ddC,d4T和3TC和蛋白酶抑制劑saquinavir,ritonavir和indinavir的單個抗病毒試劑以及它們的聯合在它們轉染時，以適當的濃度範圍加入到包裝宿主細胞的單個平板中。在轉染24小時到48小時後，通過與抗性測試載體宿主細胞或從抗性測試載體宿主細胞的過濾上清液得到的抗性測試載體病毒顆粒共培養感染靶宿主細胞。在感染之前或感染之時，將每個抗病毒試劑，或它們的聯合加入到靶宿主細胞中，以獲得存在於轉染過程中的給定試劑的相同的最後濃度。
通過指示基因表達的測試，例如在指示基因是螢火蟲luc基因的情況中，通過測量螢光素酶活性，可以對通過共培養或利用過濾的病毒上清液感染的靶宿主細胞中的指示基因的表達或抑制進行確定。當與缺乏抗病毒試劑時進行的對照比較時，在存在給定的一種或幾種抗病毒試劑時，在利用給定的抗性測試載體病毒顆粒製備物感染的靶宿主細胞中觀察到的螢光素酶的活性的減弱，通常以S形曲線與抗病毒試劑的濃度的對數值相關。將這一抑制曲線用於計算該試劑或幾種試劑的聯合對於存在於抗性測試載體中的病人起源的區段編碼的病毒靶產物的表觀抑制濃度(IC)。
在一個細胞敏感性和抗性測試的情況中，用抗性測試載體和適當的包裝表達載體轉染宿主細胞，以產生抗性測試載體宿主細胞。在它們轉染的時候，將單個抗病毒試劑，或它們的聯合，以適當範圍的濃度加入轉染細胞的各個平板。在轉染24小時到72小時後，收集細胞並測試螢火蟲的螢光素酶活性。由於培養物中的轉染細胞沒有有效地表達指示基因，培養物中的轉染細胞，以及培養物中的超感染細胞，可以作為指示基因表達的靶宿主細胞。當與在缺乏抗病毒試劑時進行的對照比較時，在存在給定的一種或幾種抗病毒試劑時觀察到的轉染細胞的螢光素酶活性的減弱通常以S形曲線與抗病毒試劑的濃度的對數值相關。將這一抑制曲線用於計算一種試劑或幾種試劑的聯合對存在於抗性測試載體中的病人起源的區段編碼的病毒靶產物的表觀抑制濃度(IC)。
抗病毒藥物/候選藥物根據抗病毒藥物的靶在選定時間將待加入測試系統的抗病毒藥物加入。例如，在HIV蛋白酶抑制劑，包括saquinavir,ritonavir,indinavir和nelfinavir，的情況中，將它們在用抗性測試載體轉染的時候，以適當範圍的濃度，加入包裝宿主細胞的單個平板。也將HIV蛋白酶抑制劑在感染時加入靶宿主細胞，以得到與轉染期間得到的相同的最終濃度。將包括AZT,ddI,ddC,d4T,3TC和nevaripine的HIV逆轉錄酶抑制劑在由抗性測試載體病毒顆粒感染的時候，以測試濃度加入靶宿主細胞的各個平板。或者，抗病毒藥物可以存在於整個檢測過程。測試濃度選自一個範圍的濃度，這一範圍通常在約0.1納摩爾和約100(摩爾之間，更具體地說對於各個下面的藥物AZT，從約1納摩爾到約5(摩爾；ddI，從約1納摩爾到約25(摩爾；3TC，從約1納摩爾到約50(摩爾；d4T，從約1納摩爾到25(摩爾；和nevaripine，從約1納摩爾到約100(摩爾。
在本發明的另一個實施方案中，在本發明的藥物敏感性和抗性測試中測試了候選抗病毒化合物。根據候選的抗病毒的蛋白質靶，在選定時間，以適當的濃度將該候選抗病毒化合物加入測試系統。或者，可以測試一個以上候選抗病毒化合物，或可以測試與已被許可的抗病毒藥物如AZT,ddI,ddC,d4T,3TC,saquinavir，或正在進行臨床測試的化合物如ritonavir或indinovir聯合的候選抗病毒化合物。通過測量指示基因的表達或抑制可以評估候選抗病毒藥物的效力。在這一實施方案的另一方面，藥物敏感性和抗性測試可以用於篩選病毒突變體。在對已知的抗病毒藥物或候選的抗病毒藥進行抗性突變體的鑑定後，分離抗性突變體並分析DNA。這樣，可以建立病毒抗性突變體的文庫以便能夠篩選單獨的或聯合的候選抗病毒劑。這將能使普通技術人員能夠鑑定有效的抗病毒劑和設計有效的治療方法。
總的材料和方法用於構建載體，和轉染和感染細胞的大部分技術在本領域已得到廣泛的實踐，並且大多數技術人員熟悉敘述特定條件和方法的標準來源的材料。但是，為了方便，下面的章節可以作為指導。
用小寫字母p以及跟隨的字母和/或數字命名「質粒」和「載體」。本文的起始質粒是商業可得的，公眾可沒有限制地得到，或能夠根據公知的方法從已有質粒構建。另外，對那些已描述的質粒的等同質粒是本領域已知的並是普通技術人員了解的。
本發明的載體的構建利用了本領域很容易理解的標準連接方法和限制技術(參見Ausubel等，(1987)當前分子生物學方法，Wiley-Interscience或Maniatis等(1992)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，N.Y.)。將分離的質粒，DNA序列，或合成的低聚核苷酸切割，剪切，和再連接成需要的形式。通過DNA序列分析證實涉及合成的DNA的所有DNA構建體的序列。
DNA的「消化」是指利用僅在DNA的某些序列，限制性位點起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所用的各種限制酶是商業可得的並且它們的反應條件，輔助因子和其它要求是普通技術人員已知的。為了分析的目的，通常1(克質粒或DNA片段與在約20升緩衝液溶液的2單位的酶一起使用。或者，將過量的限制酶用於保證DNA底物的完全消化。溫育時間約為在37℃時1小時到2小時是適宜的，雖然可以有一些變化。在每個溫育步驟之後，通過用酚/氯仿萃取除去蛋白質，並可以接著醚提取，然後通過用乙醇沉澱從水相部分回收核酸。如果需要，利用標準方法通過聚丙烯醯胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳進行被切割的片段的大小分離。在酶學方法65:499-560(1980)描述了通常的大小分離的總的描述。
在存在四種脫氧核苷三磷酸(dNTPS)，利用20℃時約15到25分鐘的溫育時間，在50mM Tris(pH7.6),50mM氯化鈉，6mM氯化鎂，6mM DTT和5-10mM dNTPs中，通過利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(Klenow)大片段處理可以將限制性切割的片段的末端平齊化。Klenow片段填平5』粘性末端，但是鋸短突出的3』單鏈，儘管四種dNTPs存在。如果需要，在粘性末端的特性規定的限制內，供應唯一的一個dNTPs，或供應選擇的dNTPs可以進行選擇性修復。在用Klenow處理後，利用酚/氯仿和乙醇沉澱提取混合物。在用S1核酸酶或Bal-31，在適當的條件下處理導致任何單鏈部分的水解。
在下面的標準條件和溫度下在15到50升體積中進行連接反應20mMTris-Cl pH7.5,10mM氯化鎂，10mM DTT,33毫克/毫升BSA,10毫摩爾-50毫摩爾氯化鈉，和40毫摩爾ATP,0.01-0.02(Weiss)單位T4 DNA連接酶，在0℃(對於「粘性末端」連接)或1毫摩爾ATP,0.3-0.6(Weiss)單位T4 DNA連接酶，在14℃(對於「鋸短末端」的連接)。分子間「粘性末端」的連接通常在33-100克/毫升總DNA濃度(5-100毫摩爾總末端濃度)進行。分子間平齊末端連接(通常應用10到30倍摩爾過量的接頭)在1毫摩爾總末端濃度進行。
「瞬時表達」是指在轉染的約1天到2星期內未擴增的表達。特定需要的異種蛋白質的瞬時表達的最適時間可以根據幾個因子包括例如，任何可以利用的反式激活因子，翻譯控制機制和宿主細胞而變化。當轉染的特定質粒發生作用時，即發生轉錄或翻譯時，發生瞬時表達。在這一時間過程中，進入細胞中的質粒DNA被轉移到核中。該DNA在核中是非整合狀態，游離的。細胞對質粒的轉錄發生在這一時期。在轉染後，質粒DNA通過細胞分裂可被降解或被稀釋。細胞染色質內會發生隨機整合。
總的來說，將含有起源於與宿主細胞相容的種類的啟動子和控制序列的載體與特定宿主細胞一起使用。適於與原核寄主一起使用的啟動子包括β內醯胺酶和乳糖啟動子系統，鹼性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動子系統和雜合啟動子如tac啟動子。但是，其它功能性細菌啟動子也是適用的。除了原核生物，真核微生物如酵母培養物也可以使用。啤酒酵母或普通的烘烤酵母是最通常使用的真核微生物，儘管通常可得許多其它菌株。在哺乳動物宿主細胞中控制從載體的轉錄的啟動子可以從各種來源，例如病毒的基因組如乳腺病毒，猴病毒40(SV40)，腺病毒，逆病毒，乙型嗜肝DNA病毒，和優選的是巨細胞病毒，或從異種哺乳動物啟動子如b-肌動蛋白啟動子得到。SV40病毒的早期的和後期的啟動子可以方便地以含有SV40病毒複製起點的SV限制片段形式得到。人巨細胞病毒的即早期的啟動子可以以HindⅢE限制性片段形式得到。當然，本文也利用了來自宿主細胞或相關種類的啟動子。
本文所用的載體可以包括選擇基因也命名為選擇性標記。選擇基因編碼載體轉染的宿主細胞的生存或生長所必須的蛋白質。適當的哺乳動物細胞的選擇性標記的例子包括二氫葉酸還原酶基因(DHFR)，鳥氨酸脫羧酶基因，多重藥物抗性基因(mdr)，腺苷脫氨基酶基因，和穀氨酸合成酶基因。當將這樣的選擇性標記成功地轉移到哺乳動物宿主細胞中，如果放置於在選擇性壓力下，轉化的哺乳動物宿主細胞可以生存。存在兩個廣泛使用的截然不同的選擇方法。第一類是根據細胞的代謝和喪失了獨立於補充培養基而生長的能力的突變的細胞系的使用。第二類被稱為顯性選擇方法，它是指用於任何細胞類型並且不需要使用突變細胞系的選擇方案。這些方案通常使用藥物阻止宿主細胞的生長。這些具有新基因的細胞將表達藥物抗性的蛋白質並在選擇中生存。這樣的顯性篩選的例子利用了藥物新黴素(Southern和Berg(1982)分子應用遺傳學雜誌1,327)，黴酚酸(Milligan和Berg(1980)科學209,1422)，或潮黴素(Sugden等(1985)分子細胞生物學5,410-413)。上面給出的三個例子利用了在真核控制下的細菌基因以便使其具有對適當的藥物新黴素(G418或慶大黴素)，xgpt(黴酚酸)或潮黴素的抗性。
「轉染」指在宿主細胞中導入DNA而使DNA表達，不論是功能性地表達或者相反；DNA也可以作為染色體外元件或通過整合進染色體中而複製。除非另有說明，本文使用的宿主細胞的轉化方法是Graham和van derEb(1973)病毒學52,456-457的磷酸鈣共沉澱方法。轉染的其它可供選擇的方法是電穿孔，DEAE-葡聚糖方法，脂質轉染法和biolistics(Kriegler(1990)基因轉移和表達實驗室手冊，Stockton出版社)。
可利用本發明的表達載體轉染宿主細胞並在為適用於誘導啟動子、選擇轉化體或擴增基因而改良的常規的培養基中培養。在含有加入的穀氨酸和沒有抗生素的F12:DMEM(Gibco)50∶50中培養宿主細胞。培養條件，如溫度、pH等，是前面與選擇用於表達的宿主細胞所使用的那些，並且是普通技術人員所了解的。
下面的實施例僅說明了已知的實施本發明的最好的方式。但不應該構成對本發明的限制。所有出現的文獻參考引入本文作為參考。
實施例1利用含有病人起源的區段和具有置換啟動子的非功能性指示基因的抗性測試載體的HIV藥物敏感性和抗性測試指示基因病毒載體-構建方法利用含有抗病毒藥物的靶的病毒基因的HIV基因組和亞基因組病毒載體設計含有具有置換啟動子的非功能性指示基因的指示基因病毒載體。指示基因病毒載體pLG-lucPP和pCG-lucPP是基於基因組病毒載體pLG和pCG的；各在HIVenv基因中攜帶缺失。起源於基因組指示基因病毒載體pLG-lucPP和pCG-lucPP的抗性測試載體含有用於將病人起源的區段插入的病人序列接受位點並與編碼兩親性的MLV 4070A env基因產物的包裝表達載體一起使用。指示基因病毒載體pLS-lucPP和pCS-lucPP是基於亞基因組病毒載體pLS和pCS的；每個僅編碼HIV gag-pol基因。起源於亞基因組指示基因病毒載體pLS-lucPP和pCS-lucPP的抗性測試載體含有用於病人起源的區段的插入的序列受體位點並與編碼H1Vvif,vpr,tat,rev,vpu和nef基因的第一個包裝表達載體和編碼兩親性的MLV 4070A env基因產物的第二個包裝載體的一起使用。
HIV病毒載體-基因組和亞基因組利用生物學活性原病毒克隆HXB2(Fisher等(1986)自然320,367-371)的序列設計HIV病毒載體。設計了兩類病毒載體在單一基因如env中具有缺失，但保留了完整病毒的mRNA表達和加工特徵的基因組病毒載體，和可以僅包括一個或少數幾個通常是敏感性和抗性測試的特異的靶，如gag-pol，或完全缺失病毒基因的亞基因組病毒載體。兩類載體在病毒基因組內具有獨特的限制位點，以用於將指示基因盒以及病人序列接受位點，即抗病毒靶基因(如pol)附近或其中的另外的獨特的限制性位點插入病毒基因組內，以便插入病人起源的HIV序列。另外，將兩類載體設計為整合進了HIV-LTR U3區的天然增強子-啟動子，或來自CMV即早期(IE)區的外源的增強子-啟動子。在構建質粒DNA時利用標準方法(Ausubel等(1987)現代分子生物學方法，Wiley-Interscience)。通過DNA序列分析證實整合了合成DNA的所有DNA構建體的序列(Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463-5467)。
從含有插入在pBluescript KS(+)質粒克隆載體(Stratagene,San Diego CA)的多接頭中的HpaⅠ到XbaⅠ限制片段上的HXB2原病毒DNA序列的質粒pBS-HIV(Page等(1990)病毒學雜誌64,5270-5276)得到HIV序列。因為這一原病毒克隆含有來自原病毒整合位點的未鑑定的，側接的人DNA，利用兩步位點特異性的誘變並將質粒pBS-HIV作為模板除去這樣的序列。在第一步驟中，利用從5』到3』方向含有下面序列的低聚核苷酸1除去與5』LTR鄰接的人序列1)與左面U3區內的整合原病毒開頭的18個核苷酸互補的序列，2)六核苷酸SmaⅠ位點，和3)與剛在多接頭和噬菌體T3啟動子之外的pBluescript KS(+)中的區域互補的18個核苷酸序列。在第二個步驟中，利用含有下面序列(5』到3』)的低聚核苷酸2除去與5』LTR鄰接的人序列1)與LacZ基因內的剛在PvuⅠ位點之外的pBluescript KS(+)中的區域互補的一個18個核苷酸的序列，2)一個六核苷酸的XbaⅠ位點，和3)與右面U5區內的後18個整合的原病毒的後18個核苷酸互補的序列。得到的質粒稱為pBS-HXB2。
通過單一步驟的位點特異性誘變，從質粒pBS-HXB2產生利用HIV-LTR U3區作為用於抗病毒靶基因(圖1)的表達的增強子-啟動子的基因組和亞基因組病毒載體。利用含有下面序列(5』-3』)的低聚核苷酸製備缺失了env基因的基因組病毒載體pLG:1)與env基因內HXB2的位置7626到7643互補的一個18個核苷酸的序列(HXB2中的編號是參照GenBank，登記號K03455),2)8核苷酸的NotⅠ位點，和3)與env基因內的HXB2的6384到6401位置互補的一個18個核苷酸的序列。利用含有下面序列(5』到3』)的低聚核苷酸4製備缺失了env,tat,rev,vif,vpr和vpu基因的亞基因組病毒載體pLS:1)與env基因內HXB2的7626到7643位置互補的一個18個核苷酸的序列，2)8核苷酸的NotⅠ位點，和3)與vif基因內的HXB2的5109到5126位置互補的一個18個核苷酸的序列。
使用CMV IE區作為用於抗病毒靶基因的表達的增強子-啟動子的基因組和亞基因組病毒載體起源於質粒pLG和pLS並分別稱為pCG和pCS(圖1)。基因組病毒載體pCG是通過兩個步驟製備的。在第一個步驟中，從兩個DNA片段製備該中間質粒1)利用SmaⅠ消化質粒pLG和利用鹼性磷酸酶處理該載體製備的11.2kB的載體片段，和2)含有通過利用SmaⅠ消化質粒pVL-1(如下所述)製備的CMV IE增強子-啟動子的0.9kB的DNA片段。通過限制性圖譜分析鑑定在與病毒LTR相同的轉錄方向含有CMV IE區的質粒。在第二個步驟中，通過位點特異性的誘變以使CMVIE增強子-啟動子與5』LTR R區相連，其連接位置應允許在R區開始起始轉錄，利用含有下面的序列(5』-3』)的低聚核苷酸5，從這一中間質粒製備質粒pCG:1)與R區開頭的HXB2的455到472位置互補的一個18個核苷酸的序列，和2)與CMV IE增強子-啟動子的-18到-1位置互補的一個18個核苷酸的序列(座標參照Boshart等(1985)細胞41,521-530)。亞基因組病毒載體pCS起源於質粒pCG並是從兩個DNA片段製備的1)利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pLS製備的9.1kB的載體DNA，和2)利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pCG製備1.3kB的DNA片段。
基因組指示基因病毒載體-置換啟動子指示基因病毒載體pLG-lucPP和pCG-lucPP和由其衍生的抗性測試載體在5』到3』方向含有下面的的元件(圖2B)1)HIV-LTR U3區(pLG-lucPP)或CMV IE增強子-啟動子(pCG-lucPP),2)HIV-LTR R區，3)含有具有與LTR相反的轉錄方向的插入的T7啟動子的HIV-LTR U5區，4)HIVgag-pol,vif,vpr,tat,rev,vpu，缺失的env，和nef基因的編碼區，5)插入在缺失的env基因的指示基因盒，和6)3』HIV-LTR。將相同的指示基因盒插入在pLG-lucPP和pCG-lucPP中，並含有下面元件1)允許內部核糖體進入的EMC 5』-UTR區，2)螢光素酶基因(luc)的完整的編碼區，和3)T7轉錄終止子。指示基因具有與HIV-LTR或CMV IE增強子-啟動子相反的轉錄方向並且所以不能通過這些元件功能性地轉錄。通過T7啟動子也不能轉錄指示基因，因為指示基因盒定位於T7啟動子的上遊。在逆轉錄和鏈轉換之後，T7啟動子被從5』LTR拷貝到3』LTR，從而允許通過T7 RNA聚合酶(圖2C)從新產生的T7啟動子功能性地轉錄指示基因。
含有指示基因盒的質粒plucPP是通過三個步驟製備的。在第一個步驟中，從兩個DNA片段中製備含有由獨特的NotⅠ位點側接的盒的質粒pVL-EMC/T7，該盆含有EMC 5』-UTR元件和T7轉錄終止子1)用NotⅠ消化質粒pVL(如下所述)和用鹼性磷酸酶處理該質粒製備的3.0kB的載體DNA，和2)利用質粒pTM1(Moss等(1990)自然348,91-92)作為模板，低聚核苷酸6和7作為引物的PCR，接著用NotⅠ消化而製備的含有EMC 5』UTR和T7終止子的0.8kB的DNA片段。低聚核苷酸6和7各摻入一個NotⅠ限制性位點。在第二步中，從兩個DNA片段製備含有插入在哺乳動物表達載體pVL-1(如下所述)的螢火蟲螢光素酶基因的編碼區的質粒pVL-luc:1)利用NruⅠ和BglⅡ消化質粒pVL-1製備的4.1kB的載體DNA，和2)利用質粒pGEM-luc(Promega,Madison,WI)作為模板和利用低聚核苷酸8和9作為引物的PCR，接著利用NruⅠ和BglⅡ消化製備的含有完整的螢光素酶編碼區的1.7kB的DNA片段。低聚核苷酸8和9分別摻入NruⅠ和NcoⅠ和BglⅡ和XhoⅠ限制性位點。在第三個步驟中，從兩個DNA片段製備含有插入在EMC 5』-UTR元件和T7轉錄終止子之間的螢光素酶基因的編碼區的質粒plucPP1)利用NcoⅠ和SacⅠ消化質粒pVL-EMC/T7製備的3.8kB的載體DNA，和2)利用NcoⅠ和XhoⅠ消化質粒pVL-luc製備的含有完整的螢光素酶編碼區的1.7kB的DNA片段。
質粒pLG-lucPP是通過兩個步驟製備的。在第一個步驟中，通過利用含有下面的序列(5』-3』)的低聚核苷酸10的位點特異性誘變將噬菌體T7啟動子插入在質粒pLG的上遊LHIV-LTR U5區製備質粒pLG-T7:1)與U5區內的HXB2的位置552到569互補的一個18個核苷酸的序列，2)與T7啟動子互補的一個20個核苷酸的序列，和3)與U5區內的HXB2的位置534到551互補的一個20個核苷酸的序列。在第二個步驟中，從兩個DNA片段製備質粒pLG-lucPP:1)利用NotⅠ消化質粒pLG-T7並利用鹼性磷酸酶處理得到的載體製備的11.2kB的載體DNA，和2)含有利用NotⅠ消化質粒plucPP製備的螢光素酶基因盒的2.5kB的DNA片段。通過限制性圖譜分析鑑定了含有以相反於病毒LTR的轉錄方向插入在病毒載體中的指示基因盒的對應於pLG-lucPP的克隆。
質粒pCG-lucPP是通過兩個步驟製備的。在第一個步驟中，通過利用低聚核苷酸10的位點特異性誘變將噬菌體T7啟動子插入在質粒pCG的上遊HIV-LTR U5區製備質粒pCG-T7。在第二個步驟中用兩個DNA片段製備質粒pCG-lucPP:1)通過利用NotⅠ消化質粒pCG-T7和利用鹼性磷酸酶處理得到的載體製備11.7kB的載體DNA，和2)含有通過利用NotⅠ消化質粒plucPP製備的螢光素酶指示基因盒的2.5kB的DNA片段。通過限制性圖譜分析鑑定了含有以相反於CMV IE增強子-啟動子和病毒LTR的轉錄方向插入在病毒載體中的指示基因盒的對應於pCG-lucPP的克隆。
亞基因組指示基因病毒載體-置換啟動子指示基因病毒載體pLS-lucPP和pCS-lucPP和起源於它們的抗性測試載體在5』到3』方向含有下面的元件(圖2B):1)HIV-LTR U3區(pLS-lucPP)或CMV IE增強子-啟動子(pCS-lucPP),2)HIV-LTR R區，3)含有與相反於LTR的轉錄方向插入的T7啟動子的HIV-LTR U5區，4)HIVgag-pol基因的編碼區，5)指示基因盒，6)來自含有病毒包裝序列的HIVenv基因的RRE元件，和7) 3』HIV-LTR。pLS-lucPP和pCS-lucPP的指示基因盒與pLG-lucPP和pCG-lucPP的相同。對後一載體，pLS-lucPP和pCS-lucPP的指示基因不能功能性地轉錄，直到逆轉錄和鏈轉換導致T7啟動子從5』LTR拷貝成3』LTR(圖2C)。
質粒pLS-lucPP是通過兩個步驟製備的。在第一個步驟中，從兩個DNA片段製備含有插入在質粒pLS的上遊HIV-LTR U5區的噬菌體T7啟動子的質粒pLS-T7:1)利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pLS製備9.1KB的載體DNA，和2)通過利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pLG-T7製備的含有具有插入的T7啟動子的R5區的HIV-LTR的0.8kB的DNA片段。在第二步中，從兩個DNA片段製備質粒pLS-lucPP:1)利用NotⅠ消化質粒pLS-T7和利用鹼性磷酸酶處理得到的載體製備的9.9kB的載體DNA，和2)含有通過利用NotⅠ消化質粒plucPP製備的螢光素酶指示基因盒的2.5kB的DNA片段。通過限制性圖譜鑑定含有以相反於病毒LTR的轉錄方向插入在病毒載體中的指示基因盒的對應於pLS-lucPP的克隆。
從兩個DNA片段製備質粒pCS-lucPP:1)通過利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pLS-lucPP製備的11.6kB的載體DNA，和2)通過用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pCG-T7製備的含有CMVIE啟動子的1.3KB的DNA片段，該CMV IE啟動子與具有插入的T7啟動子的R5區相融合。
抗性測試載體-構建方法通過1)在pol基因中或附近導入獨特的限制性位點，稱為病人序列接受位點，對指示基因病毒載體pLG-lucPP,pCG-lucPP,pLS-lucPP和pCS-lucPP進行修飾，2)通過利用從感染病人的血清或細胞中存在的病毒RNA或DNA製備的互補的DNA(cDNA)的PCR擴增對應於HIV蛋白酶和逆轉錄酶編碼區的病人起源的區段，和3)在指示基因病毒載體的病人序列接受位點精確地插入擴增的序列(圖2B)，製備抗性測試載體。將兩套病人序列接受位點通過位點特異性誘變導入四個指示基因病毒載體的每一個。第一套病人序列接受位點由HpaⅠ位點和SalⅠ位點組成，它們限定含有整個蛋白酶編碼區和大部分逆轉錄酶編碼區的間隔，產生質粒pLG-lucPP-HS,PCG-lucPP-HS,pLS-lucPP-HS和pCS-lucPP-HS。第二套病人序列接受位點由PvuⅠ位點和BamHⅠ位點組成，它們限定同樣的間隔，分別產生質粒pLG-lucPP-PB,pCG-lucPP-PB,pLS-lucPP-PB和pCS-lucPP-PB。在一些抗性測試中一起使用限定同樣的限制性位點間隔的同源的一對抗性測試載體(例如，起源於pLG-lucPP-HS和pLG-lucPP-PB的那些)，以便提高這些含有相同於給定病人序列接受位點的內部限制性位點的病人起源的區段的呈現，並因而不在單獨的抗性測試載體中呈現。
通過利用質粒pLG-lucPP作為模板的位點特異性誘變的三個連續的步驟製備質粒pLG-lucPP-HS。前兩個步驟是為了導入兩個新限制性位點，其中一個(HpaⅠ)是獨特的，其中另一個是已經在每個指示基因病毒載體中出現過一次。第三步是為了在各個載體中缺失預存在的SalⅠ位點，以使導入的SalⅠ成為唯一的位點。在步驟1中，利用含有下面的序列(5』到3』)的低聚核苷酸11，將HpaⅠ位點導入緊接HIV蛋白酶的成熟的編碼區的上遊的2243位置1)與HXB2的位置2249到2266互補的一個18個核苷酸的序列，2)使在這一位置的gag蛋白序列不改變並在pol前體序列中導入保守的胺基酸變化(Phe到Val)的一個6個核苷酸的HpaⅠ位點，和3)與HXB2的2225到2242位置互補的一個18個核苷酸的序列。在步驟2中，利用含有下面的序列(5』到3』)的低聚核苷酸12在HIV逆轉錄酶的羧基末端編碼區在4190位置導入SalⅠ位點1)與HXB2的位置4196到4213互補的一個18個核苷酸的序列，2)使逆轉錄酶蛋白序列在這一位置不改變的一個6個核苷酸的SalⅠ位點，和3)與HXB2的4172到4189位置互補的一個18個核苷酸的序列。在第三步中，利用含有下面序列(5』到3』)的低聚核苷酸13使HXB2的vpr編碼區內位置5785的的預存在的SalⅠ位點缺失1)與HXB2的5791到5808位置互補的一個18個核苷酸的序列，2)切除了SalⅠ位點但使vpr蛋白序列在這一位點不改變的一個6個核苷酸的序列GCCGAC，3)與HXB2的位置5767到5784互補的一個18個核苷酸的序列。
如下所述，質粒pCG-lucPP-HS,pLS-lucPP-HS和pCS-lucPP-HS起源於pLG-lucPP-HS。從兩個DNA片段製備質粒pCG-lucPP-HS:1)利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pLG-lucPP-HS製備12.9kb的載體DNA,2)利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pCG-lucPP製備的1.3kB的DNA片段。從兩個DNA片段製備質粒pLS-lucPP-HS:1)利用NdeⅠ和XhoⅠ消化質粒pLG-lucPP-HS製備的11.1kB的載體DNA，和2)利用NdeⅠ和XhoⅠ消化質粒pLS-lucPP製備的1.3kB的DNA片段。從兩個DNA片段製備質粒pCS-lucPP-HS:1)利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pLS-lucPP-HS製備的11.6kB的載體DNA，和2)利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pCS-lucPP製備的1.3kB的DNA片段。
通過利用質粒pLG-lucPP作為模板的位點特異性誘變的四個連續的步驟製備質粒pLG-lucPP-PB。前兩個步驟的目的是為了導入兩個新的限制性位點(PvuⅠ和BamHⅠ)，它們中的每一個已經在每個指示基因病毒載體中出現過一次。第三和第四個步驟是為了在各個載體中缺失預存在的PvuⅠ和BamⅠ位點以使新導入的位點成為唯一的。在步驟1中，利用含有下面序列(5』到3』)的低聚核苷酸14，將PvuⅠ位點導入緊接HIV蛋白酶的成熟編碼區的上遊的2221位置1)與HXB2的位置2227到2244互補的一個18個核苷酸的序列，2)使gag和pol前體蛋質序列在這一位置不改變的一個6個核苷酸的PvuⅠ位點，和3)與HXB2的位置2203到2220互補的一個18個核苷酸的序列。在步驟2中，利用含有下面序列(5』到3』)的低聚核苷酸15在HIV逆轉錄酶的羧基末端編碼區的第4212位置導入BamHⅠ位點1)與HXB2的位置4218到4235位置互補的一個18核苷酸序列，2)使逆轉錄酶蛋白序列在這一位置不改變的一個6個核苷酸的BamHⅠ位點，和3)與HXB2的4194到4211位置互補的一個18核苷酸序列。在步驟3中，利用含有下面序列(5』到3』)的低聚核苷酸16使b-乳糖酶編碼區內預存在的位置2413的PvuⅠ位點缺失(坐標參照GenBank，登記號X52331)1)與pBluescriptKS(+)的位置2395到2412互補的一個18核苷酸的序列，2)切除了PvuⅠ位點但使b-乳糖酶蛋白序列在這一位點不改變的一個6核苷酸的序列CAATCG，和3)與pBluescript KS(+)的2419到2436位置互補的一個18核苷酸的序列。在步驟4中，利用含有下面序列(5』到3』)的低聚核苷酸17使HXB2的HIV rev編碼區內位置8474預存在的BamHⅠ位點缺失1)與HXB2的位置8480到8497互補的一個18核苷酸的序列，2)切除了BamHⅠ但使HIV rev蛋白序列在這一位置不改變的一個6個核苷酸的序列GGATTC，和3)與HXB2的位置8456到8473互補的一個18個核苷酸的序列。
如下所述，質粒pCG-lucPP-PB,pLS-lucPP-PB和pCS-lucPP-PB起源於pLG-lucPP-PB。從兩個DNA片段製備質粒pCG-lucPP-PB:1)利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pLG-lucPP-PB製備12.9kB的載體DNA，和2)利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pCG-lucPP製備的1.3kB的DNA片段。從三個DNA片段製備質粒pLS-lucPP-PB:1)利用NdeⅠ和XhoⅠ消化質粒pLG-lucPP-PB製備的11.1kB的載體DNA，2)利用NdeⅠ和HindⅢ消化質粒pLS-lucPP製備的0.SkB的DNA片段，和3)利用HindⅢ和XhoⅠ消化質粒pLG-lucPP-PB製備的0.8kB的DNA片段。從兩個DNA片段製備質粒pCS-lucPP-PB:1)利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pLS-lucPP-PB製備的11.6kB的載體DNA，和2)利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pCS-lucPP製備的1.3kB的DNA片段。
利用從HIV感染的病人的血清中分離的病毒RNA，通過逆轉錄聚合酶鏈式反應方法擴增對應於HIV蛋白酶和逆轉錄酶編碼區的病人起源的區段。如本文所述利用兩個RT-PCR方法。在第一個方法(Piatak等(1993)科學259,1749-1754)中，將分離的酶，莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶(BRL,Bethesda,MD)和Taq DNA聚合酶(Roche分子分析，Ontario，加拿大)分別用於cDNA的製備和PCR反應。在第二個方法(Mulder等(1994)臨床微生物學雜誌32,292-300)中，將單個的酶，Thermus thermophilus(Tth)DNA聚合酶用於進行cDNA合成和PCR反應。將兩個由低聚核苷酸18和19，和低聚核苷酸20和21組成的引物對用於能夠分別精確地插入在含有HpaⅠ/SalⅠ和Pvu/BamHⅠ病人受體位點的指示基因病毒載體中的病人起源的區段的擴增。
從下面的兩個DNA製劑構建使用了第一個引物對的第一套四個抗性測試載體1)從利用HpaⅠ和SalⅠ消化的質粒pLG-lucPP-HS,pCG-lucPP-HS,pLS-lucPP-HS或pCS-lucPP-HS製備的載體DNA，和2)通過利用從HIV感染的個體的血清中分離的病毒RNA作為模板，和低聚核苷酸18和19作為引物的RT-PCR，並利用HpaⅠ和SalⅠ消化而製備的2.0kB擴增的DNA產物。從下面的兩個DNA製劑構建第二套四個使用第二個引物對的抗性測試載體1)從利用PvuⅠ和BamHⅠ消化的質粒pLG-lucPP-PB,pCG-lucPP-PB,pLS-lucPP-PB或pCS-lucPP-PB製備的載體DNA，和2)通過利用從HIV感染的個體的血清中分離的病毒RNA作為模板，和低聚核苷酸18和19作為引物進行RT-PCR，接著用PvuⅠ和BamHⅠ消化而製備的2.0kB的擴增的DNA產物。低聚核苷酸18,19和20分別含有HpaⅠ,SalⅠ,PvuⅠ和BamHⅠ限制性位點。
為了保證對應於8個得到的抗性測試載體中的每一個的質粒DNA含有存在於給定病人血清中的HIV病毒準種類的代表性樣品，至少將一百個在給定的抗性測試載體的構建中得到的獨立的大腸桿菌轉化體用於質粒DNA的製備。
為了提高病人起源的區段的呈現，利用部分簡併的PCR引物庫，稱為低聚核苷酸22,23,24和25，它們分別基於低聚核苷酸序列18,19,20和21，製備第三和第四套抗性測試載體。根據Los Alamos HIV序列資料庫(Myers等(1993)人逆病毒和AIDS1993,Los Alamos國家實驗室，LosAlamos,NM)中分類的不同病人分離物中展示的序列變化，在親本引物的3』末端的18個核苷酸位置的每一個中摻入超過一個核苷酸鹼基(G,A,T或C)的方式合成各個引物庫。利用從質粒pLG-lucPP-HS,pCG-lucPP-HS,pLS-lucPP-HS或pCS-lucPP-HS製備的載體並利用低聚核苷酸22和23製備的擴增的病人序列構建第三套四個抗性測試載體；利用從質粒pLG-lucPP-PB,pCG-lucPP-PB,pLS-lucPP-PB或pCS-lucPP-PB製備的載體並利用低聚核苷酸24和25製備的擴增的病人序列構建第四套四個抗性測試載體。低聚核苷酸22,23,24和25分別摻入HpaⅠ,SalⅠ,PvuⅠ和BamHⅠ限制性位點。
宿主細胞-製備包裝宿主細胞和抗性測試載體宿主細胞利用抗性測試載體從表達病毒包裝蛋白的包裝宿主細胞製備抗性測試載體宿主細胞。可以通過抗性測試載體本身、包裝表達載體或兩者內含有的病毒基因的表達提供包裝蛋白。可使用包裝宿主細胞的短暫或穩定轉染生產包裝蛋白。編碼兩親性的MLV env基因產物的包裝表達載體能夠使抗性測試載體宿主細胞中產生能夠有效地感染人靶細胞的抗性測試載體病毒顆粒。起源於質粒pLG-lucPP-HS,pLG-lucPP-PB,pCG-lucPP-HS和pCG-lucPP-PB的抗性測試載體編碼除了env的所有HIV基因，並用於生產抗性測試載體宿主細胞。將編碼兩親性MLV 4070A env基因產物的pVL-env4070A包裝表達載體與前面的基於基因組的抗性測試載體一起使用以便能夠在抗性測試載體宿主細胞中產生抗性測試載體病毒顆粒。起源於質粒pLS-lucPP-HS,pLS-lucPP-PB,pCS-lucPP-HS和pCS-lucPP-PB的抗性測試載體只編碼HIV gag-pol基因產物，並用於製備抗性測試載體宿主細胞。將提供erv的pVL-env4070A，和pLTR-HIV3』和pCMV-HIV3』包裝表達載體兩者之一，它們中的每一個提供HIV vif,vpr,tat,rev,vpu和nef基因，與前面的基於亞基因組的抗性測試載體一起使用，使抗性測試載體宿主細胞中能夠產生抗性測試載體病毒顆粒。
通過分別從基因組病毒載體pLG和pCG中除去大部分gag-pol編碼區產生質粒pLTR-HIV3』和pCMV-HIV3』。通過利用質粒pLG作為模板與含有下面序列(5』到3』)的低聚核苷酸26的位點特異性誘變製備質粒pLTR-HIV3』(圖3B):1)與pol基因內的HXB2的位置4712到4729互補的18核苷酸序列，2)與gag基因內的HXB2位置925到942互補的18核苷酸序列。從兩個DNA片段製備質粒pCMV-HIV3』(圖3C):1)通過利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pLTR-HIV3』製備的6.8KB的載體片段，和2)通過利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pCG制的備的1.3kB的DNA片段。
從兩個DNA片段構建質粒pVL-Aenv4070A(圖3D):1)通過利用NruⅠ和BglⅡ消化pVL-2哺乳動物表達載體製備的4.3kB的載體片段，和2)含有通過利用質粒pCRIPamgag-2(Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85,6460)作為模板，和低聚核苷酸27和28作為引物，的PCR，接著通過利用NruⅠ和BglⅡ消化製備的含有MLV4070A env基因產物(核苷酸37到2001，坐標由GenBank確定，登記號M33469,Ott等(1990)病毒學雜誌64,757-766)的完全的編碼區的2.0Kb的DNA片段。低聚核苷酸27摻入了獨特的NruⅠ位點，該位點後跟著用於哺乳動物翻譯起始的共有序列(例如，Kozak(1991)生物化學雜誌266,19867-19870)，而低聚核苷酸28摻入了獨特的BglⅡ位點。
哺乳動物表達載體pVL-2在5』到3』方向含有下面的元件CMV IE啟動子/增強子，CMV IE第一個外顯子拼接供體，人(1球蛋白第二個外顯子拼接受體，克隆位點多接頭，SV40 T抗原基因的多聚腺苷酸化位點，和複製的SV40原點。質粒pVL-2是以如下所述的四個步驟構建的。在第一個步驟中，通過利用含有BssHⅡ,NotⅠ,SmaⅠ,HindⅢ,SphⅠ,SmaⅠ,EcoRⅠ,NruⅠ,ApaⅠ,BglⅡ,NheⅠ,NotⅠ,XhoⅠ和BssHⅡ限制性位點的克隆位點多接頭代替質粒pBluescriptⅡKS(+)的克隆位點多接頭和噬菌體T7和T3啟動子製備質粒pVL。從兩個DNA片段構建pVL:1)通過用BssHⅡ切割質粒pBluescriptⅡKS(+)並用鹼性磷酸酶處理得到的載體製備的3.0KB的載體片段，和2)通過將交疊的低聚核苷酸29和30退火，利用Klenow DNA聚合酶延伸和利用BssHⅡ消化製備的DNA片段。通過限制性圖譜分析鑑定含有相對於pBluescript Ⅱ KS(+)質粒圖譜(GenBank登記號X52327)的5』到3』順序的HindⅢ到XhoⅠ位點的質粒。在第二個步驟中，通過插入CMV IE增強子-啟動子和第一個外顯子拼接供體，和人(1球蛋白第二個外顯子拼接受體從質粒pVL製備該中間質粒。從三個DNA片段製備該中間質粒1)通過利用HindⅢ和EcoRⅠ消化質粒pVL製備3.0kB的載體片段，2)含有CMV IE增強子-啟動子和第一個外顯子拼接供體(核苷酸-674到-19，坐標參照Bashart等(1985)細胞41,521-530)的0.9kB的DNA片段，它是通過利用含有來自HCMV菌株AD169(Boshart等，Ibid)的PstⅠm-片段的質粒pCM5027作為模板和低聚核苷酸31和32作為引物的PCR，接著利用HindⅢ和SphⅠ消化而製備的，和3)含有通過利用質粒ppSVaHP(Treisman等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80，7428-7432)作為模板，和低聚核苷酸33和34作為引物的PCR，接著利用SphⅠ和EcoRⅠ消化製備的人球蛋白(1第二個外顯子拼接受體(核苷酸6808到6916，坐標參照GenBank，登記號J00153)的0.1kB的DNA片段。低聚核苷酸31,32,33，和34分別在它們的末端摻入HindⅢ,SphⅠ,SphⅠ和EcoRⅠ限制性位點。在第三個步驟中，通過在這一中間質粒中插入SV40 T抗原低聚腺苷酸化位點製備質粒pVL。從兩個DNA片段製備質粒pVL-1:1)通過利用BglⅡ和NheⅠ切割中間質粒製備的4.0kB的載體片段，和2)通過利用質粒pSV2(Southern和Berg(1982)J.Mol.Appl.Gen.1,327-341)作為模板，和低聚核苷酸35和36作為引物的PCR，接著用BglⅡ和NheⅠ消化製備的含有SV40 T抗原多聚腺苷酸化位點(SV40的核苷酸2770到2533，坐標參照Reddy等，(1978)科學200,494-502)的0.2kB的DNA片段。低聚核苷酸35和36分別在它們的末端摻入獨特的BglⅡ和NheⅠ位點。在第四個步驟中，通過在質粒pVL-1中插入SV40複製起點製備質粒pVL-2。從兩個DNA片段製備質粒pVL-2:1)通過利用NheⅠ和XhoⅠ消化質粒pVL-1製備的4.2kB的載體片段，和2)通過利用質粒pSV2作為模板和低聚核苷酸37和38作為引物的PCR，接著利用NheⅠ和SalⅠ消化製備的含有SV40複製起點(SV40的核苷酸5725到5578，出處同上)的0.2kBd DNA片段。低聚核苷酸37和38各自的末端插入了NheⅠ和SalⅠ限制性位點。
靶宿主細胞從人胚胎腎細胞系293和Jurkat白血病T細胞系(美國典型培養物保藏中心，Rockville,MD)製備用於利用起源於質粒pLG-lucPP-HS,pLG-lucPP-PB,pCG-lucPP-HS,pCG-lucPP-PB,pLS-lucPP-HS,pLS-lucPP-PB,pCS-lucPP-HS，或pCS-lucPP-PB的抗性測試載體進行的抗性測試的靶宿主細胞。利用編碼變異的噬菌體T7 RNA聚合酶的表達載體穩定地轉染各個細胞系。這一變異體含有與T7 RNA聚合酶的N-末端同框融合的SV40 T抗原核定位信號(NLS)，從而允許它被運輸進入細胞核和在細胞核中起作用(Lieber等(1989)核酸研究17,8485-8493)。在靶細胞感染後，通過逆轉錄酶使T7啟動子相對於指示基因編碼區重新定位，將抗性測試載體中的非功能性的指示基因轉換進功能性的指示基因。在通過HIV整合酶將修復的指示基因整合進靶細胞染色體後，靶細胞表達的核T7 RNA聚合酶能功能性地轉錄指示基因。
將質粒pVL-T7RNAP-NLS在人和其它哺乳動物細胞和細胞系中用於指導與NLS連接的變異的T7 RNA聚合酶的表達。從三個DNA片段製備pVL-T7RNAP-NLS:1)利用EcoRⅠ和BglⅠ消化質粒pVL-2製備的4.3kB的載體片段，2)利用質粒pT7-G1(Deng等(1994)基因143,245-249)作為模板以及低聚核苷酸39和40作為引物的PCR，接著用NruⅠ和BglⅡ消化製備的編碼T7RNA聚合酶胺基酸殘基34到883(核苷酸267到2817，坐標參照GenBank,登記號M38308,Grachev和Pletnev(1984)Bioorg.Khim.10,824-843)的2.6KB的DNA片段，和3)通過將交疊的低聚核苷酸41和42退火，利用KlenowDNA聚合酶延伸和利用EcoRⅠ和NurⅠ消化製備的編碼開始三個SV40 T抗原的胺基酸以後接的含有NLS(Lieber等，出處同上)的SV40大T抗原的胺基酸118到133的合成DNA片段。低聚核苷酸39,40,41,42分別摻入NruⅠ,BglⅠ,EcoRⅠ和NruⅠ限制性位點。將質粒pVL-Neo用作通過共轉染建立的人和其它哺乳動物細胞和細胞系的穩定轉染體的可選擇標記。pVL指導新黴素磷酸轉移酶的表達並賦予抗生素G418抗性。從兩個DNA片段製備質粒pVL-Neo:1)利用EcoRⅠ和BglⅡ消化質粒pVL-2製備4.3kB的載體片段，和2)利用質粒pSV2neo(Southern和Berg(1982)J.Mol.Appl.Gen.1,327-341)作為模板，和低聚核苷酸43和44作為引物的PCR，接著利用EcoRⅠ和BglⅡ消化而製備的含有完全的Neo編碼區(Tn5轉座子序列的核苷酸1551至2345，坐標參照GenBank，登記號U00004,Beck等(1982)基因19,327-336)的0.8kB的DNA片段。低聚核苷酸43摻入了後接用於哺乳動物翻譯起始的共有序列的獨特的EcoRⅠ位點，而低聚核苷酸44摻入獨特的BglⅡ位點。
通過磷酸鈣共沉澱方法將質粒pVL-T7RNAP通過穩定的轉染導入293細胞(Wigler等(1979)細胞16,777)，通過電穿孔進入Jurkat細胞(Irving等(1991)細胞64,891-901)。將293細胞培養在補充了1克/升的蔗糖，10％供體小牛血清(組織培養生物學試劑公司)的DMEM培養基(JRH生物科學公司)中。將Jurkat細胞培養在補充了10％小牛胎盤血清(Irvin科學)，穀氨醯胺，青黴素和鏈黴素的RPMIl640培養基中。用於293細胞和Jurkat細胞轉染的混合物各以重量比例10∶1到20∶1含有10毫克pVL-T7RNAP和選擇標記pVL-Neo的混合物。在轉染後24到48小時，在含有抗生素G418(GIBCO,Grand島，N.Y.)的同樣的培養基上再鋪板細胞。在兩個星期後，直接從選擇平板上挑出抗G418的獨立的293細胞克隆並擴展用於分析。通過藥物篩選2到3星期後，通過限制稀釋得到抗G418的獨立的Jurkat細胞系並擴展用於分析。
通過利用Northern印跡雜交方法(Ausubel等(1987)當代分子生物學方法，Wiley-Interscience)確定細胞合成的穩定狀態的特異於T7 RNA聚合酶的mRNA的水平，篩查抗G418的293和Jurkat的細胞克隆的T7 RNA聚合酶的表達水平。然後通過確定在利用質粒pEMCLucbgAn(Deng等(1991)基因109,193-201)的短暫轉染中支持特異於T7 RNA聚合酶的轉錄的能力鑑定最適水平表達T7 RNA聚合酶的293和Jurkat細胞克隆，其中螢光素酶的轉錄是由T7啟動子引導的。選擇支持最高水平的螢光素酶基因表達的293和Jurkat克隆用於進一步使用；它們被分別稱為293/T7RNAP-NLS細胞和Jurkat/T7 RNAP-NLS細胞。
藥物敏感性和抗性測試利用兩個類型的宿主細胞或一個類型的宿主細胞，利用基於指示基因病毒載體pLG-lucPP-HS,pLG-lucPP-PB,pCG-lucPP-HS,pCG-lucPP-PB,pLS-lucPP-HS,pLS-lucPP-PB,pCS-lucPP-HS,或pCS-lucPP-PB的抗性測試載體進行抗性測試。在第一類型的抗性測試中，通過利用抗性測試載體和包裝表達載體轉染包裝宿主細胞製備的第一個宿主細胞(抗性測試載體宿主細胞)生產抗性測試載體病毒顆粒。然後將抗性測試載體病毒顆粒用於感染第二個宿主細胞(靶宿主細胞)，其中測量了指示基因的表達。在第二類型的抗性測試中，單個宿主細胞類型(抗性測試載體宿主細胞)的作用有兩個給定培養物中的一些包裝宿主細胞被轉染並產生抗性測試載體病毒顆粒，以及在同一個培養物中的一些宿主細胞是這樣產生的抗性測試載體顆粒感染的靶。使用含有具有置換啟動子的非功能性指示基因的抗性測試載體使使用單個宿主細胞類型的抗性測試成為可能當在感染許可的宿主細胞之後這樣的指示基因被有效地表達，它們在轉染同樣的宿主細胞類型之後不被有效地表達，從而，提供了一個測量待測的抗病毒試劑的效果的機會。出於同樣的原因，通過共培養兩種細胞類型可以進行利用兩種細胞類型的抗性測試，作為用第一種細胞類型的上清液中得到的病毒顆粒感染第二種細胞類型的一種可供選擇的方法。
敏感性和抗性測試-兩細胞利用293細胞系，tsa54或tsa201細胞系(Heinzel等(1988)病毒學雜誌62,3738)，或BOSC 23細胞系(Pear等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90,8392)作為包裝宿主細胞，通過抗性測試載體和適當的包裝表達載體的共轉染製備抗性測試載體宿主細胞。將包裝表達載體pVL-env4070A與通過在pLG-1ucPP-HS,pCG-lucPP-HS,pLG-lucPP-PB，和pCG-lucPP-PB中插入病人起源的區段而構建的抗性測試載體共轉染，而將包裝表達載體pVL-env4070A和，pLTR-HIV3』和pCMV-HIV3』二者之一，與通過在pLS-lucPP-HS,pCS-lucPP-HS,pLS-lucPP-PB和pCS-lucPP-PB中插入病人起源的區段而製備的抗性測試載體共轉染。將Jurkat/T7RNAP-NLS用作靶宿主細胞。
使包裝宿主細胞生長在DMEM培養基中，1克/升蔗糖，10％供體小牛血清中，每三天以1∶10的稀釋度傳代。以1×106個細胞每10釐米的平板，在轉染之前48小時將細胞鋪板。利用均為5到10毫克抗性測試載體和適當的包裝表達載體通過磷酸鈣沉澱方法轉染細胞來生產抗性測試載體宿主細胞。將各個抗病毒試劑，包括逆轉錄酶抑制劑AZT,ddI,d4T和3TC,和蛋白酶抑制劑saquinavir,ritonavir和indinavir以及它們的聯合在它們轉染的時候以適當範圍的濃度加入轉染細胞的各個平板。在轉染後24到48小時，利用抗性測試載體宿主細胞或利用從抗性測試載體宿主細胞的過濾上清液得到的病毒顆粒，通過共轉染感染靶宿主細胞。將每個抗病毒試劑，或它們的聯合，在感染的時候加入靶宿主細胞以獲得與轉染過程中相同的給定試劑或試劑的最後濃度。
對於通過共培養的感染，從24到48小時前的轉染而製備的抗性測試載體宿主細胞的10釐米平板中除去培養基，並在平板中加入含有適當濃度的抗病毒試劑的Jurkat細胞培養基中的0.5至1.0×106Jurkat/T7RNAP-NLS靶細胞。將靶細胞與抗性測試載體宿主細胞共培養24小時，然後除去，並加入新鮮製備的存在於含有適當濃度的抗病毒試劑的Jurkat細胞培養基中的抗性測試載體宿主細胞，進行第二次共培養。24小時後，從第二次共培養中收穫靶宿主細胞，離心收集，用冰冷的磷酸緩衝液(PBS)洗三次，並測試螢光素酶活性。對於利用過濾的上清液的感染，從24到48小時前的轉染而製備的抗性測試載體宿主細胞的10釐米的平板中除去培養基。通過0.45毫米的濾紙在收穫時過濾培養基，在-70℃冰凍，在轉導前融解。在5毫升Jurkat細胞培養基和過濾的上清液的等份混合物中加入Jurkat/T7RNAP-NLS細胞(0.5到1.0×106)，製成8毫克/毫升的polybrene(1,5-二甲基-1,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)(Sigma,St.Louis,MI)和適當濃度的抗病毒試劑。轉染後24到48小時，通過離心收集靶宿主細胞，用冷凍的磷酸緩衝鹽洗滌三次，並測試指示基因的表達。以所述方法(Ausubel等(1987)當前分子生物學方法，Wiley-Interscience)測試通過共培養或利用過濾的病毒上清液感染的靶宿主細胞的螢火蟲螢光素酶活性。與在缺乏抗病毒試劑時進行的對照相比，在存在給定的抗病毒試劑時觀察到的利用給定的抗性測試載體病毒顆粒製備物感染的靶宿主細胞的螢光素酶活性的減弱通常與抗病毒試劑的濃度對數值以S形曲線相關。將這一抑制曲線用於計算該試劑或試劑的聯合對存在於抗性測試載體中的病人起源的區段編碼的病毒靶產物的表觀抑制濃度(IC)。
敏感性和抗性測試-單細胞利用293/T7RNAP-NLS細胞或Jurkat/T7RNAP-NLS細胞作為包裝宿主細胞，通過抗性測試載體和適當的包裝表達載體共轉染製備抗性測試載體宿主細胞。將包裝表達載體pVL-env4070A通過在pLG-lucPP-HS,pCG-lucPP-HS,pLG-lucPP-PB和pCG-lucPP-PB中插入病人起源的區段構建的抗性測試載體共轉染，而將包裝表達載體pVL-env4070A和，pLTR-HIV3』和pCMV-HIV3』二者之一，與通過在pLS-lucPP-HS,pCS-lucPP-HS,pLS-lucPP-PB和pCS-lucPP-PB中插入病人起源的區段而製備的抗性測試載體共轉染。
利用抗性測試載體和適當的包裝表達載體各5到10毫克轉染細胞，以產生抗性測試載體宿主細胞。通過磷酸鈣共沉澱方法轉染293/T7RNAP-NLS細胞，通過電穿孔轉染Jurkat/T7RNAP-NLS細胞。在轉染的時候，以適當範圍的濃度在轉染細胞的個別平板中加入各個抗病毒試劑或它們的聯合。在轉染後24小時到72小時，通過離心收集細胞，用冰冷的磷酸緩衝鹽洗滌三次，並如所述方法測試螢火蟲螢光素酶活性。由於培養物中的轉染細胞沒有有效地表達指示基因，培養物中的轉染細胞，以及培養物中的超感染細胞，可以充當指示基因表達的靶宿主細胞。與缺乏抗病毒試劑時進行的對照相比，在存在給定的抗病毒試劑時觀察到的轉染細胞的螢光素酶活性的減弱，通常與抗病毒試劑的濃度的對數值以S形曲線相關。將這一抑制曲線用於計算試劑或試劑的聯合對存在於抗性測試載體中的病人起源的區段編碼的病毒靶產物的表觀抑制濃度(IC)。
實施例2利用含有病人起源的區段和具有置換編碼區的非功能性指示基因的抗性測試載體的HIV藥物敏感性和抗性測試指示基因病毒載體-構建方法具有病人序列的受體位點的基因組指示基因病毒載體pLG-lucPP-HS,pLG-lucPC-PB,pCG-lucPC-HS和pCG-lucPC-PB和起源於它們的抗性測試載體各在5』到3』方向含有下面的元件(圖4B):1)HIV-LTR U3區(pLG-lucPP-HS和pLG-lucPC-PB)或第一CMV IE增強子-啟動子(pCG-lucPC-HS和pCG-lucPC-PB),2)HIV-LTR R和U5區，3)HIVgag-pol,vif,fpr,tat,rev,vpu，缺失的env，和nef基因的編碼區，4)插入在缺失的env基因中的含有螢光素酶基因的5』編碼區的第一指示基因盒，5)插入在缺失的3』HIV-LTR U3區的含有螢光素酶基因的3』編碼區的第二指示基因盒，和6)3』HIV-LTR R和U5區。pLG-lucPC-HS和pCG-lucPC-HS分別在HXB2的核苷酸2243和4190含有獨特的HpaⅠ和SalⅠ病人序列接受位點；pLG-lucPC-PB和pCG-lucPC-PB分別在HXB2的核苷酸2221和4212含有獨特的PvuⅠ和BamHⅠ病人序列位點，詳情見實施例1。第一個指示基因盒含有1)第二CMV增強子-啟動子，2)螢光素酶基因的5』編碼區(胺基酸1到446)，和3)CMV IE拼接供體。第二個指示基因盒含有1)-球蛋白基因第二個外顯子拼接受體，2)螢光素酶基因的3』編碼區(胺基酸447到550)，和3)SV40多聚腺苷酸化位點。螢光素酶的5』和3』編碼區的轉錄方向相互相同，並與第一CMV增強子-啟動子和病毒LTR的相反。但是，因為在抗性測試載體中，螢光素酶5』和3』編碼區是置換的(即，5』編碼區在3』編碼區的下遊)，沒有可以拼接產生功能性螢光素酶編碼區的mRNA的轉錄。在逆轉錄和鏈轉移之後，螢光素酶被從3』LTR拷貝成5』LTR，從而允許可以拼接產生功能性螢光素酶編碼區的mRNA的轉錄(圖4C)。
具有病人序列接受位點的亞基因組指示基因病毒載體pLS-lucPC-HS,pLS-lucPC-PB,pCS-lucPC-HS和pCS-lucPC-PB，以及起源於它們的抗性測試載體各在5』到3』方向含有下面的元件(圖4B)1)HIV-LTR U3區(pLS-lucPC-HS和pLS-lucPC-PB)或第一個CMV IE增強子-啟動子(pCS-lucPC-HS和pCS-lucPC-PB),2)HIV-LTR R和U5區，3)HIVgag-pol基因的編碼區，4)含有螢光素酶基因5』編碼區的第一指示基因盒，5)來自含有病毒包裝序列的HIVenv基因的RRE元件，6)含有插入在缺失的3』HIV-LTR U3區的螢光素酶基因的3』編碼區的第二指示基因盒，和7)3』HIV-LTR R和U5區。pLS-lucPC-HS和pCS-lucPC-HS在HXB2的核苷酸2243和4190分別含有獨特的HpaⅠ和SalⅠ病人序列接受位點；pLS-lucPC-PB和pCS-lucPC-PB分別在HXB2的核苷酸2221和4212含有獨特的PvuⅠ和BamHⅠ病人序列接受位點。第一指示基因盒含有1)第二CMV增強子-啟動子，2)螢光素酶基因的5』編碼區(胺基酸1到446)，和3)CMV IE拼接供體。第二指示基因盒含有1)(-球蛋白基因第二個外顯子拼接受體，2)螢光素酶基因的3』編碼區(胺基酸447到550)，和3)SV40多聚腺苷酸化位點。因為螢光素酶5』和3』編碼區在抗性測試載體中是置換的，必須發生逆轉錄和鏈轉換方可產生非置換的螢光素酶5』和3』編碼區，從而允許可以拼接產生功能性螢光素酶編碼區的mRNA的轉錄(圖4C)。
含有第一指示基因盒的質粒pVL-luc5』是通過三個步驟製備的。在開始兩個步驟中，將包含在由CMV IE拼接供體和(-球蛋白基因拼接受體組成的pVL-1中的人工內含子進行位點特異性誘變以便產生限制性位點，在該位點消化之後產生5』和3』末端精確地對應於該人工內含子的開始和末端的DNA片段。在第一個步驟中，對pVL-1利用含有下面序列(5』到3』)的低聚核苷酸45進行位點特異性誘變1)在CMV IE拼接供體前面的18核苷酸序列，2)對應於SnaBⅠ限制性位點的開始一半的TAC三核苷酸序列，和3)在人工內含子的開端的18核苷酸序列。因為該內含子的開始三個核苷酸的序列是GTA，得到的質粒pVL-SnaBⅠ含有一個SnaBⅠ限制性位點，消化後以DNA平端釋放該內含子的5』序列。在第二個步驟中，對pVL-SnaBⅠ利用含有下面序列(5』到3』)的低聚核苷酸46進行位點特異性誘變1)在人工內含子的末端的18核苷酸的序列，2)對應於PvuⅡ限制性位點的後一半的CTG三核苷酸序列，和3)在(-球蛋白拼接受體後的18核苷酸的序列。因為內含子的後三個核苷酸序列是CAG，得到的質粒pVL-SnaBⅠ/PvuⅡ含有一個PvuⅡ限制性位點，消化後以DNA平端釋放該內含子的3』序列。在第三個步驟中，從兩個DNA片段製備質粒pVL-luc5』1)通過利用EcoRⅤ和NheⅠ消化質粒pVL-luc並用Klenow DNA聚合酶和鹼性磷酸酶處理得到的載體而製備的5.3kB載體DNA，和2)通過利用SnaBⅠ和SmaⅠ消化質粒pVL-SnaBⅠ/PvuⅡ製備的含有CMV IE拼接供體的0.1kBDNA片段。通過限制性圖譜分析鑑定對應於含有以正確的方向插入在螢光素酶編碼區的CMV IE的拼接供體的pVL-luc5』克隆。
含有第二指示基因盒的質粒pVL-luc3』是通過兩個步驟製備的。在步驟一中，從兩個DNA片段製備質粒pBS-LTR，其中pBS-HXB2的3』LTR被亞克隆1)利用XhoⅠ和XbaⅠ消化質粒pBluescript Ⅱ KS(+)而製備的3.0KB載體DNA，和2)利用XhoⅠ和XbaⅠ消化pBS-HXB2製備的含有3』LTR的0.8kB的DNA片段。在步驟二中，從兩個片段製備質粒pBS-LTR-luc3』，該質粒含有插入在缺失的3』LTR中的後接SV40多聚腺苷酸化位點的螢光素酶3』編碼區1)利用EcoRⅤ消化pBS-LTR並利用鹼性磷酸酶處理得到的載體而製備的3.5kB的載體DNA，和2)利用EcoRⅤ和NheⅠ消化質粒pVL-luc，接著利用Klenow DNA聚合酶處理得到的片段而製備的含有3』螢光素酶編碼區和SV40多聚A位點的0.5kB的DNA片段。通過限制性圖譜分析鑑定具有以正確方向(即相反於3』LTR的轉錄方向)插入的3』螢光素酶編碼區的克隆。在步驟三中，從兩個DNA片段製備質粒pVL-luc3』:1)利用EcoRV消化質粒pBS-LTR-luc3』，接著利用鹼性磷酸酶處理得到的載體而製備的4.0kB的載體DNA，和2)通過利用PvuⅡ和SmaⅠ消化質粒pVL-SnaBⅠ/PvuⅡ而製備的含有(-球蛋白基因第二個外顯子拼接受體的0.1kB的DNA片段。通過限制性圖譜分析鑑定對應於含有以正確方向插入在螢光素酶編碼區的(-球蛋白第二個外顯子拼接受體的pVL-luc3』克隆。
通過相同的三步驟方法製備質粒pLG-lucPC-HS,pLG-lucPC-PB,pLS-lucPC-HS和pLS-lucPC-PB。在第一個步驟中，從兩個DNA片段製備質粒pLG-lucDP-PB,pLG-lucDP-PB,pLS-lucDP-HS和pLS-lucDP-PB:1)利用SmaⅠ和ClaⅠ分別消化質粒pLG-lucPP-HS,pLG-lucPP-PB,pLS-lucPP-HS,pLS-lucPP-PB製備的載體DNA，和2)利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pLG製備的0.8kB的DNA片段。在第二個步驟中，從兩個DNA片段製備質粒pLG-1uc5』-HS,pLG-luc5』-PB,pLS-luc5』-HS和pLS-luc5』-PB:1)通過分別消化質粒pLG-lucDP-HS,pLG-lucDP-PB,pLS-lucDP-HS和pLS-lucDP-PB和利用鹼性磷酸酶處理得到的載體而製備的載體DNA，和2)利用NotⅠ消化pVL-luc5』製備的含有第一指示基因盒的2.5kB的DNA片段。通過限制性圖譜分析鑑定含有以相反於病毒LTR的轉錄方向插入在病毒載體中的第一指示基因盒的克隆。在步驟三中，從兩個DNA片段製備質粒pLG-lucPC-HS,pLG-lucPC-PB,pLS-lucPC-HS和pLS-lucPC-PB:1)通過利用XhoⅠ和XbaⅠ分別消化質粒pLG-luc5』-HS,pLG-luc5』-PB,pLS-luc5』-HS和pLS-luc5』-PB製備的載體DNA，和2)通過利用XhoⅠ和XbaⅠ消化質粒pVL-luc3』製備的含有第二指示基因盒的1.1kB的DNA片段。
各從兩個DNA片段製備質粒pCG-lucPC-HS,pCG-lucPC-PB,pCS-lucPC-HS和pCS-lucPC-PB:1)利用SmaⅠ和ClaⅠ分別消化質粒pLG-lucPC-HS,pLG-lucPC-PB,pLS-lucPC-HS和pLS-lucPC-PB製備的載體DNA，和2)利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pCG製備的1.3kB的DNA片段。
抗性測試載體-構建方法利用含有實施例1中所述的抗病毒靶基因的HIV基因組和亞基因組病毒載體設計了含有具有置換編碼區的非功能性指示基因的抗性測試載體。
通過實施例1所述的方法，從質粒pLG-lucPC-HS,pLG-lucPC-PB,pCG-lucPC-HS,pCG-lucPC-PB,pLS-lucPC-HS,pLS-lucPC-PB,pCS-lucPC-HS和pCS-lucPC-PB(圖4B)製備抗性測試載體。利用低聚核苷酸18和19和低聚核苷酸22和23製備的擴增的病人序列，從質粒pLG-lucPC-HS,pCG-lucPC-HS,pLS-lucPC-HS或pCS-lucPC-HS製備的載體構建抗性測試載體。利用低聚核苷酸20和21，和低聚核苷酸24和25製備的擴增的病人序列，從質粒pLG-1ucPC-PB,pCG-lucPC-PB,pLS-lucPC-PB或pCS-lucPC-PB製備的載體構建抗性測試載體。
藥物敏感性和抗性測試通過如下所述的實施例1所述的方法進行抗性測試。從質粒pLG-lucPC-HS,pLG-lucPC-PB,pCG-lucPC-HS和pCG-lucPC-PB製備的抗性測試載體缺乏功能性HIVenv基因，並與包裝表達載體pVL-env4070A一起使用。從質粒pLS-lucPC-HS,pLS-lucPC-PB,pCS-lucPC-HS和pCS-lucPC-PB製備的抗性測試載體僅編碼HIVgag-pol基因產物，並與pVL-env4070A和，pLTR-HIV3』和pCMV-HIV3』包裝表達載體二者之一，一起使用。在利用兩宿主細胞類型進行的抗性測試中，將293細胞系，tsa54細胞系，tsa201細胞系，或BOSC23細胞系用作包裝宿主細胞，未修飾的Jurkat細胞用作靶細胞。因為包含在這些抗性測試載體內的具有置換編碼區的非功能性指示基因在包裝宿主細胞轉染之後沒有有效地表達，通過利用與包裝宿主細胞的共培養，或通過利用來自包裝宿主細胞上清液的病毒都可以進行靶宿主細胞的感染。基於同樣的原因，利用這些抗性測試載體的抗性測試可以利用單個宿主細胞類型。利用293,tsa54,tsa201,BOSC23或Jurkat細胞都可以進行利用單個宿主細胞類型的抗性測試。
實施例3利用含有病人起源的區段和具有反向內含子的非功能性指示基因的抗性測試載體的HIV藥物敏感性和抗性測試利用含有實施例1所述的抗病毒靶基因的HIV基因組和亞基因組病毒載體設計含有具有反向內含子的非功能性指示基因的抗性測試載體。
指示基因病毒載體-反向內含子具有病人序列接受位點的基因組指示基因病毒載體pLG-lucⅡ-HS,pLG-lucⅡ-PB,pCG-lucⅡ-HS和pCG-lucⅡ-PB，和起源於它們的抗性測試載體，各在5』到3』方向含有下面的元件(圖5B):1)HIV-LTR U3區(pLG-lucⅡ-HS和pLG-lucⅡ-PB)或第一CMV IE增強子-啟動子(pCG-lucⅡ-HS和pCG-lucⅡ-PB),2)HIV-LTR R和U5區，3)HIVgag-pol,vif,vpr,tat,rev,vpu，缺失的env，和nef基因的編碼區，4)插入在缺失的env基因中的指示基因盒，和5)3』HIV-LTR。pLG-lucⅡ-HS和pCG-lucⅡ-HS分別在HXB2的核苷酸2243和4190含有獨特的HpaⅠ和SalⅠ病人序列接受位點；pLG-lucⅡ-PB和pCG-lucⅡ-PB分別在HXB2的核苷酸2221和4212含有獨特的PvuⅠ和BamHⅠ病人序列接受位點(參見實施例1詳細情況)。指示基因盒含有1)第二CMV增強子-啟動子，2)由顛倒的人工內含子中斷的螢光素酶基因的編碼區，和3)SV40多聚腺苷酸化序列。指示基因盒的整個轉錄方向與第一CMV增強子-啟動子和病毒LTR的方向相反，而人工內含子的方向與後面的元件相同。通過第二CMV增強子-啟動子的指示基因的轉錄不導致功能性轉錄物的產生，因為反向內含子不能在這一方向中拼接。但是通過5』病毒LTR或第一CMV IE增強子-啟動子的指示基因的轉錄卻導致通過RNA拼接除去反向內含子，雖然指示基因仍然非功能性地表達，因為得到的轉錄物具有反義方向。在這一轉錄物的逆轉錄和得到原病毒DNA整合之後，通過第二CMV增強子-啟動子可以功能性地轉錄指示基因，因為反向內含子已被除去(圖5C)。
具有病人序列接受位點的亞基因組指示基因病毒載體pLS-lucⅡ-HS,pLS-lucⅡ-PB,pCS-lucⅡ-HS，和pCS-lucⅡ-PB和起源於它們的抗性測試載體，各在5』到3』方向含有下面的元件(圖5B)1)HV-LTR U3區(pLS-lucⅡ-HS和pLS-lucⅡ-PB)或第一CMV IE增強子-啟動子(pCS-lucⅡ-HS和pCS-lucⅡ-PB)，2)HIV-LTR R和U5區，3)HIV gag-pol基因的編碼區，4)指示基因盒，5)來自含有病毒包裝序列的HIV env基因的RRE元件，和6)3』HIV-LTR。pLS-lucⅡ-HS和pCS-lucⅡ-HS分別在HXB2的核苷酸2243和4190含有獨特的HpaⅠ和SalⅠ病人序列接受位點；pLS-lucⅡ-PB和pCS-lucⅡ-PB分別在HXB2的核苷酸2221和4212含有獨特的PvuⅠ和BamHⅠ病人序列接受位點。指示基因盒含有1)第二CMV增強子-啟動子，2)顛倒的人工內含子中斷的螢光素酶基因的編碼區，和3)SV40多聚腺苷酸化序列。正如pLG-lucⅡ和pCG-lucⅡ基因組病毒載體的情況，pLS-lucⅡ和pCS-lucⅡ的指示基因不能功能性地轉錄直到反向內含子被除去並且逆轉錄和原病毒整合發生之後(圖5C)。
從兩個DNA片段製備含有指示基因盒的質粒pVL-lucⅡ，在指示基因盒中，來自pVL-SnaBⅠ/PvuⅡ的人工內含子以顛倒的方向插入在螢光素酶編碼區1)通過利用EcoRⅤ消化pVL-luc和利用鹼性磷酸酶處理得到的載體製備的5.8kB的載體片段，和2)精確地對應於通過利用SnaⅠ和PvuⅡ消化pVL-SnaBⅠ/PvuⅡ製備的人工內含子序列的0.2kB DNA片段。通過限制性圖譜分析鑑定對應於含有以顛倒的方向插入在螢光素酶編碼區的人工內含子的pVL-lucⅡ克隆。
從兩個DNA片段製備質粒pLG-lucⅡ-HS,pLG-lucⅡ-PB,pLS-lucⅡ-HS和pLS-lucⅡ-PB:1)通過分別消化質粒pLG-lucDP-HS,pLG-lucPD-PB,pLS-lucDP-HS和pLS-lucDP-PB和利用鹼性磷酸酶處理得到的載體製備的載體DNA，和2)通過利用NotⅠ消化pVL-lucⅡ製備的含有螢光素酶指示基因盒的3.2kB的DNA片段。通過限制性圖譜分析鑑定含有以相反於病毒LTR的轉錄方向插入在病毒載體中的正確的plucⅡ指示基因盒的克隆並用於抗性測試載體的製備。
從兩個DNA片段製備各個質粒pCG-lucⅡ-HS,pCG-lucⅡ-PB,pCS-lucⅡ-HS和pCS-lucⅡ-PB:1)分別利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pLG-lucⅡ-HS,pLG-lucⅡ-PB,pLS-lucⅡ-HS和pLS-lucⅡ-PB製備的載體DNA，和2)利用SmaⅠ和ClaⅠ消化質粒pCG製備的1.3kB的DNA片段。
抗性測試載體-構建方法通過實施例1所述的方法，從質粒pLG-lucⅡ-HS,pLG-lucⅡ-PB,pCG-lucⅡ-HS,pCG-lucⅡ-PB,pLS-lucⅡ-HS,pLS-lucⅡ-PB,pCS-lucⅡ-HS和pCS-lucⅡ-PB(圖5B)製備抗性測試載體。利用低聚核苷酸18和19，和低聚核苷酸22和23製備的擴增病人序列，從質粒pLG-lucⅡ-HS,pCG-lucⅡ-HS,pLS-lucⅡ-HS或pCS-lucⅡ-HS製備的載體構建抗性測試載體。利用低聚核苷酸20和21，和低聚核苷酸24和25製備的擴增病人序列，從質粒pLG-lucⅡ-PB,pCG-lucⅡ-PB,pLS-lucⅡ-PB或pCS-lucⅡ-PB製備的載體構建抗性測試載體。
藥物敏感性和抗性測試通過如下所述的實施例1敘述的方法進行抗性測試。從質粒pLG-lucⅡ-HS,pLG-lucⅡ-PB,pCG-lucⅡ-HS和pCG-lucⅡ-PB製備的抗性測試載體缺乏功能性HIV env基因，並與包裝表達載體pVL-env4070A一起使用。從質粒pLS-lucⅡ-HS,pLS-lucⅡ-PB,pCS-lucⅡ-HS和pCS-lucⅡ-PB製備的抗性測試載體僅編碼HIVgag-pol基因產物，並與pVL-env4070A和，pLTR-HIV3』和pCMV-HIV3』包裝表達載體二者之一，一起使用。在利用兩宿主細胞類型進行的抗性測試中，將293細胞系，tsa54細胞系，tsa201細胞系，或BOSC 23細胞系用作包裝宿主細胞，將未修飾的Jurkat細胞用作靶細胞。由於包含在這些抗性測試載體中的具有反向內含子的非功能性指示基因是不能在包裝宿主細胞轉染後有效地表達的，通過與包裝宿主細胞的共培養，或通過利用來自包裝宿主細胞上清液的病毒可以進行靶宿主細胞的感染。由於同樣的原因，利用這些抗性測試載體進行的抗性測試可以利用單個宿主細胞類型。利用293,tsa54,tsa201,BOSC23或Jurkat細胞進行利用單個宿主細胞類型的抗性測試。
實施例4利用含有病人起源的區段和非功能性指示基因的抗性測試載體的基於非顆粒的HIV藥物敏感性和抗性測試藥物敏感性和抗性測試如實施例1,2和3所述，利用含有具有置換啟動子，置換編碼區或反向內含子的非功能性指示基因的抗性測試載體進行基於非顆粒的抗性測試。在缺乏包裝表達載體時，通過利用各個抗性測試載體的單個宿主細胞類型的轉染進行這些基於非顆粒的抗性測試。雖然在宿主細胞轉染之後包含在這些抗性測試載體內的非功能性指示基因沒有有效地表達，存在人由基於非病毒顆粒的逆轉錄產生的可檢測的指示基因的表達。逆轉錄和鏈轉移導致置換的，非功能性的指示基因轉換成非置換的，功能性的指示基因。由於逆轉錄完全依賴於包含在各個抗性測試載體內的pol基因的表達，可以測試抗病毒試劑抑制包含在抗性測試載體內的病人起源的區段編碼的pol基因產物的能力。將實施例1所述的通用方法進行下述改良而進行基於非顆粒的抗性測試1)將抗性測試載體轉染進適當的宿主細胞，2)將抗病毒試劑或它們的聯合以適當濃度在轉染後立即加入轉染宿主細胞的各個別培養物中，3)在轉染後24到72小時收穫宿主細胞並測試螢光素酶活性。與缺乏抗病毒試劑時進行的對照比較，在存在給定抗病毒試劑時觀察到的利用給定抗性測試載體轉染的宿主細胞的螢光素酶活性的減弱可用於計算該試劑或試劑的聯合對存在於抗性測試載體中的病人起源的區段編碼的病毒靶基因產物的表觀抑制含量(Ki)。
抗性測試載體-構建方法對於利用含有具有置換啟動子的非功能性指示基因的抗性測試載體的基於非顆粒的抗性測試，如實施例1所述利用質粒pLG-lucPP-HS,pLG-lucPP-PB,pCG-lucPP-HS,pCG-lucPP-PB,pLS-lucPP-HS,pLS-lucPP-PB,pCS-lucPP-HS或pCS-lucPP-PB製備抗性測試載體。將各個抗性測試載體轉染進入表達細胞質T7 RNA聚合酶的宿主細胞(如293/T7 RNAP細胞或Jrukat/T7 RNAP細胞)。如實施例1所述，利用質粒pVL-T7 RNAP，通過293細胞和Jurkat細胞的穩定轉染製備這樣的宿主細胞，該質粒指導人和其它哺乳動物細胞和細胞系中細胞質噬菌體T7 RNA聚合酶的表達。從下面兩個DNA片段構建pVL-T7 RNAP:1)利用EcoRⅠ和BglⅡ消化哺乳動物表達載體pVL-2製備的4.3kB的DNA片段，和2)通過用質粒pT7-G1作為模板，和低聚核苷酸47和40作為引物的PCR，接著用EcoRⅠ和BglⅡ消化而製備的，含有T7 RNA聚合酶的完全的編碼區(核苷酸166到2815，基因庫登記號M3 8308給出的坐標，Grachev和Pletnev(1984)Bioorg.Khim.10,824-843)的2.6kB的DNA片段。低聚核苷酸47摻入了獨特的EcoRⅠ位點，後接用於真核翻譯起始的共有序列(如，Kozak(1991)生物化學雜誌，266,19867-19870),而低聚核苷酸40摻入了獨特的BglⅡ位點。
對於利用含有具有置換編碼區或反向內含子的非功能性指示基因的抗性測試載體的基於非顆粒的抗性測試，如實施例1所述利用質粒pLG-lucPC-HS,pLG-lucPC-PB,pCG-lucPC-HS,pCG-lucPC-PB,pLS-lucPC-HS,pLS-lucPC-PB,pCS-lucPC-HS,pCS-lucPC-PB,pLG-lucⅡ-HS,pLG-lucⅡ-PB,pCG-lucⅡ-HS,pCG-lucⅡ-PB,pLS-lucⅡ-HS,pLS-lucⅡ-PB,pCS-lucⅡ-HS或pCS-lucⅡ-PB製備抗性測試載體。將各個抗性測試載體轉染進入293,tsa54,tsa201,BOSC23或Jurkat細胞。
實施例5利用含有病人起源的區段和功能性指示基因的抗性測試載體的HIV藥物敏感性和抗性測試指示基因病毒載體-功能性指示基因具有病人序列的受體位點的基因組指示基因病毒載體，質粒pLG-luc-HS-1,pLG-luc-HS-2,pLG-luc-PB-1,pLG-luc-PB-2,pCG-luc-HS-1,pCG-luc-HS-2,pCG-luc-PB-1和pCG-luc-PB-2,和起源於它們的抗性測試載體，各在5』到3』方向含有下面的元件(圖6):1)HIV-LTR U3區(pLG-luc-HS-1,pLG-luc-HS-2,pLG-luc-PB-1和pLG-luc-PB-2)或第一CMV IE增強子-啟動子(pCG-luc-HS-1,pCG-luc-HS-2,pCG-luc-PB-1和pCG-luc-PB-2)，2)HIV-LTR R和U5區，3)HIVgag-pol,vif,vpr,tat,rev,vpu，缺失的env，和nef基因的編碼區，4)插入在缺失的env基因中的指示基因盒，和5)3』HIV-LTR。pLG-luc-HS-1,pLG-luc-HS-2,pCG-luc-HS-1和pCG-luc-HS-2分別在HXB2的核苷酸2243和4190含有獨特的HpaⅠ和SalⅠ病人序列接受位點；pLG-luc-PB-1,pLG-luc-PB-2,pCG-luc-PB-1和pCG-luc-PB-2分別在HXB2的核苷酸2221和4212含有獨特的PvuⅠ和BamHⅠ病人序列接受位點(參見實施例1詳細情況)。各個質粒的指示基因盒含有1)第二CMV增強子-啟動子，2)螢光素酶基因的編碼區，和3)SV40多聚腺苷酸化序列。pLG-luc-HS-1,pLG-luc-PB-1,pCG-luc-HS-1和pCG-lcu-PB-1的指示基因盒以與病毒LTR或第一CMV增強子-啟動子相反轉錄方向插入載體中(圖6B)，而pLG-luc-HS-2,pLG-luc-PB-2,pCG-luc-HS-2和pCG-lcu-PB-2的指示基因盒以相同方向插入載體中(圖6C)。
具有病人序列接受位點的亞基因組指示基因病毒載體，質粒pLS-luc-HS-1,pLS-luc-HS-2,pLS-luc-PB-1,pLS-luc-PB-2,pCS-luc-HS-1,pCS-luc-HS-2,pCS-luc-PB-1和pCS-luc-PB-2，和它們衍生的抗性測試載體各在5』到3』方向在含有下面的元件(圖6):1)HIV-LTR U3區(pLS-luc-HS-1,pLS-lcu-HS-2,pLS-luc-PB-1和pLS-luc-PB-2)或第-CMV IE增強子-啟動子(pCS-luc-HS-1,pCS-luc-HS-2,pCS-luc-PB-1和pCS-luc-PB-2),2)HIV-LTR R和U5區，3)HIVgag-pol基因的編碼區，4)指示基因盒，5)來自含有病毒包裝序列的HIVenv基因的RRE元件，和6)3』HIV-LTR。pLS-luc-HS-1,pLS-luc-HS-2,pCS-luc-HS-1和pCS-luc-HS-2分別在HXB2的核苷酸2243和4190含有獨特的HpaⅠ和SalⅠ病人序列接受位點；pLS-lcu-PB-1,pLS-luc-PB-2,pCS-luc-PB-l和pCS-luc-PB-2分別在HXB2的核苷酸2221和4212含有獨特的PvuⅠ和BamHⅠ病人序列接受位點。各質粒的指示基因盒含有1)第二CMV增強子-啟動子，2)螢光素酶基因的完全編碼區，和3)SV40多聚腺苷酸化序列。pLS-luc-HS-1,pLS-luc-PB-1,pCS-luc-HS-1和pCS-luc-PB-1的指示基因盒以相反於病毒LTR或第一CMV增強子-啟動子的轉錄方向插入在該載體中(圖6B)，而pLS-luc-HS-2,pLS-luc-PB-2,pCS-luc-HS-2和pCS-luc-PB-2的指示基因盒以相同方向插入載體中(圖6C)。
質粒pLG-luc-HS-1和pLG-luc-HS-2,pLG-luc-PB-1和pLG-luc-PB-2,pCG-luc-HS-1和pCG-luc-HS-2,pCG-luc-PB-1和pCG-luc-PB-2,pLS-luc-HS-1和pLS-luc-HS-2,pLS-luc-PB-1和pLS-luc-PB-2,pCS-luc-HS-1和pCS-luc-HS-2,pCS-luc-PB-1和pCS-luc-PB-2各從兩個DNA片段製備的1)利用NotⅠ分別消化pLG-luc-HS,pLG-lucⅡ-PB,pCG-lucⅡ-HS,pCG-lucⅡ-PB,pLS-luc-HS,pLS-lucⅡ-PB,pCS-lucⅡ-HS和pCS-lucⅡ-PB和利用鹼性磷酸酶處理得到的載體而製備的載體DNA，和2)通過利用NotⅠ消化製備的含有螢光素酶指示基因盒的3.0kB的DNA片段。通過限制性圖譜鑑定含有以相對於病毒LTR的兩個轉錄方向插入在給定的病毒載體中的指示基因盒的克隆(如，pLG-luc-HS-1就pLG-luc-HS-2)。
抗性測試載體-構建方法利用實施例1所述的含有抗病毒靶基因的HIV基因組和亞基因組病毒載體設計含有功能性指示基因的抗性測試載體。從上述質粒(圖6)通過實施例1所述的方法製備抗性測試載體。利用低聚核苷酸18和19，和低聚核苷酸22和23製備的擴增病人序列，從質粒pLG-luc-HS-1,pLG-luc-HS-2,pCG-luc-HS-1,pCG-luc-HS-2,pLS-luc-HS-1,pLS-luc-HS-2,pCS-luc-HS-1或pCS-luc-HS-2製備的載體構建抗性測試載體。利用低聚核苷酸20和21，和低聚核苷酸24和25製備的擴增病人序列，從質粒pLG-luc-PB-1,pLG-luc-PB-2,pCG-luc-PB-1,pCG-luc-PB-2,pLS-luc-PB-1,pLS-luc-PB-2,pCS-luc-PB-1或pCS-luc-PB-2製備的載體構建抗性測試載體。
藥物敏感性和抗性測試通過實施例1所述的方法進行抗性測試，如下所述。從質粒pLG-luc-HS-1,pLG-luc-HS-2,pLG-luc-PB-1,pLG-luc-PB-2,pCG-luc-HS-1,pCG-luc-HS-2,pCG-luc-PB-1和pCG-luc-PB-2製備的抗性測試載體缺乏功能性HIVenv基因，並與包裝表達載體pVL-env4070A一起使用。從質粒pLS-luc-HS-1,pLS-luc-HS-2,pLS-luc-PB-1,pLS-luc-PB-2,pCS-luc-HS-1,pCS-luc-HS-2,pCS-luc-PB-1和pCS-luc-PB-2製備的抗性測試載體僅編碼HIVgag-pol基因產物，並與pVL-env4070A和，pLTR-HIV3』和pCMV-HIV3』包裝表達載體二者之一，一起使用。利用兩宿主細胞類型進行抗性測試，利用293細胞系，tsa54細胞系，tsa201細胞系或BOSC23細胞系作為包裝宿主細胞，利用未修飾的Jurkat細胞作為靶細胞。如實施例1所述，利用從抗性測試載體指示基因宿主細胞得到的過濾上清液中得到的抗性測試載體病毒顆粒感染的方法進行含有功能性指示基因的這些或其它抗性測試載體對靶細胞的感染。與含有具有置換啟動子或反向內含子的非功能性指示基因病毒載體的抗性測試載體相反，含有功能性指示基因的那些通常能夠在轉染的包裝宿主細胞中表達它們的指示基因。測試共培養方法和利用單個細胞類型的抗性測試都不能容易地適用於利用具有功能性指示基因的抗性測試載體的靶細胞的感染，因為難以區分在感染的靶宿主細胞中和在轉染的包裝宿主細胞中的指示基因的表達。
所有本說明書引證的公開物和專利申請以它們的全部引入本文作為參考，正如各個單個公開物或專利申請特定地和個別地指出以便引入本文作為參考。
正如對本發明所從屬的領域的技術人員所明了的，本發明可以以除了上面特定地公開的形式為實施方案，例如，不離開本發明的精神或基本特徵進行其它毒力的藥物敏感性和抗性測試。所以，將如上所述的本發明的特定的實施方案考慮為說明性的而不是限制性的。本發明的範圍正如附加的權利要求中陳述的，不限於包含在前面的說明中的實施例。
實施例6利用含有病人起源的區段和功能性指示基因的抗性測試載體的HIV藥物敏感性和抗性測試藥物敏感性和抗性測試利用兩宿主細胞類型，基於兩個與實施例5中所述的pCG-luc-2相似的指示基因病毒載體pCG-CXCN(F-lucP)2，和pCG-CXAT(F-lucP)2的抗性測試載體進行抗性測試。在pCG-CXCN(F-lucP)2的情況中，將指示基因病毒載體進行修飾，使指示基因盒缺乏內含子A(如上所述的CMV/α-球蛋白內含子)，不含有多聚腺苷酸化信號並在構建時刪除了下遊的3』U5序列。用SV40polyA信號和複製區的起點替代了下遊U5。指示基因病毒載體pCG-CXAT(F-lucP)2與pCG-CXCN(F-lucP)2的區別在於指示基因盒在CMV增強子-啟動子和TK多聚腺苷酸化信號區下遊含有人工內含子。通過利用抗性測試載體和包裝表達載體轉染包裝宿主細胞製備的第一宿主細胞(抗性測試載體宿主細胞)產生抗性測試載體病毒顆粒。然後利用抗性測試載體病毒顆粒感染第二宿主細胞(靶宿主細胞)，測量其中指示基因的表達。
AZT藥物敏感性/抗性測試構建含有功能性螢光素酶基因盒的抗性測試載體pCG-luc-2，利用該抗性測試載體DNA轉染宿主細胞。該抗性測試載體含有對核苷逆轉錄酶抑制劑AZT(Sigma)有敏感性或有抗性的「測試」病人起源的逆轉錄酶序列。通過將該抗性測試載體DNA轉染進入宿主細胞產生的抗性測試載體病毒顆粒被用於感染在缺乏AZT或存在逐步增高的濃度的該藥物(範圍約0.0001微摩爾到1000微摩爾)時生長的靶宿主細胞。將在存在藥物時感染的靶宿主細胞中產生的螢光素酶活性的量與缺乏藥物時感染的靶宿主細胞中螢光素酶的量比較。藥物抗性是以抑制50％(50％抑制濃度，IC50)的缺乏藥物時檢測的螢光素酶活性所需要的藥物的量來測定的。通過描繪藥物抑制百分數對藥物濃度的對數值的圖確定IC50值。
在10釐米直徑的盤中播種宿主細胞(293)，在用抗性測試載體質粒DNA和包衣表達載體pCXAS(4070A-env)鋪板後幾天轉染。利用磷酸鈣沉澱方法進行轉染。在轉染後，從1到24小時，利用新鮮的培養基替代含有DNA沉澱的細胞培養基。在轉染後一到四天收穫含有抗性測試載體病毒顆粒的細胞培養基並在儲藏於-80℃之前通過0.45毫米的濾紙。按照製造商的說明(SIAC；Frederick,MD)通過EIA方法確定收穫的細胞培養基中的HIV包衣蛋白質水平(p24)。在感染之前6到48小時，在不含有AZT或含有從100微摩爾到0.00005微摩爾的系列兩倍稀釋的AZT的細胞培養基中鋪板靶細胞(293和293/T)。在感染過程中保持AZT濃度。利用90微升的轉染的抗性測試載體宿主細胞上清液接種靶宿主細胞。利用來自模仿轉染(沒有DNA)或含有沒有包衣表達質粒DNA的抗性測試載體質粒DNA(pCXAS(4070A-env))的轉染的細胞培養基進行對照感染。在接種後一到24小時，在每個孔中加入新鮮培養基。12到36小時後，培養基被新鮮培養基完全替代。感染後1到3或更多天，除去培養基，在每個孔中加入細胞溶解緩衝液(Promega)。在溶解緩衝液中稀釋細胞溶解物100倍，測量每個稀釋的細胞溶解物的螢光素酶活性(圖7A)。利用下面的方程確定AZT的抑制效果％螢光素酶抑制=1-(RLUluc(AZT)/RLUluc)其中RLUluc(AZT)是在存在AZT時感染細胞中的螢光素酶活性的相對光單位，RLUluc是缺乏AZT時感染細胞中的螢光素酶活性的相對光單位。IC50值是通過描繪螢光素酶活性的抑制百分數對藥物濃度對數值產生的S形曲線得到的。AZT抑制曲線顯示在(圖7B)。
Nevirapine藥物敏感性/抗性測試基於指示基因病毒載體pCG-CXCN(F-lucP)2的抗性測試載體含有起源於生物活性原病毒克隆pNL4-3的逆轉錄酶序列，該克隆對非核苷逆轉錄酶抑制劑nevirapme(BI-RG-587,Boehringer Igleheim)敏感。以上文對AZT藥物敏感性/抗性測試所述進行寄主包裝細胞的轉染和寄主靶細胞的感染。利用範圍為0.0001微摩爾到100微摩爾的nevirapine濃度評估nevirapine敏感性/抗性。如上對AZT所述確定nevirapine抑制曲線並示於圖7C。
Indinavir藥物敏感性/抗性測試基於指示基因病毒載體pCG-CXCN(F-lucP)2的抗性測試載體含有起源於生物活性原病毒克隆，pNL4-3，的蛋白酶序列，該克隆是敏感於蛋白酶抑制劑indinavir(MK-639,Merck)。除了該蛋白酶抑制劑，indinavir，存在於轉染的包裝宿主細胞培養物以及感染的靶宿主細胞培養物外，如對AZT藥物敏感性/抗性測試所述，進行寄主包裝細胞的轉染和寄主靶細胞的感染。利用範圍為1.5皮摩爾到3微摩爾的indinavir濃度評估indinavir敏感性/抗性。如上對AZT所述確定indinavir抑制曲線並示於圖7D。
實施例7利用含有病人起源的區段和含有反向內含子的非功能性指示基因的抗性測試載體的肝炎藥物敏感性和抗性測試指示基因病毒載體-構建方法利用含有抗病毒藥物的靶的病毒基因的HBV亞基因組病毒載體設計含有具有反向內含子的非功能性指示基因的指示基因病毒載體。指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ-(PSAS-)是在亞基因組病毒載體pCS-HBV的基礎上的。該指示基因病毒載體含有一個反向內含子的指示基因盒和所有HBV DNA複製所必須的順式作用的調節元件(即DR1,5』εDR2,DR1*,3』PA)，但缺乏提供HBV DNA複製和病毒顆粒形成必須的反式激活作用結構和酶的功能的HBV基因序列(即C,P,S,X基因)(圖8B)。C,P,S和X基因和病人序列接受位點包含在包裝載體pPK-CPX(如下所述，圖8D)和pPK-S(如下所述，圖8E)內。在這一實施方案中，指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ-(PSAS-)和包裝載體pPK-CPX構成抗性測試載體系統。非功能性指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ-(PSAS-)含有下面5』到3』方向的元件(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)HBV基因組的5』區和DR1和衣殼化信號區(ε)的5』拷貝(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼)，(3)非功能性指示基因盒，其中指示基因ORF含有反向內含子，(4)含有DR2，DR1*,3』ε,和3』HBV多聚腺苷酸化(pA)信號區的HBV基因組的區域。非功能性指示基因表達盒在5』-3』方向含有一些或全部下面的元件(1)質粒增強子-啟動子區，(2)內含子，(3)含有反向內含子的指示基因，(4)轉錄多聚腺苷酸化信號序列(如SV40)，(HSV-1胸苷激酶基因)。該指示基因表達盒的轉錄方向與HBV序列元件的相反(圖8B)。但是，指示基因ORF內的內含子具有與HBV序列元件相同的轉錄方向。
在第二個實施方案中，非功能性指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ(PSAS+)含有具有反向內含子的非功能性指示基因盒，所有HBV DNA複製所必須的順式作用調節元件，和一些或全部提供HBV DNA複製和病毒顆粒形成所必須的反式激活作用結構和酶功能的HBV基因序列(即C,P,S,X基因)(圖8F)。起源於指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ(PSAS+)的抗性測試載體含有病人序列接受位點(PSAS)與包裝載體pPK-CSX一起使用(圖8H)。在這一實施方案中，指示基因病毒載體也可以提供一些或全部包裝功能如P。利用另外的包裝載體pPK-CSX(如下所述，圖8H)提供指示基因病毒載體不提供的但是HBV DNA複製和病毒顆粒形成所必須的結構和酶活性。在這一實施方案中，非功能性指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ(PSAS+)含有下面5』到3』方向的元件(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)HBV基因組的5』區，和DR1和5』ε(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)翻譯反向內含子，定位於可能含有一些或全部C,P,S，和X基因以及病人起源P基因區段的HBV基因組區內的指示基因盒，(4)含有DR2,DR1*,3』ε，和3』εHBV pA信號區的HBV基因組的區域。在非功能性指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ-(PSAS+)內，指示基因表達盒具有相反於HBV序列元件的轉錄方向(圖8F)。但是在指示基因ORF內的內含子具有與HBV序列元件相同的轉錄方向。
在轉染細胞中，包裝載體提供HBV DNA複製和表達顆粒形成所必須的但不是抗性測試載體或指示基因病毒載體提供的反式-結構和酶功能。在指示基因病毒載體如pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS-)與包裝載體，如pPK-CPX，共轉染的實施方案中，這些載體的聯合構成了一個抗性測試載體系統，該系統是含有用於病人起源的P基因區段(如上所述)的插入的病人序列接受位點的包裝載體。包裝載體pPK-CPX含有下面5』到3』方向的元件(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)從C ORF翻譯起始密碼子到3』pA信號並包括C,P,S和X基因的HBV基因組的區域。修飾包裝載體的C基因使它不含有和/或表達前-C ORF序列和不表達S蛋白質(如下所述)。
在HBV中，優先以順式包裝編碼C和/或P蛋白質的RNA並因而幹擾含有非功能性指示基因的抗性測試載體和不編碼C和P蛋白質的非功能性指示基因表達載體RNA的有效包裝。採取兩個步驟防止從包裝載體產生的RNA的衣殼化和提高抗性測試載體或非功能性指示基因病毒載體RNA的衣殼化效力。首先，包裝載體產生的RNA不含有5』衣殼化信號區(ε)(圖8D,8E和8H)。其次，在C基因和/或P基因包裝功能是由抗性測試載體或非功能性指示基因病毒載體提供的情況中，利用了不表達C和/或P基因產物的包裝載體如pPK-S或pPK-CSK(圖8E和8H)。
抗性測試載體-構建方法如下製備抗性測試載體1)通過在P基因區導入獨特的限制性位點，稱為病人序列接受位點(PSAS)修飾指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ-(PSAS-)，2)通過擴增存在於感染病人的血清或細胞中的病毒DNA，擴增對應於HBV藥物靶，如逆轉錄酶或DNA聚合酶，的病人起源的區段，和3)在病人序列接受位點將擴增序列準確地插入指示基因病毒載體(圖8F)。可選擇地，通過如下製備抗性測試載體系統1)通過在P基因導入病人序列接受位點修飾包裝載體pPK-CPX,2)通過利用存在於感染病人的血清或細胞中的病毒DNA的擴增，擴增對應於HBV藥物靶，如逆轉錄酶或DNA聚合酶的病人起源的區段，3)在病人序列接受位點將擴增的序列準確地插入在包裝載體中(圖8D)。在一個實施方案中，5』PSAS的位置靠近P蛋白的間隔和RT區的邊界(緊接著S蛋白翻譯起始位點的下遊)，而3』PSAS位置靠近P蛋白的RNase H區的C-末端。在病人序列接受位點插入病人起源的P基因區段導致形成嵌合P基因序列，其中載體P基因序列編碼TP和間隔區，而病人起源的區段編碼逆轉錄酶/聚合酶和RNase H區(圖8D和8F)。
在HBV中，整個S基因ORF與P基因ORF交疊，但利用不同的讀碼框架得到表達(Nassal,M.和Schaller,H.(1993)微生物學趨勢1,221-228)。所以，從病人得到的HBV P基因序列(逆轉錄酶和RNase H區)也含有相應的病人S基因序列。通過在pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ-(PSAS+)或pPK-CPK載體(圖8F和8D)中刪除三個S基因ORF(前-S1，前-S2，和S)翻譯起始位點和/或導入框架內終止密碼防止來自交疊的S基因ORF的病人起源的S基因區的表達。利用提供已被清楚表徵的S基因產物(圖8E和8H)的分離的包裝載體反式提供S基因表達。沒有在P基因的終端蛋白(TP)或間隔區編碼的交疊的胺基酸序列中導入變化進行了刪除S基因表達的修飾。
藥物敏感性和抗性測試利用一種類型的宿主細胞或兩種類型的宿主細胞，使用基於指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ-(PSAS+)的抗性測試載體，或者基於指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ-(PSAS-)和包裝載體pPK-CPX的抗性測試載體系統進行藥物敏感性和抗性測試。利用抗性測試載體如pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ-(PSAS+)和包裝載體pPK-CSX，或利用指示基因病毒載體如pCS-HBV(NF-IG)Ⅱ-(PSAS-)和含有病人起源區段的包裝載體如pPK-CPX(即，抗性測試載體系統)的包裝宿主細胞的共轉染產生含有衣殼化的指示基因「前基因組」RNA的HBV病毒顆粒，由於反向內含子的拼接，它含有功能性指示基因(圖8B和8C)。
對生長在缺乏抗病毒藥物或逐漸增高的濃度的抗HBV藥物(如，HBV P蛋白逆轉錄酶或聚合酶抑制劑)時的一系列包裝宿主細胞培養物進行複製轉染。在存在或缺乏抗HBV藥物時生長包裝宿主細胞幾天後，可直接在寄主包裝細胞溶解物，或通過收穫寄主包裝細胞培養基得到的分離的HBV顆粒中可以評估藥物敏感性或抗性水平。可以利用其它的方法評估細胞溶解物和分離的HBV顆粒中的藥物敏感性和抗性。
在一個稱為一細胞測驗的實施方案中，通過測量存在或缺乏抗病毒藥物時，在轉染包裝宿主細胞中指示基因的表達如螢光素酶活性，評估藥物敏感性或抗性。與缺乏抗病毒試劑相比，存在給定抗病毒試劑，或試劑的聯合時觀察到的轉染細胞的螢光素酶活性的減弱通常以S形曲線與抗病毒試劑的濃度的對數值相關。
在第二個稱為兩細胞測試的實施方案中，通過測量分別用HBV顆粒或HBV顆粒DNA感染或轉染後的靶宿主細胞中指示基因，如螢光素酶活性的表達，評估藥物敏感性或抗性。將來自包裝宿主細胞的HBV病毒顆粒用於感染靶宿主細胞，或將來自這些顆粒的DNA用於轉染靶宿主細胞。在感染或轉染時，在細胞培養物中加入適當濃度的抗病毒藥物。在感染或轉染幾天後，溶解靶宿主細胞並測量指示基因的表達。在存在例如通過抑制HBV P蛋白質的逆轉錄酶(-鏈DNA)或DNA聚合酶活性抑制HBV複製的藥物，與缺乏藥物時進行的對照相比，可以觀察到轉染或感染的細胞中指示基因表達的減弱。
在第三個稱為DNA結構指示物測試的實施方案中，通過測量發生在轉染包裝宿主細胞或包裝宿主細胞產生的病毒顆粒內的HBV DNA複製的水平評估藥物敏感性或抗性。在轉染宿主細胞中，HBV亞基因組病毒載體被轉錄，並且該RNA轉錄物以「前基因組」RNA被包裝。在病毒成熟的過程中，前基因組RNA被轉換成由完全-鏈和部分+鏈DNA拷貝組成的基因組DNA的鬆弛圓環形式(rc-DNA)。在隨後的步驟中，rc-DNA被轉換成共價閉合圓環DNA形式(cccDNA)。為了測量HBV DNA複製，設計擴增引物以便擴增通過前基因組RNA的拼接和這一拼接的RNA轉換成rc-DNA和cccDNA形式而形成的HBV DNA結構。
在HBV顆粒內的正確的擴增靶結構的形成需要成功地完成導致rc-DNA和cccDNA的HBV DNA複製。抑制HBV DNA複製(逆轉錄和DNA聚合酶活性)的抗病毒藥物將限制DNA靶序列的形成，它本身作為擴增DNA產物的下降可利用許多定量擴增測試進行測量。在一個實施例中(圖10B)，通過以同樣於HBV序列的轉錄方向插入在指示基因ORF中的內含子序列將反向引物(Pr)的結合位點分離成兩部分。正向的引物(Pf)的引物結合位點定位於由DR2和DR1*序列側接的病毒載體的區域內。在線性HBV載體中，Pf和Pr引物以相反的方向指導DNA合成並相互方向向外。在這種情況下，Pr引物指導上遊方向的DNA的合成(朝著(ε)的5』拷貝)和Pf引物指導下遊方向的DNA合成(朝著3』(ε))。引物和模板的這種安排在線性指示基因病毒載體中不構成功能性擴增單位。另外，Pr結合位點在線性未拼接載體中是不完整的，所以Pr將不與靶DNA退火。相反，Pf和Pr引物在成熟病毒粒子中存在的HBV DNA的鬆弛圓環形式中具有相互向內的方向，並且RNA前基因組的拼接組裝了完整的Pr引物結合位點。兩個引物在rc-DNA的+鏈拷貝內和，在+鏈或-鏈和cccDNA二者之一中，朝著DR1的單個拷貝指導DNA的合成。這一引物和模板的安排構成了功能性擴增單位(圖10C)。
在DNA序列指示物測驗的可供選擇的實施方案(圖9D)中，測量了擴增酶(如Taq聚合酶)的5』外切核酸酶的活性而不是擴增DNA的生產(C.Heid等，1996，基因組研究6:986-994)。通過探測能夠與Pf和Pr結合位點側接的擴增DNA模板區結合的螢光標記的低聚核苷酸探針的核酸切割測量5』外切核酸酶的活性。這一測驗的進行依賴於上遊引物(Pf)的3』末端與低聚核苷酸探針的5』末端緊密相鄰。當Pf引物被延伸時，它替代低聚核苷酸探針的5』末端使該聚合酶的5』外切核酸酶活性切割了該低聚核苷酸探針。內含子的作用是使Pf結合位點與外切核酸酶探針序列的5』末端的距離足夠遠，以便基本上消除未拼接的靶模板中探針低聚核苷酸的可檢測的外切消化。通過拼接除去內含子的作用是將Pf結合位點的3』末端定位於緊接著探針5』結合位點的上遊。這一再安排能夠定量檢測擴增靶模板的外切活性(圖1E)。
藥物篩選利用含有具有反向內含子的非功能性指示基因盒的指示基因病毒載體和包裝載體進行藥物篩選。在轉染包裝宿主細胞中，指示基因病毒載體產生含有指示基因的可衣殼化的(ε+)RNA轉錄物。包裝載體反式提供抗性測試載體不提供的但病毒DNA複製和顆粒形成所必須的結構和/或酶病毒功能。在包裝宿主細胞共轉染之後，指示基因病毒載體和包裝載體產生含有衣殼化的指示基因病毒載體「前基因組」RNA的HBV病毒顆粒，由於反向內含子的拼接，它含有功能性指示基因。
如下進行藥物篩選利用指示基因病毒載體和包裝載體DNA轉染包裝宿主細胞。在缺乏或存在潛在的抗病毒化合物(如候選的HBV P蛋白質逆轉錄酶或聚合酶抑制劑)時生長的包裝宿主細胞培養物的系列中進行複製轉染。在存在或缺乏候選抗病毒藥物時生長包裝宿主細胞幾天後，直接在包裝宿主細胞的溶解物中，或在通過收穫寄主包裝細胞培養基而得到的分離的HBV顆粒中評估DNA複製的抑制水平。可以將如上所述的DNA檢測或指示基因活性方法用於評估潛在的抗HBV藥物候選物。
實施例8利用含有病人起源的區段和具有置換啟動子的非功能性指示基因的抗性測試載體的肝炎藥物敏感性和抗性測試指示基因病毒載體-構建方法利用含有抗病毒藥物的靶的病毒基因的HBV亞基因組病毒載體設計含有具有置換啟動子的非功能性指示基因的指示基因病毒載體。指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS-)是在亞基因組病毒載體pCS-HBV的基礎上的。指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS-)，含有具有置換啟動子的指示基因盒和所有HBV DNA複製所必須的順式作用的調節元件(即DR1,5』εDR2,DR1*,3』pA)，但缺乏提供HBV DNA複製和病毒顆粒形成所必須的反式作用結構和酶功能的HBV基因序列(即，C,P,S,X基因)(圖10B)。C,P和X和病人序列接受位點包含於包裝載體pPK-CPX(如實施例7所述，參見圖8D)。S基因包含於包裝載體pPK-S(如實施例7所述，參見圖8E)。在這一實施方案中，指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS-)和包裝載體pPK-CPX構成一個抗性測試載體系統。非功能性指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS-)，含有下面5』到3』方向的元件(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)HBV基因組的5』區和DR1和5』ε(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)組裝成使啟動子區定位於指示基因ORF的3』，即下遊，的非功能性指示基因盒，(4)含有DR2,DR1*,3』ε，和3』HBV pA信號區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)的HBV基因組的3』區。非功能性指示基因表達盒含有下面以5』到3』方向安排的一些或所有元件(1)內部核糖體進入位點(IRES),(2)可能含有反向內含子的指示基因，(3)轉錄多聚腺苷酸化信號序列(如HSV-1胸苷激酶基因，SV40)，(4)所增強子-啟動子區。在非功能性指示基因病毒載體中，指示基因表達盒具有與HBV序列元件相反或相同的轉錄方向。在指示基因ORF含有內含子的情況中，內含子具有與HBV相同的轉錄方向。
在第二個實施方案中，非功能性指示基因病毒載體含有具有置換啟動子區的非功能性指示基因盒，所有的HBV DNA複製所必須的順式作用調節元件，和一些或所有的提供HBV DNA複製和病毒顆粒形成所必須的反式激活作用結構和酶功能的HBV基因序列(即C,P,S,X基因)，pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS+)(圖10D)。起源於該指示基因病毒載體，pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS+)，的抗性測試載體含有病人序列接受位點並與包裝載體pPK-CSK一起使用(圖8H)。在這一實施方案中，指示基因病毒載體也可以提供一些或所有包裝功能。另外，在這一實施方案中，利用其它包裝載體提供了不由指示基因病毒載體提供，但是HBV DNA複製和病毒顆粒形成所必須的結構和酶活性。在這一實施方案中，非功能性指示基因病毒載體，pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS+)，在5』-3』方向含有下面的元件(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)HBV基因組的5』區和DR1和5』ε(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)增強子-啟動子區(置換啟動子)，(4)含有病人起源的區段的P基因，(5)指示基因ORF,(6)內部核糖體進入位點(IRES)，和(7)含有DR2,DR1*,3』ε和3』HBV pA信號區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)的HBV基因組的3』區。在非功能性指示基因病毒載體中，指示基因表達盒具有與HBV序列元件相反或相同的轉錄方向。在指示基因含有反向內含子的情況中，內含子具有與HBV序列元件相同的轉錄方向。
抗性測試載體-構建方法利用含有實施例8所述的抗病毒靶基因的HBV亞基因組病毒載體設計含有具有置換啟動子的非功能性指示基因的抗性測試載體。修飾指示基因病毒載體或包裝載體以便包括用於插入含有病人起源的區段(PDS)(實施例7所述，參見圖8D和8F)的P基因的病人序列接受位點(PSAS)。如實施例7所述刪除病人起源的S基因的表達(參見圖8D)。利用提供清楚表徵的S基因產物的分離的包裝載體反式提供的均一的S基因的表達(圖8E)。
藥物敏感性和抗性測試利用一種類型的宿主細胞或兩種類型的宿主細胞，利用基於指示基因表達載體pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS+)的抗性測試載體，或含有指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS-)和包裝載體pPK-CPX的抗性測試載體系統進行藥物敏感性和抗性測試。利用抗性測試載體和包裝載體或利用指示基因病毒載體和包裝載體(即抗性測試載體系統)，共轉染包裝宿主細胞的共轉染之後，產生的HBV病毒顆粒含有具有非功能性指示基因的衣殼化的指示基因「前基因組」RNA。在轉染宿主細胞內，具有顛換啟動子的非功能性指示基因在HBV複製過程中被轉換成功能性指示基因(圖10B和10C)。
如實施例7所述(上面)進行藥物敏感性和抗性測試。通過測量轉染或感染宿主細胞中指示基因表達的水平可以測量病人起源的逆轉錄酶和/或DNA聚合酶活性對各種抗病毒藥物的抗性或敏感性。或者，通過對已發生的HBV DNA複製進行定量可以測量抗性或敏感性。後者可利用定量DNA擴增測試來進行。在這一類型的測試的一個實施例中，(圖9F和9G)，將反向引物(Pr)的引物結合位點定位於5』ε的下遊區。將正向的引物(Pf)的引物結合位點定位於與DR2和DR1*序列側接的區域內。在線性HBV載體中，Pf和Pr引物指導相反方向的DNA合成。在這一情況中，Pr引物指導上遊方向的DNA合成(朝著5』ε)，Pf引物指導下遊方向的DNA的合成(朝著3』ε)。這一引物構型在用於轉染的病毒載體的線性拷貝中不構成功能性擴增單位。相反，Pf和Pr引物在成熟病毒粒子中存在的rc-DNA中具有相向的方向。兩個引物在rc-DNA的+鏈拷貝內引導朝向單拷貝DR1的DNA合成。引物和模板的這一安排構成了一個功能性擴增單位。
藥物篩選基本上如上面實施例7所述進行利用含有具有置換啟動子的非功能性指示基因的指示基因病毒載體的藥物篩選。
實施例9利用含有病人起源區段和具有置換啟動子和翻譯起始位點的非功能性指示基因的抗性測試載體的肝炎藥物敏感性和抗性測試指示基因病毒載體利用含有抗病毒藥物的靶的病毒基因的HBV亞基因組病毒載體設計含有具有置換啟動子和翻譯起始位點的非功能性指示基因的指示基因病毒載體，pCS-HBV(NF-IG)PPTIS。指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS-)是基於亞基因組病毒載體pCS-HBV的。該指示基因病毒載體含有具有置換啟動子和翻譯起始區的非功能性指示基因盒和所有HBV複製所必須的順式作用調節元件(即DR1,5』ε,DR2,DR1*,3』pA),但缺乏通過HBV DNA複製和病毒顆粒形成所必須的反式作用結構和酶功能的HBV基因序列(即，C,P,S,X基因)(圖11B)。C,P和X基因和病人序列接受位點包含在包裝載體pPK-CPX內(實施例7，圖8D)。S基因包含在包裝載體pPK-S內(實施例7，圖8E)。在這一實施方案中，指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS-)和包裝載體pPK-CPX構成一個抗性測試載體系統。非功能性指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS-)含有下面5』到3』方向的元件(1)CMVIE增強子-啟動子區，(2)包括DR1和5』ε的HBV的基因組的5』區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)缺乏翻譯起始位點的指示基因ORF,(4)增強子-啟動子區(置換啟動子)，(5)含有DR2，功能性前-C ORF翻譯起始密碼子，DR1*,3』ε，和3』HBV pA信號區的HBV基因組的3』區。非功能性指示基因盒由下面以5』到3』方向排列的一些或所有元件組成(1)不含有框架內翻譯起始位點的指示基因ORF,(2)轉錄多聚腺苷酸化信號序列(如HSV-1胸苷激酶基因SV40),(3)增強子-啟動子區。在非功能性指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS-)中，指示基因表達盒轉錄方向與HBV序列元件的相同。在指示基因ORF含有內含子的情況中，內含子具有與HBV序列元件相同的轉錄方向。
在第二個實施方案中，非功能性指示基因病毒載體含有具有置換啟動子和翻譯起始區的非功能性指示基因盒，所有HBV DNA複製所必須的順式作用調節元件，一些或所有提供HBV DNA複製和病毒顆粒形成所必須的反式激活作用結構和酶功能的HBV基因序列(即C,P,S,X基因)(pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS+)(圖11D)。利用其它包裝載體pPK-CSX(實施例7所述，參見圖8E)提供指示基因病毒載體不提供但是HBV DNA複製和病毒顆粒形成所必須的結構和酶活性。C,S和X包含在包裝載體pPK-CSX(實施例7所述，參見圖8H)內。在這一實施方案中，非功能性指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS+)含有下面5』到3』方向的元件(圖11D)(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)包括DR1和5』ε的HBV基因組的5』區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)缺乏翻譯起始位點的指示基因ORF，(4)含有病人起源的區段的P基因，(5)增強子-啟動子區(置換啟動子)，(6)含有DR2，前-C ORF翻譯起始密碼子，DR1*,3』ε，和3』HBVpA信號區的HBV基因組的3』區。在非功能性指示基因病毒載體內，指示基因表達盒具有與HBV序列元件相同的轉錄方向。在指示基因含有反向內含子的情況中，內含子的轉錄方向與HBV序列元件的相同。
抗性測試載體-構建方法利用含有實施例7中所述的抗病毒靶基因的HBV亞基因組病毒載體設計含有具有置換啟動子的非功能性指示基因的抗性測試載體。修飾指示基因病毒載體和包裝載體以使其包括用於含有病人起源的區段(PDS)的P基因的插入的病人序列接受位點(PSAS)(實施例7所述，參見圖8D和8F)。如實施例7所述刪除了病人起源的S基因的表達(參見圖8D)。利用提供已清楚表徵的S基因產物的分開的包裝載體反式提供均一的S基因的表達(圖8E)。
藥物敏感性和抗性測試通過實施例7和8所述的方法進行藥物敏感性和抗性測試。在HBV複製過程中非功能性指示基因被轉換成功能性指示基因(圖11B和11C)。
藥物篩選基本上如實施例7和8(上面)所述進行利用含有具有置換啟動子和翻譯起始區的非功能性指示基因的指示基因病毒載體的藥物篩選。
實施例10利用含有病人起源的區段和具有置換編碼區的非功能性指示基因的抗性測試載體的肝炎藥物敏感性和抗性測試指示基因病毒載體-利用含有抗病毒藥物的靶的病毒基因的HBV亞基因組病毒載體設計含有具有置換編碼區的非功能性指示基因的指示基因病毒載體。指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PCR(PSAS-)的基礎是亞基因組病毒載體pCS-HBV。指示基因病毒載體含有具有置換編碼區的非功能性指示基因盒，和所有HBV DNA複製所必須的順式作用調節元件(即DR1,5』ε,DR2,DR1*,3』pA)，但缺乏提供HBV DNA複製和病毒顆粒形成所必須的反式作用結構和酶功能的HBV基因序列(即C,P,S,X基因)(圖12B)。C,P和X基因和病人序列接受位點包含在包裝載體，pPK-CPX內，S基因是由包裝載體pPK-S提供的(實施例7所述，參見圖8D和8E)。在這一實施方案中，指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PCR(PSAS-)和包裝載體pPK-CPX構成一個抗性測試載體系統。非功能性指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PCR(PSAS-)含有下面5』到3』方向的元件(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)包括DR1和5』ε的HBV基因組的5』區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)其組裝使啟動子區和編碼區的5』部分定位於餘下的編碼區的3』部分的3』，即下遊，的非功能性指示基因盒，(4)含有DR2,DR1*,3』ε，和3』HBV pA信號區的HBV基因組的3』區(刪除了前-C ORF的翻譯起始密碼子)。非功能性指示基因盒是由下面以5』到3』方向安排的一些或全部元件組成的(1)終止於拼接受體序列中的內含子的3』區，(2)指示(報導)ORF或可選擇的標記ORF的3』區，(3)轉錄多聚腺苷酸化信號序列(如HSV-1胸苷激酶基因，SV40),(4)增強子-啟動子區，(5)指示基因ORF的5』區，(6)開始於拼接供體序列的內含子的5』區。在非功能性指示基因病毒載體內，指示基因表達盒的轉錄方向與HBV序列元件的相同或相反。在指示基因ORF含有內含子的情況中，內含子的定向與HBV序列元件的相同。
在第二個實施方案中，非功能性指示基因病毒載體含有具有置換編碼區的非功能性指示基因盒，所有HBV DNA複製所必須的順式作用的調節元件，和一些或全部提供HBV DNA複製和病毒顆粒形成所必須的反式激活作用結構和酶功能的HBV基因序列(即C,P,S,X基因)pCS-HBV(NF-IG)PCR(PSAS+)(圖12D)。起源於指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PCR(PSAS+)的抗性測試載體含有病人序列接受位點(PSAS)並與包裝載體pPK-CSK一起使用(實施例7所述，參見圖8H)。在這一實施方案中，指示基因病毒載體也可以提供一些或所有包裝功能。在這一實施方案中，利用其它包裝載體提供了指示基因病毒載體不提供，但是HBV DNA複製和病毒顆粒形成所必須的結構和酶活性。在這一實施方案中，非功能性指示基因病毒載體含有下面5』到3』方向的元件(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)緊接著前-C ORF翻譯起始密碼子下遊和DR1和5』ε的HBV基因組的區，(3)含有可能含有一些或全部C,P,S，和X基因的HBV基因組的區域的指示基因盒，(4)含有DR2,DR1*,3』ε,3』HBV pA信號區的HBV基因組的區(刪除了前-C ORF起始密碼子)。在非功能性指示基因病毒載體pCS-HBV(NF-IG)PCR(PSAS+)內，指示基因表達盒具有與HBV序列元件相同或相反的轉錄方向。在指示基因含有反向內含子的情況中，內含子的方向與HBV序列元件相同。
抗性測試載體-構建方法如實施例7所述，利用含有抗病毒靶基因的HBV亞基因組病毒載體設計含有具有置換編碼區的非功能性指示基因的抗性測試載體。修飾指示基因病毒載體或包裝載體以使其包括用於含有病人起源的區段(PDS)的P基因的插入的病人序列接受位點(PSAS)(實施例7所述，參見圖8D和8F)。如實施例7所述刪除了病人起源的S基因的表達(參見圖8D)。利用提供已清楚表徵的S基因產物的分開的包裝載體反式提供均一的S基因的表達(圖8E)。
藥物敏感性和抗性測試通過實施例7和8所述的過程進行藥物敏感性和抗性測試。在HBV複製過程中非功能性指示基因被轉換成功能性指示基因(圖12B和12C)。
藥物篩選基本上如實施例7和8(上面)所述進行利用含有具有置換啟動子和翻譯起始區的非功能性指示基因的指示基因病毒載體的藥物篩選。
實施例11利用含有病人起源的區段和功能性指示基因的抗性測試載體的肝炎藥物敏感性和抗性測試指示基因病毒載體-構建方法利用含有抗病毒藥物靶的病毒基因的HBV亞基因組病毒載體設計含有功能性指示基因的指示基因病毒載體。指示基因病毒載體pCS-HBV(F-1G)(PSAS-)是基於亞基因組病毒載體pCS-HBV的。指示基因病毒載體pCS-HBV(F-IG)(PSAS-)含有功能性指示基因盒和所有HBV DNA複製所必須的順式作用調節元件(即DR1,5』εDR2,DR1*,3』pA)，但缺乏提供HBV DNA複製和病毒顆粒形成所必須的反式作用結構和酶功能的HBV基因序列(即C,P,S,X基因)(圖14B)。C,P和X基因和病人序列接受位點包含在包裝載體pPK-CPX和S基因包含在包裝載體pPK-S內(如下所述，參見圖8D和8E)。在這一實施方案中，指示基因病毒載體pC-HBV(F-IG)(PSAS-)和包裝載體pPK-CPX構成一個抗性測試載體系統。功能性指示基因病毒載體pCS-HBV(F-IG)(PSAS-)含有下面5』到3』方向的元件(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)包括DR1和5』ε的HBV基因組的5』區(刪除了前-C ORF翻譯起始密碼子)，(3)功能性指示基因盒，(4)含有DR2,DR1*,3』ε，和3』HBVpA信號區的HBV基因組的3』區(刪除了前-C ORF的翻譯起始密碼子)。指示基因表達盒由一些或所有下面5』到3』方向安排的元件組成(1)轉錄增強子-啟動子區，(2)內含子，(3)指示基因ORF或選擇性標記基因ORF，(4)轉錄多聚腺苷酸化信號序列(如SV40)或未定向的(HSV-1胸苷激酶基因)。指示基因表達盒具有與HBV序列元件相同或相反的轉錄方向。
在第二個實施方案中，指示基因病毒載體含有功能性指示基因盒，所有HBV DNA複製所必須的順式作用調節元件，提供HBV DNA複製和病毒顆粒形成所必須的反式作用結構和酶功能的HBV基因序列(即C,P,S,X基因)pCSHBV(F-IG)(PSAS+)(圖13D)。起源於指示基因病毒載體pCS-HBV(F-IG)(PSAS+)的抗性測試載體含有病人序列接受位點(PSAS)並與包裝載體pPK-CSK)一起使用。在這一實施方案中，指示基因病毒載體也提供一些或全部包裝功能。利用其它包裝載體pPK-CSX(實施例7所述，參見圖8H)提供指示基因病毒載體不提供但是HBV DNA複製和病毒顆粒形成所必須的結構和酶活性。在這一實施方案中，功能指示基因病毒載體含有下面5』到3』方向的元件(1)CMV IE增強子-啟動子區，(2)緊接著前-C ORF翻譯起始密碼子，和DR1和5』ε的下遊的HBV基因組的區，(3)含有一些或全部C,P,S，和X基因的HBV基因組的區域內的功能性指示基因盒，(4)含有DR2,DR1*,3』ε和3』HBVpA信號區的HBV基因組的區。在指示基因病毒載體內，指示基因表達盒基因與HBV序列元件相反或相同的轉錄方向。
抗性測試載體-構建方法利用含有實施例7所述的抗病毒靶基因的HBV亞基因組病毒載體設計含有具有置換啟動子的非功能性指示基因的抗性測試載體。修飾指示基因病毒載體或包裝載體以使其包括用於含有病人起源的區段的P基因的插入的病人序列接受位點(PSAS)(實施例7所述，參見圖8D和8F)。如實施例7所述刪除了病人起源的S基因的表達(參見圖8D)。利用提供已清楚表徵的S基因產物的分開的包裝載體反式提供均一的S基因的表達(圖8E)。
藥物敏感性和抗性測試利用功能性指示基因病毒載體pCS-HBV(F-IG)(PSAS+)基礎上的抗性測試載體或指示基因病毒載體pCS-HBV(F-IG)(PSAS-)和包裝載體基礎上的抗性測試載體系統進行藥物敏感性和抗性測試。在轉染包裝宿主細胞中，指示基因病毒載體產生含有功能性指示基因盒的可衣殼化的(ε+)RNA轉錄物。包裝載體反式提供功能性指示基因病毒載體不提供但是病毒DNA複製和顆粒形成必須的結構和/或酶病毒功能。在包裝宿主細胞共轉染之後，指示基因病毒載體和包裝載體能夠形成含有具有功能性指示基因盒的衣殼化的指示基因病毒載體「前基因組」RNA的HBV顆粒。
在這一實施例中，指示基因病毒載體含有功能性指示基因盒，所以能在缺乏HBV DNA的複製時在轉染細胞中產生指示基因活性(圖13)。在功能性指示基因的情況中，通過收穫包裝宿主細胞中產生的病毒顆粒和利用該顆粒(或顆粒DNA)感染(或轉染)靶宿主細胞可以評估藥物對HBV DNA複製的抑制。或者，通過利用DNA作為指示物可以在從包裝宿主細胞分離的病毒顆粒中直接測量DNA複製。抑制HBV DNA複製的藥物將減弱含有「成熟」rc-DNA形式的功能性指示基因病毒載體的病毒顆粒的形成。結果是，在感染/轉染過程中功能性指示基因將不能有效地轉移到靶宿主細胞中，這些細胞中指示基因病毒載體cccDNA的量和指示基因活性將減少。如實施例7所述進行了兩細胞測試中靶宿主細胞中指示基因表達的檢測。如實施例8所述和圖9F和9G圖解，利用DNA作為指示物進行了病毒顆粒中rc-DNA的檢測。
藥物篩選基本上如實施例7和8所述(上面)進行了利用含有具有置換啟動子和翻譯起始區的非功能性指示基因的指示基因病毒載體的藥物篩選。低聚核苷酸1)5′-AGTGAATTAGCCCTTCCACCCGGGTCGAGCTTGGCGTAATCA-3′(42-mer) (SEQ ID NO:1)2)5′-CTGTTGGGAAGGGCGATCTCTAGATGCTAGAGATTTTCCACA-3′(42-mer) (SEQ ID NO:2)3)5′-CTCCTCCTCCAAGTCTGAGCGGCCGCCTTTAGCATCTGATGCAC-3′(44-mer) (SEQ ID NO:3)4)5′-CTCCTCCTCCAAGTCTGAGCGGCCGCCATATGGTGTTTTACTAA-3′(44-mer) (SEQ ID NO:4)5)5′-GGTCTAACCAGAGAGACCCGGTTCACTAAACGAGCT-3′(36-mer) (SEQ ID NO:5)6)5′-GAATTCGCGGCCGCAATTCCGCCCCTCTCCCT-3′(32-mer) (SEQ ID NO:6)7)5′-GTTAACGCGGCCGCGATATAGTTCCTCCTTTC-3′(32-mer) (SEQ ID NO:7)8)5′-GAATTCTCGCGACCATGGAAGACGCCAAAAAC-3′(32-mer) (SEQ ID NO:8)9)5′-GTTAACAGATCTCTCGAGTTACAATTTGGACTTTCC-3′(36-mer) (SEQ ID NO:9)10)5′-AGACGGGCACACACTACTTAATACGACTCACTATAGGGTGAAGCACTCAAGGCAAG-3′(56-mer) (SEQ ID NO:10)11)5′-AAGAGTGACCTGAGGGAAGTTAACGGATACAGTTCCTTGTCT-3′(42-mer) (SEQ ID NO:11)12)5′-TCCAGCACTGACTAATTTGTCGACTTGTTCATTTCCTCCAAT-3′(42-mer) (SEQ ID NO:12)13)5′-TAACGCCTATTCTGCTATGCCGACACCCAATTCTGAAAATGG-3′(42-mer) (SEQ ID 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NO:1的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度42個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:1:AGTGAATTAG CCCTTCCACC CGGGTCGAGC TTGGCGTAAT CA42(2)SEQ ID NO:2的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度44個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:2:CTGTTGGGAA GGGCGATCTC TAGATGCTAG AGATTTTCCA CA42(2)SEQ ID NO:3的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度44個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:3:CTCCTCCTCC AAGTCTGAGC GGCCGCCTTT AGCATCTGAT GCAC(2)SEQ ID NO:4的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度44個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:4:CTCCTCCTCC AAGTCTGAGC GGCCGCCATA TGGTGTTTTA CTAA 44(2)SEQ ID NO:5的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度36個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:5:GGTCTAACCA GAGAGACCCG GTTCACTAAA CGAGCT36(2)SEQ ID NO:6的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:6:GAATTCGCGG CCGCAATTCC GCCCCTCTCC CT32(2)SEQ ID NO:7的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:7:GTTAACGCGG CCGCGATATA GTTCCTCCTT TC32(2)SEQ ID 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NO:15的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度42個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:15:CTAAAAATAG TACTTTCCGG ATCCCAGCAC TGACTAATTT AT42(2)SEQ ID NO:16的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度42個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:16:TTAGCTCCTT CGGTCCTCCA ATCGTTGTCA GAAGTAAGTT GG42(2)SEQ ID NO:17的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度42個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:17:GTCCCAGATA AGTGCCAAGG ATTCGTTCAC TAATCGAATG GA42(2)SEQ ID NO:18的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:18GAATTCGTTA ACTTCCCTCA GATCACTCTT TGG33(2)SEQ ID NO:19的資料:
(Ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:19:GTTAACGTCG ACTTGTTCAT TTCCTCCAAT30(2)SEQ ID NO:20的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度55個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:20:GAATTCCGAT CGACAAGGAA CTGTATCCTT TAACTTCCCT CAGATCACTCTTTGG 55(2)SEQ ID NO:21的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度52個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性
(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:21:GTTAACGGAT CCCAGCACTG ACTAATTTAT CTACTTGTTC ATTTCCTCCA AT52(2)SEQ ID NO:22的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:22:GAATTCGTTA ACTTCCCTCA RATCMCTCTT TGG33(2)SEQ ID NO:23的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:23:GTTAACGTCG ACTTKYTCAT TTCCTCCWAT30(2)SEQ ID NO:24的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度55個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性
(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:24:GAATTCCGAT CGACAAGGAA CTGTATCCTT TAACTTCCCT CARATCMCTCTTTGG 55(2)SEQ ID NO:25的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度52個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:25:GTTAACGGAT CCCAGCACTG ACTAATTTAT CTACTTKYTC ATTTCCTCCW AT52(2)SEQ ID NO:26的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度36個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:26:ATCTCTTACC TGTCCTATCT AACAGGCCAG GATTAA36(2)SEQ ID NO:27的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度35個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性
(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:27:GAATTCTCGC GACCACCATG GCGCGTTCAA CGCTC(2)SEQ ID NO:28的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:28:GTTAACAGAT CTTCATGGCT CGTACTCTAT30(2)SEQ ID NO:29的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度72個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:29GAATTCGCGC GCAAGCGGCC GCAACCCGGG AAAAGCTTAA GCATGCAACCCGGGAAGAAT TCAATCGCGA AA 72(2)SEQ ID NO:30的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度72個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈
(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:30:GTTAACGCGC GCTTCTCGAG TTGCGGCCGC TTGCTAGCTT AGATCTTTGGGCCCTTTCGC GATTGAATTC TT 72(2)SEQ ID NO:31的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:31:GAATTCAAGC TTGGCCATTG CATACGTTGT30(2)SEQ ID NO:32的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:32:GTTAACGCAT GCATAAGAAG CCAA24(2)SEQ ID NO:33的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈
(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:33:GAATTCGCAT GCTCCCCTGC TCCGACCCGG30(2)SEQ ID NO:34的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:34:GTTAACGAAT TCTCCTGCGG GGAGAAGCAG30(2)SEQ ID NO:35的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:35:GAATTCAGAT CTGCCATACC ACATTTGTAG30(2)SEQ ID NO:36的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈
(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:36:GTTAACGCTA GCTCCAGACA TGATAAGATA30(2)SEQ ID NO:37的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:37:GAATTCGCTA GCATCCCGCC CCTAACTCCG30(2)SEQ ID NO:38的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:38:GTTAACGTCG ACGCAAAAGC CTAGGCCTCC30(2)SEQ ID NO:39的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈
(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:39:GAATTCTCGC GAACAGTTGG CCCT24(2)SEQ ID NO:40的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:40:GTTAACTGAT CTTTACGCGA ACGCGAAGTC30(2)SEQ ID NO:41的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度66個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:41:GTTAACGAAT TCTTGCAAAA AGCTTTGCAA GATGGATAAA GTTTTTAGAAACTCCAGTAG GACTCC 60(2)SEQ ID NO:42的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度63個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈
(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:42:GAATTCTCGC GATCTAGACG TTCTACCTTT CTCTTCTTTT TTGGAGGAGTCCTACTGGAG TTT 63(2)SEQ ID NO:43的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度35個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:43:GTTAACGAAT TCCCACCATG ATTGAACAAG ATGGA35(2)SEQ ID NO:44的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:44:GAATTCAGAT CTTCAGAAGA ACTCGTCAAG30(2)SEQ ID NO:45的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈
(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:45:CCCCGTGCCA AGAGTGACTA CGTAAGTACCGCCTATAGA39(2)SEQ ID NO:46的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:46:CTCTGCTTCT CCCCGCAGCT GGAGAATTCA ATCGCGAAA39(2)SEQ ID NO:47的資料(Ⅰ)序列特徵(A)長度35個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈數單鏈(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:47:GTTAACGAAT TCCCACCATG AACACGATTA ACATC3權利要求
1．一種用於確定抗病毒藥物的敏感性的方法，包括(a)在宿主細胞中導入含有病人起源的區段和指示基因的抗性測試載體；(b)培養來自(a)的宿主細胞；(c)測量靶宿主細胞中指示基因的表達；(d)將來自(c)的指示基因的表達與在缺乏抗病毒藥物時進行步驟(a)到(c)時測量的指示基因的表達比較，其中抗病毒藥物以測試濃度存在於步驟(a)到(c)；步驟(b)到(c)；或步驟(c)。
2．根據權利要求1所述的方法，其中抗性測試載體包括基因組病毒載體的DNA。
3．根據權利要求1所述的方法，其中抗性測試載體包括亞基因組病毒載體的DNA。
4．根據權利要求1所述的方法，其中抗性測試載體包括逆病毒的DNA。
5．根據權利要求1所述的方法，其中抗性測試載體包括HIV的DNA。
6．根據權利要求1所述的方法，其中抗性測試載體包括編碼vif,vpr,tat,rev,vpu，和nef的DNA。
7．根據權利要求1所述的方法，其中病人起源的區段包括功能性病毒序列。
8．根據權利要求1所述的方法，其中病人起源的區段編碼一種為抗病毒藥物的靶的蛋白質。
9．根據權利要求1所述的方法，其中病人起源的區段編碼兩種或多種為抗病毒藥物的靶的蛋白質。
10．根據權利要求1所述的方法，其中病人起源的區段包括逆病毒基因。
11．根據權利要求1所述的方法，其中病人起源的區段包括HIV基因。
12．根據權利要求1所述的方法，其中病人起源的區段包括HIVgag-pol基因。
13．根據權利要求1所述的方法，其中指示基因是功能性指示基因，宿主細胞是抗性測試載體宿主細胞，包括另外一個利用來自所述的抗性測試載體宿主細胞的過濾上清液的抗性測試載體病毒顆粒感染靶宿主細胞的步驟。
14．根據權利要求1所述的方法，其中指示基因是非功能性指示基因。
15．根據權利要求14所述的方法，其中宿主細胞是包裝宿主細胞/抗性測試載體宿主細胞。
16．根據權利要求15所述的方法，其中通過共培養進行培養。
17．根據權利要求15所述的方法，其中靶宿主細胞是利用來自所述的包裝宿主細胞/抗性測試載體宿主細胞的抗性測試載體病毒顆粒感染的。
18．根據權利要求1所述的方法，其中指示基因是螢光素酶基因。
19．根據權利要求1所述的方法，其中指示基因是大腸桿菌lacZ基因。
20．根據權利要求15所述的方法，其中包裝宿主細胞/抗性測試載體宿主細胞是人細胞。
21．根據權利要求15所述的方法，其中包裝宿主細胞/抗性測試載體宿主細胞是人胚胎腎細胞。
22．根據權利要求15所述的方法，其中包裝宿主細胞/抗性測試載體宿主細胞是293細胞。
23．根據權利要求1所述的方法，其中靶宿主細胞是人T細胞。
24．根據權利要求1所述的方法，其中靶宿主細胞是人T細胞白血病細胞系。
25．根據權利要求1所述的方法，其中靶宿主細胞是Jurkat細胞系。
26．根據權利要求1所述的方法，其中靶宿主細胞是H9細胞系。
27．根據權利要求1所述的方法，其中靶宿主細胞是CEM細胞系。
28．一種含有病人起源區段和指示基因的抗性測試載體。
29．根據權利要求28所述的抗性測試載體，其中病人起源的區段是一個基因。
30．根據權利要求28所述的抗性測試載體，其中病人起源的區段是兩個或更多個基因。
31．根據權利要求28所述的抗性測試載體，其中病人起源的區段包括逆病毒基因。
32．根據權利要求28所述的抗性測試載體，其中病人起源的區段包括HIV基因。
33．根據權利要求28所述的抗性測試載體，其中病人起源的區段包括HIVgag-pol基因。
34．根據權利要求28所述的抗性測試載體，其中指示基因是功能性指示基因。
35．根據權利要求28所述的抗性測試載體，其中指示基因是非功能性指示基因。
36．根據權利要求28所述的抗性測試載體，其中指示基因是螢光素酶基因。
37．一種用抗性測試載體轉染的包裝宿主細胞。
38．根據權利要求37所述的包裝宿主細胞哺乳動物宿主細胞。
39．根據權利要求37所述的包裝宿主細胞是人宿主細胞。
40．根據權利要求37所述的包裝宿主細胞是人胚胎腎細胞。
41．根據權利要求37所述的包裝宿主細胞是293細胞。
42．根據權利要求37所述的包裝宿主細胞是人肝癌細胞系。
43．根據權利要求37所述的包裝宿主細胞是HepG2。
44．根據權利要求37所述的包裝宿主細胞是Huh7。
45．一種用於確定抗病毒藥物的敏感性的方法，包括(a)在宿主細胞中導入含有病人起源區段和非功能性指示基因的抗性測試載體；(b)培養來自(a)的宿主細胞；(c)測量靶宿主細胞中指示基因的表達；和(d)比較來自(c)的指示基因的表達與當缺乏抗病毒藥物時進行步驟(a)到(c)時測量的指示基因的表達，其中抗病毒藥物以測試濃度存在於步驟(a)到(c)；步驟(b)到(c)；或步驟(c)。
46．根據權利要求45所述的方法，其中抗性測試載體包括基因組病毒載體的DNA。
47．根據權利要求45所述的方法，其中抗性測試載體包括亞基因組病毒載體的DNA。
48．根據權利要求45所述的方法，其中抗性測試載體包括逆病毒的DNA。
49．根據權利要求45所述的方法，其中抗性測試載體包括HIV的DNA。
50．根據權利要求45所述的方法，其中抗性測試載體包括編碼vif,vpr,tat,rev,vpu和nef的DNA。
51．根據權利要求45所述的方法，其中病人起源的區段編碼一種蛋白質。
52．根據權利要求45所述的方法，其中病人起源的區段編碼兩種或多種蛋白質。
53．根據權利要求45所述的方法，其中病人起源的區段包括逆病毒基因。
54．根據權利要求45所述的方法，其中病人起源的區段包括HIV基因。
55．根據權利要求45所述的方法，其中病人起源的區段包括HIVgag-pol基因。
56．根據權利要求45所述的方法，其中指示基因是螢光素酶基因。
57．根據權利要求45所述的方法，其中宿主細胞是包裝宿主細胞。
58．根據權利要求45所述的方法，其中包裝宿主細胞是人細胞。
59．根據權利要求45所述的方法，其中包裝宿主細胞是人胚胎腎細胞。
60．根據權利要求45所述的方法，其中包裝宿主細胞是293細胞。
61．根據權利要求45所述的包裝宿主細胞是人肝癌細胞系。
62．根據權利要求45所述的包裝宿主細胞是HepG2。
63．根據權利要求45所述的包裝宿主細胞是Huh7。
64．根據權利要求45所述的方法，其中非功能性指示基因包括置換啟動子。
65．根據權利要求45所述的方法，其中非功能性指示基因包括置換編碼區。
66．根據權利要求45所述的方法，其中非功能性指示基因包括反向內含子。
67．根據權利要求45所述的方法，其中宿主細胞和靶細胞是同樣的細胞。
68．根據權利要求45所述的方法，其中靶細胞是人細胞。
69．根據權利要求45所述的方法，其中靶細胞是人T細胞。
70．根據權利要求57所述的方法，其中靶宿主細胞是利用來自所述的包裝宿主細胞/抗性測試載體宿主細胞的過濾上清液的抗性測試載體病毒顆粒感染的。
71．根據權利要求57所述的方法，其中所述的培養是通過共培養進行的。
72．一種確定病人的抗病毒藥物抗性的方法，包括(a)作出對抗病毒藥物的藥物敏感性的標準曲線；(b)根據權利要求1所述的方法，確定病人的抗病毒藥物敏感性；和(c)比較步驟(b)中的抗病毒藥物敏感性與步驟(a)中確定的標準曲線，其中抗病毒敏感性的下降表明了病人抗病毒藥物抗性的產生。
73．一種確定病人抗病毒藥物抗性的方法，包括(a)作出抗病毒藥物的藥物敏感性的標準曲線；(b)根據權利要求45的方法確定病人的抗病毒藥物敏感性；和(c)比較步驟(b)中的抗病毒藥物敏感性與步驟(a)中確定的標準曲線，其中抗病毒敏感性的下降表明病人產生了抗病毒藥物抗性。
74．一種確定病人的抗病毒藥物抗性的方法，包括(a)根據權利要求1所述的方法在第一個時間確定病人的抗病毒藥物敏感性，其中病人起源的區段是在大約所述的時間從病人獲得的；(b)在後一個時間確定同一個病人的抗病毒藥物敏感性；和(c)比較步驟(a)和(b)確定的抗病毒藥物敏感性，其中與第一個時間比較後一個時間抗病毒藥物敏感性下降，表明病人產生或增加了抗病毒藥物抗性。
75．一種確定病人的抗病毒藥物抗性的方法，包括(a)根據權利要求45所述的方法在第一個時間確定病人的抗病毒藥物敏感性，其中病人起源的區段是在大約所述時間從病人得到；(b)在後一個時間確定同一個病人的抗病毒藥物敏感性；和(c)比較步驟(a)和(b)中確定的抗病毒藥物敏感性，其中與第一個時間比較後一個時間的抗病毒藥物敏感性的下降表明病人產生或增加了抗病毒藥物敏感性。
76．根據權利要求1所述的方法，其中抗性測試載體包括嗜肝DNA病毒的DNA。
77．根據權利要求1所述的方法，其中抗性測試載體包括HBV的DNA。
78．根據權利要求1所述的方法，其中抗性測試載體包括編碼C,P,和X的DNA。
79．根據權利要求1所述的方法，其中病人起源區段包括P基因。
80．根據權利要求1所述的方法，其中病人起源區段包括HBV基因。
81．根據權利要求1所述的方法，其中病人起源的區段包括HBVRT基因。
82．根據權利要求1所述的方法，其中病人起源的區段包括HBV DNA聚合酶基因。
83．根據權利要求28所述的抗性測試載體，包括指示基因病毒載體和包裝載體，所述的指示基因病毒載體含有指示基因和所述的包裝載體含有病人起源區段。
84．根據權利要求28所述的抗性測試載體，其中病人起源的區段包括嗜肝DNA病毒基因。
85．根據權利要求28所述的抗性測試載體，其中病人起源的區段包括HBV基因。
86．根據權利要求28所述的抗性測試載體，其中病人起源區段包括HBV P基因。
87．根據權利要求28所述的抗性測試載體，其中病人起源區段包括RT/DNA聚合酶基因。
88．一種評估候選抗病毒藥物化合物的生物學效力的方法包括(a)在宿主細胞中導入含有病人起源區段和指示基因的抗性測試載體；(b)培養來自步驟(a)的宿主細胞；(c)測量靶宿主細胞中指示基因的表達；(d)比較來自步驟(c)的指示基因的表達與當缺乏候選抗病毒藥物化合物時進行的步驟(a)到(c)時測量的指示基因的表達，其中測試濃度的候選抗病毒藥物化合物存在於步驟(a)到(c)；步驟(b)到(c)；或步驟(c)。
89．根據權利要求88所述的方法，其中抗性測試載體包括逆病毒的DNA。
90．根據權利要求88所述的方法，其中抗性測試載體包括HIV的DNA。
91．根據權利要求88所述的方法，其中抗性測試載體包括嗜肝DNA病毒的DNA。
92．根據權利要求88所述的方法，其中抗性測試載體包括HBV的DNA。
93．根據權利要求88所述的方法，其中抗性測試載體包括編碼HIVgag-pol的DNA。
94．根據權利要求88所述的方法，其中抗性測試載體包括編碼HBV P蛋白質的DNA。
95．根據權利要求88所述的方法，其中病人起源的區段編碼一種蛋白質。
96．根據權利要求88所述的方法，其中病人起源的區段包括兩種或更多種蛋白質。
97．根據權利要求88所述的方法，其中病人起源的區段包括逆病毒基因。
98．根據權利要求88所述的方法，其中病人起源的區段包括HIV基因。
99．根據權利要求88所述的方法，其中病人起源的區段包括嗜肝DNA病毒基因。
100．根據權利要求88所述的方法，其中病人起源的區段包括HBV基因。
101．一種確定抗病毒藥物敏感性的方法，包括(a)在宿主細胞中導入含有病人起源區段和指示物的抗性測試載體；(b)培養來自(a)的宿主細胞；(c)測量靶宿主細胞中的指示物；和(d)比較來自(c)的指示物的測量結果與當缺乏抗病毒藥物時進行的步驟(a)到(c)時指示物的測量結果，其中測試濃度的抗病毒藥物存在於步驟(a)到(c)；步驟(b)到(c)；或步驟(c)。
102．根據權利要求101所述的方法，其中指示物包括DNA結構。
103．根據權利要求101所述的方法，其中指示物包括RNA結構。
104．一種評估候選抗病毒藥物化合物的生物學效力的方法，包括(a)在宿主細胞中導入含有病人起源區段和指示物的抗性測試載體；(b)培養來自步驟(a)的宿主細胞；(c)測量靶宿主細胞中的指示物；和(d)比較來自步驟(c)的指示物的測量結果與當缺乏候選抗病毒藥物化合物時進行步驟(a)到(c)時指示物的測量結果，其中測試濃度的候選抗病毒藥物化合物存在於步驟(a)到(c)；步驟(b)到(c)；或步驟(c)。
105．根據權利要求104所述的方法，其中指示物包括DNA結構。
106．根據權利要求105所述的方法，其中指示物包括RNA結構。
全文摘要
本發明提供了確定抗病毒藥物的敏感性的方法,包括:(a)將含有來源於病人的區段和指示基因的抗性測試載體導入宿主細胞;(b)培養來自(a)的宿主細胞;(c)測量靶宿主細胞中指示基因的表達;和(d)將來自(c)的指示基因的表達與當缺乏抗病毒藥物時進行步驟(a)－(c)時測量的指示基因的表達進行比較,其中抗病毒藥物以測試濃度存在於步驟(a)－(c);步驟(b)－(c);或步驟(c)。本發明同時提供了確定病人的抗病毒藥物抗性的方法。本發明也提供了對候選的抗病毒藥物化合物的生物學效力進行評估的方法。提供了含有包括來源於病人的區段和指示基因的抗性測試載體的組合物和抗性測試載體轉化的宿主細胞。
文檔編號G01N33/50GK1213407SQ97192932
公開日1999年4月7日 申請日期1997年1月29日 優先權日1996年1月29日
發明者丹尼爾·J·卡彭, 克裡斯託·約翰·彼得羅普洛斯 申請人:病毒科學公司