Rip5基因及其用途的製作方法

2023-10-05 19:46:59

專利名稱：Rip5基因及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一個能誘導細胞調亡的新基因RIP5、該基因編碼的蛋白序列及其在篩選治療或預防癌症藥物的用途。
背景技術：
1972年Kerr等人首次發現存在著細胞凋亡這種有別於壞死的現象，其後三十多年的研究使人們認識到了細胞的這種「自殺」行為的廣泛的生理學意義。細胞是否在正確的時間和地點啟動清除自己的機制，這與機體各個系統的正常發育和各個器官生理功能的正確實行息息相關；一旦這種機制發生異常，就將引起包括癌症、自身免疫疾病和神經退行性疾病等等多種病症。目前，研究能夠誘導腫瘤細胞發生細胞凋亡或者能夠抑制腫瘤細胞內拮抗細胞凋亡分子活性的新的藥物，已經成為癌症治療研究的一個新的熱點。
目前發現的細胞凋亡類型包括以下幾種1.caspase依賴性的細胞凋亡caspase依賴性的細胞凋亡的信號途徑中有caspase蛋白酶的參與。
在哺乳動物中，caspase依賴性的細胞凋亡主要有兩條信號通路由TNF家族的死亡受體誘導起始的性細胞凋亡信號轉導途徑和內源性細胞凋亡信號轉導途徑，即線粒體接受到細胞內部或者外部的信號後，線粒體的外膜上打開向細胞質中釋放出一些凋亡相關因子，引起細胞發生凋亡。
2.caspase非依賴性的細胞凋亡Apoptosis inducing factor(AIF)是在1999年首先被克隆的第一個由線粒體釋放的能夠誘導caspase非依賴的細胞凋亡的因子。此外，屬於依賴於Mg2+的核酸酶家族的Endonuclease G在細胞凋亡中發揮著一定的作用，而且它可能與AIF共同作用來影響凋亡進程。
NF-κB(nuclear factor-κB)是一種在各種類型細胞中廣泛表達的轉錄因子，負責調節大量與細胞應急狀態相關的基因的轉錄。NF-κB在機體免疫應答和炎症反應中發揮重要作用。NF-κB活化的失調與許多人類病症直接相關，同時NF-κB在某些造血細胞，上皮細胞和淋巴器官結構發育過程中發揮重要作用。近來的研究證明，NF-κB家族成員還參與了神經突觸的形成和腫瘤的遷移(Karin and Ben-Neriah，2000)。
NF-κB通常與抑制因子IκBs(inhibit κB)相結合，以非活性形式存在於細胞質中。NF-κB能被各種刺激因子激活。細胞在上遊刺激因素的作用下，通過不同的胞內信號傳遞途徑，導致IκBs的降解及NF-κB的活化。NF-κB活化途徑中的關鍵因子均可作為藥物設計篩選的靶標，因此研究者們一直致力於克隆調節NF-κB活性的因子。它們不僅對細胞信號轉導機制的基礎理論研究有重要意義，而且為免疫及炎症的醫學幹預提供了機遇。
RIP是一種已知的，在TNF-R1誘導的NF-κB活化過程中發揮重要作用的激酶。
RIP家族已經發現了4個成員——RIP，RIP2，RIP3，RIP4。RIP2的C-端為Caspase招募結構域。在細胞中過表達RIP2能激活NF-kB和JNK激酶；RIP3的C端沒有明結構域，能與RIP結合併且磷酸活化RIP從而抑制RIP和TNF誘導的NF-kB的激活；RIP4的C端含有錨結構域重複，能激活NF-kB和JNK。

發明內容
本發明的目的是尋找RIP家族的新基因成員，以便找到能誘導細胞調亡的新基因。
本發明利用序列同源性比對得到了具有SEQ ID NO1所示序列的DNA，命名為RIP5。實驗結果證明，RIP5基因及其編碼的蛋白(具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列)能夠誘導細胞凋亡，在篩選治療或預防癌症等與細胞凋亡有關疾病的的藥物中，可用作分子靶標或診斷標記。
本發明以RIP的序列在NCBI序列庫中進行了blast搜索，找到了一個與RIP有同源性的RIP家族新基因RIP5。在哺乳動物細胞內過表達RIP5能引起細胞死亡，並且能誘導細胞出現DNA ladder，並且RIP5誘導的DNAladder能被crmA抑制，這個現象說明RIP5誘導的細胞死亡是調亡。但是在凋亡形態學研究中，本發明人發現RIP5誘導的細胞死亡形態不能被crmA抑制，認為RIP5能引起Caspase依賴和非依賴兩條凋亡信號通路。以上結果表明，RIP5是一種能夠誘導細胞凋亡的RIP家族新基因。


圖1是人RIP5和RIP在激酶結構域的序列比對，陰影代表相似胺基酸。
圖2表示細胞中過表達RIP5後存活細胞的數量變化。圖中，橫坐標表示RIP5的DNA用量按0，0.5，1，2，4ug遞增，縱坐標表示每孔存活細胞的相對數目。
圖3是經β-Gal染色分析，200倍光鏡所示的轉染RIP5的細胞形態變化。圖中A為轉染空載體的形態，B為轉染RIP5表達載體的形態。
圖4表示RIP5誘導細胞出現DNA ladder，進行DNA ladder分析的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，從左到右依次為
RIP+CrmA；RIP；RIP5+CrmA；RIP5；Marker；圖5表示RIP5基因在各種不同凋亡抑制劑存在下，轉染細胞後存活細胞的數量變化。圖中，橫坐標表示轉染的內容從左到右分別為空載體；RIP5；RIP5+VAD-fmk；RIP5+CrmA；RIP；RIP+VAD-fmk；RIP+CrmA，縱坐標表示存活細胞的相對數量。
具體實施例方式以下是本發明實驗方法及結果詳述。
一、材料及方法材料人胚腎293細胞購自ATCC；細胞培養用DMEM，胎牛血清，0.05％胰酶溶液，丙酮酸鈉溶液，青、鏈酶素溶液購自GIBCO和Hyclone；哺乳動物細胞表達載體pRK-HA和PRK-flag由本實驗室構建；CMV-β-gal報告質粒由Dr.Gary Johnson(University of Colorado Health Science Center)惠贈；RIP5基因從人乳腺癌細胞系MCF-7中RT-PCR得到並聯入PRK-HA和PRK-flag載體；載體構建所需限制性內切酶購自Promega；DNA回收試劑盒Geneclean III Kit購自Q-BIO Gene；RT-PCR試劑盒購自PROMEGA公司；DNA序列測定由中國上海生工生物工程公司完成；PCR引物由中國上海生工生物工程公司合成；Western blot用硝酸纖維素膜Hybond ECL和HRP偶聯的羊抗鼠IgG、羊抗鼠兔IgG購自Amersham pharmacia biotech.；化學發光底物試劑盒購自PIERCE；HA單克隆抗體購自Sigma；兔抗人RIP5蛋白的多克隆抗體由中科院遺傳所免疫室製備；
CaCl2，PEG4000，LiAc，DMSO購自Sigma；CsCl購自Fisher Biotech.；β-gal購自Promega；其它化學試劑購自北京化學試劑商店。
方法1.質粒構建及DNA純化以RIP序列在NCBI序列庫中進行blast搜索和EST(expression sequece tag)序列拼接得到RIP5分子的全長編碼序列，然後根據RIP5的全長編碼序列設計引物，從人乳腺癌細胞系MCF-7中RT-PCR得到RIP5基因並聯入PRK-HA的表達載體中。構建的哺乳動物細胞表達質粒均參照《分子克隆》(J.薩姆布魯克等，1999)質粒大量提取法，經CsCl密度梯度超速離心純化。
2.細胞培養和細胞轉染人胚腎293細胞培養於含10％胎牛血清的高糖DMEM培養基中37℃，5％二氧化碳培養箱培養。
293細胞(1×105)接種於12孔板中，18小時後參照《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等，1999)進行磷酸鈣介導的轉染。
3.β-Gal染色將CMV-β-Gal基因作為報告基因和RIP5表達載體共轉染293細胞，36小時以後用戊二醛固定細胞，並用β-Gal染色過夜。次日在顯微鏡下對形態正常的細胞進行計數。每個孔計3個視野，取平均值，作為存活細胞的數目。
4.DNA ladder分析以RIP5等表達載體傳染293細胞，36小時以後收集所有漂浮的和貼壁的細胞，用含有0.2mg/ml蛋白酶K和2％NP40的裂解液裂解，釋放出來的細胞DNA用無水乙醇沉澱，並用50ul水溶解，再加入2ulRNA處理，最後進行2％瓊脂糖凝膠電泳。
二、RIP5的克隆及功能鑑定1.RIP5基因的克隆為了尋找RIP家族的新基因，我們以RIP序列在NCBI序列庫中進行了BLAST搜索，找到了多個EST克隆，對這些基因進行的分析表明其中一些EST克隆編碼同一個尚未報導過的新基因。我們將其命名為RIP5。RIP5得C-末端含有一個激酶結構域，該結構域與RIP得激酶結構域有較大同源性。我們根據RIP5的5』和3』cDNA序列設計引物，從人乳腺癌細胞中RT-PCR得到了RIP5的全長cDNA並連入PRK-HA和PRK-flag表達載體。
2.RIP5基因誘導細胞凋亡的功能鑑定用RIP5的表達載體轉染293細胞，並隨著RIP5量的增加存活細胞的數量逐漸下降(見圖2)經β-Gal染色分析發現，轉染RIP5的細胞死亡形態的細胞明顯增多，並且與RIP5的表達量成正比(圖2，3)，說明在細胞中過表達RIP5能引起細胞死亡。在細胞中過表達RIP5能誘導細胞產生DNA ladder。並且這種RIP5誘導產生的DNA ladder能被crmA抑制。但是在apoptosis assay實驗中，RIP5誘導的細胞凋亡不能被crmA抑制，也不能被調亡抑制劑VAD-fmk抑制(圖5)。上述結果說明RIP5誘導的細胞調亡能同時通過Caspase依賴和Capase非依賴兩條途徑進行。
序列表110北京大學120RIP5基因及其用途13004-011602170PatentIn version 3.121012112927212DNA213人(human)4001ccacgcgtcc ggccgcaaag acagagcggg cagaggcgat ggagggcgac ggggtgccat60ggggcagcga gcccgtctcg ggtcccggcc ccggcggcgg cggaatgatc cgcgagctgt120gccggggctt cggccgctac cgccgctacc tgggacggct gcgacagaac ctgcgcgaga180cccagaagtt cttccgcgac atcaagtgct cccacaacca cacttgtctc tcctccctca240cgggcggcgg cggggccgag cgcggccctg caggcgatgt cgccgaaacc gggctgcagg300cgggccaact gagctgcatt tccttcccac ctaaggaaga gaagtacctc cagcagattg360tggactgcct cccttgcata ctgatcctcg gccaggattg taacgtcaag tgccagctgt420tgaatctgct gttgggggtg caggtgcttc ccaccaccaa gctgggcagt gaggagagct480gtaagcttcg gcgcctccgc ttcacctatg ggactcagac tcgggtcagc ctggcgctcc540ctggacagta tgaactagtg cacacgctgg ttgctcatca gggcaactgg gagaccatcc600ctgaggagga tctggaggtc caagagaaca atgaggatgc tgctcatgtt ttagcggaac660tggaggtaac gatgcaccat gctctcttac aggaagtgga cgttgtggta gcaccatgcc720aaggcctccg gcccacagtg gatgttctgg gtgacttggt gaatgatttc ttgcctgtga780taacctatgc actccacaaa gatgaactct ctgagaggga tgagcaagag cttcaggaaa840tccgaaagta tttctccttt cctgtattct ttttcaaagt gccgaaactg ggctcggaga900taatagactc ctcaaccagg agaatggaga gcgaaagatc accgctttat cgccagctaa960ttgacctggg ctatctgagc agcagtcact ggaactgtgg ggctcctggc caggatacta1020aagctcagag catgttggtg gaacagagtg aaaagctgag acacttgagc acattttctc1080accaggtgtt acagactcgc ctggtggatg cagccaaggc cctgaacctg gtgcactgcc1140actgccttga catctttatt aaccaggcat ttgacatgca gcgggacctg cagatcactc1200
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權利要求
1.具有SEQ ID NO1所示序列的DNA。
2.權利要求1所述DNA誘導細胞凋亡的用途。
3.用權利要求1所述DNA在篩選治療或預防與細胞凋亡有關疾病的藥物的用途。
4.權利要求1所述DNA在篩選治療或預防癌症藥物的用途。
5.具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽。
6. 權利要求5所述胺基酸序列誘導細胞凋亡的用途。
7.權利要求5所述胺基酸序列在篩選治療或預防與細胞凋亡有關疾病的藥物的用途。
8.權利要求5所述胺基酸序列在篩選治療或預防癌症藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及RIP5基因及其用途。本發明利用序列同源性比對得到了一種新基因RIP5。實驗結果證明，該基因及其編碼的蛋白能夠誘導細胞凋亡，在篩選治療或預防癌症等與細胞凋亡有關疾病的的藥物中，可用作分子靶標或診斷標記。
文檔編號C07K14/435GK1600857SQ20041003413
公開日2005年3月30日 申請日期2004年4月26日 優先權日2004年4月26日
發明者查紀坤, 舒紅兵, 翟中和 申請人:北京大學