一種用蠶蛹培養擬青黴菌的方法及藥用用途的製作方法
2023-10-06 00:01:14 1
專利名稱：一種用蠶蛹培養擬青黴菌的方法及藥用用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及擬青黴菌的培養技術，提供一種用蠶蛹培養擬青黴的方法，並公開了其藥用用途，屬於生物菌類培養技術領域。
擬青黴菌屬含粉狀擬青黴菌、蟬擬青黴、細腳擬青黴等，該屬為半知菌亞門、絲孢綱、擬青黴屬真菌。該菌與蟲草菌同為蟲生真菌類。半知菌中擬青黴是包含蟲生真菌較多的一個屬，通常選用桑蠶幼蟲作為寄主培養擬青黴菌，培養期只能在養蠶季節進行，並且，在培養中直接將擬青黴菌種噴灑在蠶幼蟲體或桑葉上，靠接觸性自然感染培養，容易汙染環境，感染時間長，寄生率低，不利於產業化生產，影響了擬青黴菌的產業化生產。
目前，國內外開發成正式藥的藥用真菌大多數集中在擔子菌亞門的層菌綱中，其次在子囊菌的核菌綱中。在半知菌中能入藥的僅有白僵菌屬的僵蠶或僵蠶蛹。關於用蠶蛹培養擬青黴菌及藥用用途的研究，國內外尚末見有報導。
本發明的目的在於公開一種用蠶蛹培養擬青黴菌的方法，解決了用蠶幼蟲作為寄主，培養擬青黴菌受養蠶季節環境條件限制的問題；本發明的另一個目的是提供擬青黴菌的醫用用途。
本發明的採用以下技術解決方案選用蠶蛹作為寄主培養擬青黴菌，通過以下技術工藝實現
菌種製作-菌種培養-蠶蛹選擇-消毒處理-接種蠶蛹-培養僵蛹-培擬青黴黴菌(孢梗束、孢子粉)-採收幹制-包裝-冷藏。
1、菌種製作採用含C、N源豐富的培養基，例如鮮蠶蛹(或蠶蛹粉)10g、蛋白腖8g、奶粉8g、葡萄糖10g、磷酸二鉀氫1.5g、磷酸二氫鈉1.0g、硫酸鎂500ng、水1000ml、PH5.8配製成培養基。
首先將鮮蠶蛹攪碎(蠶蛹粉)加500ml水，煮沸10分鐘，過濾，用此濾液溶解蛋白腖、奶粉、葡萄糖，取另一容器放入磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂元素，加入適量水溶解，合併藥液，定容1000ml。充分攪拌後分裝在500ml三角瓶內。每瓶250ml。將瓶口封好，置於滅菌鍋內，在1.2Pa下滅菌30分鐘。取出，置於潔淨工作檯上，冷卻後接入黃豆粒大小的擬青黴菌種一塊，瓶口按原樣封好。
2、菌種培養將上述製備好的菌種置於培養室內培養溫度23℃±2℃。靜止培養12小時，然後間歇振蕩培養，每隔6小時振動培養20-30分鐘。培養4-5天約100小時左右開始接種蠶蛹。
3、活蠶蛹的選擇和消毒處理將活柞、家蠶蛹從繭殼中取出。選擇無病、健壯、不發育的柞、家蠶活蛹，首先用流水衝洗乾淨，然後放入75％酒精溶液內浸泡3分鐘，取出。移入5℃無菌室備用。(儲備時間不超過6小時)。
4、接種蠶蛹將菌種和蠶蛹移入無菌室內工作檯上，在無菌條件下，用注射器吸取菌液注入蛹體內柞蠶蛹0.2ml左右；家蠶蛹0.1ml左右。接種後的蠶蛹擺放在培養盤中培養。
5、培養僵蛹培養溫度15-18℃，培養時間5-10天。將已僵化的蠶蛹放入潔淨培養瓶內，柞蠶蛹每瓶7個，家蠶蛹每瓶17個。瓶口用塑料膜封好。移入高溫室培養子實體。
6、培養擬青黴孢梗束23-25℃高溫無光條件下培養3天，侍菌絲從蛹體上發出時，進行降溫光照培養光照強度為500勒克斯，溫度18℃±2，溼度90％以上。培養時間約25天。整個培養時間(從培養僵蛹到孢梗束長成)35天左右。
7、採收幹制侍孢梗束從蛹體上長高2-7cm時，將其從培養瓶內取出，裝入乾燥盤中，陰乾或冷凍燥。
8、包裝儲存為防止孢梗束從蛹體上脫落，採用真空包裝，在-2℃度下避光保存。保存時間為3-5年。
蠶蛹擬青黴菌的用途該菌可廣乏在醫藥、食品、保健品、製酒、飲料、日用化妝品、生物防治等領域應用。
在醫藥方面內服主要用於抗炎抑菌，提高機體免疫力，預防腫瘤發生，具有清熱解毒、降膽固醇、抗疲勞和補腎壯陽等作用。可廣泛地應用於各種腫瘤患者，免疫功能和性功能低下等患者，還可用於治療癲癇、小兒驚癇、喉痺、中風、腦炎後遺症、瘰癧結核及動脈硬化病等疾病。外用治丹毒搔癢、滅諸瘡瘢痕等。本發明可製成單方製劑也可與其它藥物製成複合製劑，劑型包括藥劑學中的任何劑型。
在食品方面可用於製作各種飲料、口服液、保健茶、保健酒，食品添加劑等。可起到抗疲勞、增強體力、延緩衰老。降低血脂，預防腫瘤等作用。
在外用或化妝品方面用於治療丹毒、痤瘡、粉刺，酒糟鼻、色斑等。
本發明的積極效果在於本發明以蠶蛹作為寄主，在蛹期培養擬青黴菌，原料蠶蛹易購、耐儲、可進行長年培養，原料來源不受環境條件限制。本發明工藝在全自控無菌條件下接種，培養到採收包裝，整個培養過程約30左右天，寄生率高達98％以上，產品質量好，無雜菌汙染，適合於產業化生產。
本發明產品經吉林省中醫研究院藥理研究室藥理活性試驗表明，該菌、具有多種藥理活性無毒副作用，有些藥效高於蛹蟲草；北京中醫研究院中藥研究所對該菌化學成分測試結果為該菌含有核苷類、胺基酸、牛磺酸、多糖、硒、鍺、鋅等微量元素等化學成分和天然冬蟲夏基本一致；孢子粉的多糖含量是靈芝孢子粉3倍以上、核苷類含量高於靈芝孢子粉。
為了說明本發明的藥用用途，採用同類藥物對照的試驗的形式給予證明
試驗品擬青黴菌(稱為白蛹粉)、粉狀擬青黴孢子粉(稱為白基粉)對照品蛹蟲草(稱黃基粉)、頤和春(對照陽性藥物)。
試驗動物雄性健康未成年小鼠，體重12-15g。雄性wistar健康大白鼠體重150-200g，雌性健康KM封閉群小鼠18-22g試驗方法1、對成年去勢雄性大鼠血清睪丸酮含量及附性器官重量的影響選擇wistar雄性大鼠，體重150-200g左右80隻，用乙醚麻醉後摘除以側睪丸，正常飼養一周，使體內雄性激素代謝後，挑選狀態健康的大鼠80隻，隨機分為組，每組8隻。用乙醚麻醉後摘除雙側睪丸，正常飼養一周，使體內雄性激素代謝掉後，選健康大鼠隨機分組，每組8隻同時設正常對照組、去勢對照組、陽性藥對照組及各大、小劑量組連1g給藥10天，每天1次對照組給同體積蒸餾水，末閃給藥後稱體重並處理死亡動物，取血離心，測血清睪酮含量，並立即剖取包皮腺、前列腺-貯精囊及提肛肌-海綿球肌，稱重並計策臟器指數。結果採用組間t檢驗統計。結果見表1。
表1、對雄性去勢大鼠血清睪酮含量及附性器官指數的影響(X＋S)
由表1結果可以看出，雄性大鼠去勢後與正常對照比較，無論是血清睪酮含量還是附性器官指數均較正常對照組有非常明顯的降低及減輕(p0.001)，說明去勢模型成立，各給藥組與去勢組比較血清睪丸酮含量明顯的增加趨勢。尤其是白基粉二種樣品更好些；對附怕器官指數各給藥組對包皮腺的重量均有非常顯著的增加作用(p0.001)，對前列腺-貯精囊的重量，白基粉及白蛹粉有顯著的增加作用(p0.05)；對提肛肌-海棉球肌的重量，白及白蛹粉也呈現出明顯的使重量增加的趨勢。
2、對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響選擇健康小鼠(體重18-22g)雌雄各半，隨機分組給藥，對照組給同體積蒸餾水，每天一次，連續10天，每次給藥40min尾靜脈注射墨汁0.1ml/10g體重，置於5ml0.1的NaCl溶液中，7230分光光度計比色，並摘取肝、脾臟器、扭力天平稱重，參照NaIpem文獻方法計算指數K及活性。組間t檢驗比較，結果見表2
表2、對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響(X±S)
結果表明，各給藥組連續1g給藥後是，均可使小鼠噬細胞的吞噬功能增強，而陽性藥物頤和春卻無此作用，而對於吞噬活性白基粉及白蛹粉的作用有顯著的統計學意義，黃基粉有增強趨勢。
3、抗疲勞作用選體重18-22g健康小鼠70隻雌雄各半，隨機分為8組，分組情況及給藥劑量詳見表3，連續給藥7天，末次給藥後0分鐘將動物投入水溫282、水深35cm的遊泳槽內進行遊泳試驗，記錄每隻動物的遊泳時間，組間t檢驗比較結果見表3表3、抗疲勞作用(X±S)
4、抗乏氧作用將80隻健康小鼠(體重)20-22g雌雄各半，隨機分為8組，一組為對照組，二組為頤和春藥物對照組，其餘6組為三個樣品大、小劑量組，連續1g給葤10天，末次給藥40min後將小鼠裝入250ml的密閉廣口瓶內，瓶內裝5g鈉石灰，瓶口塗凡士林封閉，觀察並記錄小鼠的死亡時間，結果見表4表4、抗疲勞作用(X±S)
表3結果表明各給藥組對小鼠的抗乏氧作用與對照組比較均有延長小鼠生存時間的趨勢(p＜0.05)。
結論與討論通過上述各項藥理活性實驗表明，蠶蛹培養的擬青黴菌和粉狀擬青黴孢子粉和蛹蟲草均有補腎壯陽之功效，相對而言白基粉與白蛹粉的效果略好於蛹蟲草及頤和春。擬青黴菌和粉狀擬青黴菌有非常明顯的增強免疫功能的作用。使注射化可的松造成免疫低下的動物(胸腺明顯萎縮)免疫功能器官重量明顯增加，同時增強小鼠的噬細胞吞噬功能，對健體強身扶正固本，起到較好的作用。抗乏氧和抗疲勞試驗中粉狀擬青黴菌也有明顯的作用。
該菌、具有多種藥理活性無毒副作用，有些藥效高於蛹蟲草；北京中醫研究院中藥研究所對該菌化學成分測試結果為該菌含有核苷類、胺基酸、牛磺酸、微量元素等化學成分和天然冬蟲夏基本一致；孢子粉的多糖含量是靈芝孢子粉3倍以上、核苷類含量高於靈芝孢子粉。
下面結合實施例進一步說明本發明，但不以實施例限定本發明的保護範圍。
實施例1用柞蠶蛹培養粉狀擬青黴菌1、菌種製作採用鮮蠶蛹(或蠶蛹粉)10g、蛋白腖8g、奶粉8g、葡萄糖10g、磷酸二鉀氫1.5g、磷酸二氫鈉1.0g、硫酸鎂500ng、水1000ml、PH5.8配製成培養基。
將鮮柞蠶蛹攪碎(蠶蛹粉加500ml水)加500ml水，煮沸10分鐘，過濾，用此濾液溶解蛋白腖、奶粉、葡萄糖，取另一容器放入磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂元素，加入適量水溶解，合併藥液，定容1000ml。充分攪拌後分裝在500ml三角瓶內。每瓶250ml。將瓶口封好，置於滅菌鍋內，在1.2Pa下滅菌30分鐘。取出，置於潔淨工作檯上，冷卻後接入黃豆粒大小的粉狀擬青黴菌種一塊，瓶口按原樣封好。
2、菌種培養將上述製備好的菌種置於培養室內培養溫度23℃±2℃。靜止培養12小時，然後間歇振蕩培養，每隔6小時振動培養20-30分鐘。培養4-5天約100小時左右開始接種柞蠶蛹。
3、柞蠶蛹的選擇和消毒處理將活柞蠶蛹從繭殼中取出。選擇無病、健壯、不發育的柞、家蠶活蛹，首先用流水衝洗乾淨，然後放入75％酒精溶液內浸泡3分鐘，取出。移入5℃無菌室備用。(儲備時間不超過6小時)。
4、接種柞蠶蛹將菌種和柞蠶蛹移入無菌室內工作檯上，在無菌條件下，用注射器吸取菌液注入蛹體內柞蠶蛹0.2ml左右；接種後的蠶蛹擺放在培養盤中培養。
5、培養僵蛹培養溫度15-18℃，培養時間5-10天。將已僵化的蠶蛹放入潔淨培養瓶內，柞蠶蛹每瓶7個，瓶口用塑料膜封好。移入高溫室培養孢梗束。
6、培養擬青黴孢梗束
23-25℃高溫無光條件下培養3天，侍菌絲從蛹體上發出時，進行降溫光照培養光照強度為500勒克斯，溫度18℃±2，溼度90％以上。培養時間約25天。整個培養時間(從培養僵蛹到孢梗束長成)35天左右。
7、採收幹制侍孢梗束從蛹體上長高2-7cm時，將其從培養瓶內取出，裝入乾燥盤中，陰乾或冷凍燥。
8、包裝儲存為防止孢梗束從蛹體上脫落，採用真空包裝，在-2℃度下避光保存。保存時間為3-5年。
用本發明方法接種柞蠶蛹2萬個培養出蠶蛹粉狀擬青黴子實體18700個詳見表1
實施例2用實施例1的方法，只是在接種菌種選擇時選用孢子粉多的菌種，孢子粉的獲取方法將蠶蛹冷凍乾燥後，將其放入篩中篩取。其它培養方法同實施例1的培養方法。
試驗結果2000年5月-2001年5月採用上述方法共制培養柞蠶蛹5000個，獲純孢子粉200g詳見下表2
實施例3蠶蛹粉狀擬青黴菌膠囊將冷凍乾燥(或室溫下陰乾)的人工培養的蠶蛹粉狀擬青黴或擬青黴孢子粉，進行超微粉碎或粉碎後過120目篩後，直接插入膠囊或加入輔料充分混合後裝入膠囊。每粒025g一日三次、每次4-6粒。溫水或黃酒送服。治療腫瘤和惡性腫瘤，鎮痛、安神。
實施例4粉狀擬青黴孢子粉加入靈芝孢子粉膠囊取粉擬青黴孢子粉500g、靈芝孢子粉500g、攪拌均勻，裝入膠囊，每粒重05g每粒含粉擬青黴孢子粉和靈芝孢子粉各025克。主治各種腫瘤和惡性腫瘤，治療白血病、風溼病痛等症。
實施例5粉擬青黴菌有效成分及有效部位群提取及其製劑將培養的粉擬青黴菌絲和子實體粉碎、加水浸泡2小時、煮沸提取或用50％乙醇回流提取有效成分部分，經濃縮、乾燥後再粉碎過120目，裝膠囊或壓片。
實施例6蠶蛹粉狀擬青黴飲料將蠶蛹粉擬青黴10g切成薄片，加水500ml煮沸、過濾、濃縮100ml、3度冰葙保存。可提高機體免疫力、防止動脈硬化。
實施例7粉擬青黴酒將蠶蛹粉擬青黴75g切成溥片，加入500ml白酒中，浸泡一周，日服三次，每次20ml，抗疲勞，對神經衰弱、風溼痺痛有療效。
實施例8蠶蛹粉擬青黴化妝品配方為將蠶蛹粉擬青黴或孢子粉提取濃縮液滅菌後，冷卻至85度，然後將其加入到紅花油或其它潤膚劑中進行乳化反應，並不斷攪拌，然後通冷卻水，40度時加入香精，35度後停止攪拌，侍抽檢化驗合格後即可分裝。
本產品對皮膚有治療作用如斑、粉刺、防曬等。
權利要求
1.一種蠶蛹培養擬青黴菌方法，其特徵在於以蠶蛹作為寄主，通過以下步驟製成擬青黴菌菌種製作、菌種培養、蠶蛹選擇、消毒處理、接種蠶蛹、培養僵蛹、培擬青黴黴菌、採收幹制、包裝冷藏。
2.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於擬青黴菌包括粉狀擬青黴菌、蟬擬青黴、細腳擬青黴、粉狀擬青黴孢梗束、粉狀擬青黴素孢子粉。
3.擬青黴菌在製備治療或預防腫瘤和惡性腫瘤疾病的藥物的應用。
4.擬青黴菌在製備治療或預防癲癇、小兒驚癇疾病的藥物的應用。
5.擬青黴菌在製備治療或預防動脈硬化、預防心、腦血管疾病的藥物的應用。
6.擬青黴菌在製備治療或預防病毒性肝炎疾病的藥中應用。
7.擬青黴菌在製備治療或預防免疫功能低下、抗疲勞、抗乏氧疾病的藥中應用。
8.擬青黴菌在製備治療或預防性功能低下疾病藥物中的應用。
9.擬青黴菌在製備食品中的應用。
10.擬青黴菌在製備化妝品中的應用。
全文摘要
本發明公開一種用蠶蛹培養擬青黴菌的方法及藥用用途,以蠶蛹作為寄主,通過菌種製作－菌種培養－蠶蛹選擇－消毒處理－接種蠶蛹－培養僵蛹－培擬青黴黴菌(孢梗束、孢子粉)－採收幹制－包裝－冷藏等工藝,在蛹期培養擬青黴菌。原料蠶蛹易購、耐儲、可進行長年培養,原料來源不受環境條件限制。本發明工藝在全自控無菌條件下接種,培養到採收包裝,整個培養過程約30左右天,寄生率高達98%以上,產品質量好,無雜菌汙染。本發明還公開了其藥用用途,用於治療或預防心腦血管、惡性腫瘤、性功能低下、癲癇、免疫功能低下、動脈硬化等疾病藥物中。
文檔編號C12N1/14GK1327047SQ0112794
公開日2001年12月19日 申請日期2001年7月19日 優先權日2001年7月19日
發明者徐哲, 徐道田, 苑桂華, 唐國鎮, 金順姬, 王波 申請人:吉林東北虎藥業股份有限公司