一種用於豬肉嫩度選育的方法及其檢測試劑盒的製作方法
2023-10-08 06:32:29 2
專利名稱：一種用於豬肉嫩度選育的方法及其檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物分子育種方法，具體是一種用於豬肉嫩度選育的方法及其檢測試劑盒。
背景技術：
近半個世紀以來，動物遺傳育種者對於豬的研究一直以提高生長速度和瘦肉率為主攻目標，並取得了巨大的成功，使豬的生長速度、飼料轉化效率和瘦肉率得到很大提高，但是這種高強度的選擇卻帶來了豬肉品質的下降。近年來，劣質豬肉不斷出現，嚴重地影響了養豬生產和豬肉加工業。因此，豬的肌肉品質改良成為新的研究熱點。
肉的嫩度是反映豬肉品質的一個重要指標，其含義是消費者對肉的口感愜意程度。人們通常所謂的肉嫩和老化，是主觀的定性描述，客觀上是對骨骼肌各種蛋白質結構特性的總概括(陳潤生，1995)。幾十年來，人們試圖用物理的和化學的方法測定嫩度，尤其是想用各種複雜機械來模擬人的咀嚼動作，但始終未能找出被普遍接受的方法(周光宏等，1999；Pearson，A.M.1963)。早在20世紀30年代初由Warner(1928)和Bratzler(1932)設計的一種簡單的剪切儀(ShearDevice)，一直沿用至今，被國際認可。陳潤生和馬小愚等(1988)根據剪切力(Shear force)原理設計的C-LM型肌肉嫩度計被國內普遍應用。正常肉平均剪切力值愈高表示肉愈老化，剪切力值愈低則肉愈嫩。一般來說剪切力值大於4kg就比較老了，難以被消費者所接受(周光宏等，1999)。
傳統的豬肉嫩度選育以剪切力值測定為基礎，根據種豬的全同胞、半同胞、後裔等親屬屠宰後的剪切力測定值來估測該種豬的育種值，然後決定是否留種。該方法有很大的局限性，而且費時、費力。分子生物學的興起尤其是分子標記輔助選擇技術在其他性狀上的成功應用，向我們提供了一項新的途徑。
目前，還沒有專門用於豬肉嫩度的分子標記輔助育種方法及其相關的檢測試劑盒。
發明的內容本發明的目的之一是提供一種基於分子標記輔助育種技術的用於豬肉嫩度的選育方法。
本發明的另一目的是提供用於所述基於分子標記輔助育種技術的用於豬肉嫩度的選育方法的檢測試劑盒。
本發明所述方法的前提是嫩度的分子標記輔助選擇體系的建立，首要是找到影響豬肉嫩度的主效基因或其他分子標記。鈣蛋白酶系統是細胞中普遍存在一種蛋白質水解體系，參與了大量生長和代謝過程。鈣蛋白酶抑制蛋白(CAST)是鈣蛋白酶系統的重要成員之一，是鈣蛋白酶(calpain)特異性的抑制劑。CAST可抑制鈣蛋白酶的活性，降低蛋白質的水解。大量的研究表明，CAST與肉的嫩度相關T.D.Pringle(2000)等在雜交牛試驗中證實CAST與μ-calpain的活性比值與嫩度高度相關。Delgado等(2001)肉的嫩化與CAST的活性及降解速度有關。因此，CAST基因成為研究肉嫩度一個極有希望的侯選基因。
為了建立豬肉嫩度的分子標記輔助選擇體系，以加速豬肉嫩度的改良。我們選擇CAST基因作為目標標記。為確認CAST基因的多態是否與豬肉的嫩度相關，我們運用PCR-RFLP技術對72頭豬的CAST基因的多態進行了研究，並藉助Popgen32和SPSS軟體，就其基因型與豬肉嫩度作了相關性分析。結果嫩度在HinfI/MspI/RsaI三酶切產生的部分基因型間差異顯著，以基因型ABDDEF剪切力值最小，肉質越嫩。由此得出結論豬CAST基因可作為嫩度的遺傳標記，應用育種實踐。
為實現本發明的第一目的而採用的技術方案是這樣的，即一種用於豬肉嫩度的選育方法，其特徵是方法包括以下的步驟類型A主要用於種豬的肉質嫩度選育，以生產具有最優嫩度的商品肥育豬(1)豬耳組織基因組DNA的提取；(2)豬CAST基因的PCR擴增；(3)PCR產物酶切反應；(4)豬CAST基因的基因型的確定；(5)最佳交配組合的確定；或類型B主要用於商品肥育豬群中最優嫩度的商品肥育豬只的篩選(1)豬耳組織基因組DNA的提取；(2)豬CAST基因的PCR擴增；(3)PCR產物酶切反應；(4)豬CAST基因的基因型的確定；(5)最優嫩度的商品肥育豬只的確定。
為實現本發明的第二目的而採用的技術方案是這樣的，即一種用於豬肉嫩度的選育方法的檢測試劑盒，試劑盒包括基因組DNA提取試劑、PCR擴增試劑、酶切分型試劑；其中酶切分型試劑有兩種類型A和B。類型A主要用於種豬的嫩度選育，以生產具有最優嫩度的商品肥育豬；類型B主要用於商品肥育豬群中最優嫩度的商品肥育豬只的篩選。
本發明通過對與豬肉嫩度緊密相關的CAST基因進行分型，確定最佳交配組合來選育豬肉嫩度的方法具有獨特性。而傳統的豬肉嫩度選育以剪切力值測定為基礎，根據種豬的全同胞、半同胞、後裔等親屬屠宰後的剪切力測定值來估測該種豬的育種值，然後決定選留。該方法具有很大的局限性，而且費時、費力。本發明所建立的豬肉嫩度選育的方法通過PCR-RFLP技術對種豬的CAST基因進行基因分型，確定最佳的交配組合，從而生產基因型為ABDDEF的豬作為肥育商品豬。該方法不但節省了屠宰測定實驗所花費的資金，而且可以早期選種，極大地縮短了育種周期。同時，本發明所提供的方法和試劑盒可用於豬肉嫩度選育。通過該方法，可加速豬肉的嫩度改良，進而生產出符合人類口味的豬肉，市場前景廣闊。
附圖1為HinfI酶切產物凝膠電泳圖譜；圖中，MDNA Marker DL2000，1、4AA型，2BB型，3，5AB型。
附圖2為Msp I酶切產物凝膠電泳圖譜；圖中MDNA Marker DL2000，1、4CC型，2DD型，3，5CD型。
附圖3RSA I酶切產物凝膠電泳圖譜；圖中MDNA Marker DL2000，1、2、3EE型，4EF型，5FF型具體實施方式
實施例1 CAST基因的多態與豬肉嫩度的相關性實驗從遺傳學角度講，豬肉嫩度是一個數量性狀，儘管受許多微效基因控制，但是也存在對其影響極大的主效基因。鈣蛋白酶抑制蛋白(CAST)是鈣蛋白酶系統的重要成員之一，是鈣蛋白酶(calpain)特異性的抑制劑。CAST可抑制鈣蛋白酶的活性，降低蛋白質的水解。大量的研究表明，CAST與肉的嫩度相關T.D.Pringle(2000)等在雜交牛試驗中證實CAST與μ-calpain的活性比值與嫩度高度相關。Delgado等(2001)肉的嫩化與CAST的活性及降解速度有關。因此，CAST基因成為研究肉嫩度一個極有希望的侯選基因。
為確認CAST基因的多態是否與豬肉的嫩度相關，我們運用PCR-RFLP技術對72頭豬的CAST基因的多態進行了研究，並藉助Popgen32和SPSS軟體，就其基因型與豬肉嫩度作了相關性分析。結果嫩度在在HinfI/MspI/RsaI三酶切產生的部分基因型差異顯著，以基因型ABDDEF剪切力值最小，肉質越嫩。由此得出結論豬CAST基因可作為嫩度的遺傳標記，應用育種實踐。
本發明方法正是基於上述結論，該方法原理可概括為CAST基因是影響豬肉嫩度的一個重要的分子標記，以基因型ABDDEF剪切力值最小，肉質越嫩，故通過PCR-RFLP技術對種豬群豬只的CAST基因進行基因分型，確定最佳的交配組合，從而生產基因型為ABDDEF的豬作為肥育商品豬。該原理也可用於商品肥育豬群中最優嫩度的商品肥育豬只的篩選。
實施例2豬肉嫩度的選育方法方法包括類型A主要用於種豬的嫩度選育，以生產具有最優嫩度的商品肥育豬，步驟如下(1)豬耳組織基因組DNA的提取；(2)豬CAST基因的PCR擴增；
(3)PCR產物酶切反應；(4)豬CAST基因的基因型的確定；(5)最佳交配組合的確定；或類型B主要用於商品肥育豬群中最優嫩度的商品肥育豬只的篩選，步驟如下(1)豬耳組織基因組DNA的提取；(2)豬CAST基因的PCR擴增；(3)PCR產物酶切反應；(4)豬CAST基因的基因型的確定；(5)最優嫩度的商品肥育豬只的確定；具體實施步驟類型A主要用於種豬的嫩度選育，以生產具有最優嫩度的商品肥育(1)豬耳組織基因組DNA的提取用上海華舜生產的少量組織/細胞基因組DNA抽提試劑盒(W6501)提取豬耳組織基因組DNA。依照其說明進行，稍做修改。具體如下①、取待測豬的耳組織約1g盛於70％酒精中，-20℃凍存。
②、剪取20mg，用剪刀/刀片將組織切小後，移入離心管中。加入400ul DL液，振蕩懸浮後，置65℃溫浴使小塊組織消失(15分鐘以上)，期間來回顛倒離心管數次。再加入200ul DT液，20ul RNase A和25ulProteinase K，迅速溫和地來回顛倒離心管徹底混勻。置65℃溫浴15-30分鐘，期間來回顛倒離心管數次。離心3分鐘，將上清移至另外一個離心管中。
③、加入200ul異丙醇，劇烈顛倒離心管使溶液混勻後，移取600ul至吸附柱中，離心30秒。棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。將剩餘的全部移至吸附柱中，離心30秒。棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。
④、加入500ul W1液，靜置1分鐘後，離心30秒。
⑤、將吸附柱移入另外一個乾淨的收集管中。加入500ul W1液，離心15秒。
⑥、棄掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。離心1分鐘。
⑦、將吸附柱移入一個乾淨的1.5ml離心管中。在吸附膜中央加入100ulT1液，65℃靜置5分鐘後，離心1分鐘。將1.5ml離心管(DNA)-20℃保存。
(2)豬CAST基因的PCR擴增引物序列來源於文章C M Ernst(1998)。上遊引物5』-GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC-3』，下遊引物5』-TGCAGATACACCAGTAACAG-3』。DNA Marker DL2000，Taq DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司的.
擴增反應總體積為30μL，其中10×反應緩衝液3μL，MgCL21.5mM，每種dNTP200μM，每種引物1μM，1U Taq DNA聚合酶，50ng基因組DNA，用滅菌水補足30μL。反應條件為94℃熱變性4min，然後94℃40sec，60℃復性1min，72℃延伸1.5min，33個循環，最後72℃延伸10min。
將所擴增的PCR產物、DNA Marker DL2000、任意一個陽性樣品各5μL在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，檢測是否擴增出目標片段。
(3)PCR產物酶切反應將擴增出目標片段的PCR產物，利用三種限制性酶分別進行酶切。同時，對陽性樣品1(AA)，2(BB)進行HinfI酶切；陽性樣品3(DD)進行MspI酶切；陽性樣品4(EE)，5(FF)進行RsaI酶切。具體操作如下PCR產物、陽性樣品1(AA)，2(BB)的HinfI酶切總反應體系為20μL，其中擴增產物(或陽性樣品)為10-15μL，限制性內切核酸酶HinfI 1μL，酶切緩衝液10×H Buffer 2μL，然後加雙蒸水至20μL，37℃恆溫2小時。
PCR產物、陽性樣品3(DD)的MspI酶切總反應體系為20μL，其中擴增產物(或陽性樣品)為10-15μL，限制性內切核酸酶MspI 1μL，酶切緩衝液10×T Buffer 2μL，0.1％BSA 2μL，然後加雙蒸水至20μL，37℃恆溫2小時。
PCR產物、陽性樣品4(EE)，5(FF)的RsaI酶切總反應體系為20μL，其中擴增產物(或陽性樣品)為10-15μL，限制性內切核酸酶RsaI 1μL，酶切緩衝液10×T Buffer 2μL，0.1％BSA 2μL，然後加雙蒸水至20μL，37℃恆溫2小時。
(4)豬CAST基因的基因型的確定酶切產物上樣於2％的瓊脂糖凝膠，同時將DNA Marker DL2000、陽性樣品在同種酶切下的酶切產物同時上樣，依次確定待檢豬的基因型。
如果已檢測的PCR產物的HinfI酶切圖譜與陽性樣品1(AA)的HinfI酶切圖譜完全吻合，則定義其基因型為AA型。如果已檢測的PCR產物的HinfI酶切圖譜與陽性樣品2(BB)的HinfI酶切圖譜完全吻合，則定義其基因型為BB型。如果已檢測的PCR產物的HinfI酶切圖譜與陽性樣品1(AA)、2(BB)的HinfI酶切圖譜都不吻合，則直接淘汰該號種豬。
如果已檢測的PCR產物的MspI酶切圖譜與陽性樣品3(DD)的MspI酶切圖譜完全吻合，則定義其基因型為DD型。如果已檢測的PCR產物的MspI酶切圖譜與陽性樣品3(DD)的MspI酶切圖譜不吻合，則直接淘汰該號種豬。
如果已檢測的PCR產物的RsaI酶切圖譜與陽性樣品4(EE)的RsaI酶切圖譜完全吻合，則定義其基因型為EE型。如果已檢測的PCR產物的RsaI酶切圖譜與陽性樣品5(FF)的RsaI酶切圖譜完全吻合，則定義其基因型為FF型。如果已檢測的PCR產物的RsaI酶切圖譜與陽性樣品4(EE)、5(FF)的RsaI酶切圖譜都不吻合，則直接淘汰該號種豬。
經過三次酶切後，對於HinfI酶切為AA型且MspI酶切為DD型且RsaI酶切為EE型的種豬，定義其CAST基因的基因型為ADE；經過三次酶切後，對於HinfI酶切為BB型且MspI酶切為DD型且RsaI酶切為EE型的種豬，定義其CAST基因的基因型為BDE；經過三次酶切後，對於HinfI酶切為AA型且MspI酶切為DD型且RsaI酶切為FF型的種豬，定義其CAST基因的基因型為ADF；經過三次酶切後，對於HinfI酶切為BB型且MspI酶切為DD型且RsaI酶切為FF型的種豬，定義其CAST基因的基因型為BDF；(5)確定交配組合為保證後代的商品肥育豬都為具有最優嫩度基因型的商品豬，我們要定向地選擇下列任意一個交配組合CAST基因型為ADE的公豬與CAST基因型為BDF的母豬交配；CAST基因型為ADF的公豬與CAST基因型為BDE的母豬交配；CAST基因型為BDE的公豬與CAST基因型為ADF的母豬交配；
CAST基因型為BDF的公豬與CAST基因型為ADE的母豬交配。
下面我們以第一個交配組合為例從理論上證明該交配組合產生的後代商品肥育豬都為具有最優嫩度基因型的商品豬。
遺傳學理論認為，商品豬CAST基因的基因型來源於其親代種豬CAST基因的基因型，而且是父母產生配子基因型的組合。對於CAST基因型為ADE的公豬，其只能產生ADE型的精子；對於CAST基因的基因型為BDF的母豬，其只能產生BDF型的卵子，當精子與卵子結合併發育成個體時，其CAST基因的基因型一定為ABDDEF，而這正是最佳肉質嫩度豬所具有的基因型。
其他交配組合應用同樣的理論也可證明交配組合產生的後代商品肥育豬都為具有最優嫩度ABDDEF基因型的商品豬。
類型B主要用於商品肥育豬群中最優嫩度的商品肥育豬只的篩選(1)豬耳組織基因組DNA的提取用上海華舜生產的少量組織/細胞基因組DNA抽提試劑盒(W6501)提取豬耳組織基因組DNA。依照其說明進行，稍做修改。具體如下①、取待測豬的耳組織約1g盛於70％酒精中，-20℃凍存.
②、剪取20mg，用剪刀/刀片將組織切小後，移入離心管中。加入400ul DL液，振蕩懸浮後，置65℃溫浴使小塊組織消失(15分鐘以上)，期間來回顛倒離心管數次。再加入200ul DT液，20ul RNase A和25ulProteinase K，迅速溫和地來回顛倒離心管徹底混勻。置65℃溫浴15-30分鐘，期間來回顛倒離心管數次。離心3分鐘，將上清移至另外一個離心管中。
③、加入200ul異丙醇，劇烈顛倒離心管使溶液混勻後，移取600ul至吸附柱中，離心30秒。棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。將剩餘的全部移至吸附柱中，離心30秒。棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。
④、加入500ul W1液，靜置1分鐘後，離心30秒。
⑤、將吸附柱移入另外一個乾淨的收集管中。加入500ul W1液，離心15秒。
⑥、棄掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個收集管中。離心1分鐘。
⑦、將吸附柱移入一個乾淨的1.5ml離心管中。在吸附膜中央加入100ulT1液，65℃靜置5分鐘後，離心1分鐘。將1.5ml離心管(DNA)-20℃保存。
(2)豬CAST基因的PCR擴增引物序列來源於文章C M Ernst(1998)。上遊引物5』-GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC-3』，下遊引物5』-TGCAGATACACCAGTAACAG-3』。DNA Marker DL2000，Taq DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司的.
擴增反應總體積為30μL，其中10×反應緩衝液3μL，MgCL21.5mM，每種dNTP200μM，每種引物1μM，1U Taq DNA聚合酶，50ng基因組DNA，用滅菌水補足30μL。反應條件為94℃熱變性4min，然後94℃40sec，60℃復性1min，72℃延伸1.5min，33個循環，最後72℃延伸10min。
將所擴增的PCR產物、DNA Marker DL2000、任意一個陽性樣品各5μL在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，檢測是否擴增出目標片段。
(3)PCR產物酶切反應將擴增出目標片段的PCR產物，利用三種限制性酶分別進行酶切。同時，對陽性樣品0(ABDDEF)分別進行HinfI酶切、MspI酶切和RsaI酶切。具體操作如下PCR產物、陽性樣品0(ABDDEF)的HinfI酶切總反應體系為20μL，其中擴增產物(或陽性樣品)為10-15μL，限制性內切核酸酶HinfI 1μL，酶切緩衝液10×H Buffer 2μL，然後加雙蒸水至20μL，37℃恆溫2小時。
PCR產物、陽性樣品0(ABDDEF)的MspI酶切總反應體系為20μL，其中擴增產物(或陽性樣品)為10-15μL，限制性內切核酸酶MspI 1μL，酶切緩衝液10×T Buffer 2μL，0.1％BSA 2μL，然後加雙蒸水至20μL，37℃恆溫2小時。
PCR產物、陽性樣品0(ABDDEF)的RsaI酶切總反應體系為20μL，其中擴增產物(或陽性樣品)為10-15μL，限制性內切核酸酶RsaI 1μL，酶切緩衝液10×T Buffer 2μL，0.1％BSA 2μL，然後加雙蒸水至20μL，37℃恆溫2小時。
(4)豬CAST基因的基因型的確定酶切產物上樣於2％的瓊脂糖凝膠，同時將DNA Marker DL2000、陽性樣品在同種酶切下的酶切產物同時上樣，依次確定待檢豬的基因型。
如果已檢測的PCR產物的HinfI酶切圖譜與陽性樣品0(ABDDEF)的HinfI酶切圖譜完全吻合，則定義其基因型為AB型。否則，直接淘汰該號商品豬。
如果已檢測的PCR產物的MspI酶切圖譜與陽性樣品0(ABDDEF)的MspI酶切圖譜完全吻合，則定義其基因型為DD型。否則，直接淘汰該號商品豬。
如果已檢測的PCR產物的RsaI酶切圖譜與陽性樣品0(ABDDEF)的RsaI酶切圖譜完全吻合，則定義其基因型為EF型。否則，直接淘汰該號商品豬。
經過三次酶切後，對於HinfI酶切為AB型且MspI酶切為DD型且RsaI酶切為EF型的商品豬，定義其CAST基因的基因型為ABDDEF。
(5)最優嫩度的商品肥育豬只的確定在商品肥育豬群中，選擇CAST基因的基因型為ABDDEF的豬留下，作為商品肥育用，該商品豬的豬肉將來具有最優嫩度。
實施例3用於豬肉嫩度的選育方法的試劑盒上述試劑盒包括基因組DNA提取試劑、PCR擴增試劑、酶切分型試劑；其中酶切分型試劑有兩種類型A和B，其中類型A主要用於種豬的嫩度選育，以生產具有最優嫩度的商品肥育豬；類型B主要用於商品肥育豬群中最優嫩度的商品肥育豬只的篩選。其中(1)基因組DNA提取試劑上海華舜生產的少量組織/細胞基因組DNA抽提試劑盒(W6501)，包括吸附柱50套，收集管50支，DT液15ml，DL液20ml，W1液12ml，T1液10ml，Proteinase K 25mg，Rnase A 4mg。
(2)PCR擴增試劑大連寶生物工程有限公司生產的PCR擴增相關試劑(產品編號DR001AM，包括TaKaRa Taq(5u/ul)50ul，10×PCR Buffer(Mg2+free)1mL，MgCL2(25mM)1mL，dNTP Mixture(2.5mM)800ul，6×Loading Buffer 1mL)分子標準DNA Marker DL2000(產品編號D501A)。
北京賽百勝生物技術有限公司合成的2.50D引物。引物序列來源於文章C M Ernst(1998)。具體序列為上遊引物5』-GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC-3』，下遊引物5』-TGCAGATACACCAGTAACAG-3』。
(3)酶切分型試劑
酶切分型試劑有兩種類型A和B。類型A主要用於種豬的嫩度選育，以生產具有最優嫩度的商品肥育豬。類型B主要用於商品肥育豬群中最優嫩度的商品肥育豬只的篩選。
A類酶切分型試劑包括大連寶生物工程有限公司生產的三種限制性內切酶HinfI(產品編號D1061A，1500U)，MspI(產品編號D1150A，750U)，RsaI(產品編號D1116A，300U)，還包括由我們提供的5個陽性樣品，其編號依次為1(AA)，2(BB)，3(DD)，4(EE)，5(FF)。每個陽性樣品濃度≥10納克/微升，體積500微升。
關於上述陽性樣品的解釋上述陽性樣品是我們依次按照實施例2豬肉嫩度的選育方法中的步驟(1)、(2)、(3)進行後的PCR產物，該產物依照(4)步驟進行了酶切驗證1號陽性樣品，該PCR產物在HinfI酶切圖譜中包含一條大小約為700bp特徵性片段，故定義HinfI酶切的基因型為AA型，如圖1中的泳道1或泳道4所示；2號陽性樣品，該PCR產物在HinfI酶切圖譜中包含一條大小約為450bp特徵性片段，故定義HinfI酶切的基因型為BB型，如圖1中的泳道2所示；3號陽性樣品，該PCR產物在MspI酶切圖譜中包含一條大小約為720bp特徵性片段，故定義MspI酶切的基因型為DD型，如圖2中的泳道2或泳道4所示；4號在陽性樣品，該PCR產物在RsaI酶切圖譜中包含一條大小約為400bp特徵性片段，故定義RsaI酶切的基因型為EE型，如圖3中的泳道1或泳道2或泳道3所示；5號陽性樣品，該PCR產物在RsaI酶切圖譜中包含一條大小約為250bp特徵性片段，故定義RsaI酶切的基因型為FF型，如圖3中的泳道5所示。
B類酶切分型試劑包括大連寶生物工程有限公司生產的三種限制性內切酶HinfI(產品編號D1061A，1500U)，MspI(產品編號D1150A，750U)，RsaI(產品編號D1116A，300U)，還包括由我們提供的1個陽性樣品，編號為0(ABDDEF)。該陽性樣品濃度≥10納克/微升，體積500微升。
關於0號(ABDDEF)陽性樣品的解釋該陽性樣品是我們依次按照實施例2豬肉嫩度的選育方法中的步驟(1)、(2)、(3)進行後的PCR產物，該產物依照(4)步驟進行了酶切驗證0號陽性樣品，該PCR產物在HinfI酶切圖譜中包含兩條大小約為700bp、450bp特徵性片段，故定義HinfI酶切的基因型為AB型，如圖1中的泳道3或泳道5所示；0號陽性樣品，該PCR產物在MspI酶切圖譜中包含一條大小約為720bp特徵性片段，故定義MspI酶切的基因型為DD型，如圖2中的泳道2或泳道4所示；0號在陽性樣品，該PCR產物在RsaI酶切圖譜中包含兩條大小約為400bp、250bp特徵性片段，故定義RsaI酶切的基因型為EF型，如圖3中的泳道4所示。綜合三種酶切結果，0號陽性樣品在三種酶切後的基因型為ABDDEF型。
序列表210121121212DNA213Artificial220
223人工合成的用於PCR擴增的引物序列4001gcgtgctcataaagaaaaagc 21210221120212DNA213Artificial220
223人工合成的用於PCR擴增的引物序列4002tgcagatacaccagtaacag20
權利要求
1.一種用於豬肉嫩度的選育方法，包括用於種豬的嫩度選育，以生產具有最優嫩度的商品肥育豬的類型A，或用於篩選商品肥育豬群中最優嫩度的商品肥育豬只的類型B；其特徵是方法包括以下的步驟類型A(1)豬耳組織基因組DNA的提取；(2)豬CAST基因的PCR擴增；(3)PCR產物酶切反應，獲得酶切圖譜；(4)根據獲得的酶切圖譜與陽性樣品酶切圖譜的對照，確定待測豬CAST基因的基因型；(5)根據上述測定的基因型，確定待測豬的交配組合；或類型B(1)豬耳組織基因組DNA的提取；(2)豬CAST基因的PCR擴增；(3)PCR產物酶切反應，獲得酶切圖譜；(4)根據獲得的酶切圖譜與陽性樣品酶切圖譜的對照，確定待測豬CAST基因的基因型；(5)根據上述測定的基因型，確定待測豬是否為最優嫩度的商品肥育豬。
2.根據權利要求1所述的用於豬肉嫩度的選育方法，其特徵是在類型A的步驟(4)中確定出ADE、ADF、BDE、BDF四種基因型，在步驟(5)中確定下列交配組合CAST基因型為ADE的公豬與CAST基因型為BDF的母豬交配；或CAST基因型為ADF的公豬與CAST基因型為BDE的母豬交配；或CAST基因型為BDE的公豬與CAST基因型為ADF的母豬交配；或CAST基因型為BDF的公豬與CAST基因型為ADE的母豬交配。
3.根據權利要求1所述的用於豬肉嫩度的選育方法，其特徵是在類型B的步驟(4)中確定出具有ABDDEF基因型的豬為最優嫩度的商品肥育豬。
4.一種用於如權利要求1所述豬肉嫩度的選育方法的檢測試劑盒，其特徵是所述試劑盒包括基因組DNA提取試劑、PCR擴增試劑、酶切分型試劑；其中酶切分型試劑中包括有分別用於種豬的嫩度選育，以生產具有最優嫩度的商品肥育豬的5種陽性對照樣品；或/和用於商品肥育豬群中最優嫩度的商品肥育豬只的篩選的1種陽性對照樣品。
5.根據權利要求4所述的豬肉嫩度的選育方法的檢測試劑盒，其特徵是用於種豬的嫩度選育，以生產具有最優嫩度的商品肥育豬的5種陽性對照樣品為類型A選育方法中的步驟(1)、(2)、(3)進行後選出的PCR產物，這些產物依照(4)步驟進行了酶切驗證其中1號陽性樣品，該PCR產物在HinfI酶切圖譜中包含一條大小約為700bp特徵性片段，故定義HinfI酶切的基因型為AA型；2號陽性樣品，該PCR產物在HinfI酶切圖譜中包含一條大小約為450bp特徵性片段，故定義HinfI酶切的基因型為BB型；3號陽性樣品，該PCR產物在MspI酶切圖譜中包含一條大小約為720bp特徵性片段，故定義MspI酶切的基因型為DD型；4號在陽性樣品，該PCR產物在RsaI酶切圖譜中包含一條大小約為400bp特徵性片段，故定義RsaI酶切的基因型為EE型；5號陽性樣品，該PCR產物在RsaI酶切圖譜中包含一條大小約為250bp特徵性片段，故定義RsaI酶切的基因型為FF型。
6.根據權利要求4所述的豬肉嫩度的選育方法的檢測試劑盒，其特徵是用於商品肥育豬群中最優嫩度的商品肥育豬只的篩選的1種陽性對照樣品，該陽性對照樣品是按類型B選育方法中的步驟(1)、(2)、(3)進行後的PCR產物，該PCR產物依照步驟(4)進行了酶切驗證為在HinfI酶切圖譜中包含兩條大小約為700bp、450bp特徵性片段，故定義HinfI酶切的基因型為AB型；該PCR產物在MspI酶切圖譜中包含一條大小約為720bp特徵性片段，故定義MspI酶切的基因型為DD型；該PCR產物在RsaI酶切圖譜中包含兩條大小約為400bp、250bp特徵性片段，故定義RsaI酶切的基因型為EF型；所述陽性樣品在三種酶切後的基因型為ABDDEF型。
全文摘要
本發明提供了一種用於豬肉嫩度的選育方法，包括用於種豬的嫩度選育，以生產具有最優嫩度的商品肥育豬的類型A，或用於商品肥育豬群中最優嫩度的商品肥育豬只的篩選的類型B；其特徵是方法包括以下的步驟(1)豬耳組織基因組DNA的提取；(2)豬CAST基因的PCR擴增；(3)PCR產物酶切反應，獲得酶切圖譜；(4)根據獲得的酶切圖譜與陽性樣品酶切圖譜的對照，確定待測豬CAST基因的基因型；(5)根據上述測定的基因型，確定待測豬的交配組合或根據上述測定的基因型，確定待測豬是否為最優嫩度的商品肥育豬。本發明還涉及用於實施上述方法的檢測試劑盒。
文檔編號A01K67/02GK1768581SQ200510057169
公開日2006年5月10日 申請日期2005年7月15日 優先權日2005年7月15日
發明者王金勇, 白小青, 程豐, 陳四清 申請人:重慶市畜牧科學研究院