位點特異性聚乙二醇化的方法

2023-10-07 18:42:54 3

專利名稱：位點特異性聚乙二醇化的方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質、肽和其他分子中具有未氧化的巰基側鏈和游離a-氨基的半胱氨酸殘基的化學選擇性聚乙二醇化的方法。
背景技術：
不像通常通過口服途徑施用的小分子藥物，基於蛋白質和肽的治療劑 由於它們極其低的口服生物利用度通常通過注射施用。注射後大多數蛋白 質和肽會被酶快速斷裂並從機體清除，導致短暫的體內循環半衰期。這種 短暫的循環半衰期是效能較低、施用更頻繁、患者順應性減少以及蛋白質 和肽治療法成W高的主要原因。因此，強烈需要開發延長蛋白質和肽藥 物作用的持續時間的方法。
蛋白質或肽與聚乙二醇(PEG)的共價連接(Covalent attachment)已證 明是增加機體中蛋白質和肽的循環半衰期的有用方法(Abuchowski， A.等人， Cancer Biochem. Biophys" 1984， 7:175-186; Hershfield， M.S.等人，N. Engl. 丄Medicine 316:589-596;和Meyers, F. J.等人,Clin. Pharmacol. Ther.， 1991， 49:307-313)。 PEG與蛋白質和肽的共價連接不僅保護分子免遭酶降 解，而且降低它們從機體中清除的速率。與蛋白質連接的PEG的大小對蛋 白質的循環半衰期有顯著的影響。通常PEG越大，結合的蛋白質的體內半 衰期越長。幾種大小的PEG市售可得(Nektar Advanced PEGylation Catalog 2005-2006;和NOF DDS Catalogue Ver 7.1)，它們適用於產生具 有靶向循環半衰期的蛋白質和肽。PEG部分還增加蛋白質、肽和其他分子 的水溶性並且降低免疫原性(Katre， N.V.等人，Proc. Natl. Aced. Sci. USA, 1998， 84:1487-1491; 和Katre N.V.等人，J. Immunology, 19卯，144:209-213)。
已經在文獻中報導對蛋白質進行聚乙二醇化的幾種方法。例如，N-羥 基琥珀醯亞胺(NHS)-PEG用於聚乙二醇化蛋白質的N-末端和賴氨酸殘基 的游離氨基。由於蛋白質通常包含多個賴氨酸殘基和末端氨基，所以通過 使用這種方法蛋白質的多個位點將被聚乙二醇化。這種非選擇性聚乙二醇 化導致聚乙二醇化蛋白質的功效降低，因為多個PEG部分通常會擾亂蛋白 質與其生物靼分子之間的相互作用(Teh， L.-C.和Chapman, G.E.， Biochem. Biophys. Res. Comm., 1988， 150:391畫398;及Clark， R.等人，J. Biol. Chem. 1996， 271:21969-21977)。多位點的非選擇性聚乙二醇化還造成終產物的非 均質混合物。很多這些非均質的聚乙二醇化的蛋白質由於低的比活性而不 適於醫療用途。很難純化和表徵非均質的聚乙二醇化的蛋白質。不同批的 非均質的聚乙二醇化的蛋白質產物之間含量的變化通常很高，並且很難對 這些混合物進行質量控制。
儘管含有醛基的PEG已用於在還原劑的存在下對蛋白質的氨基末端 進行聚乙二醇化，但是這樣的方法不產生唯一的N-末端聚乙二醇化的蛋白 質，蛋白質的賴氨酸殘基也被聚乙二醇化。因此，所得的蛋白質也是非均 質混合物(Kinstler O. B.等人，U.S. Application No. 09/817,725)。這種方法 也具有使用苛刻的還原反應條件的缺點。還原劑如氰基硼氫化物能損害蛋 白質，造成較低的反應產率。
具有馬來醯亞胺官能團的PEG用於選擇性聚乙二醇化蛋白質中的半 胱氨酸殘基的游離巰基。這種方法經常需要帶來新半胱氨酸的點突變。由 於大多數蛋白質包含一個或多個半胱氨酸殘基，所以為選擇性阻止該新的 "非天然"半胱氨酸殘基的巰基與其他半胱氨酸殘基形成二硫鍵、並且然後 為了選擇性聚乙二醇化該特定的新半胱氨酸，需要複雜的反應條件(2004 年6月22日授權的美國專利第6,753,165號；和2003年8月19日授權的 美國專利第6，608，183號)。甚至在受控的反應條件下，其他半胱氨酸殘基 也可被聚乙二醇化並且獲得非均質材料。
曾報導生長激素類似物的乙醯苯丙氨酸殘基的位點特異性聚乙二醇
16化。這種方法需要帶來非天然胺基酸乙醯苯丙氨酸的點突變(於2005年1 月28號提交的美國專利申請第11/046,432號)。這種方法的缺點之一是含 非天然胺基酸如乙醯苯丙氨酸的蛋白質的聚乙二醇化只可在細菌中進行但 不可在哺乳動物細胞中進行。
由胺硫內酯與白介素-2的游離氨基的反應所產生的游離巰基和氨基已 用於聚乙二醇化所述蛋白質。然而，在這種方法中，所用的胺硫內酯與蛋 白質的N-末端和賴氨酸殘基中的任何氨基官能團均反應，這種方法不是位 點選擇性的(2001年10月30日授權的美國專利第6，310，180號)。
因此，儘管來自不同研究組的先前努力，但是仍強烈需要開發容易且 實用的蛋白質、肽和其他分子的位點特異性聚乙二醇化的方法。
發明概述
本發明一般涉及用於位點特異性聚乙二醇化蛋白質、肽和其他分子的 新方法。發現含有醛官能團的PEG(PEG-醛)與帶有未氧化的巰基側鏈和遊 離a-氨基的半胱氨酸可以在寬pH範圍內於水溶液中自發地反應，生成噻 唑烷，這使得PEG-醛可以與含有各種各樣官能團的肽片段反應，而這由 於PEG的親水性質和大尺寸(例如30千道爾頓)在以前是不確定的。我們 還發現僅有帶未氧化的巰基側鏈和游離a-氨基的半胱氨酸殘基與PEG-醛 反應。其他殘基中的其他官能團(例如不含游離a-氨基的半胱氨酸的巰基、 Arg的胍基、Lys的絲、Asp的側鏈氛基、Glu的側鏈氛基、Tyr的羥基 和Ser的羥基)不與PEG-醛反應。
通過使用本發明，蛋白質、肽和其他分子中僅含未氧化的巰基側鏈和
游離(X-氨基的半胱氨酸殘基被聚乙二醇化，而任何其他胺基酸均不被聚乙
二醇化。因此，本方法是高位點選擇性的。本發明聚乙二醇化方法的位點 特異性性質導致更為均質的產物，所述均質產物容易表徵、純化和製備並 且其不同批次之間的含量差異較小。連接在蛋白質和肽的特異性位點(即 N-末端半胱氨酸)的PEG應該有較少的機會與生物靶點相互作用，並因此 應導致更有效的治療劑。在本發明中，PEG的醛官能團可以與蛋白質或肽的N-末端的半胱氨 酸殘基的氨基和巰基官能團在pH範圍(例如pH 2-8)內在不同溫度(例如室 溫)在水溶液中自發地反應。在PEG和蛋白質或肽之間新產生的官能團是 1,3-噻唑烷。穀氨酸和天冬氨酸殘基的M和C-末端羧基、賴氨酸殘基的 氨基、精氨酸殘基的胍基、中間半胱氨酸殘基的巰基與絲氨酸、蘇氨酸和 酪氨酸殘基的羥基在這種聚乙二醇化條件下不與PEG的醛官能團反應。因 此，本發明提供N-末端半胱氨酸殘基的位點特異性聚乙二醇化。為了在聚 乙二醇化期間防止二硫鍵生成，可以使用還原劑如三(羧乙基)膦(TCEP)並 且所述反應可以在氮和氬下進行。可以使用1-4當量的PEG-醛。反應通常 在2至72小時完成，這取決於溶液的pH和所用PEG-醛的當量。如果聚 乙二醇化在未摺疊蛋白上發生，則所述蛋白產物可在聚乙二醇化後重摺疊。 如果聚乙二醇化在正確摺疊的蛋白上進行，則重摺疊步驟可省略。
用於本發明的PEGs可具有不同的分子量(例如2-40千道爾頓)，具有 線性、支鏈和多臂(multi-arm)結構並且包含一個或一個以上醛官能團。當 使用包含兩個醛官能團的PEG時，終產物將是蛋白質或肽二聚物並且之間 的連接基團(linker)是PEG。含有多個醛官能團的PEG將產生聚乙二醇化
的蛋白質或肽的多聚體。
緩衝溶液體系如PBS可用於控制反應溶液的pH。該反應溶液還可包 含其他試劑如EDTA以促進所述反應。
最終的聚乙二醇化的蛋白質和肽可通過不同純化方法如反相高效液相 色譜法(RP-HPLC)、尺寸排阻色語法和離子交換色譜法來純化，並且可以 通過MALDI-MS、色鐠法、電泳、胺基酸分析和蛋白質及肽測序技術來表 徵。
在第 一 實施方案中，本發明涉及使含游離醛基的PEG與分子的半胱氨 酸殘基的未氧化巰基側鏈和游離ot-氨基化學綴合的方法，所述方法包括使 所述PEG的游離醛基與所述半胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-氨 基反應以在產物中生成1，3-噻唑烷基團，其中所述產物具有以下結構
18其中Ri是所述PEG，且R2是所述分子。
在第二實施方案中，本發明涉及使含游離醛基的PEG與分子的半胱氨 酸殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-JL^化學綴合的方法，所述方法包括使 所述PEG的游離醛基與所述半胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-氨 基在反應溶液中反應以在中間體中生成1，3-噻唑烷基團，和將該反應溶液 的pH調節至約為7，由此所述中間體重排以生成終產物，其中所述中間體 具有以下結構
其中R!是所述PEG，且R2是所述分子。在這裡，術語"約，，表示± 10%。 在第三實施方案中，本發明涉及使含游離醛基的PEG與分子的青黴胺 殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-氨基化學綴合的方法，所述方法包括使所 述PEG的游離醛基與所述青審胺殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-M反 應以在產物中生成5，5-二甲基-1，3-噻唑烷基團，其中所述產物具有以下結 構
其中R是所述PEG ，且R2是所述分子。
在第四實施方案中，本發明涉及使含游離醛基的PEG與分子的青黴胺 殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-M化學綴合的方法，所述方法包括使所
且所述終產物具有以下結構:
19述PEG的游離趁基與所述青黴胺殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-氨基在 反應溶液中反應以在中間體中生成5，5-二曱基-1，3-噻唑烷基團，和將該反 應溶液的pH調節至約為7，由此所述中間體重排以形成終產物，其中所述 中間體具有以下結構
且所述終產物具有以下結構
hq
s、
n一 \r h
其中R,是所述PEG，且R2是所述分子。在這裡，術語"約，，表示± 10%。 在第五實施方案中，本發明涉及使含游離醛基的PEG與分子的同型半 胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-M化學綴合的方法，所述方法包 括使所述PEG的游離醛基與所述同型半胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈和 游離a-氨基反應以在產物中生成六元環系統，其中所述產物具有以下結構
其中&是所述PEG，且R2是所述分子。
在第六實施方案中，本發明涉及使含游離醛基的PEG與分子的同型半 胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈和游離(X-J^化學綴合的方法，所述方法包 括將所述PEG的游離醛基與所述同型半胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈和 游離a-氨基在反應溶液中反應以在中間體中生成六元環系統，和將該反應 溶液的pH調節至約為7，由此所述中間體重排以形成終產物，其中所述中 間體具有以下結構
20且所述終產物具有以下結構:
其中R,是所述PEG，且R2是所述分子。在這裡，術語"約，，表示± 10%。 在第七實施方案中，本發明涉及將含游離醛基的PEG與分子的硒代半 胱氨酸殘基的未氧化游離硒基和游離a-M化學綴合的方法，所述方法包 括將所述PEG的游離醛基與所述竭代半胱氨酸殘基的未氧化游離硒基和 游離a-氨基反應以在產物中生成五元環系統，其中所述產物具有以下結構
其中R,是所述PEG，且R2是所述分子。
在第八實施方案中，本發明涉及將含游離醛基的PEG與分子的硒代半 胱氨酸殘基的未氧化游離硒基和游離a-^化學綴合的方法，所述方法包 將所述PEG的游離醛基與所述竭代半胱氨酸殘基的未氧化游離硒基和遊 離a-tJ^在反應溶液中反應以在中間體中生成五元環系統，並且將該反應 溶液的pH調節至約為7，由此所述中間體重排以形成終產物，其中所述中 間體具有以下結構
其中！^是所述PEG,且R2是所述分子。在這裡，術語"約，，表示± 10%。 在第九實施方案中，本發明涉及將含游離醛基的PEG與分子的N-甲 基-半胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-甲基-tt化學綴合的方法，
且所述終產物具有以下結構:
21所述方法包括將所述PEG的游離醛基與所述N-甲基-半胱氨酸殘基的未氧 化巰基側鏈和游離a-曱基-氨基反應以在產物中生成3-甲基-l，3-噻唑烷基 團，其中所述產物具有以下結構
formula see original document page 22 ，
其中是所述PEG，且R2是所述分子。
在本發明的每一個前述實施方案中-即本發明的第一到第九實施方案 -所述游離醛基通過連接基團與所述PEG連接，所述連接基團可包含醯 胺、酯、磺醯胺、磺醯基、巰基、氧基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬 來醯亞胺或胺官能團或其任何組合。
在第十實施方案中，本發明涉及將含游離馬來醯亞胺基團的PEG與分 子的N-甲基-半胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈化學綴合的方法，所述方法 包括將所述PEG的游離馬來醯亞胺基團與所述N-曱基-半胱氨酸的未氧化 巰基側鏈反應以生成綴合產物，其中所述綴合產物具有以下結構
其中R,是所述PEG，且R2是所述分子。
在第十一實施方案中，本發明涉及將含游離馬來醯亞胺基團的PEG與 分子的青黴胺殘基的未氧化巰基側鏈化學綴合的方法，所述方法包括將所 述PEG的游離馬來醯亞胺基團與所述青黴胺殘基的未氧化巰基側鏈反應 以生成綴合產物，其中所述綴合產物具有以下結構其中R！是所述PEG ，且R2是所述分子。
在第十二實施方案中，本發明涉及將含游離馬來醯亞胺基團的PEG與 分子的同型半胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈化學綴合的方法，所述方法包 括將所述PEG的游離馬來醯亞胺基團與所述同型半胱氨酸殘基的未氧化 巰基側鏈反應以生成綴合產物，其中所述綴合產物具有以下結構
其中Ri是所述PEG，且R2是所述分子。
在第十三實施方案中，本發明涉及將含游離馬來醯亞胺基團的PEG與 分子的硒代半胱氨酸殘基的未氧化竭基側鏈化學綴合的方法，所述方法包 括將所述PEG的游離馬來醯亞胺基團與所述硒代半胱氨酸殘基的未氧化 硒基側鏈反應以生成綴合產物，其中所述綴合產物具有以下結構
其中R!是所述PEG，且Rz是所述分子。
在本發明的每一個前述實施方案-即本發明的第十到第十三實施方案 一中，游離馬來醯亞胺基團通過連接基團與所述PEG連接，所述連接基團 可包含醯胺、S旨、磺醯胺、磺醯基、巰基、氧基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來醯亞胺或胺官能團或其任何組合。
在本發明的所有前述實施方案中，PEG可具有線性結構、支鏈結構或 多臂結構。
在本發明的所有前述實施方案中，PEG具有約100道爾頓至約500,000 道爾頓的平均分子量，且更優選具有約1,000道爾頓至約50,000道爾頓的 平均分子量。
發明詳述
本領域技術人員被認為可以根據本文描述利用本發明至其最充分的程 度。因此，下面特定的實施方案應理解為僅僅是舉例說明性的，而無論如 何並不限定本發明的剩餘部分。
除非另有定義，本文所用的所述^L術和科學術語具有如本發明所屬領 域的普通技術人員通常所理解的相同含義。同樣，本文所提到的所有出版 物、專利申請、專利和其他參考文獻各自以其全部內容通過引用併入。
命名法和縮寫符號含義
Ala或A丙氨酸
Arg或R精氨酸
Asn或N天冬醯胺
Asp或D天冬氨酸
Cys或C半胱氨酸
hCys同型半胱氨酸
Gln或Q穀氨醯胺
Glu或E穀氨酸
Gly或G甘氨酸
His或H組氨酸
Ile或I異亮氨酸Lieu或L Lys或K Met或M Nle
N-Me-Cys或NmeCys
PEG Pen
Phe或F Pro或P Ser或S sdcuoCys Thr或T Trp或W Tyr或Y Val或V
亮氨酸 賴氨酸 甲硫氨酸 正亮氨酸
N-曱基-半胱氨酸，其具有以下結構:
HS
N
CH3 6 聚乙二醇
青
黴胺
苯丙氨酸
脯氨酸
絲氨酸
硒代半胱氨酸 蘇氨酸 色氨酸 酪氨酸
本文所用的某些其他縮寫如下定義:
Boc 叔丁氧羰基
Bzl 千基
DCM 二氯曱烷
DIC N，N-二異丙基碳二亞胺
DIEA 二異丙基乙胺
Dmab 4-{]\-(1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代環己亞基)-3畫曱丁基)-氨基} 千基
DMAP 4-(二甲^&)吡啶image see original document page 26formula see original document page 27馬來醯亞胺具有以下結構
O
N
Prd
O
吡咯烷-2，5-二酮，其具有以下結構:O
N
O
NMeCys(Prd-PEG)具有以下結構:
O
PEG—NS.
O
PEG — N
O
S
HN
O
hCys(Prd-PEG)具有以下結構:
O
Pen(Prd-PEG)具有以下結構:
O
NIC
28selenoCys(Prd-PEG)具有以下結構
formula see original document page 29
PEG是眾所周知的、水溶性聚合物，它是市售可得的或可根據本領域 已知的方法通過乙二醇的開環聚合來製備(Sandler和Karo， Polymer Synthesis, Academic Press, New York,第3巻，第138-161頁)。術語"PEG，， 按廣義使用，包括任何聚乙二醇分子，而不涉及PEG的大小和末端修飾。 PEG可具有線性、支鏈或多臂結構。
實施例
實施例1)製備H-NMeCys-Lys-Phe-NH;
formula see original document page 29
將Rink醯胺MBHA樹脂(211mg， 0.152毫摩爾)(Novabiochem， San Diego, Calif.)在二氯曱烷(DCM)中溶脹，並用二甲基甲醯胺(DMF)洗滌。 通過用25。/。哌咬/DMF (10mL)溶液處理2 x 10分鐘，使樹脂脫封閉 (debolck)。將樹脂用DMF (lOmL)洗滌三次。通過用Fmoc-Phe-OH(Novabiochem， San Diego, Calif.) (235mg， 0.606毫摩爾)、l畫羥基苯並三喳 (HOBt) (92.3mg， 0.606毫摩爾)和二異丙基碳二亞胺(DIC) (77mg， 0.606亳 摩爾)在N-曱基吡咯烷酮(NMP) (2mL)中的溶液處理l小時，將第一個氨 基酸偶聯到樹脂。將樹脂過濾，並用DMF(10mL)洗滌三次。
通過用25。/。哌咬/DMF (10mL)溶液處理2 x 10分鐘，將Fmoc保護基 去除，並且將樹脂用DMF (10mL)洗滌三次。於存在NMP (2mL)中的HOBt (0.606毫摩爾)和DIC (0.606毫摩爾)的情況下1小時，將Fmoc-Lys(Boc)-OH (Novabiochem, San Diego, Calif.) (285mg， 0.606毫摩爾)偶聯到所得的游離 胺樹脂。
如上重複脫封閉和洗滌操作。通過使用NMP(2mL)中的HOBt(51mg， 0.33 毫摩爾)和DIC (83.8mg， 0.66 毫摩爾)12 小時，將 Fmoc-N誦Me-Cys(Trt)-OH (Timen Chemicals, Lodz， Poland.) (100mg， 0.167 亳摩爾)偶聯到所得的肽-樹脂。通過使用NMP(2mL)中的四甲基氟代甲脒 鏞五氟磷酸鹽(TFFH) (20mg, 0.075毫摩爾)和二異丙基乙胺(DIEA) (19.4mg， 0.150毫摩爾)l小時，重複Fmoc-N-Me-Cys(Trt)-OH (45mg， 0.075 亳摩爾)的偶聯。如上重複脫封閉和洗滌操作。將樹脂用DCM洗滌三次， 然後用甲醇洗滌三次。在空下乾燥所述樹脂。
通過用三異丙基矽烷(trispr叩ylsilane)/三氟乙酸(TFA) pmL)振搖樹 脂2小時，將肽從所述樹脂上斷裂下來。將樹脂過濾並用DCM (2mL)洗滌。 將濾液合併，且濃縮至lmL。加入乙醚(35mL)以沉澱肽。離心後收集沉 澱的肽。將沉澱物溶解於水和乙腈中，然後凍幹。
將所得的粗品在反相HPLC系統(Lima 5微米C8 (2) 100 X 20mm柱) 上純化，從100o/o緩沖液A(水中的0.iy。TFA)和00/0緩衝液B(乙腈中的 0.1% TFA)至80%緩衝液A和20%緩衝液B洗脫30分鐘並在235nm下 監控。凍幹後，獲得51.2 mg終產物。通過ESI質譜分析法檢測到410.3 道爾頓的M+l離子，這與計算的分子量409.6道爾頓相符。
實施例2) 製備mPEG-Tmc-Lvs-Phe-NH2
mPEG在此具有CH30(CH2CH20V(CH2)2-的結構，其中n為正整數。CH30(CH2CH20)n-CH2CH
CH30(CH2CH20)n-CH2CH
將實施例1的肽產物(0.5mg， 1.22微摩爾)溶解於l.OmL pH 4緩沖液 (20毫摩爾NaOAc， 150毫摩爾NaCl和1毫摩爾EDTA)。將mPEG-醛(1.5 當量，平均分子量為31378道爾頓，NOF Corp., Tokyo, Japan)加至所得溶 液中。根據通過使用反相分析型HPLC系統(Vydac C18 5^i肽/蛋白質柱，4.6 x 250mm)所進行的分析，反應在室溫下27小時後大約完成卯％。將反應 〉'昆合物上才羊於5mL ZebaTM脫鹽自方走柱(Pierce Biotechnology, Rockford， IL)。凍幹後獲得白色泡沫狀物(36.7mg)。
實施例3) 製備H-NMeCvs(Prd-PEG)畫Lvs-Phe-NH2
將實施例1的肽產物(0.5mg， 1.22樹摩爾)溶解於1.0mL pH 7緩衝液 (20毫摩爾NaOAc)。將a-(3-(3-馬來醯亞氨基-l-氧代丙基)^J^)丙基-co-甲 氧基-聚氧乙烯(1.5當量，平均分子量為11962道爾頓，NOF Corp., Tokyo, Japan)和2當量的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)加至所得溶液。根據通過 使用反相分析型HPLC系統(Vydac C18 ^/蛋白質柱，4.6 x 250mm)所進 行的分析，反應在室溫下1小時後完成。將反應混合物上樣於5mL ZebaTM 脫鹽自旋柱(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)。凍幹後獲得白色泡沫狀 物(15.1mg)。將該產物在High Trap SPXL陽離子交換柱(GEHealthcare, Piscataway， NJ)上進一步純化。經純化的產物的分子量分布通 過使用MALDI-TOF質譜分析法來確定。所獲得的實驗結果與計算的分子 量分布一致。
實施例4) 製備H-Cys-Lys-Phe-NH2
使用Rink醯胺MBHA樹脂(347mg， 0.25毫摩爾)(Novabiochem， San Diego, Calif.)在LibertyTM型微波肽合成儀(CEM Corp., Matthews, NC)上 合成標題肽。利用HBTU活化，以四倍過量使用胺基酸Fmoc-Phe-OH、 Fmoc Lys(Boc)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH (Novabiochem， San Diego, CA)， 並且重複進行每個偶聯。
通過用三異丙^J^烷/三氟乙酸(TFA)和1%二硫蘇糖醇(10mL)振搖 樹脂3小時，將肽從所述樹脂上斷裂。將樹脂過濾並用DCM (5mL)洗滌。 將該濾液合併，且濃縮至3mL。加入乙醚(35mL)以沉澱肽。離心後收集 沉澱的肽。將沉澱物溶解於水和乙腈中，然後凍幹。
將所得的粗品在反相HPLC系統(Luna5微米C8 (2) 100 X 20mm柱) 上純化，從100。/o緩沖液A(水中的0.1。/。TFA)和0。/0緩沖液B(乙腈中的 0.1% TFA)至70%緩衝液A和30%緩衝液B洗脫35分鐘並在235nm下 監控。凍幹後，獲得89.1 mg終產物。通過ESI質譜分析法檢測396.5道 爾頓的M+1離子，這與計算的分子量395.5道爾頓相符。
實施例5)製備mPEG-Tha-Lvs-Phe-NH2
mPEG在此具有CH30(CH2CH20V(CH2)2-的結構，其中n為正整數。
32CH30(CH2CH20)n-CH2CH
CH30(CH2CH20)n-CH2CH
將實施例4的肽產物(O.Smg, 126微摩爾)溶解於1.0mLpH4緩衝液 (20毫摩爾NaOAc)。將mPEG-醛(1.5當量，平均分子量為20644道爾頓， NOF Corp., Tokyo, Japan)和TCEP (2.0當量)加至所得溶液中。根據通過 使用反相分析型HPLC系統(Vydac C18 5|n肽/蛋白質柱，4.6 x 250mm)所進 行的分析，反應在室溫下3小時後大約完成85%。將反應混合物加樣於 lOmL ZebaTM脫鹽自》走柱(Pierce Biotechnology, Rockford， IL)。凍幹後獲 得白色泡沫狀物。
實施例6) 製備H-hCvs- Lvs-Phe-NH2
使用Rink醯胺MBHA樹脂(347mg， 0.25毫摩爾)(Novabiochem, San Diego， Calif.)在LibertyTM型微波肽合成儀(CEM Corp" Matthews, NC)上 合成標題肽。利用HBTU活化，以四倍過量使用胺基酸Fmoc-Phe-OH、 Fmoc Lys(Boc)-OH和Fmoc-hCys(Trt)畫OH (Novabiochem, San Diego, CA)，並且重複進行每個偶聯。
通過用三異丙M烷/三氟乙酸(TFA)和1%二硫蘇糖醇(10mL)振搖 樹脂3小時，將M所述樹脂上斷裂。將樹脂過濾並用DCM (10mL)洗滌。 將該濾液合併，且濃縮至3mL。加入乙醚(35mL)以沉澱肽。離心後收集 沉澱的肽。將沉澱物溶解於7JC和乙腈中，然後凍幹。
將所得的粗品在反相HPLC系統(Luna5微米C8 (2) 100X20mm柱) 上純化，從100。/。緩衝液A(水中的0.1。/oTFA)和0。/。緩衝液B(乙腈中的0.1% TFA)至75%緩衝液A和25%緩衝液B洗脫35分鐘並在235nm下 監控。凍幹後，獲得85.7 mg終產物。通過ESI質鐠分析法檢測到410.5 道爾頓的M+1離子，這與計算的分子量409.6道爾頓相符。 實施例7) 製備H-Pen- Lys-Phe-NBb
使用Rink醯胺MBHA樹脂(347mg, 0.25毫摩爾)(Novabiochem, San Diego， Calif.)在LibertyTM型微波肽合成儀(CEM Corp., Matthews, NC)上 合成標題肽。利用HBTU活化，以四倍過量使用胺基酸Fmoc-Phe-OH、 Fmoc Lys(Boc)-OH和Fmoc畫Pen(Trt)-OH (Novabiochem， San Diego， CA)， 並且重複進行每個偶聯。
通過用三異丙基矽烷/三氟乙酸(TFA)和1%二硫蘇糖醇(10mL)振搖 樹脂3小時，將M所述樹脂上斷裂。將樹脂過濾並用DCM (5mL)洗滌。 將該濾液合併，且濃縮至3mL。加入乙醚(35mL)以沉澱肽。離心後收集 沉澱的肽。將沉澱物溶解於水和乙腈中，然後凍幹。
將所得的粗品在反相HPLC系統(Luna 5微米C8 (2) 100 X 20mm柱) 上純化，從100y。緩衝液A(水中的0.1。/oTFA)和0。/。緩衝液B(乙腈中的 0.1% TFA)至80%緩衝液A和20%緩衝液B洗脫35分鐘並在235nm下 監控。凍幹後，獲得83.9 mg終產物。通過ESI質譜分析法檢測到424.5 道爾頓的M+1離子，這與計算的分子量423.6道爾頓相符。
實施例8) 製備mPEG-Dma- Lys-Phe-NH2
mPEG在此具有CH30(CH2CH20)n-(CH2)2-的結構，其中n為正整數。CH30(CH2CH20)n-CH2CH:
CH30(CH2CH20)n-CH2CH
KF-NH2
將實施例7的肽產物(0.5mg, 1.18獨源爾)溶解於1.0mLpH4緩衝液 (20毫摩爾NaOAc)。將mPEG-醛(1.5當量，平均分子量為20644道爾頓， NOF Corp., Tokyo, Japan)和TCEP (2.0當量)加至所得溶液中。根據通過 l吏用反相分析型HPLC系統(Vydac C18 5fi肽/蛋白質柱，4.6 x 250mm)所進 行的分析，反應在室溫下3小時後大約完成80%。將反應混合物加樣於 10mL ZebaTM脫鹽自旋柱(Pierce Biotechnology, Rockford， IL)。凍幹後獲 得白色泡沫狀物。
實施例9) 製備mPEG-Thc-Lvs-Phe-NH2
mPEG在此具有CH30(CH2CH20V(CH2)2-的結構，其中n為正整數。
將實施例6的肽產物(0.5mg，1.22賴b學爾)溶解於l.OmL pH 4緩衝液 (20毫摩爾NaOAc)。將mPEG-醛(1.5當量，平均分子量為20644道爾頓， NOF Corp., Tokyo, Japan)和TCEP (2.0當量)加至所得溶液中。根據通過 4吏用反相分析型HPLC系統(Vydac C18 5jt肽/蛋白質柱，4.6 x 250mm)所進 行的分析，反應在室溫下3小時後大約完成卯％。將反應混合物加樣於 10mL ZebaTM脫鹽自旋柱(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)。凍幹後獲 得白色泡沫狀物。
CH30(CH2CH20)n-CH2CH
H2N 、 O
KF-NH
35實施例10) 製備selenoCys- Lys-Phe-NB^
HSe、
,y'詣2
6
基本上依照實施例1中所述的操作合成標題肽。Fmoc-selenoCys (4畫MeOBzl)-OH (Novabiochem, San Diego， CA)用於在N-末端併入硒代半 胱氨酸。
實施例11) 製備mPEG-Sez- Lys-Phe-NH2
mPEG在此具有CH30(ch2ch20)n-(ch2)2-的結構，其中n為正整數。
HSe、
.0
CH30(CH2CH20)n-CH2CH2^^+ h n^^^KF-NH:
H 2
O
Se、
~^ CH30(CH2CH20)n-CH2CH2"
3 22 n 22 XN^\ /KF-NHc
H
O
基本上依照實施例2中所述的操作合成標題肽。從實施例10獲得的產 物是肽起始材料。
O
H
CH30(CH2CH20)n-CH2ClV 〇 實施例12)製備_^
mPEG在此具有CH30(ch2ch20v(ch2)2-的結構，其中n為正整數。
在60°C、 mPEG-C(O)OH銫鹽與溴代乙醛二甲基乙縮醛在DMF中反
應2天。去除溶劑後，在0。C將產物用DCM中的40% TFA和少量水處
理約30分鐘。
實施例13) 製備mPEG-Hth-Lys-Phe-NH2
HO ,S
CH30(CH2CH20)n-CH2CH2
n, y KF—NH2
O
在此mPEG具有ch30(ch2ch20)n-(ch2)2-的結構，其中n為正整數:基本上依照實施例2中所述的操作合成標題肽。肽起始材料是從實施 例4獲得的產物。PEG-醛起始材料是從實施例12獲得的產物。存在調節 緩衝液溶液的pH的額外步驟在pH4於室溫靜置2小時後，將反應溶液 的pH調節至7，並在室溫靜置3天後純化。
實施例14) 製備mPEG-Hdm-Lvs-Phe-NH7
此處mPEG具有CHbO(CH2CH20V(CH2)2-的結構，其中n為正整數。 基本上依照實施例8中所述的操作合成標題肽。肽起始材料是從實施 例7獲得的產物。PEG-醛起始材料是從實施例12獲得的產物。存在調節 緩衝液溶液的pH的額外步驟在室溫靜置過夜後，將反應溶液的pH調 節至7，並在純化前於室溫靜置溶液3天。
實施例15) 製備mPEG-Haz-Lys-Phe-NBb
此處mPEG具有CH30(CH2CH20V(CH2)2-的結構，其中n為正整數。 基本上依照實施例9中所述的操作合成標題肽。肽起始材料是從實施 例6獲得的產物。PEG-醛起始材料是從實施例12獲得的產物。存在調節 緩衝液溶液的pH的額外步驟在pH4於室溫靜置過夜後，將反應溶液的 pH調節至7，並在純化前於室溫靜置溶液3天。 實施例16) 製備mPEG-Hsz-Lys-Phe-NH^
在此mPEG具有CH30(CH2CH20)n-(CH2)2-的結構，其中n為正整數。基本上依照實施例11中所述的操作合成標題肽。肽起始材料是從實施
例IO獲得的產物。PEG-醛起始材料是從實施例12獲得的產物。存在調節 緩衝液溶液的pH的額外步驟在pH4於室溫靜置2小時後，將反應溶液 的pH調節至7，並在純化前於室溫靜置溶液3天。 實施例17) 製備H-Pen(Prd-PEG)-Lys-Phe-NH，
基本上依照實施例3中所述的操作合成標題肽。肽起始材料是從實施 例7獲得的產物。
實施例18) 製備H-hCys(Prd-PEG)-Lys-Phe-NBb
將實施例6的肽產物(l.Omg， 2.44孩傳爾)溶解於l.OmL pH 7緩沖液 (20毫摩爾NaOAc)。將a-(3-(3-馬來醯亞氨基-l-氧代丙基)M)丙基-to-曱 氧基-聚氧乙烯(1.5當量，平均分子量為11962道爾頓，NOF Corp., Tokyo, Japan)和2當量的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)加至所得溶液。根據通過 使用反相分析型HPLC系統(Vydac C18 肽/蛋白質柱，4.6 x 250mm)所進 行的分析，在室溫下1小時後反應完全。將反應混合物加樣於lOmL ZebaTM 脫鹽自旋柱(Pierce Biotechnology, Rockford，IL)。凍幹後獲得白色泡沫狀 物。
實施例19) 製備H畫selenoCvs(Prd-PEG)-Lys-Phe-NH2
38formula see original document page 39基本上依照實施例3中所述的操作合成標題肽。肽起始材料是從實施 例IO獲得的產物。
權利要求
1.一種將含游離醛基的PEG與分子的半胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈和游離α-氨基化學綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離醛基與所述半胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈和游離α-氨基反應以在產物中生成1，3-噻唑烷基團，其中所述產物具有以下結構其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。
2. —種將含游離醛基的PEG與分子的半胱氨酸殘基的未氧化巰基側 鏈和游離(x-氨基化學綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離醛基 與所述半胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-tj^在反應溶液中反應以 在中間體中生成1，3-噻唑烷基團，和將所述反應溶液的pH調節至約為7， 由此所述中間體重排以形成終產物，其中所述中間體具有以下結構其中Ri是所述PEG,且R2是所述分子。
3. 根據權利要求1或2的方法，其中游離醛基通過連接基團與所述 PEG連接，所述連接基團可包含醯胺、S旨、磺醯胺、磺醯基、巰基、氧基、 烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來醯亞胺或胺官能團，或其任何組合。
4. 根據權利要求1或2的方法，其中所述PEG具有線性結構。
5. 根據權利要求1或2的方法，其中所述PEG具有支鏈結構。
6. 根據權利要求1或2的方法，其中所述PEG具有多臂結構。且所述終產物具有以下結構:
7. 根據權利要求1或2的方法，其中一個或多個游離醛基與所述PEG 連接。
8. 根據權利要求1或2的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓至 約500,000道爾頓的平均分子量。
9. 根據權利要求8的方法，其中所述PEG具有約1,000道爾頓至約 50,000道爾頓的平均分子量。
10. 根據權利要求1或2的方法，其中所述半胱氨酸殘基為L型。
11. 根據權利要求1或2的方法，其中所述半胱氨酸殘基為D型。
12. 根據權利要求1或2的方法，其中所述半胱氨酸殘基在蛋白質中。
13. 根據權利要求1或2的方法，其中所述半胱氨酸殘基在肽中。
14. 根據權利要求1或2的方法，其中所述半胱氨酸殘基在有機分子中。
15. 根據權利要求1或2的方法，其中所述產物或所述終產物包含一 個或多個蛋白質、肽或有機分子部分、或其任何組合。
16. 根據權利要求2的方法，其中所述中間體包含一個或多個蛋白質、 肽或有機分子部分、或其任何組合。
17. 根據權利要求1或2的方法，其中還原劑用於所述反應中。
18. 根據權利要求16的方法，其中所述還原劑選自由TCEP和含未氧 化巰基的化合物組成的組。
19. 一種將含游離醛基的PEG與分子的青黴胺殘基的未氧化巰基側鏈 和游離a-M化學綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離醛基與 所述青黴胺殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-M反應以在產物中生成5，5-二曱基-l，3-噻唑烷基團，其中所述產物具有以下結構formula see original document page 3其中Ri是所述PEG ，且R2是所述分子。
20. —種將含游離醛基的PEG與分子的青黴胺殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-tj^化學綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離醛基與 所述青黴胺殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-氨基在反應溶液中反應以在中 間體中生成5，5-二曱基-1，3-噻唑垸基團，和將所述反應溶液的pH調節至約 為7，由此所述中間體重排以形成終產物，其中所述中間體具有以下結構其中R!是所述PEG，且R2是所述分子。
21. 根據權利要求19或20的方法，其中游離醛基通過連接基團與所 述PEG連接，所述連接基團可包含醯胺、酯、磺醯胺、磺醯基、巰基、氧 基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來醯亞胺或胺官能團，或其任何組合。
22. 根據權利要求19或20的方法，其中所述PEG具有線性結構。
23. 根據權利要求19或20的方法，其中所述PEG具有支鏈結構。
24. 根據權利要求19或20的方法，其中所述PEG具有多臂結構。
25. 根據權利要求19或20的方法，其中一個或多個游離醛基與PEG 連接。
26. 根據權利要求19或20的方法，其中所述PEG具有約IOO道爾頓 至約500,000道爾頓的平均分子量。
27. 根據權利要求26的方法，其中所述PEG具有約1,000道爾頓至約 50,000道爾頓的平均分子量。
28. 根據權利要求19或20的方法，其中所述青黴胺殘基為L型。
29. 根據權利要求19或20的方法，其中所述青黴胺殘基為D型。
30. 根據權利要求19或20的方法，其中所述青黴胺殘基在蛋白質中。
31. 根據權利要求19或20的方法，其中所述青黴胺殘基在肽中。且所述終產物具有以下結構:
32. 根據權利要求19或20的方法，其中所述青黴胺殘基在有機分子中。
33. 根據權利要求19或20的方法，其中所述產物或所述終產物包含 一個或多個蛋白質、肽或有機分子部分、或其任何組合。
34. 根據權利要求19或20的方法，其中所述中間體包含一個或多個 蛋白質、肽或有機分子部分、或其任何組合。
35. 根據權利要求19或20的方法，其中還原劑用於所述反應中。
36. 根據權利要求35的方法，其中所述還原劑選自由TCEP和含未氧 化巰基的化合物組成的組。
37. —種將含游離醛基的PEG與分子的同型半胱氨酸殘基的未氧化巰 基側鏈和游離a-M化學綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離 醛基與所述同型半胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-氨基反應以在產 物中生成六元環系統，其中所述產物具有以下結構其中R是所述PEG，且R2是所述分子。
38. —種將含游離醛基的PEG與分子的同型半胱氨酸殘基的未氧化巰 基側鏈和游離a-M化學綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離 醛基與所述同型半胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-氨基在反應溶液 中反應以在中間體中生成六元環系統，和將該反應溶液的pH調節至約為 7，由此所述中間體重排以形成終產物，其中所述中間體具有以下結構且所述終產物具有以下結構:R1 R2其中Rt是所述PEG，且R2是所述分子。
39. 根據權利要求37或38的方法，其中游離醛基通過連接基團與所 述PEG連接，所述連接基團可包含醯胺、酯、磺醯胺、磺醯基、巰基、氧 基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來醯亞胺或胺官能團，或其任何組合。
40. 根據權利要求37或38的方法，其中所述PEG具有線性結構。
41. 根據權利要求37或38的方法，其中所述PEG具有支鏈結構。
42. 根據權利要求37或38的方法，其中所述PEG具有多臂結構。
43. 根據權利要求37或38的方法，其中一個或多個游離醛基與所述 PEG連接。
44. 根據權利要求37或38的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓 至約500,000道爾頓的平均分子量。
45. 根據權利要求44的方法，其中所述PEG具有約1，000道爾頓至約 50,000道爾頓的平均分子量。
46. 根據權利要求37或38的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基為L型。
47. 根據權利要求37或38的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基為D型。
48. 根據權利要求37或38的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基在蛋 白質中。
49. 根據權利要求37或38的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基在肽中。
50. 根據權利要求37或38的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基在有 機分子中。
51. 根據權利要求37或38的方法，其中所述產物或終產物包含一個 或多個蛋白質、肽或有機分子部分、或其任何組合。
52. 根據權利要求37或38的方法，其中所述中間體包含一個或多個 蛋白質、肽或有機分子部分、或其任何組合。
53. 根據權利要求37或38的方法，其中還原劑用於所述反應中。
54. 根據權利要求53的方法，其中所述還原劑選自由TCEP和含未氧 化巰基的化合物組成的組。
55. —種將含游離醛基的PEG與分子的硒代半胱氨酸殘基的未氧化遊 離硒基和游離a-M化學綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離 醛基與所述竭代半胱氨酸殘基的未氧化游離硒基和游離a-M反應以在產 物中生成五元環系統，其中所述產物具有以下結構其中&是所述PEG，且R2是所述分子。
56. —種將含游離醛基的PEG與分子的硒代半胱氨酸殘基的未氧化遊 離竭基和游離a-tJ^化學綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離 醛基與所述竭代半胱氨酸殘基的未氧化游離硒基和游離a-氨基在反應溶液 中反應以在中間體中生成五元環系統，和將該反應溶液的pH調節至約為 7,由此所述中間體重排以形成終產物，其中所述中間體具有以下結構其中R,是所述PEG,且R2是所述分子。
57.根據權利要求55或56的方法，其中游離醛基通過連接基團與所 述PEG連接，所述連接基團可包含醯胺、酯、磺醯胺、磺醯基、巰基、氧 基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來醯亞胺或胺官能團，或其任何組合。且所述終產物具有以下結構:
58. 根據權利要求55或56的方法，其中所述PEG具有線性結構。
59. 才艮據權利要求55或56的方法，其中所述PEG具有支鏈結構。
60. 根據權利要求55或56的方法，其中所述PEG具有多臂結構。
61. 根據權利要求55或56的方法，其中一個或多個游離醛基與所述 PEG連接。
62. 根據權利要求55或56的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓 至約500,000道爾頓的平均分子量。
63. 根據權利要求62的方法，其中所述PEG具有約l，OOO道爾頓至約 50,000道爾頓的平均分子量。
64. 根據權利要求55或56的方法，其中所述硒代半胱氨酸殘基為L型。
65. 根據權利要求55或56的方法，其中所述硒代半胱氨酸殘基為D型。
66. 根據權利要求55或56的方法，其中所述躅代半胱氨酸殘基在蛋 白質中。
67. 根據權利要求55或56的方法，其中所述竭代半胱氨酸殘基在肽中。
68. 根據權利要求55或56的方法，其中所述竭代半胱氨酸殘基在有 機分子中。
69. 根據權利要求55或56的方法，其中所述產物或所述終產物包含 一個或多個蛋白質、肽或有^f幾分子部分、或其任何組合。
70. 根據權利要求56的方法,其中所述中間體包含一個或多個蛋白質、 肽或有機分子部分、或其任何組合。
71. 根據權利要求55或56的方法，其中還原劑用於所述反應中。
72. 根據權利要求71的方法，其中所述還原劑選自由TCEP和含未氧 化巰基或未氧化游離硒基的化合物組成的組。
73. —種將含游離醛基的PEG與分子的N-甲基-半胱氨酸殘基的未氧 化巰基側鏈和游離a-甲基-M化學綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離醛基與所述N-曱基-半胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈和游離a-曱基-氨基反應以在產物中生成3-甲基-l，3-噻唑烷基團，其中所述產物具有以下 結構其中R是所述PEG，且R2是所述分子。
74. 根據權利要求73的方法，其中游離醛基通過連接基團與所述PEG 連接，所述連接基團可包含醯胺、酯、磺醯胺、磺醯基、巰基、氧基、烷 基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來醯亞胺或胺官能團，或其任何組合。
75. 根據權利要求73的方法，其中所述PEG具有線性結構。
76. 根據權利要求73的方法，其中所述PEG具有支鏈結構。
77. 根據權利要求73的方法，其中所述PEG具有多臂結構。
78. 根據權利要求73的方法，其中一個或多個游離醛基與所述PEG 連接。
79. 根據權利要求73的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓至約 500,000道爾頓的平均分子量。
80. 根據權利要求79的方法，其中所述PEG具有約l，OOO道爾頓至約 50,000道爾頓的平均分子量。
81. 根據權利要求73的方法，其中所述N-甲基-半胱氨酸殘基為L型。
82. 根據權利要求73的方法，其中所述N-甲基-半胱氨酸殘基為D型。
83. 根據權利要求73的方法，其中所述N-曱基-半胱氨酸殘基在蛋白 質中。
84. 根據權利要求73的方法，其中所述N-曱基-半胱氨酸殘基在肽中。
85. 根據權利要求73的方法，其中所述N-甲基-半胱氨酸殘基在有機 分子中。
86. 根據權利要求73的方法，其中所述產物包含一個或多個蛋白質、 肽或有機分子部分、或其任何組合。
87. 根據權利要求73的方法，其中還原劑用於所述反應中。
88. 根據權利要求87的方法，其中所述還原劑選自由TCEP和含未氧 化巰基的化合物組成的組。
89. —種將含游離馬來醯亞胺基團的PEG與分子的N-甲基-半胱氨酸 殘基的未氧化巰基側鏈化學綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離 馬來醯亞胺基團與所述N-曱基-半胱氨酸的未氧化巰基側鏈反應以生成綴 合產物，其中所述綴合產物具有以下結構其中Ri是所述PEG,且R2是所述分子。
90.根據權利要求89的方法，其中游離馬來醯亞胺基團通過連接基團 與所述PEG連接，所述連接基團可包含醯胺、酯、磺醯胺、磺醯基、巰基、 氧基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來醯亞胺或胺官能團，或其任何組 合。
91. 根據權利要求89的方法，其中所述PEG具有線性結構。
92. 根據權利要求89的方法，其中所述PEG具有支鏈結構。
93. 根據權利要求89的方法，其中所述PEG具有多臂結構。
94. 根據權利要求89的方法，其中一個或多個游離馬來醯亞胺基團與 所述PEG連接。
95. 根據權利要求89的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓至約 500,000道爾頓的平均分子量。
96. 根據權利要求95的方法，其中所述PEG具有約l，OOO道爾頓至約 50,000道爾頓的平均分子量。
97. 根據權利要求89的方法，其中所述N-曱基-半胱氨酸殘基為L型。
98. 根據權利要求89的方法，其中所述N-曱基-半胱氨酸殘基為D型。
99. 根據權利要求89的方法，其中所述N-甲基-半胱氨酸殘基在蛋白 質中。
100. 根據權利要求89的方法，其中所述N-甲基-半胱氨酸殘基在肽中。
101. 根據權利要求89的方法，其中所述N-甲基-半胱氨酸殘基在有機 分子中。
102. 根據權利要求89的方法，所述綴合產物包含一個或多個蛋白質、 肽或有機分子部分、或其任何組合。
103. 根據權利要求89的方法，其中還原劑用於所述反應中。
104. 根據權利要求103的方法，其中所述還原劑為TCEP。
105. —種將含游離馬來醯亞胺基團的PEG與分子的青黴胺殘基的未 氧化巰基側鏈化學綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離馬來醯亞 胺基團與所述青黴胺殘基的未氧化巰基側鏈反應以生成綴合產物，其中所 述綴合產物具有以下結構其中R!是所述PEG,且R2是所述分子。
106. 根據權利要求105的方法，其中所述游離馬來醯亞胺基團通過連 接基團與所述PEG連接，所述連接基團可包含醯胺、酯、磺醯胺、磺醯基、 巰基、氧基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來醯亞胺或胺官能團，或其 任何組合。
107. 根據權利要求105的方法，其中所述PEG具有線性結構。
108. 根據權利要求105的方法，其中所述PEG具有支鏈結構。
109. 才艮據權利要求105的方法，其中所述PEG具有多臂結構。
110. 根據權利要求105的方法，其中一個或多個游離馬來醯亞胺基團 與所述PEG連接。
111. 根據權利要求105的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓至 約500,000道爾頓的平均分子量。
112. 根據權利要求lll的方法，其中所述PEG具有約1，000道爾頓至 約50,000道爾頓的平均分子量。
113. 根據權利要求105的方法，其中所述青黴胺殘基為L型。
114. 根據權利要求105的方法，其中所述青黴胺殘基為D型。
115. 才艮據權利要求105的方法，其中所述青黴胺殘基在蛋白質中。
116. 才艮據權利要求105的方法，其中所述青黴胺殘基在肽中。
117. 根據權利要求105的方法，其中所述青黴胺殘基在有機分子中。
118. 根據權利要求105的方法，其中所述綴合產物包含一個或多個蛋 白質、肽或有機分子部分、或其任何組合。
119. 根據權利要求105的方法，其中還原劑用於所述反應中。
120. 根據權利要求119的方法，其中所述還原劑是TCEP。
121. —種將含游離馬來醯亞胺基團的PEG與分子的同型半胱氨酸殘 基的未氧化巰基側鏈化學綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離馬 來醯亞胺基團與所述同型半胱氨酸殘基的未氧化巰基側鏈反應以生成綴合 產物，其中所述綴合產物具有以下結構其中R!是所述PEG,且R2是所述分子。
122. 根據權利要求121的方法，其中所述游離馬來醯亞胺基團通過連 接基團與所述PEG連接，所述連接基團可包含醯胺、S旨、磺醯胺、磺醯基、 巰基、氧基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來醯亞胺或胺官能團，或其 任何組合。
123. 根據權利要求121的方法，其中所述PEG具有線性結構。
124. 根據權利要求121的方法，其中所述PEG具有支鏈結構。
125. 根據權利要求121的方法，其中所述PEG具有多臂結構。
126. 根據權利要求121的方法，其中一個或多個馬來醯亞胺基團與所 述PEG連接。
127. 根據權利要求121的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓至 約500,000道爾頓的平均分子量。
128. 根據權利要求127的方法，其中所述PEG具有約1，000道爾頓至 約50,000道爾頓的平均分子量。
129. 根據權利要求121的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基為L型。
130. 根據權利要求121的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基為D型。
131. 根據權利要求121的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基在蛋白質中。
132. 根據權利要求121的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基在肽中。
133. 根據權利要求121的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基在有機分 子中。
134. 根據權利要求121的方法，所述綴合產物包含一個或多個蛋白質、 肽或有機分子部分、或其任何組合。
135. 根據權利要求121的方法，其中還原劑用於所述反應中。
136. 根據權利要求135的方法，其中所述還原劑是TCEP。
137. —種將含游離馬來醯亞胺基團的PEG與分子的硒代半胱氨酸殘 基的未氧化竭基側鏈化學綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離馬 來醯亞胺基團與所述硒代半胱氨酸殘基的未氧化硒基側鏈反應以生成綴合 產物，其中所述綴合產物具有以下結構其中Ri是所述PEG,且R2是所述分子。
138. 根據權利要求137的方法，其中游離馬來醯亞胺基團通過連接基 團與所述PEG連接，所述連接基團可包含醯胺、酯、磺醯胺、磺醯基、巰 基、氧基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來醯亞胺或胺官能團或其任何 組合。
139. 根據權利要求137的方法，其中所述PEG具有線性結構。
140. 根據權利要求137的方法，其中所述PEG具有支鏈結構。
141. 根據權利要求137的方法，其中所述PEG具有多臂結構。
142. 根據權利要求137的方法，其中一個或多個游離馬來醯亞胺基團 與所述PEG連接。
143. 根據權利要求137的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓至 約500,000道爾頓的平均分子量。
144. 根據權利要求143的方法，其中所述PEG具有約1,000道爾頓至 約50,000道爾頓的平均分子量。
145. 根據權利要求137的方法，其中所述竭代半胱氨酸殘基為L型。
146. 根據權利要求137的方法，其中所述竭代半胱氨酸殘基為D型。
147. 根據權利要求137的方法，其中所述硒代半胱氨酸殘基在蛋白質中。
148. 根據權利要求137的方法，其中所述硒代半胱氨酸殘基在肽中。
149. 根據權利要求137的方法，其中所述硒代半胱氨酸殘基在有機分 子中。
150. 根據權利要求137的方法，其中所述綴合產物包含一個或多個蛋 白質、肽或有機分子部分、或其任何組合。
151. 根據權利要求137的方法，其中還原劑用於所述反應中。
152.根據權利要求151的方法，其中所述還原劑是TCEP。
全文摘要
本發明涉及蛋白質、肽和其他分子中具有未氧化的巰基側鏈和游離α-氨基的半胱氨酸殘基的化學選擇性聚乙二醇化的方法。本發明提供同型半胱氨酸、硒代半胱氨酸、青黴胺和N-甲基-半胱氨酸殘基的化學選擇性聚乙二醇化的類似方法。
文檔編號C08G63/00GK101495536SQ200780028146
公開日2009年7月29日 申請日期2007年5月25日 優先權日2006年5月26日
發明者J·S·埃耶昂, 董正新 申請人:科學研究和應用諮詢股份公司