高密度高品質培養小球藻的方法
2023-10-27 05:48:32
專利名稱：高密度高品質培養小球藻的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種適合用於小球藻高密度高品質培養的方法。
背景技術：
人們對小球藻的研究歷史較長，其中普通小球藻(Chlorella vulgaris)和蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)是研究的較多的藻種，也是目前商業化生產普遍採用的藻種。
目前，小球藻常用的培養方式有兩種開放式戶外大池光自養培養和發酵罐異養培養。開放式戶外大池培養是目前商業化大規模生產常用的方法，雖然其成本低，但由於細胞密度低、易汙染、佔地面積大等缺點，使其發展受到很大限制。異養培養目前基本上處於實驗室研發階段，其雖可較大幅度地提高藻細胞密度，但獲得的藻體與光自養培養相比其蛋白質和色素的含量明顯下降，即品質降低，不具有光自養培養的小球藻的應用價值。Atev.A(1981)異養培養普通小球藻A2(Chlorella vulgaris A2)時發現胞內葉綠素、蛋白質、類胡蘿蔔素、尼克酸的含量均比光自養生長時要低，胞內胺基酸除賴氨酸和酪氨酸含量高於光自養生長，其它胺基酸含量均低於光自養培養(Atev A.，Manova A.Heterotrophic cultivation of Chlorella vulgaris A2.Dokl.Bolg.Akad.Nauk，(English)1981，34(5)687～690)。張大兵等(1996)發現從自養模式轉化為異養模式時蛋白核小球藻(Chlorella prototuecoides)細胞內葉綠素消失，總蛋白含量減少，僅為光自養培養的1/5(張大兵，吳慶餘.小球藻細胞的異養轉化.植物生理學通報，1996，32(2)140～144)。James.C.Ogbonna等(1997)異養培養蛋白核小球藻C-212(Chlorella pyrenoidosa C-212)也證實了類似的實驗結果(Ogbonna J.C.，Masui.H.，Tanaka.H.Sequential heterotrophic/autotrophic cultivation-an efficient method ofproducing Chlorella biomass for health food and animal feed.J.Appl.Phycol.1 997，9，359～366)。潘欣等(2002)異養培養橢圓小球藻，也發現蛋白含量減少(潘欣，李建宏，戴傳超，等.小球藻異養培養的研究.食品科學，2002，23(4)28～33)。由上可見，對於小球藻屬中常用的三個種(即普通小球藻、蛋白核小球藻、橢圓小球藻)在異養培養時均存在品質下降問題。因此，在實現高密度培養時如何保持其高品質，是小球藻培養技術中一個亟待解決的重要問題。
James.C.Ogbonna等(1997)採用Endo培養基異養-光自養串聯培養蛋白核小球藻C-212(Chlorella pyrenoidosa C-212)可使藻體蛋白質和葉綠素含量得到較大幅度的提高(Ogbonna J.C.，Masui.H.，Tanaka.H.Sequential heterotrophicautotrophiccultivation-an efficient method of producing Chlorella biomass for health food andanimal feed.J.Appl.Phycol.1997，9，359～366.)。但從工業化大規模生產角度來看，Ogbonna等建立的培養系統和培養工藝存在以下三方面難以解決的問題1)U型管式光生物反應器規模較大時存在易碎、不便於清洗、氧氣解析緩慢等問題，難以放大；2)異養-光自養串聯培養過程中異養培養系統(可在位蒸汽滅菌)與光自養培養系統直接相連結，容易染菌，在大規模培養時無法實現無菌操作；3)連續培養工藝極易汙染雜菌，在工業化生產中基本上不使用，採用更多的是分批補料培養工藝。文獻中未見小球屬中其它種的高密度高品質培養的報導。
本發明者首先採用Ogbonna等使用的培養基和培養方法對普通小球藻進行探索性實驗，結果表明培養結束時普通小球藻藻細胞密度僅為4.68g/L，藻體蛋白質和葉綠素分別僅為23.3％和1.2％，不能實現普通小球藻高密度高品質培養。這說明採用Ogbonna等使用的培養基和培養方法並不能通用於其它種的小球藻的高密度高品質培養。因此有必要對小球藻高密度高品質培養的方法展開深入研究。
發明內容
實現小球藻高密度高品質培養可從三個方面著手一是選擇合適的培養基，二是選擇合適的培養系統，三是建立合適的培養工藝。本發明主要以普通小球藻為研究對象，建立了一種小球藻高密度高品質培養的方法，並將該方法應用於蛋白核小球藻高密度高品質培養。申請人的另一項發明專利申請已給出了適合於普通小球藻高密度高品質培養的培養基組合物(李元廣，李興武，沈國敏，等.一種適合於普通小球藻高密度高品質培養的培養基組合物.中國發明專利，申請號200610024004.9，該文納入本文作為參考)，本發明中培養普通小球藻採用的培養基即為該培養基組合物，本發明中培養蛋白核小球藻採用的培養基為Ogbonna等使用的Endo培養基。
本發明的目的是提供一種適用於小球藻高密度高品質培養的培養方法。該培養方法可使小球藻達到高密度培養的前提下，藻體品質與異養培養相比有較大幅度提高，培養結束時達到光自養培養時的水平。
為實現上述目的，本發明提供了一種用於高密度高品質培養小球藻的培養方法，所述培養方法包括生物反應器高密度異養培養、高密度藻液的稀釋和光自養培養三個階段。
具體而言，本發明提供了一種培養小球藻的方法，其特徵在於，該培養方法包括以下步驟a)在生物反應器中進行異養培養在生物反應器中加入pH為6.0～7.0的培養基，按工作體積的5～10％接入小球藻藻種進行補料分批培養，培養溫度為28～32℃，控制pH小於8.5，控制溶氧在15％以上，至小球藻細胞密度最高時結束培養；b)藻液稀釋用培養基將步驟a)獲得的藻液稀釋至細胞密度為5-25克/升，所述培養基不含有機碳源，其pH為6.0～7.0；c)光自養培養將步驟b)獲得的稀釋液轉入光自養培養，培養溫度為17～42℃，光照強度為5～60klx，光自養培養周期為30～40小時。
在一個較佳的實施方案中，所述小球藻選自普通小球藻和蛋白核小球藻。
在一個較佳的實施方案中，所述步驟b)中的培養基為不含有機碳源的步驟a)的培養基，且其中氮源濃度為2～10克/升。
在一個較佳的實施方案中，步驟a)在溶氧供應良好且全封閉的機械攪拌式生物反應器中進行，步驟c)在選自封閉式光生物反應器、開放式大池的光自養培養裝置中進行。
在一個較佳的實施方案中，步驟a)在葡萄糖完全消耗後結束。
在一個較佳的實施方案中，在步驟a)中，當培養基的pH高於8.5時用酸進行調節。
在一個較佳的實施方案中，在步驟a)中，在接種後27～33小時進行補料，之後每隔5～8小時進行補料，補料是加入葡萄糖及氮源溶液(如前所述培養普通小球藻時氮源為KNO3，培養蛋白核小球藻時為尿素)，葡萄糖的補加濃度為使培養液中葡萄糖濃度達到15-25克/升，氮源濃度達到3-4克/升。
在一個較佳的實施方案中，當小球藻為普通小球藻時，步驟a)中的所述異養培養的培養基基本上由以下成分組成KNO37～11克/升、葡萄糖25～35克/升、KH2PO40.6～0.8克/升、Na2HPO4·12H2O 1.7～2.0克/升、MgSO4·7H2O 0.6～0.8克/升、CaCl20.1～0.2克/升、FeSO4·7H2O 0.01～0.03克/升；微量元素0.5～2ml，其中微量元素的組成為H3BO311～12克/升，ZnSO4·7H2O 8.5～9.5克/升，MnCl2·H2O 1.4～1.5克/升，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.8～0.9克/升，CuSO4·5H2O 1.5～1.6克/升，Co(NO3)2·6H2O0.45～0.55克/升；水。
在一個較佳的實施方案中，當小球藻為蛋白核小球藻時，步驟a)中的所述異養培養的培養基基本上由以下成分組成葡萄糖27-30克/升，尿素4.5-5克/升，KH2PO41-1.5克/升，MgSO4·7H2O 1-1.5克/升，CaCl20.07-0.1克/升，檸檬酸三鈉0.1-0.3克/升，Fe-EDTA溶液0.5-1mL，A5溶液3-3.5mL，其中Fe-EDTA溶液配方為FeSO4·7H2O24-26克/升和EDTA 32-35克/升，A5溶液配方為H3BO32.8-2.9克/升，MnCl2·4H2O1.7-1.9克/升，ZnSO4·7H2O 0.2-0.25克/升，CuSO4·5H2O 0.05-0.1克/升，Na2MoO40.02-0.25克/升；水。
本發明還有一個方面涉及用上述方法獲得的小球藻培養物在製備保健食品或飼料添加劑中的用途。
用本發明公開的方法來培養小球藻，一方面可使小球藻在較短的培養周期裡細胞密度達到高密度培養的水平(異養培養結束時細胞密度可達到45～55克/升)，另一個更重要的方面在於其可使小球藻的品質與異養培養相比有較大幅度提高，達到了光自養培養時的水平，從而實現了小球藻高密度高品質的培養。
附圖簡述
圖1顯示了在5L生物反應器/1L開放式平板光生物反應器串聯繫統中異養培養結束後用稀釋用培養基稀釋與不稀釋的普通小球藻培養的結果。
圖2顯示了5L生物反應器/1L平板光生物反應器中不同稀釋倍數下異養-稀釋-光自養串聯培養的結果，其中，H表示異養培養階段，A-10表示光自養培養階段細胞乾重11.45g/L，A-20表示光自養培養階段細胞乾重21.89g/L，A-30表示光自養培養階段細胞乾重32.56g/L。
圖3顯示了50L生物反應器/30L平板式光生物反應器串聯繫統中異養-稀釋-光自養串聯分批補料培養普通小球藻的結果。
圖4顯示了50L生物反應器/30L平板式光生物反應器串聯繫統中異養-稀釋-光自養串聯培養普通小球藻時30L平板式光生物反應器置於戶外的培養結果。
圖5顯示了30L平板式光生物反應器、5L塑料盆、開放式大池中普通小球藻光自養培養階段在戶外進行的培養結果。
圖6顯示了50L生物反應器/30L平板式光生物反應器串聯繫統中異養-稀釋-光自養串聯分批補料培養蛋白核小球藻的結果。
具體實施方案本發明提供了一種高密度高品質培養小球藻的方法，該培養方法包括生物反應器高密度異養培養、高密度藻液的稀釋和光自養培養三個階段a)在生物反應器中進行異養培養在生物反應器中加入pH為6.0～7.0的培養基，按工作體積的5～10％接入小球藻藻種進行補料分批培養，培養溫度為28～32℃，控制pH小於8.5，控制溶氧在15％以上，至小球藻細胞密度最高時結束培養；b)藻液稀釋用培養基將步驟a)獲得的藻液稀釋至細胞密度為5-25克/升，所述培養基不含有機碳源，其pH為6.0～7.0；c)光自養培養將步驟b)獲得的稀釋液轉入光自養培養，培養溫度為17～42℃，光照強度為5～60klx，光自養培養周期為30～40小時。
a)生物反應器高密度異養培養階段/步驟a)在生物反應器中進行。所述生物反應器可以由本領域技術人員根據常規技能來作合適的選擇，例如可以是溶氧供應良好且全封閉的機械攪拌式生物反應器。
在閱讀了下文、尤其是實施例後，本領域技術人員能夠理解，本發明的實質並不在於培養基本身。換言之，本領域技術人員也可在本發明中採用小球藻培養領域中所常用的其它培養基。在本發明的優選方案中，具體使用了兩種培養基，一種為HA-SK培養基(該培養基組合物申請人已申請一項中國發明專利，申請號200610024004.9)，用於培養普通小球藻，另一種為Ogbonna等使用的Endo培養基，用於培養蛋白核小球藻。因此，在較佳的實施方案中，本發明的方法適用於培養普通小球藻和蛋白核小球藻。
本發明所用的HA-SK培養基是基本上由KNO3、葡萄糖以及少量無機鹽、微量元素和水組成。在所述技術方案中，所述微量元素宜選自H3BO3，ZnSO4·7H2O，MnCl2·H2O，(NH4)6Mo7O24·4H2O，CuSO4·5H2O，Co(NO3)2·6H2O中的一種或多種或全部。
本文所用的術語「基本上由……組成」表示本發明的組合物中除了含有主要組分KNO3、葡萄糖以及少量無機鹽、微量元素和水外，還可包含一些對於組合物的基本特性或新的特性(即可維持普通小球藻在較短的培養周期裡細胞密度達到高密度培養的水平，同時葉綠素和蛋白質水平與常規異養培養相比有較大幅度提高)沒有實質上影響的組分。本文所用的術語「由……組成」表示本發明的組合物由所指出的具體組分組成，沒有其他組分，但是可以帶有含量在通常範圍內的雜質。
在該培養基中，培養基的各組分可在一定範圍內變化而不會對普通小球藻細胞密度和品質有很大的實質影響。因此，這些組分的用量不應受實施例的嚴格限制。如本領域技術人員所熟知的，培養基中還應加入少量無機鹽，例如硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵和磷酸鹽等，以及少量微量元素如Mn、Zn、B、I、M、Cu、Co等。在本發明中，較佳的微量元素組分宜選自H3BO3，ZnSO4·7H2O，MnCl2·H2O，(NH4)6Mo7O24·4H2O，CuSO4·5H2O，Co(NO3)2·6H2O中的一種或多種。無機鹽和微量元素的用量可根據常規知識確定。
作為氮源的KNO3的範圍為7.0～11.0克/升，作為碳源和能源的葡萄糖可在25～35克/升之間。具體而言，KNO3的濃度可為7-10克/升，7-9克/升或大約8克/升。葡萄糖的濃度可為26-34克/升、27-33克/升、28-32克/升、29-31克/升或大約30克/升。KH2PO4的濃度可為0.65-0.75克/升或大約0.7克/升。Na2HPO4·12H2O的濃度可為1.75-1.95克/升、1.8-1.9克/升、1.83-1.85克/升或大約1.84克/升。MgSO4·7H2O的濃度可為0.65-0.75克/升或大約0.7克/升。CaCl2的濃度可為0.13-0.18克/升，0.14-0.15克/升，或大約0.142克/升。FeSO4·7H2O的濃度可為0.015-0.025克/升或大約0.02克/升。
對於微量元素，一個較佳的實施方案是在培養基組合物中加入0.5～2ml具有以下組成的微量元素母液H3BO311～12克/升，ZnSO4·7H2O 8.5～9.5克/升，MnCl2·H2O1.4～1.5克/升，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.8～0.9克/升，CuSO4·5H2O 1.5～1.6g，Co(NO3)2·6H2O0.45～0.55克/升。該微量元素母液可在配製本發明培養基組合物之前預先配製。微量元素母液的加入量可以為0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8和2毫升。
在一個尤其佳的實施方案中，本發明的HA-SK培養基組合物宜由以下成分組成KNO37～11克/升、葡萄糖25～35克/升、KH2PO40.6～0.8克/升、Na2HPO4·12H2O 1.7～2.0克/升、MgSO4·7H2O 0.6～0.8克/升、CaCl20.1～0.2克/升、FeSO4·7H2O 0.01～0.03克/升；微量元素0.5～2ml，其中微量元素的組成為H3BO311～12克/升，ZnSO4·7H2O8.5～9.5克/升，MnCl2·H2O 1.4～1.5克/升，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.8～0.9克/升，CuSO4·5H2O 1.5～1.6克/升，Co(NO3)2·6H2O 0.45～0.55克/升；水1000ml。
本發明所用的Endo培養基基本上由以下成分組成葡萄糖27-30克/升，尿素4.5-5克/升，KH2PO41-1.5克/升，MgSO4·7H2O 1-1.5克/升，CaCl20.07-0.1克/升，檸檬酸三鈉0.1-0.3克/升，Fe-EDTA溶液0.5-1mL，A5溶液3-3.5mL，其中Fe-EDTA溶液配方為FeSO4·7H2O 24-26克/升和EDTA 32-35克/升，A5溶液配方為H3BO32.8-2.9克/升，MnCl2·4H2O 1.7-1.9克/升，ZnSO4·7H2O 0.2-0.25克/升，CuSO4·5H2O 0.05-0.1克/升，Na2MoO40.02-0.25克/升；水。
在一個較佳的實施方案中，所述Endo培養基由以下成分組成葡萄糖28克/升，尿素4.8克/升，KH2PO41.2克/升，MgSO4·7H2O 1.2克/升，CaCl20.08克/升，檸檬酸三鈉0.2克/升，Fe-EDTA溶液0.64mL，A5溶液3.2mL，其中Fe-EDTA溶液配方為FeSO4·7H2O 25克/升和EDTA 33.5克/升，A5溶液配方為H3BO32.86克/升，MnCl2·4H2O1.81克/升，ZnSO4·7H2O 0.222克/升，CuSO4·5H2O 0.07克/升，Na2MoO40.021克/升；水。
在根據上述配方配製培養基後，可用常規手段如酸或鹼將所述培養基的pH調為6.0～7.0，並在115-120℃下高壓滅菌15～20分鐘。另外，Endo培養基中的尿素配製成高濃度溶液後單獨高壓滅菌。
在將上述培養基加入生物反應器中後(裝料係數通常為0.6～0.8，優選是0.7)，加水(宜是自來水)至工作體積，然後滅菌。然後，當溫度降至25～30℃時，按工作體積的5～15％(更佳為5-10％)接入小球藻開始異養培養，培養條件為溫度25～30℃，控制溶氧在15％以上，pH小於8.5。
異養培養階段採用補料分批培養的方式進行，可在接種一段時間後(通常是27-38小時後)補料，之後每隔5～8小時補料，補料是加入碳源葡萄糖及氮源(培養普通小球藻的氮源為KNO3，培養蛋白核小球藻的氮源為尿素)溶液，葡萄糖的補加濃度為15-25克/升，氮源溶液的補加濃度為3-4克/升，培養直至小球藻細胞密度最高時結束培養。補料液的濃度宜較高，目的是使培養液體積不至於補料而太大。補料母液要分開滅菌。
在補料過程中若出現溶氧迅速下跌的現象，可調節轉速，使溶氧保持在一定水平上，因為溶氧不足會抑制藻細胞的生長甚至出現藻體自溶的現象，從而影響小球藻細胞密度的進一步提高。在培養時，應當注意pH不宜過高，因為pH太高了藻細胞不易生長。當pH高於8.5時，宜用酸例如10％的硫酸調節pH。
異養培養至小球藻細胞密度最高時(通常可達45克/升-55克/升或更高)結束培養，更佳的可在小球藻細胞密度達到最高且培養液內葡萄糖被完全消耗時結束培養。
b)高密度藻液的稀釋在階段/步驟b)中，採用pH為6.0～7.0的不含有機碳源的培養基對異養培養獲得的高密度藻液進行稀釋。所述培養基可對應於現有技術中常規用於培養小球藻的培養基，只是其中不含有機碳源，且其pH為6.0-7.0。在更優選的實施方案中，所述培養基的氮源濃度為2～10克/升，較佳為2～8克/升，更佳為3～6克/升。所述氮源可以與步驟a)中所用的氮源相同或不同。
在一個優選的具體方案中，異養培養獲得的高密度藻細胞宜用不含有機碳源、氮源濃度為2～10克/升的初始培養基(即培養普通小球藻時採用不含葡萄糖的HA-SK培養基，培養蛋白核小球藻時採用不含葡萄糖的Endo培養基)進行適當稀釋。
稀釋採用的培養基無需高壓滅菌，配製好後調節pH至6.0～7.0即可使用。稀釋後的細胞密度宜為2～25克/升，更佳為5～20克/升。
在一個更佳的方案中，稀釋採用的培養基中的氮源濃度為3～5克/升，稀釋後的細胞密度為10～16克/升。
c)光自養培養隨後，將光自養培養裝置用自來水清洗乾淨後，將步驟b)的稀釋後的細胞液轉入其中後進行光自養培養。光自養培養與異養培養在不同的生物反應器中進行。通常，光自養培養可在封閉式光生物反應器、平板式光生物反應器、開放式大池等光自養培養裝置中進行。培養溫度控制在17～42℃，光照強度為5～60klx，光自養培養周期為30～40小時。
本發明關鍵之處在於，異養培養階段與光自養培養階段在不同的生物反應器中進行，異養培養在溶氧供應良好且全封閉的機械攪拌式生物反應器中進行，而光自養培養在封閉式光生物反應器、開放式大池等光自養培養裝置中進行。且異養培養獲得的高密度藻液必須採用不含有機碳源的培養基適當稀釋後轉入光自養培養，才可實現高密度高品質培養。
在本文中，所述藻體的品質指標為單位藻體蛋白質和葉綠素含量。所述藻體的生物量指標為單位培養液中藻體乾重。本領域技術人員能夠採用常規技術對所述單位藻體蛋白質、葉綠素含量和進行測定。
蛋白質含量的測定採用凱氏定氮法(寧正祥.食品成分分析手冊[M].北京中國輕工業出版社，1998，76～78.)。葉綠素含量測定採用甲醇提取比色法(Ogbonna J.C.，Masui.H.，Tanaka.H.Sequential heterotrophicautotrophic cultivation-an efficientmethod of producing Chlorella biomass for health food and animal feed.J.Appl.Phycol.1997，9，359～366.)。藻體乾重測量時取培養過程中某一時刻的培養液V(ml)，7200r/min離心10min，將離心後的藻體用去離子水洗滌3次，轉移至稱量瓶(W1(g))中在80℃烘箱中烘乾至恆重W2(g)。藻體乾重CX可根據下式計算CX(g/L)＝(W2-W1)/V/1000。
用本發明的方法不僅能夠使小球藻在較短的培養周期裡細胞密度達到高密度培養的水平，另一個更重要的方面在於其可使小球藻的品質與異養培養相比有較大幅度提高，達到了光自養培養時的水平，從而實現了小球藻高密度高品質的培養。因此，本發明獲得的小球藻培養物能夠用於製備保健食品、飼料添加劑等諸多應用。
以下將通過實施例對本發明的有關內容作進一步的說明。除非另有所述，本發明採用的培養基中各組分含量均用克/升(g/l)表示。本發明所採用的普通小球藻和蛋白核小球藻購自中科院武漢水生生物研究所。
實施例1在5L生物反應器中加入下述異養採用的培養基，加自來水至3.4L後滅菌，然後當溫度降至30℃時按工作體積的6％接入普通小球藻，開始異養培養。異養培養條件溫度為30℃，轉速從接種時的200r/min逐漸調整到培養結束時的400r/min，空氣流量為1vvm，pH小於8.5，控制溶氧在15％以上。接種後30h時開始添加補料液(20g/L葡萄糖和3.33g/LKNO3的混合溶液)，之後每隔5～8小時補加1次，共補加4次。培養至56.34h細胞乾重(□)達到47.91g/L，藻體蛋白質(○)和葉綠素(□)含量分別為33.42％和15.65mg/gDcw(見
圖1)，異養培養階段結束。
KNO39.25葡萄糖30KH2PO40.7 Na2HPO4·12H2O1.84MgSO4·7H2O0.7 CaCl20.142FeSO4·7H2O0.02微量元素1ml；微量元素配方(g/L)H3BO311.42ZnSO4·7H2O 8.82MnCl2·H2O 1.42 (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.8707CuSO4·5H2O 1.57 Co(NO3)2·6H2O 0.49水1000ml異養培養獲得的藻細胞蛋白質和葉綠素含量處於較低水平，其中一部分藻液採用下述稀釋採用的培養基將藻細胞稀釋至約20g/L，轉入1L平板式光生物反應器進行光自養培養。光自養培養條件溫度為30℃，裝液體積0.9L，空氣流量為0.45L/min，平板反應器採用雙面人工光照，每一面的光強為36klx。繼續培養至83.00h，細胞乾重(■)基本上不變，為20.05g/L，藻體蛋白質(●)和葉綠素(▲)含量分別為52.80％和36.45mg/gDcw(見
圖1)。
KNO34.95 FeSO4·7H2O0.02KH2PO40.7Na2HPO4·12H2O1.84MgSO4·7H2O0.7 CaCl20.142微量元素1ml；微量元素配方(g/L)H3BO311.42 ZnSO4·7H2O 8.82MnCl2·H2O 1.42 (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.8707CuSO4·5H2O 1.57 Co(NO3)2·6H2O 0.49
水1000ml異養培養獲得的藻液的另一部分不經過稀釋處理，直接轉入1L平板式光生物反應器進行光自養培養。光自養培養條件溫度為30℃，裝液體積0.9L，空氣流量為0.45L/min，平板反應器採用雙面人工光照，每一面的光強為36klx。繼續培養至80.34h，細胞乾重大幅度下降，為38.45g/L，藻體蛋白質和葉綠素含量分別為41.34％和29.32mg/gDcw(見
圖1)，其明顯低於上述經過稀釋處理的結果。
上述結果表明，異養培養獲得的高密度藻液必須通過適當的稀釋轉入光自養培養，既維持細胞密度處於較高水平，同時獲得的藻體品質也處於較高水平。
實施例2在5L生物反應器中加入實施例1中異養採用的培養基，採用實施例1中使用的異養培養條件和培養工藝培養普通小球藻。培養至60.08h細胞乾重(□)達到51.15g/L，藻體蛋白質(○)和葉綠素(□)含量分別為33.65％和12.80mg/gDcw(見圖2)，異養培養階段結束。
採用下述稀釋採用的培養基，其中KNO3含量分別為2.60g/L、4.95g/L和7.36g/L，將異養培養獲得的高密度藻液分別稀釋成11.45g/L(A-10)、21.89g/L(A-20)和32.56g/L(A-30)後轉入1L平板式光生物反應器中進行光自養培養。光自養培養條件與實施例1中相同。繼續培養至87.08h，轉入光自養初始細胞乾重為11.45g/L時，細胞乾重略有增加，為12.07g/L，藻體蛋白質和葉綠素含量分別為51.49％和33.51mg/gDcw；轉入光自養初始細胞乾重為21.89g/L時，細胞乾重基本不變，為19.79g/L，藻體蛋白質和葉綠素含量分別為52.54％和36.15mg/gDcw；而轉入光自養初始細胞乾重為32.56g/L時，細胞乾重下降，為28.07g/L，藻體蛋白質和葉綠素含量分別為51.16％和32.42mg/gDcw(見圖2)。
KNO32.60、4.95、7.36 FeSO4·7H2O0.02KH2PO40.7Na2HPO4·12H2O1.84MgSO4·7H2O0.7 CaCl20.142微量元素1ml；微量元素配方(g/L)H3BO311.42 ZnSO4·7H2O 8.82MnCl2·H2O 1.42 (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.8707CuSO4·5H2O 1.57 Co(NO3)2·6H2O 0.49水1000ml上述結果表明，異養培養獲得的高密度藻液經過適當稀釋後轉入光自養培養藻體品質均可達到較高水平，但稀釋後細胞密度較高時藻細胞較大幅度死亡。
實施例3在50L生物反應器中加入實施例1中異養採用的培養基，加自來水至34L後滅菌，然後當溫度降至30℃時按工作體積的6％接入普通小球藻，開始異養培養。採用實施例1中使用的異養培養條件和培養工藝培養普通小球藻，其中補料次數增加至5次。培養至58.20h細胞乾重達到54.52g/L，藻體蛋白質和葉綠素含量分別為32.01％和12.70mg/gDcw(見圖3)，異養培養階段結束。
50L生物反應器異養培養獲得的高密度藻細胞，採用實施例1中稀釋用的培養基(其中KNO3含量為2.60g/L)稀釋至14.88g/L，然後轉入30L平板式光生物反應器進行光自養培養。光自養培養條件溫度為30℃，裝液體積24L，空氣流量為12L/min，平板反應器採用雙面人工光照，每一面的光強為45klx。繼續培養至100h，細胞乾重基本不變，為13.78g/L，藻體蛋白質和葉綠素含量分別為55.79％和30.33mg/gDcw(見圖3)，基本上實現了普通小球藻高密度高品質培養的實驗室放大。
實施例4在50L生物反應器中加入實施例1中異養採用的培養基，加自來水至34L後滅菌，然後當溫度降至30℃時按工作體積的6％接入普通小球藻，開始異養培養。採用實施例1中使用的異養培養條件和培養工藝培養普通小球藻。培養至58.20h細胞乾重達到46.40g/L，藻體蛋白質和葉綠素含量分別為35.02％和15.46mg/gDcw(見圖4)，異養培養階段結束。
異養培養獲得的高密度藻細胞，採用實施例1中稀釋用的培養基(其中KNO3含量為2.60g/L)稀釋至12.66g/L轉入30L平板式光生物反應器中，然後將30L平板式光生物反應器置於戶外進行光自養培養。光自養培養條件裝液體積24L，空氣流量為12L/min，自然溫度，溫度在17.8～42.4℃，自然光照，光強在0～65klx。在戶外繼續培養至113h，細胞乾重為10.11g/L，藻體蛋白質和葉綠素含量分別為57.40％和36.92mg/gDcw(見圖4)。
上述結果說明，本發明建立的異養-稀釋-光自養串聯培養方法不受自然光晝夜交替的光照模式和自然溫度變化的影響。
實施例5在1500L發酵罐中加入實施例1中異養採用的培養基，且採用實施例1中的培養條件與培養工藝培養普通小球藻，培養約60小時細胞密度達到50.80g/L，藻體葉綠素和蛋白含量分別為10.98mg/gDcw和30.37％。
將獲得的高密度藻液實施例1中稀釋用的培養基稀釋至3.70g/L，分別在30L平板式光生物反應器、5L塑料盆(50×40×20cm)、開放式大池中進行戶外光自養培養。光自養培養條件自然溫度，溫度在17.8～42.4℃，自然光照，光強在0～65klx。在戶外光自養培養26.75h，30L平板式光生物反應器中細胞乾重為4.08g/L，藻體蛋白質和葉綠素含量分別為51.95％和20.98mg/gDcw；5L塑料盆中細胞乾重為4.20g/L，藻體蛋白質和葉綠素含量分別為55.02％和21.85mg/gDcw；開放式大池中細胞乾重為3.90g/L，藻體蛋白質和葉綠素含量分別為52.52％和22.83mg/gDcw(見圖5)。
上述結果說明，本發明建立的異養-稀釋-光自養串聯培養方法不受光自養培養階段採用的培養裝置的限制。
實施例6在50L生物反應器中加入下述異養採用的培養基，加自來水至34L後滅菌，然後當溫度降至30℃時按工作體積的8％接入蛋白核小球藻，開始異養培養。異養培養條件溫度為30℃，轉速從接種時的150r/min逐漸調整到培養結束時的400r/min，空氣流量為1vvm，pH小於8.5，控制溶氧在15％以上。接種後37h時開始添加補料液(18g/L葡萄糖溶液和3.2g/L尿素溶液)，之後每隔6～10小時補加1次，共補加5次。培養至71.48h細胞乾重(□)達到54.88g/L，藻體蛋白質(○)和葉綠素(□)含量分別為46.18％和7.17mg/gDcw(見圖6)，異養培養階段結束。
葡萄糖28g/L 尿素4.8g/LKH2PO41.2g/L MgSO4·7H2O1.2g/LCaCl20.08g/L 檸檬酸三鈉0.2g/LFe-EDTA溶液0.64mL A5溶液3.2mL其中Fe-EDTA溶液配方為FeSO4·7H2O25g/L和EDTA 33.5g/L；A5溶液配方H3BO32.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.222g/L，CuSO4·5H2O 0.07g/L，Na2MoO40.021g/L。
50L生物反應器異養培養獲得的高密度藻細胞，採用下述稀釋用的培養基15.20g/L後轉入30L平板光生物反應器進行光自養培養。光自養培養條件溫度為30℃，裝液體積24L，空氣流量為12L/min，平板反應器採用雙面人工光照，每一面的光強為45klx。經過後續光照培養的藻細胞蛋白質和葉綠素含量分別為72.31％和20.97mg/gDcw(見圖6)。
尿素4.8g/LKH2PO41.2g/L MgSO4·7H2O1.2g/LCaCl20.08g/L 檸檬酸三鈉0.2g/LFe-EDTA溶液0.64mL A5溶液3.2mL其中Fe-EDTA溶液配方為FeSO4·7H2O 25g/L和EDTA 33.5g/L；A5溶液配方H3BO32.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.222g/L，CuSO4·5H2O 0.07g/L，Na2MoO40.021g/L。
上述結果說明，本發明建立的異養-稀釋-光自養串聯培養方法是一種小球藻高密度高品質培養普遍適用的方法，不僅可實現普通小球藻的高密度高品質培養，而且可實現蛋白核小球藻的高密度高品質培養。
儘管上面已經描述了本發明的具體例子，但是有一點對於本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和範圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明範圍內的變動。
權利要求
1.一種培養小球藻的方法，其特徵在於，該培養方法包括以下步驟a)在生物反應器中進行異養培養在生物反應器中加入pH為6.0～7.0的培養基，按工作體積的5～10％接入小球藻藻種進行補料分批培養，培養溫度為28～32℃，控制pH小於8.5，控制溶氧在15％以上，至小球藻細胞密度最高時結束培養；b)藻液稀釋用培養基將步驟a)獲得的藻液稀釋至細胞密度為5-25克/升，所述培養基不含有機碳源，其pH為6.0～7.0；c)光自養培養將步驟b)獲得的稀釋液轉入光自養培養，培養溫度為17～42℃，光照強度為5～60klx，光自養培養周期為30～40小時。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述小球藻選自普通小球藻和蛋白核小球藻。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟b)中的培養基為不含有機碳源的步驟a)的培養基，且其中氮源濃度為2～10克/升。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟a)在溶氧供應良好且全封閉的機械攪拌式生物反應器中進行，步驟c)在選自封閉式光生物反應器、開放式大池的光自養培養裝置中進行。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟a)在葡萄糖完全消耗後結束。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，在步驟a)中，當培養基的pH高於8.5時用酸進行調節。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，在步驟a)中，在接種後27～33小時進行補料，之後每隔5～8小時進行補料，補料是加入碳源葡萄糖及氮源溶液，葡萄糖的補加濃度為使培養液中葡萄糖濃度達到15-25克/升，氮源濃度達到3-4克/升。
8.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，當小球藻為普通小球藻時，步驟a)中的所述異養培養的培養基基本上由以下成分組成KNO37～11克/升、葡萄糖25～35克/升、KH2PO40.6～0.8克/升、Na2HPO4·12H2O 1.7～2.0克/升、MgSO4·7H2O0.6～0.8克/升、CaCl20.1～0.2克/升、FeSO4·7H2O 0.01～0.03克/升；微量元素0.5～2ml，其中微量元素的組成為H3BO311～12克/升，ZnSO4·7H2O 8.5～9.5克/升，MnCl2·H2O 1.4～1.5克/升，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.8～0.9克/升，CuSO4·5H2O 1.5～1.6克/升，Co(NO3)2·6H2O 0.45～0.55克/升；水。
9.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，當小球藻為蛋白核小球藻時，步驟a)中的所述異養培養的基本上由以下成分組成葡萄糖27-30克/升，尿素4.5-5克/升，KH2PO41-1.5克/升，MgSO4·7H2O 1-1.5克/升，CaCl20.07-0.1克/升，檸檬酸三鈉0.1-0.3克/升，Fe-EDTA溶液0.5-1mL，A5溶液3-3.5mL；其中Fe-EDTA溶液配方為FeSO4·7H2O 24-26克/升和EDTA 32-35克/升；A5溶液配方為H3BO32.8-2.9克/升，MnCl2·4H2O 1.7-1.9克/升，ZnSO4·7H2O 0.2-0.25克/升，CuSO4·5H2O 0.05-0.1克/升，Na2MoO40.02-0.25克/升；水。
10.用權利要求1所述的方法獲得的小球藻培養物在製備保健食品或飼料添加劑中的用途。
全文摘要
本發明提供了一種高密度高品質培養小球藻的方法，該培養方法包括生物反應器高密度異養培養、高密度藻液的稀釋和光自養培養三個階段。用本發明方法可使小球藻在較短的培養周期裡細胞密度達到高密度培養的水平，還可使小球藻的品質與異養培養相比有較大幅度提高，達到了光自養培養時的水平，從而實現了小球藻高密度高品質的培養。
文檔編號A23K1/16GK1837351SQ200610025618
公開日2006年9月27日 申請日期2006年4月12日 優先權日2006年4月12日
發明者李元廣, 李興武, 沈國敏, 錢峰慧, 安洋, 魏鴻剛, 王偉 申請人:華東理工大學, 上海澤元海洋生物技術有限公司