原因不明性男性不育症的生物標誌物及其應用方法

2023-10-23 20:28:07 2

原因不明性男性不育症的生物標誌物及其應用方法
【專利摘要】本發明提供了一種診斷原因不明性男性不育症的方法，一般涉及體液樣品的分析性測試。在一些方面中，包含了用於指示原因不明性男性不育症的生物標誌物，包含用於鑑定和檢測生物標誌物的方法，還包含用於診斷或檢測原因不明性男性不育症的試劑盒。本發明作為一種診斷方法，可實現對原因不明性男性不育症的簡單、準確和非侵入性的診斷。
【專利說明】原因不明性男性不育症的生物標誌物及其應用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物標誌物，特別是涉及原因不明性男性不育症的生物標誌物，包含用於鑑定和篩選原因不明性男性不育症的生物標誌物的方法，包含用於檢測這些生物標誌物的方法，還包含用於診斷或檢測原因不明性男性不育症的試劑盒。
【背景技術】
[0002]據世界衛生組織預測，在本世紀，不孕症將成為僅次於腫瘤和心腦血管疾病的第三大疾病。在已婚夫婦中不孕不育症的發生率為10-20%，由男性因素引起的不孕不育症的比例約為50%，而在男性不育患者中，50%是由生精過程異常而導致的少精子、弱精子和畸精子症。我國人口和計劃生育委員會的研究結果表明，我國男性的精液質量正以每年1%的速度下降，而精子數量的降幅更是高達40%。男性不育已經成為我國目前面臨的重大公共健康問題，男性不育的病因和發病機制的研究將成為男性科學中的重點和熱點。
[0003]目前在臨床中使用最廣泛的判斷男性生育力的手段是精液常規分析，包括精子數量、存活力、活動率和形態等指標，但是僅僅依靠精液常規分析來預測男性生育狀況仍是很不準確的(N Engl J Med, 2001, 345: 1388-1393; Reproduction, 2007, 13: 675-684;Clinics, 2011，66: 691-700; Asian J AndroI, 2010，13: 53-58)。而且，雖然有些男性患者的常規精液分析結果均處於正常值範圍，但是仍然不育，這類人群佔到男性不育症的近30%，被稱為原因不明性男性不育症，長期以來臨床對這類男性不育的診斷存在很大的困難。主要原因是精子數量、存活力、活動率和形態等常規精液分析指標只能反映最基本的精液質量，而不能反映所有的精子功能，因此探索新的生物標誌物以輔助傳統的精液常規分析，實現對男性不育症的準確診斷尤為重要。
[0004]2006年，Agarwal首次利用氧化應激生物標記物對來自5組研究對象(包括4組男性不育病人與I組正常對照)的精漿標本進行了測評，結果表明氧化應激生物標記物能作為一種有效的診斷各種形式男性不育的快速、非侵入性的方法(Fertil Steril, 2006,86: S180)。Maher等通過對比脊髓損傷後不育症的男性患者和對照組精漿的差異，發現膽鹼、N-乙醯氨基葡萄糖和尿苷等重要標誌物(Anal Chem, 2008, 81: 288-295)。代謝標誌物也被成功應用於不育症患者前列腺組織的差異分析(Hum Reprod, 2010，25:847-852)。以上所述都提示相關生物標誌物在男性不育的鑑別診斷方面具有潛在的臨床價值。但是，到目前為止，還未有原因不明性男性不育症方面的報導。另外，診斷中所需的組織切片常常會對患者身體造成一定的損傷，精液樣品的取樣過程也比較繁瑣和困難，甚至由於其特殊性可能會被某些患者排斥，因此，發現體液中生物標誌物以及發展簡單、非侵入性的檢測方法顯得極為重要和緊迫。

【發明內容】

[0005]為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了一種診斷原因不明性男性不育症的方法，一般涉及體液樣品的分析性測試。在一些方面中，包含了用於指示原因不明性男性不育症的生物標誌物，包含用於鑑定和檢測生物標誌物的方法，還包含用於診斷或檢測原因不明性男性不育症的試劑盒。本發明作為一種診斷方法，可實現對原因不明性男性不育症的簡單、準確和非侵入性的診斷。
[0006]在本發明的一個方面中，本文提供了一種診斷原因不明性男性不育症的方法，包括:
(a)提供男性受試者體液樣品，體液樣品選自受試者尿液、血清、血漿、血液、精液、精子、精漿、唾液；
(b)體液樣品經過必要的前處理，包括使其保持液體狀態、稀釋、離心、過濾、固相萃取等操作；
(c)通過液相色譜-質譜聯用技術或酶聯免疫方法測定受試者體液中生物標誌物-白細胞三烯E4、羥基棕櫚醯肉鹼、天冬氨酸、黃苷、甲氧色氨酸的水平，並將一種或兩種或多種任意組合的生物標誌物水平與所對應的參考水平進行比較，其中所述至少一種生物標誌物的水平與參考水平的差異指示該受試者患有原因不明性男性不育症。
[0007]在一個實施方案中，參考水平是指正常生育男性受試者對照群體中對應的所述體液中對應的所述至少一種生物標誌物的水平。
[0008]在一個實施方案中，所述男性受試者不局限於人類，還包括所有的哺乳動物。
[0009]在一個實施方案中，所述酶免疫測定是指固相酶聯免疫測定(ELISA)。
[0010]在本發明的另一 方面，本文提供了一種用於鑑定和檢測指示原因不明性男性不育症生物標誌物的方法，其特徵在於:該方法包括:
Ca)通過液相色譜-質譜聯用技術測定測定患有原因不明性男性不育症的男性受試者群體和正常生育男性受試者對照群體的體液樣品中所有可檢測生物標誌物的水平；
(b)將原因不明性男性不育症的男性受試者群體和正常生育男性受試者對照群體的體
液樣品中的所有可檢測生物標誌物的水平--對應進行比較，顯示差異的生物標誌物被鑑
定為指示原因不明性男性不育症的生物標誌物。
[0011]在一個實施方案中，所述體液選自受試者尿液、血清、血漿、血液、精液、精子、精漿、唾液。
[0012]在一個實施方案中，所述液相色譜-質譜聯用方法不局限於生物標誌物的鑑定，包括獨立用於生物標誌物的定性、定量測定。
[0013]在本發明的另一方面，本文提供了一種用於診斷檢測原因不明性男性不育症的試劑盒，其包括:
(a)所述白細胞三烯E4、羥基棕櫚醯肉鹼、天冬氨酸、黃苷、甲氧色氨酸是指示原因不明性男性不育症的生物標誌物的標準品；
(b)用於檢測所述指示原因不明性男性不育症的標誌物的存在的介質；
(c)用於檢測所述指示原因不明性男性不育症的生物標誌物的所述介質的試劑和/或說明書。
[0014]在一個實施方案中，用於檢測所述指示男原因不明性男性不育症的生物標誌物的存在的所述介質為抗體、抗體片段或抗體衍生物。
[0015]在一個實施方案中，其中所述的抗體、抗體片段或抗體衍生物可特異性地結合於所述指示原因不明性男性不育症的生物標誌物或其修飾配體。[0016]在一個實施方案中，其中所述試劑盒用於測定來自受試者的體液樣品中所述白細胞三烯E4、羥基棕櫚醯肉鹼、天冬氨酸、黃苷、甲氧色氨酸的至少一種生物標誌物的水平，並與所對應的參考水平進行比較，其中所述至少一種生物標誌物的水平與參考水平的差異指示該受試者患有原因不明性男性不育症。
[0017]在一個實施方案中，所述參考水平可以通過使用正常生育男性受試者對照群體來確定，對於人類受試者，一種更常見的測定是來自多個正常個體的結果的統計學組合。
[0018]在一個實施方案中，所述測定通過固相酶聯免疫測定(ELISA)進行。
[0019]與現有技術相比，本發明的有益效果是:(1)檢測所需樣品為體液，獲取方便，避免了機體損傷、射線成像等有害複雜的過程；(2)作為一種新型的診斷方法，結合現有的臨床診斷方法，可實現對原因不明性男性不育症的準確診斷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是白細胞三烯E4的ROC分析圖。實線是白細胞三烯E4的ROC分析(AUC=0.822，Ρ=1.27E-07);虛線是參比線。
[0021]圖2是羥基棕櫚醯肉鹼的ROC分析圖。實線是羥基棕櫚醯肉鹼的ROC分析(AUC=0.818，Ρ=1.90E-07);虛線是參比線。
[0022]圖3是天冬氨酸的ROC分析圖。實線是天冬氨酸的ROC分析(AUC=0.781，P=4.23E-06);虛線是參比線。
[0023]圖4是黃苷的ROC分析圖。實線是黃苷的ROC分析(AUC=0.780，P=4.56E-06);虛線是參比線。
[0024]圖5是甲氧色氨 酸的ROC分析圖。實線是甲氧色氨酸的ROC分析(AUC=0.776，P=6.10E-06);虛線是參比線。
[0025]圖6是聯合指標(白細胞三烯E4+羥基棕櫚醯肉鹼+天冬氨酸+黃苷+甲氧色氨酸)的ROC分析圖。實線是聯合指標的ROC分析(AUC=0.901);虛線是參比線。
【具體實施方式】
[0026]通過藉助以下實施例將更詳細說明本發明。以下實施例僅是說明性的，本發明並不受這些實施例的限制。
實施例
[0027]樣品收集
尿液樣品來自71名原因不明性男性不育症患者和47名正常健康男性對照。本文中男性不育症患者為與其配偶經過一年以上沒採取避孕措施的正常性生活仍然不育，但其配偶經臨床檢查被評估為生育功能正常。而且這些患者的常規精液檢查指標均為正常，設定標準為精液體積≥1.5 mL，精子密度≥15X106/mL，精子總活力(%)≥40，前向運動精子率(%)≥32，生命力(%)≥58。正常對照為與其配偶3個月內正常生育的男性。全部尿液樣品均在南京醫科大學附屬醫院收集，所有受試者均籤署書面知情同意書。
[0028]尿液製備
分析前，在室溫下溶解尿液樣品。將300μ L去離子水加入300μ L尿液中，在4 ° C下，12000 Xg離心10分鐘。在進行液相色譜-質譜(LC/MS)分析前，用注射過濾器使樣品離心後上清液通過孔徑0.22ΜΠ1的濾膜過濾。
[0029]LC/QT0F-MS 條件
尿液代謝圖譜通過Ultimate-3000液相色譜儀與MicrOTOF-Q I1-四級杆飛行時間質譜聯用系統獲得。反相分離使用的是填料孔徑為2.1X 150 mm 2.6 Mm的Phenomenex C18色譜柱，柱溫維持在30 ° C，進樣體積為5yL。流動相為(A)0.1%的甲酸水溶液和(B)
0.1%的甲酸乙腈溶液的混合液，洗脫梯度如下:在1.5分鐘內，流動相B體積分數由5%上升到20%,在8.5分鐘時流動相B上升至IJ 60%, 0.1分鐘後流動相B上升到95%並保持1.9分鐘，再在0.1分鐘內下降至5%，最終流動相B體積分數在5%維持3分鐘。流動相流速為200 μ L /min。質譜儀在正離子，ESI掃描模式下運行，掃描範圍為50到lOOOm/z。數據在centroid模式下收集。毛細管電壓和端板偏移電位分別設置為4500V和-500V。噴霧氣壓設置為0.6bar，幹氣流量為6 L/min，溫度為200° C。利用二級質譜實驗進一步潛在的生物標誌物。碰撞氣為IS氣，對於每一個生物標誌物，碰撞能範圍調整為IOeV到40eV。
[0030]數據分析
對所有採集到的色譜圖進行峰對齊、背景噪音去除和保留時間-分子量離子對的提取，經過歸一化和pareto模式化後，導入SMCA-P vl2軟體進行多元數據分析。利用80%樣本(57病例和37對照)作為訓練集以建立分析模型，利用剩餘的20%樣本(14病例和10對照)對所建立模型進行驗證。利用正交偏最小方差判別分析法針對訓練集樣本建立模型，對病例和對照樣本進行區別並篩選生物標誌物，並用非參數檢驗法進一步證實，P值小於0.05則認為具有統計學上的差異顯著性。
[0031]生物標誌物鑑定
等量混合所有樣本製備一個混合的尿液樣本，分析該混合樣本以獲得目標生物標誌物的精確分子量信息和同位素模式。使用DataAnalysis 4.0軟體擬合生物標誌物的可能分子式，並將結構信息提交Human Urine Metabolome Database (HMDB)資料庫檢索,對候選標誌物進行二級質譜分析，最終通過與商品化的標準品進行比較，以最終確認生物標誌物。
[0032]統計分析
使用SPSS Statistics 18軟體(SPSS Inc.)進行統計分析。米用Mann-Whitney非參數U檢驗法比較病例組和對照組之間的生物標誌物水平，P值小於0.05指示差異顯著性。採用 SPSS Statistics 18 軟體進行受試者操作特徵(Receiver Operating CharacteristicCurve, ROC)曲線分析，以評估這些生物標誌物區分不育個體和可育對照個體的預測能力。通過ROC曲線計算曲線下面積(AUC)。AUC的大小表徵單個生物標誌物或生物標誌物組合的不明原因性不育症診斷能力的強弱。通過檢索那些同時具有最高靈敏度和特異性的生物標誌物，確定每個生物標誌物的最佳截點。
[0033]生物標誌物的篩選
採用有監督的OPLS-DA最大化病例組和對照組之間的代謝圖譜差異。選擇對兩組之間的分類貢獻最大的變量作為潛在的生物標誌物。首先，採用變量的VIP得分作為篩選潛在生物標誌物的擴展集的一個重要因素。VIP得分大於4的變量在此步驟中被選中。其次，從候選名單中移除jack-knifing置信區間小於O的變量。然後，採用非參數檢驗作為最終程序，排除P值大於0.05的變量。最後，應用ROC分析進一步對候選生物標誌物進行評價。AUC是評價生物標誌物總體敏感性和特異性的度量標準。敏感性對應於真實的陽性率，而1-特異性對應於假陽性率。AUC為0.5說明模型預測到的是偶然性；AUC大於0.5，代表具有對疾病的識別能力。ROC曲線越靠近左上角，試驗的準確性就越高。在本實施例中，我們選擇了 AUC最高的前五個生物標誌物(表1)以用於診斷，它們分別是:白細胞三烯E4(AUC=0.822，Ρ=1.27E-07)(圖1);羥基棕櫚醯肉鹼(AUC=0.818，Ρ=1.90E-07)(圖 2);天冬氨酸(AUC=0.781，Ρ=4.23E-06)(圖 3);黃苷(AUC=0.780，Ρ=4.56Ε-06)(圖 4);甲氧色氨酸(AUC=0.776,Ρ=6.10Ε_06)(圖5)。這5個生物標誌物的各種組合被用於考察診斷男性不育的能力，結果發現聯合指標(白細胞三烯Ε4+羥基棕櫚醯肉鹼+天冬氨酸+黃苷+甲氧色氨酸)可獲得最高AUC值(0.901)，敏感性和特異性分別為85.7%和86.8% (圖6)。
[0034]表1生物標誌物
【權利要求】
1.一種用於診斷原因不明性男性不育症的方法，其特徵在於: (a)檢測受試者體液中至少一種指示原因不明性男性不育症的生物標誌物的水平，這些生物標誌物包括白細胞三烯E4、羥基棕櫚醯肉鹼、天冬氨酸、黃苷、甲氧色氨酸； (b)將所述受試者體液中至少一種生物標誌物的水平與參考水平進行比較，其中所述至少一種生物標誌物的水平與參考水平的差異指示該受試者患有原因不明性男性不育症。
2.根據權利要求1所述方法，其中，所述參考水平是正常生育男性受試者對照群體中對應的所述體液中對應的所述生物標誌物的水平。
3.根據權利要求1-2任一項所述方法，其中，所述體液包括受試者尿液、血清、血漿、血液、精液、精子、精眾、唾液。
4.根據權利要求1-3任一項所述方法，其中，所述受試者為男性，但不局限於人類，包括其它所有哺乳動物。
5.根據權利要求1-4任一項所述方法，其中，所述生物標誌物通過液相色譜-質譜聯用法或酶聯免疫法測定。
6.一種用於鑑定和檢測指示原因不明性男性不育症的生物標誌物的方法，其特徵在於: (a)測定患有原因不明性男性不育症的男性受試者群體和正常生育男性受試者對照群體的體液樣品中所有可檢測生物標誌物的水平； (b)將原因不明性男性不育症的男性受試者群體和正常生育男性受試者對照群體的體液樣品中的所有可檢測生物標誌物的水平--對應進行比較，顯示差異的生物標誌物被鑑定為指示男性不育的生物標誌物。
7.根據權利要求6所述方法，其中，所述體液選自受試者尿液、血清、血漿、血液、精液、精子、精漿、唾液。
8.根據權利要求6所述方法，其中，所述測定通過液相色譜-質譜聯用方法進行。
9.根據權利要求6和權利要求8所述方法，其中，所述液相色譜-質譜聯用方法不局限於生物標誌物的鑑定，包括獨立用於生物標誌物的定性、定量測定。
10.一種用於診斷檢測原因不明性男性不育症的試劑盒，包括用於檢測在權利要求1中所述的指示原因不明性男性不育症的生物標誌物的存在的介質。
11.根據權利要求10所述的試劑盒，其中，用於檢測所述生物標誌物的存在的所述介質為抗體、抗體片段或抗體衍生物。
12.根據權利要求11所述的抗體、抗體片段或抗體衍生物可特異性地結合於權利要求1所述的指示原因不明性男性不育症的生物標誌物或其修飾配體。
13.根據權利要求10所述的試劑盒，其中，用於檢測權利要求1所述的指示原因不明性男性不育症生物標誌物的方法為固相酶聯免疫測定(ELISA)。
14.根據權利要求10所述的試劑盒，還包括用於使用在權利要求10-14中任一項所述的方法中檢測生物標誌物的所述介質的試劑和/或說明書。
【文檔編號】G01N30/02GK103776914SQ201310467069
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年10月10日 優先權日:2013年10月10日
【發明者】張潔, 木曉麗, 申河清 申請人:中國科學院城市環境研究所