重組共表達維生素k環氧化物還原酶亞基1以提高依賴維生素k的蛋白質表達的製作方法

2023-10-23 22:30:47 9

專利名稱：重組共表達維生素k環氧化物還原酶亞基1以提高依賴維生素k的蛋白質表達的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種宿主生物體，其含有編碼維生素K還原酶複合體亞基1 (VK0RC1) 的重組核酸和編碼依賴於維生素K的(VKD)蛋白質的重組核酸，其中重組VK0RC1和重 組VKD蛋白質在所述宿主生物體中都得到表達。本發明還涉及一種包含細胞的細胞培養系 統，該細胞含有所述重組核酸。本發明還涉及一種提高在宿主生物體中表達重組VKD蛋白 質的生產率的方法，該宿主生物體在合適的體系中進行培養。
背景技術：
維生素K環氧化物還原酶複合體(VKORC)重複利用還原形式的維生素K，該維生 素K形式是依賴於維生素K的(VKD)蛋白質翻譯後Y-羧基化必需的輔助因子(Nelsestuen, G. L., Zytkovicz， T. H., & Howard, J. B. (1974) The mode of action of vitamin K Identification of gamma- carboxyglutamic acid as a component of prothrombin. J. Biol. Chem.， 249, 6347-6350)。 最近，VKORC1基因得到了鑑定，並且被Rost等於2004年進行了詳細描述(Rost，S.,Fregin， A., Ivaskevicius, V.， Conzelmann, E,， Hortnagel, K.， Pelz, H. J.， Lappegard, K., Seifried， E.， Scharrer, I" Tuddenham， E. G., Muller， C. R., Strom, T. M., & Oldenburg, J. (2004) Mutations in VKORC1 cause warfarin resistance and multiple coagulation factor deficiency type 2. Nature, 427, 537-541)。
VKD蛋白質含有Y-羧基化穀氨酸(gla)殘基，該殘基表現出特異的生物化學和生理 學特性，類似於依賴於Ca的結合凝血因子帶負電磷脂膜的特性(Mann, K.G.， Jenny, R. J.，& Krishnaswamy, S. (1988) Cofactor proteins in the assembly and expression of blood clotting enzyme complexes. Annu. Rev. Biochem., 57, 915-956) 。 VKD蛋白質包括促凝血的因子II、 VII和x，以及抗凝血的蛋白質c、 s和z。雖然限定為一種單獨的己知酶促反應，但在所有 哺乳動物組織中都發現有Y-羧化酶活性(Vermeer, C. & de Boer-van den Berg MA (1985) Vitamin K-dependent carboxylase. Haematologia (Budap), 18， 71-97) 。 y-羧化酶使用還原的維生 素K作為輔助因子來催化羧基化反應。
依賴於維生素K的(VKD)穀氨酸殘基，羧基化是一種必要的翻譯後蛋白質的改性， 用於產生在止血、培養對照樣、體內鈣平衡和信號轉導中發揮作用的有生物學活性的VKD
蛋白質(Furie B., Bouchard, B. A" & Furie B. C, (1999) Vitamin K-dependent biosynthesis of gamma-carboxyglutamic acid. Blood, 93, 1798-1808; Berkner K. L. (2000) The vitamin K-dependent carboxylase. J. Nutr.， 130, 1877-1880)。在這些蛋白質的Gla-結構域N端上的幾 個穀氨酸殘基進行羧基化改性，以能夠使鈣依賴性磷脂膜相互作用(StenfloJ. &SuttieJ. W. (1977) Vitamin K-dependent formation of gamma-carboxyglutamic acid. Annu. Rev. Biochem.， 46, 157-172; Suttie J. W. (1980) Mechanism of action of vitamin K: synthesis of gamma-carboxyglutamic acid. CRC Crit Rev. Biochem., 8， 191-223)。這些多y-穀氨酸(Gla) 殘基使得Gla結構域產生構象變化，這對於VKD蛋白質活性和與磷脂膜表面結合活性的組合 而言是必需的(Nelsestuen G. L., Broderius M., & Martin, G. (1976) Role of gamma-carboxyglutamic acid, Cation specificity of prothrombin and factor X-phospholipid binding. J. Biol. Chem., 251， 6886-6893; Zwaal R. F., Comftirius P., & Bevers E. M. (1998) Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim. Biophys. Acta, 1376， 433-453)。
VKD凝血蛋白要求完全的或者接近完全的羧基化以便在有鈣離子存在時結合於細 胞膜表面(Furie B. & Furie B. C. (1988) The molecular basis of blood coagulation. Cell, 53， 505-518)。如果維生素K拮抗劑抑制了Y-羧基化，正在羧基化的VKD蛋白質不能形成鈣依 賴性結構，這將導致對磷脂膜的低親和性並且活性較小(EsmonC.T.,SadowskiJ. A.,&Suttie J. W. (1975a) A new carboxylation reaction. The vitamin K-dependent incorporation of H-14-C03-into prothrombin. J. Biol. Chem., 250, 4744-4748; Esmon C. T., Suttie J. W.， & Jackson, C. M. (1975b) The ftinctional significance of vitamin K action. Difference in phospholipid binding between normal and abnormal prothrombin. J. Biol. Chem.， 250, 4095-4099; Malhotra O. P., Nesheim M. E,， & Mann K. G. (1985) The kinetics of activation of normal and gamma-carboxyglutamic acid-deficient prothrombins. J. Biol. Chem.， 260,279-287)。例如，造成 總蛋白質活性損失的原因可能歸因於活化的人類蛋白質C缺少VKD蛋白質的10個Gla殘基 中的任 一 個(Zhang L., Jhingan A.， & Castellino F. J. (1992) Role of individual gamma-carboxyglutamic acid residues of activated human protein C in defining its in vitro anticoagulant activity. Blood, 80， 942-952)。在血友病B病人身上發現，正在羧基化的因子IX 突變體缺少促凝血活性，這可以歸因於鈣誘導的構象變化的降低和結合磷脂囊泡能力的損失 ((Ware, J., Diuguid D. L.， Liebman H. A., Rabiet M. J., Kasper C. K., Furie B. C., Furie B., & Stafford, D. W. (1989) Factor IX San Dimas. Substitution of glutamine for Arg-4 in the propeptide leads to incomplete gamma-carboxylation and altered phospholipid binding properties. J. Biol.Chem.，264, 11401-11406)。
對重組因子IX而言，研究表明，在中國地鼠卵巢細胞中表達功能性因子IX會被在 較高生產水平上的羧基化能力飽和這一事實所限制(Kaufman, R. J., Wasley L. C., Furie B. C.， Furie B.， & Shoemaker C. B. (1986) Expression, purification, and characterization of recombinant gamma-carboxylated factor IX synthesized in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem., 261 , 9622-9628; Derian C. K.， VanDusen W., Przysiecki, C. T.， Walsh P. N., Berkner K. L., Kaufman, R. J., & Friedman, P. A. (1989) Inhibitors of 2-ketoglutarate-dependent dioxygenases block aspartyl beta-hydroxylation of recombinant human factor IX in several mammalian expression systems. J. Biol. Chem" 264, 6615-6618)。
此外，當培養介質中有過剩的維生素K可利用時，對於人類因子IX，顯示出？羧基化蛋白質的重組過量表達，導致前肽裂解受到限制並且限制以更高的分泌速率進行，羧基化， 這樣生產出僅部分具有gla殘基的蛋白質。這會導致具有還原活性的VKD重組蛋白質變體分 泌出來。向培養基中添加維生素K不會以高表達水平提高因子IX活性。研究顯示，要得到 活性因子IX，對於細胞培養基中維生素K的需要在5ng/ml時達到飽和。低於該水平，中國 地鼠卵巢(CHO)細胞分泌的活性因子IX的量取決於維生素K濃度(Kaufman, R. J., Wasley， L. C., Furie， B. C., Furie， B.， & Shoemaker, C. B. (1986) Expression, purification, and characterization of recombinant gamma-carboxylated factor IX synthesized in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem., 261， 9622-9628)。
到目前為止，低表達水平的細胞系必須進行選擇才能用於生產，以便克服這些對修 飾翻譯後VKD蛋白質的細胞能力的限制。弗林蛋白酶、前肽裂解酶的共表達會導致該前肽 完全裂解(Wasley, L. C., Rehemtulla， A., Bristol, J. A., & Kaufman, R. J. (1993) PACE/ftirin can process the vitamin K-dependent pro-factor IX precursor within the secretory pathway. J. Biol. Chem.， 268, 8458-8465)，但是不涉及Y-羧基化的提高。另一個方法是y-羧化酶過量表達，對 於因子IX，其不會導致蛋白質分泌提高(Rehemtulla, A.， Roth, D. A., Wasley， L. C., Kuliopulos, A.， Walsh, C. T., Furie， B., Furie, B. C., & Kaufman, R. J. (1993) In vitro and in vivo fiinctional characterization of bovine vitamin K-dependent gamma-carboxylase expressed in Chinese hamster ovary cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 4611-4615)。在羧基化反應期間結合於羧化酶的 因子IX分子，不能被有效地釋放。可得到如下結論，在Y-羧基化位點，還原性維生素K形 式的供應是該反應的限制步驟(Hallgren， K. W., Hommema, E. L., McNaIIy, B. A., & Berkner, K. L. (2002) Carboxylase overexpression effects full carboxylation but poor release and secretion of factor IX: implications for the release of vitamin K-dependent proteins. Biochemistry, 41, 15045-15055)。
因此，人們非常需要使表達穩定化，尤其是使宿主生物體內的VKD蛋白質重組表達 穩定化，該宿主生物體以提高的表達VKD蛋白質的分泌速率和/或活性來生產VKD蛋白質。發明內容
因此，本發明的一個目的是提供新的系統和方法，以提高經由VKORCl共表達來表 達VKD蛋白質(尤其是重組VKD蛋白質)的生產率。
本發明涉一種宿主生物體，其含有編碼維生素K還原酶複合體亞基1 (VKORCl)或 其功能活性衍生物的重組核酸、以及編碼依賴於維生素K的(VKD)蛋白質或其功能活性衍 生物的重組核酸，其中重組VKORCl和重組VKD蛋白質在所述宿主生物體中都得到表達。
本發明進一步涉及一種細胞培養系統，其包含含有編碼VKORCl或其功能活性衍生 物的重組核酸和編碼VKD蛋白質或其功能活性衍生物的重組核酸的細胞，其中重組VKORCl 和重組VKD蛋白質在所述細胞中都得到表達；本發明還涉及一種通過重組共表達VKORCl 來提高在宿主生物體中表達重組VKD蛋白質或其功能活性衍生物的生產率的方法；本發明 還涉及一種在宿主生物體或細胞培養系統中重組表達VKORCl的的應用，以提高表達重組 VKD的生產率。
本發明的一個方面涉及一種宿主生物體，其含有編碼維生素K還原酶複合體亞基1 (VKORCl)或其功能活性衍生物的重組核酸、以及編碼依賴於維生素K的(VKD)蛋白質 或其功能活性衍生物的重組核酸，其中重組VKORCl和重組VKD蛋白質在所述宿主生物體 中都得到表達。
在此使用的術語"功能活性衍生物"，是指其生物機能基本上分別與VKORCl和 VKD蛋白質相同的任何多肽。該功能活性衍生物的多肽序列可以包括胺基酸的缺失、添加和 /或取代，該胺基酸的缺失、存在和/或取代都不會對多肽活性產生任何實質性的負面影響，例 如該胺基酸位於多肽序列中對蛋白質生物活性無貢獻的部分上。不改變所述多肽生物活性的 各個多肽序列上少量的胺基酸缺失、添加和/或取代，也作為功能活性衍生物包括在本申請中。
在下文中術語"(重組)VKORCl或其功能活性衍生物"和"(重組)VKD蛋白質 或其功能活性衍生物"也分別稱為"(r) VKORCl"和"(r) VKD蛋白質"。
通過本技術領域任何已知用於生產重組核酸的方法，例如通過重組DNA技術、RNA 逆轉錄和/或DNA擴增技術或者經由細菌繁殖的技術，可以得到本發明的重組核酸。
本發明的宿主生物體可以源自於任何能夠表達生物學活性rVKORCl和生物學活性 rVKD蛋白質的宿主生物體，包括重組宿主生物體。特別地，本發明的宿主生物體可以是真 核宿主生物體，包括多細胞生物體，其特徵在於能夠生產有藥理學活性的rVKD蛋白。
在本發明的一種實施方式中，宿主生物體是哺乳動物細胞，例如該細胞來源於選自 由CHO細胞、HEK293細胞、NSO細胞、SP20細胞、Perc.6細胞、SkHep細胞、HepG2細 胞、BHK細胞、Hela細胞、Vero細胞和COS細胞所組成的細胞組的哺乳動物細胞株。在本 發明的具體實施例中，宿主生物體是衍生於CHO細胞或HEK293細胞的細胞。
在本發明的一種實施方式中，包含或者同時包含於本發明的宿主生物體的編碼 rVKORCl的核酸或編碼rVKD蛋白的核酸，經由選自由誘導表達、瞬時表達和固定表達所組 成的模式組的表達模式而得到表達。可以使用本技術領域己知的任何表達系統或者商品表達 系統，用於編碼VKORC1和/或VKD蛋白質的重組核酸表達，包括使用調節系統比如合適的、 可很好控制的啟動子、增強子等。
在本發明的宿主生物體的優選實施方式中，將編碼VKORC1的重組核酸或編碼VKD 蛋白質的重組核酸、或者將二者同時穩定地整合入本發明宿主生物體的遺傳物質中。
本發明的宿主生物體可以用於提高rVKD蛋白的表達水平，該rVKD蛋白比如是血 液因子或其功能活性衍生物，優選人類促凝血的或抗凝血的血液因子或其功能活性衍生物。 在本發明的一種優選實施方式中，rVKD蛋白是藥理學上可接受的人體促凝血因子，其可以 用於出血病症的治療。
作為本發明的例子，rVKD蛋白是促凝血因子，包括因子II、因子VII、因子IX和因 子X，優選人類因子IX;或者是抗凝血因子，包括蛋白質C、蛋白質S和蛋白質Z。
根據本發明，宿主生物體含有編碼VKORC1的重組核酸和編碼VKD蛋白質的重組 核酸,其中rVKORCl和rVKD蛋白在所述宿主生物體中都得到表達，並且其中表達重組VKD 蛋白質的生產率有實質性的提高。
在此使用的術語"其中表達重組VKD蛋白質的生產率有實質性的提高"是指與不 進行rVKORCl共表達的宿主生物體內表達rVKD蛋白的情況相比，重組表達的VKD蛋白質 或其功能活性衍生物的數量、分泌速率、活性和/或穩定性有實質性的提高。
通過本技術領域任何已知的方法，包括例如從培養介質中分離、或者通過收穫宿主 生物體，並對表達蛋白進行分析例如進行電泳分析、色層分析、或免疫吸附，可以確定表達 重組VKD蛋白質的生產率的提高。在本發明的一種優選實施方式中，經由任何已知的酶免 疫測試方法比如酶聯免疫吸附測試(ELISA)，來檢測rVKD蛋白的表達。作為選擇之一，
通過測定活化的部分促凝血酶原激酶時間(APTT)，可以評價rVKD蛋白的完整性和活性。
本發明的另一個方面涉及一種細胞培養系統，其包含含有編碼VK0RC1的重組核酸 和編碼VKD蛋白質的重組核酸的細胞，其中rVKORCl和rVKD蛋白在所述細胞中都得到表 達。
本發明的細胞培養系統可以包括任何細胞培養系統，其含有能表達生物活性 rVKORCl和生物活性rVKD蛋白的細胞。上文已列舉了該細胞的合適例子。在一種優選實施 方式中，本發明的細胞培養系統是真核細胞系統，其特徵在於可以生產一種或多種藥理學活 性的rVKD蛋白。
在本發明的一種實施方式中，本發明的細胞培養系統包括如上限定的宿主生物體。
對本發明的細胞培養系統中用於培養細胞(包括以連續方式或分批方式培養細胞) 的培養基、試劑和培養條件沒有具體限制。在本發明的一個實施方式中，細胞在無血清、或 者無血清及蛋白質的條件下進行培養。在本發明的另一種實施方式中，所採用的條件是使含 有編碼VKORC1或VKD蛋白質的重組核酸的細胞選擇性地增殖，例如使用選擇性培養基。
已被經選擇的宿主生物體細胞表達的、以及取決於所用轉染/載體系統的預期rVKD 蛋白包含於細胞中，或者分泌到培養細胞用培養基中，可以使用本技術領域已知的方法將其 從細胞培養系統中分離/回收。
本發明的另一個目的在於提供一種用於提高在宿主生物體中表達的重組VKD蛋白質 的比活性的方法，其包括下述步驟(a) 提供宿主生物體；(b) 將編碼VKD蛋白質或其功能活性衍生物的重組核酸插入步驟(a)所述宿主生物體；(c) 將編碼VKORCl的重組核酸插入步驟(a)所述宿主生物體；以及(d) 表達步驟(b)和(c)所述重組核酸。
在本發明的一種實施方式中，將編碼VKORC1或VKD蛋白質的重組核酸經由共轉 染同時地插入宿主生物體中。作為選擇之一，通過先後轉染依次將所述重組核酸插入宿主生 物體中。
根據本發明使用的重組核酸可以容納在適合於轉染進入含有質粒和病毒載體的宿主 生物體中的任何形式和任何系統中。編碼VK0RC1以及VKD蛋白質的重組核酸，可以二者 同時存在於一個載體分子中，也可以各自存在於一個載體分子中，其中兩種不同的載體分子 可以相同也可以不同。重組核酸的轉染取決於所用的轉染系統，並且可以通過本技術領域任 何已知用於轉染宿主生物體例如真核細胞的方法或者商業化方法來進行轉染，包括電穿孔法、
沉澱法、或者微量注射法。
本發明的另一個方面在於提供一種用於提高在宿主生物體中表達重組VKD蛋白質的 生產率的方法，其包括下述步驟(a) 提供一種編碼VKD蛋白質的重組核酸被整合入其遺傳物質中的宿主生物體，所述遺 傳物質優選基因組；(b) 將編碼VK0RC1的重組核酸插入步驟(a)所述宿主生物體；以及(c) 表達步驟(a)和(b)所述核酸。
在本發明的一種優選實施方式中，穩定地表達編碼VKD蛋白質的重組核酸。
本發明的另一個目的在於提供一種用於提高在宿主生物體中表達重組VKD蛋白質的生產率的方法，其包括下述步驟-(a) 提供一種編碼VKORCl的重組核酸被整合入其基因組的宿主生物體；(b) 將編碼VKD蛋白質的重組核酸插入步驟(a)所述宿主生物體；以及(c) 表達步驟(a)和(b)所述核酸。
在本發明的一種優選實施方式中，穩定地表達編碼VKORCl的重組核酸。
根據本發明，如上限定的宿主生物體或如上限定的細胞培養系統，可以通過rVKORCl共表達而驚人地提高表達重組VKD蛋白質的生產率。
本發明的另一個目的在於提供一種rVKD蛋白質，該rVKD蛋白質可通過插入編碼 VKORCl的重組核酸和編碼所述rVKD蛋白的重組核酸、表達所述核酸、以及回收所述rVKD 蛋白來獲得。


如下附圖為圖1顯示了在用rVKORCl (1)或空載體(2)瞬時轉染CHO衍生的產rFIX的細胞株後， 基於ELISA值計算的以ng/ml計的rFIX濃度(縱軸)(圖1A)，和基於凝固活性(APTT) 值計算的以mU/ml計的rFIX比活性(縱軸)(圖1B)。在24小時後，收集無血清的細胞 培養上清液。圖2顯示了在用rVKORCl (1)或空載體(2)瞬時轉染CHO衍生的產rFIX的細胞株後， 基於ELISA值計算的以ng rFIX/l6個細胞/天計的rFIX比生產力(縱軸)(圖2A)，和基 於凝固活性(APTT)值計算的以mUrFIX/lS個細胞/天計的rFIX比活性(縱軸)(圖2B)。 在24小時後，收集無血清的細胞培養上清液。
圖3顯示了在用rVKORC3 (1)或空載體(2)瞬時轉染HEK293衍生的產rFIX的細胞 株後，基於ELISA值計算的以ng/ml計的rFIX濃度(縱軸)(圖3A)，和基於凝固活性(APTT) 值計算的以mU/ml計的rFIX比活性(縱軸)(圖3B)。在24小時後，收集無血清的細胞 培養上清液。圖4顯示了在用rVKORC4 (1)或空載體(2)瞬時轉染HEK29 3衍生的產rFIX的細胞 株後，基於ELISA值計算的以ngrFIX/l(^個細胞沃計的rFIX比生產力(縱軸)(圖4A)， 和基於凝固活性(APTT)值計算的以mU rFIX/l(^個細胞沃計的rFIX比活性(縱軸)(圖 4B)。在24小時後，收集無血清的細胞培養上清液。圖5顯示了在用rVKORC5 (1)或空載體(2)瞬時轉染CHO衍生的產rFIX的細胞株後 以％計的rFIX比凝固活性值(圖5A)、以及在用rVKORCl (1)或空載體(2)瞬時轉染 HEK293衍生的產rFIX的細胞株後以。/。計的rFIX比凝固活性值(圖5B)。圖6顯示了在CHO衍生的穩定表達rFVII的細胞株中rVKORCl的瞬時表達。用編碼 VKORC1的載體或作為對照的不含VKORCl的相同載體("空載體")瞬時轉染該細胞株。 重複進行轉染，並且連續地使用5種不同的維生素Kl濃度。圖中顯示了培養上清液中相應 於維生素K濃度的rFVII的生產率和rFVII活性測定結果。(圖6A)是基於ELISA測量值的 生產率值。(圖6B)是基於凝固活性測量值的生產率值。(圖6C)基於用ELISA測定的每 嗎下FVII凝固單位而計算的FVII比活性。圖7顯示了在CHO衍生的穩定表達rFVII的細胞株以及HEK293衍生的穩定表達rFVII 的細胞株中rVKORCl的瞬時表達。用編碼rVKORCl的載體或作為對照的不含rVKORCl的 相同載體("空載體")瞬時轉染這些細胞株。重複進行轉染。基於ELISA和培養上清液中 FVII及FVIIa凝固性的rFVn生產率和rFVn活性的測量結果如圖所示。A)是CHO衍生的 細胞株。B)是HEK293衍生的細胞株。圖8顯示了在CHO-DHFR-寄主細胞中穩定的rFVII和rVKORC雙順反子共表達。通過 隨MTX含量提高的基因共擴增產生所選克隆的rFVII生產率。用編碼DHFR'的選擇性質粒共 轉染兩種不同的編碼人類rFVII的表達載體。圖8A)是用引起rFVII和rVKORCl雙順反子 共表達的載體構建體轉染的83個克隆。圖8B)是用編碼rFVII的載體共轉染的133個克隆。圖9顯示了在用亞克隆和基因擴增進行穩定的轉染後所產生的產rFVII的CHO衍生克隆 的生產率和比活性值，包括rFVII單獨表達或者rFVII與rVKORCl進行雙順反子共表達的情 況。基於分泌的rFVII的ELISA測試和FVII凝固性測試，對133個未進行共表達的克隆和 83個與rVKORCl共表達的克隆進行了 rFVII生產率和比凝固活性的對比。圖10顯示了分離於CHO衍生細胞株的mRNA水平的基因表達Northern印跡分析實施例。 泳道l:非CHO-DHFR'轉染的細胞株；泳道2: rFVII克隆；泳道3和4:如在實施例4中描 述的依次用rFVII和rVKORCl編碼質粒載體轉染的兩種克隆。泳道5至7:用編碼雙順反子 mRNA的單一載體轉染的克隆，該mRNA具有如實施例3中描述的經IRES偶聯的rFVII和 rVKORCl序歹iJ。區域A、 B和C顯示了在與三種不同探針雜交後產生的相同印跡。A)用於 人VK0RC1的探針。B)用於人FVII的探針。C)用於地鼠GAPDH的探針。圖中給出了識 別的mRNA的指示和大小。圖11顯示了穩定轉染的CHO衍生細胞克隆和HEK293衍生細胞克隆的rFVII表達水平，這些克隆在用rVKORCl編碼質粒或者對照樣質粒對產rFVn的細胞株進行第二次轉染後分離出來。該對照樣是空的宿主載體。生產率值是基於分泌的rFVII的ELISA測試而計算出來的。圖11A)是CHO衍生細胞克隆。圖11B)是HEK293衍生細胞克隆。圖12顯示了穩定轉染的CHO衍生細胞克隆和HEK293衍生細胞克隆相對於比活性值的rFVII表達水平，這些克隆在用rVKORCl編碼質粒或者對照樣質粒對產rFVII的細胞株進行第二次轉染後分離出來。該對照樣是空的宿主載體。生產率值是基於分泌的rFVII的ELISA測試而計算出來的。通過ELISA測定，以FVII凝固性單位每figFVII計算出比活性值。圖12A)顯示的是CHO衍生細胞克隆，圖12B)為HEK293衍生細胞克隆。
具體實施方式
以下用實施例進一步闡明本發明，但並不是對本發明作任何限制。實施例實施例1:在產rFIX的HEK293衍生細胞株和CHO衍生細胞株中瞬時轉染並且共表達 的rVKORCl
通過適當的轉染方法，將含有人類因子IX (FIX)、編碼受強病毒性啟動子調控的 DNA序列的表達質粒導入哺乳動物寄主細胞株，使得該細胞具有穩定地整合入其基因組的導 入序列，從而實現重組因子IX (rFIX)的表達。通過傳遞足夠的抗性基因，也使該質粒具有 對可選擇的標記藥劑的抗性。就CHO細胞而言，因為缺乏核苷酸從頭合成路徑的酶，其僅能 在培養基中含有核苷酸前體時生長，而這種酶的表達需要二氫葉酸還原酶(DHFR)。這使 得通過逐漸提高氨甲蝶呤(MTX)濃度能夠進行FIX基因的共擴增，由此導致在細胞基因組 內編碼DHFR和rFIX基因拷貝數都會增加。為此目的，CHO衍生細胞克隆也得在缺乏核苷 酸和核苷酸前體的選擇性培養基中進行培養。
為鑑別產人rFIX的細胞，在轉染並且向培養基添加選擇性藥劑後，將細胞懸液進行 稀釋，使得能夠分離出單細胞衍生克隆。在分離後，培養這些細胞克隆以進行融合，使得能 夠通過酶聯免疫吸附測試(ELISA)技術測量細胞培養上清液的rFIX含量。為此目的，細胞 得在缺少任何培養促進性胎牛血清或其組分的條件下進行培養，以確保通過細胞分泌的rFIX 來進行鑑別。為確保全功能的rFIX蛋白質，加入維生素K。在24小時後收穫上清液，並且 通過rFIX專一性ELISA技術進行分析。另外，通過測定活化的部分促凝血酶原激酶時間(APTT)，可以評價蛋白質的完整性和活性。
使用己被選擇用於rFIX表達的細胞株，通過瞬時表達技術來完成rVKORCl的共表 達。在不進一步進行克隆選擇的條件下，將包含rVKORCl cDNA的表達質粒轉染入這些細 胞。從完整的轉染細胞池收集上清液，並且將rFIX含量和活性與陰性對照進行對比，使之標 準化為rFIX比分泌速率，來評價rVKORCl活性效果。材料和方法表達載體
根據標準的克隆技術來克隆表達載體。簡言之，通過將含有鼠DHFR的載體 pAdD26SV(A)-3 (Scahill, S. J., Devos, R., Van der, H. J., & Fiers, W. (1983) Expression and characterization of the product of a human immune interferon cDNA gene in Chinese hamster ovary cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 80,4654-4658; vector is a gift by Dr. Hauser, GBF Germany) 的Pstl 1.5 kbp片段插入提供有SV40增強子、早期啟動子和內含子的pSVI3載體(Clontech 公司，PaloAlto， Ca)，來產生pSV-DHFR，其中pSV卩載體的P-半乳糖苷酶基因已通過Notl 消化而去除，並且已插入多接頭。該載體也已用於通過EcoRI/Hindlll片段與phpAPr-l-卩gal 的EcoRI/Hindlll片段進行交換，來產生含人肌動蛋白啟動子和內含子的phact,其中 phpAPr-l-|3gal也是Dr. Hauser的贈品。通過EeoRI消化pFIX-bluescript，產生包含具有alal48 多態性的野生型人FIX cDNA的phact-FIX (McGraw, R. A" Davis, L. M.， Noyes， C, M.， Lundblad, R. L.， Roberts, H. R., Graham, J. B., & Stafford, D. W. (1985) Evidence for a prevalent dimorphism in the activation peptide of human coagulation factor IX. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 2847-2851)，其中pFIX-bluescript是通過將來自於任意的最初人類肝臟cDNA文庫的人 體FIX插入pBluescript (Stratagene公司，La JoIIa， CA)、並且將所得片段插入用EcoRI部 分消化的phact而產生的。
載體pCMV-FIX-neo是通過將載體pFIX-bluescript的EcoRI片段插入pCMV卩 (Clontech公司)而產生的，其中(3-gal cDNA已經去除。在該載體內，通過經由PCR的位
點專一突變，將ala密碼子交換為thr密碼子，使天然多態性alal48變化為thrl48。再將該PCR 產品再次插入相同的載體中。將該載體的EcoRI片段克隆入pcDNA3.1 (Invitrogen公司， Carlsbad, Ca)。得到pCMV-FIX-neo。
通過使用載體pCEP4-VKORCl產生載體pCMV-VKORCl-EDHpro (Prof. Oldenburg 友好提供，其描述參見Rost et al., 2004)作為PCR模板，。將含有rVKORCl cDNA的PCR 產品克隆入pCMV-EDHpro載體((Herlitschka， S. E., Falkner, F. G.， Schlokat, U., & Dorner, F. (1996) Overexpression of human prothrombin in permanent cell lines using a dominant selection/amplification ftision marker. Protein Expr. Purif., 8, 358- 364)。 細胞培養和轉染
從哥倫比亞大學(紐約，紐約州)得到CHO DUKX/DXB11細胞，並且在補充有5 % 胎牛血清(PAA， Linz，奧地利)、脫氧腺苷、腺苷和胸腺嘧啶核苷(皆購自Sigma公司， St Louis, MO)和L-穀氨醯胺(Invitrogen公司)以及青黴素/鏈黴素(Invitrogen公司)的 DMEM/Ham's F12 (1:1)混合物(Invitrogen公司)中進行培養。將NEK293細胞(ATCCNo. CRL-1573)在補充有5 %胎牛血清和L-穀氨醯胺及青黴素/鏈黴素的DMEM/Ham's F12 (1:1) 混合物中進行培養。為進行穩定的轉染，使用磷酸鈣共沉澱方法。通過用線性化質粒phact-FIX 和pSV-DHFR共轉染，並且通過在補充有5 %透析的FBS (PAA)的不含次黃嘌呤、甘氨酸 和胸腺嘧啶核苷的DMEM/Ham's F12( 1:1 )混合物(Invitrogen公司)中進行篩選，形成CHOrFIX 細胞。為進行基因擴增，從10 nM至200 nM逐步增加濃度地加入MTX(Ebewe公司，Unterach， 奧地利)。用線性化質粒pCMV-FIX-neo轉染NEK293細胞，並且在含有500 pg/ml G418 (Invitrogen公司)的培養基中進行篩選。通過手工或使用流式細胞術細胞分類技術而進行限 制性稀釋克隆技術，分離出細胞克隆。
通過將生長培養基換成補充有10 pg/ml維生素Kl (Sigma公司)的無血清培養基， 檢測分泌入細胞培養上清液的FIX。收集上清液，並且通過ELISA和凝固性測試(活化的部 分促凝血酶原激酶時間，APTT)來測定FIX濃度。為計算比分泌速率，使用CASY細胞計 數器(Scharfe Systems公司，Reutlingen，德國)計算細胞數量。
為進行瞬時共表達實驗，使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen公司)處理非線 性化質粒pCMV-VKORCl-EDHPro。不含rVKORCl cDNA的相同載體用作陰性對照。 分析方法
使用稀釋為1:40000的兔抗人FIX多克隆抗體(Accurate Chemical公司，Westbury，紐約州)作為最初抗體，並且使用羊抗人FIX多克隆抗體-辣根過氧化物酶偶聯物作為檢測抗
體，進行ELISA。使用來源於人血漿的FIX (Enzyme Research Laboratories, S Lafayette, In) 作為標準。使用STA Compact的自動血凝度計(Diagnostica Stago公司，Asnieres,法國)， 通過將FIX樣品稀釋入FIX不足的血漿來測定APTT。所有用於凝固的試劑皆購自位於奧地 利維也納的巴克斯特公司。 結果
對兩種穩定的產rFIX細胞株，即CHO-衍生細胞株和HEK293衍生細胞株，用攜帶 有編碼人VKORC1的cDNA的表達載體pCMV-VKORCl-EDHpro進行瞬時轉染處理。使用 空載體pCMV-EDHpro和穩定表達rFIX的細胞株作為對照。在瞬時轉染後，將細胞留在含血 清培養基中過夜。用PBS洗滌細胞，並且在無血清培養基中培養24小時，然後收穫上清液。 通過免疫化學和測定抗原水平或凝固活性的凝血診斷方法，監測FIX表達和其在培養基中的 分泌情況。基於單位細胞數量和24小時的產品濃度(圖1至圖4)，計算出分泌速率，以估 計其對細胞生產率的影響。
與空載體對照樣相比，HEK293細胞表達rFIX的比分泌速率顯示出平均增加2.7倍， 並且在rVKORCl轉染後，rFIX濃度增加2.9倍。這些值皆基於APTT測量值。而ELISA測 試值顯示出濃度增加2.0倍，並且比生產率增加1.8倍。
對於CHO衍生的產rFIX細胞株，研究發現ELISA-滴度增加了 1.5倍，並且基於比 分泌速率的ELISA增加了 1.2倍。經APTT計算的分泌速率提高1.4倍，而經APTT測定的 FIX濃度提高1.7倍。
從這些值可以得出結論，當含有rVKORCl時，兩種不同的細胞類型都可以達到更高 的rFIX產品濃度，這主要是因為其具有更高的細胞rFIX比分泌速率。完全？羧基化rFIX分 子的較高分泌速率的一個原因，可能是用於翻譯後修飾的細胞質量控制機制(Lin， P. J.， Straight, D. L.， & Stafford, D. W. (2004) Binding of the factor IX gamma-carboxyglutamic acid domain to the vitamin K-dependent gamma-glutamyl carboxylase active site induces an allosteric effect that may ensure processive carboxylation and regulate the release of carboxylated product. J. Biol. Chem., 279， 6560-6566)。對於兩種細胞株，APTT值比ELISA值增加得較高，也表明 了其較好的FIX凝固活性。
rVKORCl對在HEK293衍生細胞中rFIX共表達的影響比對在CHO細胞中rFIX共 表達的影響更強，這可被解釋為前者有更高的細胞性rFIX生產率。在VKORCl瞬時轉染前， 關於APTT值，293衍生克隆的生產率比CHO克隆的生產率高3.5倍，但關於ELISA值則高5倍。這表明，因為生產率更高，293衍生細胞的翻譯後加工程度較低。因此，當通過rVKORCI 共表達來恢復Y-羧基化能力時，在該細胞株上發現有更高收率的活性rFIX同種型。實施例2:在CHO和HEK293衍生的哺乳動物細胞株中瞬時共表達重組人VK0RC1， 穩定生產重組人凝血因子VII (rFVII)
通過在產人重組凝血因子VII (rFVII)的細胞中瞬時共表達，可以研究rVKORCl對 rFVII活性和/或分泌速率的任何影響。這樣，大部分產rFVII的細胞群也會短時間共表達 VK0RC1。在該期間內，可以對分泌的rFVII進行取樣、表徵並且與用空載體對照樣並行轉 染的相同細胞株所分泌的rFVII相比較。
通過轉染質粒載體含有人類rFVII cDNA並且經篩選抗性基因、隨後篩選生產性克隆， 可以實現在哺乳動物細胞中穩定表達rFVII。實施例1中所述的相同寄主細胞株可以用於rFVII 的穩定表達。必需進行類似的基因篩選和基因擴增步驟、以及生產性克隆株的篩選。
然後，按與實施例1中描述的同樣方法，將攜帶人VK0RC1 cDNA的表達載體進行 瞬時轉染，以實現重組VK0RC1 (rVKORCl)共表達。材料和方法表達載體
通過用來自適當的來源比如牛痘表達載體pselp/huFVII (Himly等，1998)的PCR分 離出人FVIIcDNA作為模板，可以構建包含人rFVII遺傳信息的表達載體。可以將PCR產物 經限制性酶切位點插入哺乳動物表達載體，該載體提供有強病毒性啟動子比如來自巨細胞病 毒(CMV)的啟動子、以及附加的抗生素篩選標記物比如新黴素或潮黴素抗性基因，例如是 pcDNA3.1/hyg+或pcDNA3,l/neo+ (Invitrogen公司，Carlsbad, Ca)。
為在CHO-DHFIT表達系統中穩定表達基因，可以使用附加的質粒比如在實施例1中 描述的pSV-DHFR,以便能夠篩選含DHFR-的細胞克隆並且進行MTX基因擴增。
如在實施例1中描述的載體pCMV-VKORCl-EDHpro可以用於rVKORCl瞬時表達。 細胞培養和轉染
可以使用在實施例1中描述的相同細胞株和培養方案。為形成穩定的轉染子，可以 使用磷酸鈣共沉澱方法。在轉染之前，質粒得通過限制性內切酶消化進行線性化。含有FVII cDNA的哺乳動物表達載體可以用於CHO或HEK293寄主細胞株的穩定轉染。CHO DUKX DXB11細胞必須用pSV-DHFR共轉染。如果潮黴素B用作選擇試劑，其在培養基中的濃度 應當為100 pg/ml以篩選出HEK293衍生轉染子，而對於CHO轉染子則為250 ng/ml。如果
新黴素抗性用作篩選標記，則對於每種細胞類型，應調節G418濃度，如同實施例1中的描 述。
瞬時轉染方案包括如在實施例1中描述的LipofectamineTM 2000試劑的應用。為了能 夠將細胞瞬時表達rVKORCl與合適的陰性對照進行對比，應將載體pCMV-VKORCl-EDHpro 和不含VK0RC1 cDNA序列的相同載體並行地進行重複若干次的轉染，優選在6孔板上進行。 以每孔相等的細胞密度分配從相同群落衍生的細胞。進行融合時，所有的轉染同時進行。
通過將生長培養基換成補充有濃度變化範圍為0.1到10 pg/ml的維生素Kl的無血清 培養基，可以檢測分泌入細胞培養上清液的rFVII。在24小時後，可以收集上清液。並且可 以通過下述適當的方法測定rFVII濃度。為計算rFVII比分泌速率，例如應通過使用CASY 細胞計數器(Scharfe Systems公司，Reutlingen，德國)或者臺盼藍排除法對細胞進行計數。 分析測試方法
對於篩選產rFVII的克隆株，並且分析FVII活性與抗原水平的關係，下述測試方法 是適當的
按凝固性測試方法比如測量凝血酶原凝固時間(PT)、或者根據歐洲藥典(歐洲藥 典5， 2005)按顯色分析方法比如測量凝固因子Xa (FXa)產生量，可以測定FVII活性，其 中通過FXa的顯色底物轉化量對FXa產生量進行定量。通過ELISA測試，使用適當的配對 抗體，例如經親和純化的稀釋至1:3000以用於捕獲的羊抗人FVII多克隆抗血清(Affinity Biologicals公司，Ancaster, Canada)、和用於檢測的羊抗人FVII多克隆抗體-辣根過氧化物 酶偶聯物(Cedarlane公司，Ontario,加拿大；稀釋至1:2000)，接著添加適當的用於光度計 檢測的顯色試劑，可以測定FVII抗原水平。
對於所有的測試方法，應將源於血漿的FVII製品用作標準材料，該製品的測試是根 據FVII的國際標準測試法97/592。通過計算被測抗原對活性值的比率，並且將這些值相互對 比或者與血漿或其FVII製品的值進行比較，可以估算出有關的比凝固活性。
可以使用下述測試方法估算作為分泌的總rFVII —部分的FVIIa水平:Staclc^測試方 法(Diagnostica Stago公司，Asnieres，法國)適於選擇性地測定FVIIa凝血酶原凝固時間 (Morrissey等，1993)。應根據FVIIa的國際標準測試法89/688來測試FVIIa水平。 結果
用編碼VKORC1的表達載體pCMV-VKORCl-EDHpro對穩定地產rFVII的CHO衍 生細胞株進行瞬時轉染。作為對照，可以使用不含編碼VKORC1的cDNA的空載體 pCMV-EDHpro。以每孔"106個細胞的細胞濃度將細胞接種於6孔板。當完成融合時，重複
進行瞬時轉染步驟。在孵育過夜後，細胞在不含任何維生素K1的無血清培養基中進行孵育， 以便耗盡由FBS提供的細胞內部蓄積的維生素K1。在24小時後，把培養基換成含有從0到 5 lig/ml的多種濃度範圍維生素Kl的無血清培養基。收集上清液用於進一步分析。通過ELISA 測量和單級凝固性測試方法測得的rFVII抗原和活性濃度值，每24小時確定一次生產率。以 FVII凝固單位每嗎抗原計算FVII比凝固活性。可以使用Staclot⑧測試方法來估計rFVIIa自 動活化為rFVIIa的程度。這些實驗結果如圖6A、 6B和6C所示。
在用兩種載體構建體瞬時轉染後，通過ELISA (圖6A)和FVII凝固性實驗(圖6B) 測定rFVII表達水平。細胞株並沒有大量產生rFVIIa,因此rFVII活性可能與rFVII生產率相 關。
培養基不含維生素Kl時，不論有和沒有進行rVKORCl共表達，所產rFVII的細胞 生產率和比活性都明顯較低。通過凝固和ELISA兩種方法測量，發現在rVKORCl共表達情 況下，rFVII生產率恢復至O.l pg/ml ,比用空載體轉染作為對照時高4倍。不管維生素Kl 濃度如何，rVKORCl共表達提高了加入細胞培養基中的維生素Kl利用率。 一般來講，在所 有的維生素Kl濃度下進行rVKORCl共表達，通過兩種不同的方法測定的rFVII生產率比對 照樣高4倍。以凝固單位每嗎所產rFVII來表示的比活性僅在0 pg/ml維生素Kl時顯示出 明顯較低的值，並且不論有和沒有rVKORCl都未顯示出顯著差異。
在類似實驗中，rVKORCl瞬時共表達後，將CHO衍生細胞株和HEK293衍生細胞 株穩定表達rFVII的情況與兩種對照樣轉染情況相比較時，可以發現生產率明顯較高(圖7)。 該實驗中，使用0.5 ng/ml的維生素Kl。對於CHO-rFVII細胞，通過凝固性和ELISA測定可 以發現，rVKORCl共表達的rFVII表達水平相比對照樣要高出2.5倍。 [It074] 由此可得出結論，對於rFVII生產率，當該反應所需的維生素K還原形式不能足量 得到時，Y-羧基化是速率限定步驟。 一種假定的細胞控制機理是，在內部細胞中保留rFVII 分子不完全Y-羧基化(Lin等，2004) 。 rVKORCl瞬時共表達，通過更好地提供確保完全？ 羧基化的維生素K還原形式，在較寬的維生素Kl濃度範圍內提高了 rFVII生產率。
這些發現再次證明與前述文獻一致，即Y-羧化酶共表達會導致在哺乳動物細胞中重 組人因子IX生產率降低(Hallgren等，2002)。在細胞代謝內，迄今VK0RC1僅有的已知 功能是將維生素K的2,3環氧化物還原為Y-羧基化反應所必需的氫醌形式。甚至哺乳動物細 胞株本身也具有全功能的Y-羧基化手段，由此可得出結論，rVKORCl共表達保證了預期的完 全，羧基化的rFVII蛋白質品質。 實施例3:在非病毒性基因轉染後，在CHO衍生細胞株中進行穩定的rVKORCl和rFVII 雙順反子共表達
在形成穩定的產rFVII哺乳動物細胞株範圍內，可以使用雙順反子表達系統，以利用 rVKORCl共表達對Y-羧基化的任何影響。採用這樣一種系統，在供給單一表達載體後，可以 實現在真核細胞中同時表達兩種蛋白質。此外，由相同的mRNA分子同時地翻譯出兩種蛋白 質。這能夠通過將在編碼兩種轉基因的cDNA之間、術語稱作內部核糖體進入序列(IRES) 的病毒性遺傳因子導入表達載體構建體而實現(Mountford and Smith, 1995)。在己穩定地 整合入寄主細胞染色體的DNA載體構建體轉錄為mRNA後，兩種核糖體可以與加工的mRNA 結合起來，導致同時延伸了兩種多肽鏈。
需要構建載體，以提供用於哺乳動物表達的因子例如強病毒性啟動子、聚腺苷酸化 信號和能夠進行克隆篩選的抗性基因。將兩種編碼預期蛋白質的cDNA克隆入中間具有IRES 序列的載體。
以將rFVII表達與雙順反子rFVII和rVKORCl共表達相比較，可以構建出精確地衍 生於僅攜帶rFVII cDNA的相同宿主載體的對照表達載體。這兩種載體可以平行地轉染進入相 同的寄主細胞株，例如CHO-DHFR-細胞株CHODUXKDXBll。該細胞株提供了通過基因擴 增來增強蛋白質表達水平的機會。這可以通過攜帶有DHFR基因的質粒共轉染、以及通過如 實施例1所述在亞培養期間提高藥劑MTX水平來實現。通過在該表達系統和共擴增系統中 將共表達載體與單順反子rFVII載體相比較，可以觀察到，在存在或缺少作為輔助蛋白質的 rVKORCl時，基因擴增對rFVII表達水平及活性的影響。如實施例2所述，可以實現產rFVII 的克隆株的篩選和產生的rFVII的表徵。為避免克隆專一性偏差，當比較兩種表達系統時， 應表徵大量的通過相同方法篩選的克隆株。材料和方法表達載體
通過標準的克隆技術，可以構建出如實施例2所述衍生於相同宿主載體的質粒載體 構建體。載體pCMV-rFVII的構建體可以按照實施例2中所述方法來形成，可以按如下方法 構建出同型載體pCMV-rFVII-IRES- VK0RC1:經由在實施例2中所用的來自相同來源的PCR 可以擴增出人FVIIcDNA。可以由源載體pIRES2-EGFP (Clontech公司，PaloAlto， CA)分 離出IRES因子，並且可以由如在實施例1中描述的相同源載體(pCEP4-VKORCl)克隆出 VKORClcDNA。可以將所有三個因子克隆入用於構建pCMV-rFVII (參見實施例2)的相同 宿主載體。更詳細地，可以將FVII cDNA的PCR產物與附加的Kozak序列和EcoRI限制性
酶切位點一起克隆入中間載體(例如pBluescript; Stratagene公司，LaJoIIa， Ca)，以便能夠 經適當的限制性酶切位點進行裂解。可以將含有FVII cDNA的中間載體的HindlII/BamHI片 段克隆入pcDNA3.1/Hyg+(Invitrogen公司)。該中間構建體可以用BamHI和Xhol消化，以 便在一個連接反應中能夠將源於pIRES2-EGFP (含有IRES)的BamHI/BstXI片段與具有 VK0RC1 cDNA的PCR產物(由模板pCEP4-VKORCl得到)和BstXI及Xhol位點一起在 5'和3'端同時地插入，以得到pCMV-rFVII-IRES-VKORCl 。
為了能夠在CHO-DHFR-表達系統中表達和擴增基因，可以使用如在實施例1中描述 的第二次篩選的質粒pSV-DHFR。 細胞培養和轉染
可以使用如在實施例1中描述的CHO-DHFR—寄主細胞株和相同的材料以及轉染和培 養方案，用於產生並篩選預期的產rFVII的克隆株。相似地，可以用MTX完成基因擴增。 分析測試方法
為表徵rFVII克隆株和上清液或者rFVII活性和濃度，並且為測定細胞比生產率，可 以使用與實施例2中所述相同的測試方法。相似地，需要監測FVIIa活性。 Northern印跡
該技術可用於尤其在mRNA水平上檢測導入基因的轉錄情況，並且用於檢査正確的 mRNA大小。從細胞群分離並製備的總細胞RNA可以在瓊脂糖凝膠上進行分離並且印跡到 尼龍薄膜上。經過與DIG標記探針雜交，並且在結合於雜交探針後用鹼性磷酸酶標記的抗 DIG抗體(羅氏公司，巴塞爾，瑞士)顯色，通過在X光片上進行化學發光，可以檢測特定 的RNA序列。應將耙mRNA水平(rVKORCl和rFVII)與持家基因(例如地鼠甘油醛磷酸 脫氫酶(GAPDH))相比較。 結果
可以形成衍生於CHO-DHFR-表達系統的穩定的細胞克隆，並且通過ELISA和凝血酶 原-時間(PT)凝固技術來測試其rFVII生產率。可以通過磷酸鈣共沉澱技術，用篩選的質粒 pSV-DHFR共轉染表達質粒pCMV-rFVII-IRES-VKORCl或pCMV-rFVII，並且通過對缺乏次 黃嘌呤、甘氨酸和胸腺嘧啶核苷的選擇性培養基的露光和對抗生素篩選的露光，可以得到克 隆株。在有限制地稀釋克隆後，篩選出源於單細胞的克隆，並且用增加的MTX濃度進行若 幹次亞培養，從而完成基因擴增。每個亞克隆步驟中，使克隆受到濃度高達320 nM的MTX 的作用。在全部亞克隆過程中，總共擴展了 133個來源於pCMV-rFVII轉染的克隆和83個來 源於用rVKORCl共表達構建體轉染的克隆，並且詳細地進行表徵。對於細胞培養上清液，
可以通過由ELISA測定rFVII濃度，並且通過平行地進行PT凝固性測試，測定了 rFVII和 rFVIIa活性。表徵時考慮到僅克隆不到10 %的rFVII活化為FVIIa，從而人為地避免較高的 FVII比凝固值(數據未顯示)。以ng每l(^個細胞每24小時為單位，由ELISA濃度值計算 出表達水平。以凝固單位每pg為單位，計算出FVII比凝固活性。
圖中8，基於ELISA的測試，分別畫出僅表達rFVII的克隆的比生產率值對MTX濃 度的曲線(圖8A)，以及rFVII-rVKORCl共表達的克隆比生產率值對MTX濃度的曲線(圖 8B)。兩種細胞株的MTX水平與表達水平的關係是很明顯的。在無MTX時，僅表達rFVII 的克隆的表達水平與起始克隆相當或稍高。特別地，當MTX增加到低的開始水平20 40nM 時，伴隨rFVII-rVKORCl共表達克隆表達水平增加的較陡模式清楚顯示圖8A和圖8B中。 在MTX為80 nM時，所有的rFVII-rVKORCl共表達克隆表達出比初始克隆多2~80倍的 rFVII，反之對於僅表達rFVII的克隆，發現有些克隆的表達水平仍類似於初始克隆。從20 nM 往上，發現在所有的MTX水平中，rFVII-rVKORCl生產性克隆比僅表達rFVII的克隆更好。 由圖可見，在基因擴增後，特別是在MTX增加的初始過程中，較好的產rFVII克隆的表達水 平比rVKORCl共表達克隆高兩倍。
關於FVII比凝固活性，可以畫出所有這些克隆的計算值對生產率的曲線，以便比較 蛋白質功能性。在圖9中，兩種細胞株的比較顯示，在類似的生產率下，其活性值大約相等， 兩種細胞株的活性值在生產率較高時呈總體下降趨勢。當發現rFVII-rVKORCl共表達生產細 胞株的生產率超過兩倍時，活性值在超出4嗎每106個細胞每天的範圍就不能進行比較。在 rFVII-rVKORCl克隆中高於該表達水平，可以維持一個恆定的、類似於源於血漿的FVII活性 值—2U每昭(Moor等，1995)。
特別地，如果沒有VK0RC1特異的分析方法可利用，則通過Northern印跡技術可以 顯示含有IRES因子的載體構建體的功能性和功能性基因組整合情況，其中IRES因子會導致 含有rFVII和rVKORCl編碼序列的單個雙順反子mRNA的轉錄。
圖10顯示了 Northern印跡實施例，在細胞溶解後分離CHO衍生轉染子或對照細胞 的總mRNA，並且在電泳分離後印跡到尼龍薄膜上。該薄膜己經依序用對人VKORCl專一、 對人FVII專一、對參照基因地鼠GAPDH專一的DIG標記的DNA探針雜交三次。用DIG特 異性標記抗體檢測探針。該樣品是未轉染CHO-DHFR.細胞、 一種僅表達rFVII的CHO衍 生克隆、按照在實施例3中描述的方法先後用rFVII和rVKORCl編碼載體轉染的兩種克隆、 以及三種帶有雙順反子rFVII和rVKORCl共表達的克隆。可以用所有的三種探針檢測用於 rFVII-IRES-rVKORCl構建體的大小約為2.4 kb的mRNA轉錄產物、用於rFVII構建體的1.4 kb的轉錄產物、用於rVKORCl mRNA的0.5 kb的轉錄產物、以及用於GAPDH對照樣mRNA 的1.0 kb轉錄產物。在所有的克隆中都可以找到GAPDH，反之rVKORCl和rFVII根據轉染 質粒載體而存在於各個細胞株中。
總之，穩定的雙順反子rVKORCl共表達對哺乳動物細胞中rFVII生產率具有增強效 果，特別在實施基因擴增時。在進行rVKORCl共表達的基因轉移後，高產rFVII的克隆的產 率會更高。在相同的MTX濃度水平下，使用一半數目的所篩選的克隆，可以實現高出兩倍 的表達水平。在較高的細胞蛋白質分泌水平下，可以維持蛋白質活性。兩種效果可作如下解 釋提供足夠的Y-羧基化反應所需維生素K還原形式，該反應需要在較高蛋白質分泌水平下 以高轉換率發生，以確保完全羧基化的蛋白質的及時釋放。實施例4:在CHO或HEK293哺乳動物細胞中先後進行兩種非病毒性轉染後穩定的rFVII 和rVKORCl共表達
為證實rVKORCl作為輔助蛋白質對在哺乳動物細胞培養中重組表達rFVII的影響， 另一個方法可用於實現rVKORCl與rFVII—起共表達。在第二次轉染後，可以使用一策略， 以篩選顯示出穩定的rFVII和rVKORCl共表達的克隆。在穩定轉染後已被篩選用於rFVII表 達的克隆，可以用另一種編碼人VKORCl的質粒載體進行第二次轉染。可以導入第二種抗性 標記物，以確保通過對另一種抗生素的抗性而進行篩選步驟。作為適當的對照樣，可以平行 地將不含VKORCl cDNA的相同載體轉染入相同的細胞群。在用兩種抗生素在一個克隆步驟 內進行同時篩選、並且按照實施例2和3中描述的方法進行表徵後，可以從這些轉染細胞中 分離出穩定的克隆。這些新分離的克隆對比將能夠總結出rVKORCl共表達對rFVII生產率和 活性的影響。材料和方法表達載體
為形成產rFVII的克隆，可以使用與實施例2中所述相同的表達載體和rFVII cDNA 來源。至於CHO-DHFR.系統，可以使用附加的篩選質粒pSV-DHFR。
為實現第二次轉染後的rVKORCl共表達，可以採用編碼人VKORC1的載體和與用 於第一次轉染時不同的抗生素篩選標記。通過將用實施例1中描述的相同模板得到的PCR產 物插入pcDNA3.1基載體(Invitrogen公司)，可以構建該載體。這種情況下，應將不含插入 物的相同pcDNA3.1載體進行二次對照轉染。作為選擇之一，可以把如實施例1中描述的載 體pCMV-VKORCl-EDHpro作為表達載體用於相同的轉染。作為對照質粒，可以使用空載體 pCMV-EDHpro (參見實施例l)。 細胞培養和轉染
可以使用與實施例1中相同的CHO和HEK293細胞株，以形成穩定的產rFVII的細 胞株。因此可以採用其所有的細胞培養基、轉染和培養方案。為實現在這些細胞株中穩定的 rVKORCl共表達，可以進行使用磷酸鈣共沉澱法的第二次轉染。有必要進行另一種使用附加 抗生素篩選藥劑的克隆步驟，以便得到rFVII和rVKORCl共表達的克隆。 分析測試方法
可以使用與如實施例2和3所述濃度和活性測量相同的測試方法，以檢驗rFVII表達。 通過在實施例3中描述的Northern印跡技術，可以在mRNA水平上顯示rVKORCl轉錄情況。 結果
為顯示rVKORCl輔助蛋白質對rFVII表達的影響，可以使用先後兩輪轉染以及克隆 步驟的方法。在第一輪中，在穩定轉染和抗生素篩選後，通過適當的篩選技術，可以分離出 表達rFVII的細胞克隆。可以將這些克隆中的一種進行增殖，並且用編碼人VKORCl的質粒 或空的對照質粒進行第二次轉染。可以導入另一種篩選標記物。而且，在向培養基添加第二 種抗生素篩選藥劑以確保耗盡未轉染的細胞後，通過適當的技術，可以篩選出用於表達rFVII 的克隆。可以比較來源於rVKORCl或對照樣轉染的克隆的rFVII生產率或活性。空的對照載 體確保了在相同的對rFVII表達有影響的培養條件下、特別是進行雙重抗生素篩選時的克隆 的對比。
典型地，從所有來源於成功轉染的細胞的克隆中，根據它們的rFVII生產率篩選出少 量克隆，並且進行增殖以用於進一步表徵。該表徵包括，通過抗原ELISA技術並且通過rFVII 和rFVIIa凝固活性測量來測定分泌的rFVII濃度。通過對如圖10中所示的二個CHO衍生克 隆的泳道3和4進行Northern印跡技術，可以在mRNA水平上檢驗rVKORCl和rFVII的共表達。
圖11中，顯示了在來源於產rFVII的CHO衍生細胞株(圖11A)和HEK293衍生細 胞株(圖11B)的rVKORCl 二次轉染或對照樣轉染的所選克隆範圍內培養上清液中基於 ELISA滴度的比生產率值。由圖可見，對於兩種細胞類型，rVKORCl轉染衍生的克隆比來 源於對照樣轉染衍生的的克隆產生了更多的rFVII。在兩種情況中，rVKORCl克隆株的所有 生產率的中值皆高出大約兩倍。
在圖12A和12B中，顯示了來源於兩種細胞類型二次轉染後的克隆以FVII凝固單位 每微克ELISA為單位的rFVII比凝固活性。對於比活性計算，將不予考慮大量的rFVII活化 為rFVIIa的克隆，該活化可以通過FVIIa比凝固性測試方法測量。可以選擇一個10 %的FVIIa 凝固單位每FVII凝固單位的數量值，以排除那些產生大量rFVII活化為rFVIIa的克隆。因此 圖1 2中所示克隆數比圖11中少。
FVII凝固比活性差異可能與表達水平相關，而與rVKORCl共表達並不相關。然而， 對於CHO衍生克隆，具有類似表達水平的克隆在存在rVKORCl共表達時顯示出更高的活性。 至於CHO衍生細胞克隆和HEK293衍生細胞克隆這兩種克隆的生產率，可得出結論與對 照樣相比，rVKORCl共表達導致所述生產率平均提高兩倍。此外，可得出如下結論除？ 羧基化之外，rFVII活性也受其它因子的影響，而這些因子受細胞代謝的蛋白質分泌和修飾能 力的影響。生產率和活性值與如實施例2和3所述rFVII/rVKORCl共表達實驗的結果相符合。
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權利要求
1. 一種宿主生物體，其含有編碼維生素K還原酶複合體亞基1 (VK0RC1)或其功能活性 衍生物的重組核酸、以及編碼依賴於維生素K的(VKD)蛋白質或其功能活性衍生物的重組 核酸，其中重組VK0RC1和重組VKD蛋白質在所述宿主生物體中都得到表達。
2. 如權利要求1所述的宿主生物體，其特徵在於，所述編碼重組VK0RC1的核酸或所 述編碼重組VKD蛋白質的核酸分別地、或者兩者同時地通過選自由誘導表達、瞬時表達和 固定表達所組成的模式組的表達模式進行表達。
3. 如權利要求1或2所述的宿主生物體，其特徵在於，所述宿主生物體是哺乳動物細胞。
4. 如權利要求3所述的宿主生物體，其特徵在於，所述哺乳動物細胞是從選自CHO細 胞和HEK293細胞的哺乳動物細胞株衍生的細胞。
5. 如權利要求1至4中任一項所述的宿主生物體，其特徵在於，所述重組VKD蛋白質 是促凝血因子或其功能活性衍生物。
6. 如權利要求5所述的宿主生物體，其特徵在於，所述促凝血因子選自由因子II、因子 VII、因子IX和因子X所構成的因子組。
7. 如權利要求6所述的宿主生物體，其特徵在於，所述促凝血因子是人類因子IX。
8. —種包含細胞的細胞培養系統，所述細胞含有編碼維生素K還原酶複合體亞基1 (VK0RC1)或其功能活性衍生物的重組核酸、以及編碼依賴於維生素K的(VKD)蛋白質或其功能活性衍生物的重組核酸，其中重組VK0RC1和重組VKD蛋白質在所述細胞中都得 到表達。
9. 如權利要求8所述的細胞培養系統，其特徵在於，所培養的細胞是哺乳動物細胞。
10. 如權利要求9所述的細胞培養系統，其特徵在於，所述哺乳動物細胞選自CHO細胞 和HEK293細胞。
11. 如權利要求8至10中任一項所述的細胞培養系統，其特徵在於，所述重組VKD蛋 白質是促凝血因子或其功能活性衍生物。
12. 如權利要求ll所述的細胞培養系統，其特徵在於，所述促凝血因子選自由因子II、 因子VII、因子IX和因子X所構成的因子組。
13. 如權利要求12所述的細胞培養系統，其特徵在於，所述促凝血因子是人類因子IX。
14. 一種提高在宿主生物體中表達重組的依賴於維生素K的(VKD)蛋白質或其功能活 性衍生物的生產率的方法，其包括下述步驟 (a) 提供宿主生物體；(b) 將編碼VKD蛋白質或其功能活性衍生物的重組核酸插入到步驟(a)的宿主生物體中；(c) 將編碼維生素K還原酶複合體亞基1 (VK0RC1)或其功能活性衍生物的重組核酸插 入到步驟(a)的宿主生物體中；以及(d) 表達步驟(b)和(c)所述重組核酸。
15. —種提高在宿主生物體中表達重組的依賴於維生素K的(VKD)蛋白質或其功能活 性衍生物的生產率的方法，其包括下述步驟(a) 提供一種編碼VKD蛋白質或其功能活性衍生物的重組核酸被整合入其基因組的宿主 生物體；(b) 將編碼維生素K還原酶複合體亞基1 (VKORC1)或其功能活性衍生物的重組核酸插 入到步驟(a)的宿主生物體中；以及(c) 表達步驟(a)和(b)所述核酸。
16. 如權利要求15所述的方法，其特徵在於，穩定地表達所述編碼VKD蛋白質或其功 能活性衍生物的重組核酸。
17. —種提高在宿主生物體中表達重組的依賴於維生素K的(VKD)蛋白質或其功能活 性衍生物的生產率的方法，其包括下述步驟(a) 提供一種編碼維生素K還原酶複合體亞基1 (VKORC1)或其功能活性衍生物的重組 核酸被整合入其基因組的宿主生物體；(b) 將編碼VKD蛋白質或其功能活性衍生物的重組核酸插入到步驟(a)的宿主生物體中；以及。)表達步驟(a)和(b)所述核酸。
18. 如權利要求17所述的方法，其特徵在於，穩定地表達所述編碼VKORC1或其功能 活性衍生物的重組核酸。
19. 一種重組的依賴於維生素K的(VKD)蛋白質，其可通過如下方法獲得將編碼維 生素K還原酶複合體亞基1 (VKORC1)或其功能活性衍生物的重組核酸以及編碼所述重組 VKD蛋白質或其功能活性衍生物的重組核酸插入到宿主生物體中，表達所述核酸，以及回收 所述重組VKD蛋白質。
全文摘要
本發明涉及一種宿主生物體，其含有編碼維生素K還原酶複合體亞基1(VKORC1)的重組核酸和編碼依賴於維生素K的(VKD)蛋白質的重組核酸，其中重組VKORC1和重組VKD蛋白質在所述宿主生物體中都得到表達。本發明還涉及一種包含細胞的細胞培養系統，該細胞含有所述重組核酸。本發明還進一步涉及一種提高在宿主生物體中表達重組VKD蛋白質的生產率的方法，該宿主生物體在合適的體系中進行培養。
文檔編號C12N9/04GK101124320SQ200680004712
公開日2008年2月13日 申請日期2006年1月27日 優先權日2005年2月28日
發明者弗裡德裡希·沙伊夫林格爾, 恩斯特·伯姆 申請人:巴克斯特國際公司;巴克斯特保健股份有限公司