甜蕎dreb轉錄因子的製作方法
2023-10-23 23:30:07 3
甜蕎dreb轉錄因子的製作方法
【專利摘要】本發明甜蕎DREB轉錄因子涉及一種來自於植物且具有多於20個胺基酸的肽。所述的甜蕎DREB轉錄因子，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本發明運用同源克隆技術（Race技術）從甜蕎中分離到甜蕎FeDREB1，通過農桿菌轉化擬南芥，使之在擬南芥中過表達，證實所分離的甜蕎FeDREB1可以增加植物的抗寒性和耐旱性。甜蕎FeDREB1在植物抗寒性和耐旱性狀改良具有重要的理論及實際意義，將在植物的耐逆基因工程改良中發揮重要作用，應用前景廣闊。
【專利說明】甜蕎DREB轉錄因子
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種來自於植物且具有多於20個胺基酸的肽。
【背景技術】
[0002]非生物脅迫(如乾旱、高鹽、低溫)是植物的生長發育、生物量形成和經濟產量提高的主要限制因子。近20年來，大量受非逆境脅迫的誘導的基因被分離與功能鑑定，根據脅迫誘導基因表達產物的作用，可將這些脅迫誘導表達的基因分為兩大類，第一類基因的編碼產物在抗逆性中直接發揮功能，包括:1)直接保護細胞免受水份脅迫傷害的功能蛋白，如LEA蛋白(胚胎發生後期豐富蛋白)、滲透蛋白、抗凍蛋白、水通道蛋自、離子通道蛋白、伴侶蛋白和mRNA結合蛋白等滲透調節因子，如脯氨酸、甜菜鹼、一些糖類等的合成。在脅迫條件下，水通道蛋白，糖運輸蛋自，脯氨酸運輸蛋白通過質膜和液泡膜運輸水分，糖類和脯氨酸，以調節內外滲透壓；2)毒性降解酶，如谷膚甘膚S轉移酶、可溶性環氧化物水解酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和抗壞血酸過氧化物酶等可以保護細胞，免受活性氧的傷害。第二類基因編碼的產物參與調控下遊基因的表達以及信號的傳導，包括:I)感應和傳一導脅迫信號的蛋白激酶，如活化分裂素的蛋白激酶、依賴鈣的蛋白激酶、受體蛋白激酶、核糖體蛋白激酶、轉錄調控蛋白激酶等；2)傳導信號和調控基因表達的轉錄因子，如AP2/ERF轉錄因子(乙烯反應結合因子)、bZIP轉錄因子(帶有亮氨酸拉鏈的轉錄因子家族)、MYC轉錄因子(帶有基本螺旋串的螺旋轉錄因子家族)、MYB轉錄因子(帶有色氨酸串基元的轉錄因子家族)、WRKY轉錄因子(N-端含有WRKYGQK高度保守胺基酸序列)、NAC轉錄因子(N端含有高度保守的NAC結構域)和DELLA轉錄因子；3)以及在信號傳導中起重要作用的蛋自酶，如磷酸醋酶、磷酸酶c等。
[0003]植物的抗逆性往往是由多基因控制的數量性狀。植物對幹早、低溫抗性的強弱往往不取決於某一單一基因，而是受許多基因的共同調控。一個關鍵因子可以調控許多相關功能基因的表達，因此，通過增強一些關鍵的轉錄調控因子的作用可能使植物的抗逆性得到綜合的、根本性的改良。這與導入或改良個別功能基因來提高某種抗性的傳統方法相比，將是提高作物抗逆性的更為有效的方法和途徑。研究表明DREB轉錄調控因子在調控非生物脅迫相關基因的轉錄表達中起著重要的作用。DREB轉錄因子屬於AP2/ER家族轉錄因子，它結合DRE或CRT脫水反應元件,激活下遊啟動子區具有該元件的抗逆相關基因的表達。近年來，擬南芥、水稻、大麥、小麥、大豆、玉米、棉花和等大量植物中的DREB轉錄因子功能相繼被鑑定，證明它參與植物調控乾旱、高鹽、低溫、病害和細胞發育相關的基因表達，提高植物耐低溫和乾旱能力，是植物基因工程改良植物耐非生物脅迫的重要有效基因。如A.htalinaa的DREB1A/CBF3基因的超量表達能提高植株對低溫脅迫的耐性；Yamaguch1-Shinozaki等人(2006)的研究結果表明能有效的用，來提高作物的乾旱、低溫的抗性。Dubuozet等人(2003)也證明水稻的以基因能明顯提高單子葉植物對乾旱、低溫脅迫的耐性。甄偉等將CBFl基因轉入菸草和油菜基因組中，對轉化的菸草和油菜抗寒性的檢測結果顯示，轉基因油菜的抗寒性有明顯提高，轉基因菸草的抗寒性也有一定提高。Hsieh等將擬南芥的CBFl轉入番茄，轉基因番茄葉片中的過氧化氫酶的活性比對照顯著提高，H202含量比對照明顯降低，轉基因植株的抗寒性得到顯著改善。韋善君等將玉米泛素啟動子(Pubi)調控的CBFl基因轉化菸草，發現CBFl組成型表達增強了轉基因菸草的抗寒性。金建鳳等將CBFl基因轉入水稻中，發現低溫處理後轉基因植株體內脯氨酸含量比野生型明顯增加，植株的抗寒性也明顯增強。金萬梅等利用根癌農桿菌介導的方法將擬南芥CBFl基因導入草莓中，提高了草莓對低溫脅迫的抵抗力。DREB轉錄因子在植物非生物抗逆的作用明顯，是目前被用來提高農作物的耐逆功能的重要基因之一。
【發明內容】
[0004]本發明旨在提供一種能有效提高植物耐逆性的甜蕎DREB轉錄因子。本發明還提供了該轉錄因子的編碼基因。
[0005]本發明還提供了一種提高植物耐逆性的方法。
[0006]本發明所述的轉錄因子命名為甜蕎FeDREBl。
[0007]本發明所述的甜蕎DREB轉錄因子，其胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]本發明所述的甜蕎DREB轉錄因子的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所
/Jn o
[0009]本發明還提供了含有上述編碼基因的表達載體，細胞系和宿主菌。
[0010]本發明所述的提高植物耐逆性的方法，將含有上述編碼基因導入植物中即可。其中所述的耐逆性為抗寒性和耐旱性。
[0011]本發明運用同源克隆技術(Race技術)從甜蕎中分離到甜蕎FeDREBl，通過農桿菌轉化擬南芥，使之在擬南芥中過表達，證實所分離的甜蕎FeDREBl可以增加植物的抗寒性和耐旱性。甜蕎FeDREBl在植物耐寒性狀改良具有重要的理論及實際意義，將在植物的耐逆基因工程改良中發揮重要作用，應用前景廣闊。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為轉化FeDREBl擬南芥T3代植株和野生型植株耐寒效果比較。
[0013]圖2為轉化FeDREBl擬南芥T3代植株和野生型植株耐旱效果比較。
【具體實施方式】
[0014]實施1:甜蕎FeDREBl基因的製備一
(I)將甜蕎「西農9976」種子在MS培養基上萌發，在光照條件為8000LUX，溫度為25°C條件下生長3周成苗，將整個植株放入一 6°C低溫培養箱中，冷脅迫6小時，取植株葉片，錫箔紙包裹後，迅速放入液氮，於一 80°C低溫冰箱永久保存，採用Takara公司RNA提取試劑盒，提取RNA，反轉錄成cDNA。最終用PCR方法擴增FeDREBl基因序列。其擴增引物如下，其上遊引物中引入Xbal酶切位點，下遊引物中引入Sac I酶切位點:
上遊引物:5』_ CGTCTAGAGCGATCATGGATTCTTTCTC -3』
下遊引物:5』- AGGAGCTCGGTTCAAAATTTACCAAG -3』
PCR反應體系
【權利要求】
1.甜蕎DREB轉錄因子，其特徵在於其胺基酸序列如SEQID NO:2所示。
2.一種如權利要求1所述的甜蕎DREB轉錄因子的編碼基因，其特徵在於其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
3.含有權利要求2所述編碼基因的表達載體。
4.含有權利要求2所述編碼基因的細胞系。
5.含有權利要求2所述編碼基因的宿主菌。
6.一種提高植物耐逆性的方法，其特徵在於將含有權利要求2所述編碼基因導入植物中即可。
7.如權利要求6所述的提高植物耐逆性的方法，其特徵在於所述的耐逆性為抗寒性和耐旱性。
【文檔編號】C12N15/82GK103483436SQ201310377196
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年8月27日 優先權日:2013年8月27日
【發明者】方正武, 馮佰利, 王鵬科, 高小麗, 高金鋒, 楊璞 申請人:西北農林科技大學