一種以重樓芽鞘為外植體的愈傷組織誘導方法

2023-10-24 06:29:47 1

專利名稱：一種以重樓芽鞘為外植體的愈傷組織誘導方法
技術領域：
本發明涉及一種重樓組織培養方法，特別是涉及一種以重樓芽鞘為外植體的愈傷組織誘導方法。
背景技術：
重樓是名貴中藥材之一，全世界共有24種，我國擁有19種，其中又以西南地區各省的種類和資源尤為豐富，如雲南、四川、貴州等地。重樓主要有效成分是留體皂苷，其苷元主要為異螺留烷醇類的薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元，並含有胺基酸、留酮、蛻皮激素、黃酮苷等化合物。現代藥理研究表明，重樓具有抗腫瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒等作用，其良好的療效已被眾多的製藥工業用於藥劑的使用，是雲南白藥、宮血寧、熱毒清等重要中成藥的主要成分。隨著中醫藥產業的快速發展，重樓藥材的需求正以每年20%的幅度遞增，而其野生資源卻逐年減少，導致重樓價格迅速上漲，嚴重製約了製藥企業的產量和質量。當前，重樓主要靠採挖野生資源，由於長期過度採挖，並缺乏對其生態環境的保護，致使野生重樓資源遭到了毀滅性的破壞，現已瀕臨滅絕。當前重樓主要是靠種子和根莖進行繁殖，由於重樓種子存在種胚發育不完全，胚乳堅硬，胚軸後熟等明顯「雙重休眠」特性，因此重樓種子在播種後通常需要經歷兩個冬天才能萌發成苗，是典型的「二年生種子」，而且在自然狀態下重樓種子出苗率很低、生長周期長，從出苗到成材需要8 10年的時間；而使用重樓根莖進行營養繁殖，由於重樓根莖本身就是其藥用有效部位，因此利用根莖切塊生產重樓種苗存在用種量大、生產成本高等問題。利用組織培養技術生產重樓具有生長周期短，繁殖率高、能有效降低災害性氣候對重樓生長的影響等優點，可進行周年培養生產，且培養條件優越，對重樓生長極為有利。 目前重樓植物的組織培養仍未取得滿意效果，其主要原因是在外植體的選擇和進行有效誘導培養上仍未有明顯突破
發明內容
本發明的目的在於提供一種以重樓芽鞘為外植體的愈傷組織誘導方法，該方法能實現對愈傷組織的有效誘導。為達到上述目的，本發明採用的解決方法包括下列步驟(1)選取重樓根莖上將萌發的隱芽，先將隱芽用自來水衝洗乾淨，然後陰乾，再在超淨臺用濃度為70% 75%的酒精消毒10 60s，接著用濃度為0. 0. 15%的升汞消毒4 lOmin，最後用無菌水震蕩洗3 6次，洗後用已滅菌的濾紙反覆吸乾隱芽表面的水分；(2)將消毒處理後的隱芽接種於培養基MS+6-BA1.0 3.0mg · L—1+椰汁O IOOmg · L—1+蔗糖30 50g · Γ1+瓊脂6. O 7. Og · L—1中進行預培養，所採用的ρΗ值為 5. 5 6. 0，培養溫度16 20°C、每天光照6 10小時、光照強度為1000 15001x ；
(3)選取預培養後體積明顯膨大的芽體，在超淨工作檯上先剝去其外層芽鞘，再將其白色內層芽鞘作為外植體接入愈傷組織誘導培養基MS+6-BA0. 5 2. Omg · +ΝΑΑ0. 5 4mg · L—1+椰汁20 80mg · L—1+蔗糖30 50g · L—1+瓊脂6. 0 7. Og · L-1中進行培養，所採用的培養基PH值為5. 5 6. 0，培養溫度為16 26°C、每天光照8 12小時、光照強度為1200 18001x，培養50 60天後，外植體表面上長出的白色或黃白色物即為愈傷組織。上述步驟(2)的預培養時間為20 30 天。本發明首次提出了以重樓內層芽鞘為外植體的愈傷組織誘導方法，為重樓植物的組織培養提供了一種新的途徑。該方法可縮短重樓的生長周期、降低生產成本，且能實現批量生產，從而可有效解決當前重樓藥材短缺的問題。
具體實施例方式實施例1(1)選取重樓根莖上將萌發的健壯、無病蟲害和直徑在2cm左右的白色隱芽，先將隱芽用自來水衝洗乾淨，然後陰乾，再在超淨臺用濃度為70 %的酒精消毒30s，接著用濃度為0. 1 %的升汞消毒8min，最後用無菌水震蕩洗5次，洗後用已滅菌的濾紙反覆吸乾隱芽表面的水分；(2)將消毒處理後的隱芽接種於培養基MS+6-BA2. Omg · L—1+椰汁SOmg · L—1+蔗糖 30g · Γ1+瓊脂6. Og · Γ1中進行預培養，所採用的pH值為5. 8，培養溫度20°C、每天光照8 小時、光照強度為12001x ；(3)選取預培養25天後體積明顯膨大的芽體，在超淨工作檯上先剝去其外層芽鞘，再切取其肥厚肉質的白色內層芽鞘作為外植體接入愈傷組織誘導培養基 MS+6-BA1. Omg · +NAA3. Omg · L-1+ 椰汁 50mg · Γ1+ 蔗糖 30g · Γ1+ 瓊月旨 6. Og · Γ1 中進行培養，所採用的培養基PH值為5. 8，培養溫度為25°C、每天光照10小時、光照強度為15001x， 培養55天後，外植體表面上長出的白色或黃白色物即為愈傷組織，統計其愈傷組織誘導率為 22. 3%。實施例2將實施例1步驟(2)中的預培養基改為MS+6-BA2. Omg · L—1+蔗糖30g · Γ1+瓊脂 6. Og · L—1，步驟(3)中的愈傷組織誘導培養基改為MS+6-BA1. Omg · L^+NAAS. Omg · L—1+椰汁 30mg · Γ1+蔗糖30g · Γ1+瓊脂6. Og · L—1，其它步驟同實施例1，誘導培養55天後其愈傷組織誘導率為18. 14%。比較實施例1將實施例1中的步驟(2)去掉，直接選取未經預培養處理的白色內層芽鞘作為外植體，其它步驟同實施例1，誘導培養55天後其愈傷組織誘導率僅為2. 54%，說明對隱芽進行預培養處理能明顯提高愈傷組織的誘導率。
權利要求
1.一種以重樓芽鞘為外植體的愈傷組織誘導方法，其特徵在於包括如下步驟(1)選取重樓根莖上將萌發的隱芽，先將隱芽用自來水衝洗乾淨，然後陰乾，再在超淨臺用濃度為70% 75%的酒精消毒10 60s，接著用濃度為0. 0. 15%的升汞消毒 4 lOmin，最後用無菌水震蕩洗3 6次，洗後用已滅菌的濾紙反覆吸乾隱芽表面的水分；(2)將消毒處理後的隱芽接種於培養基MS+6-BA1.O 3. Omg化―1+椰汁O IOOmg化一1+ 蔗糖30 50g · Γ1+瓊脂6. 0 7. Og · Γ1中進行預培養，所採用的ρΗ值為5. 5 6. 0，培養溫度16 20°C、每天光照6 10小時、光照強度為1000 15001x ；(3)選取預培養後體積明顯膨大的芽體，在超淨工作檯上先剝去其外層芽鞘，再將其白色內層芽鞘作為外植體接入愈傷組織誘導培養基MS+6-BA0. 5 2. Omg · +ΝΑΑ0. 5 4mg · L—1+椰汁20 80mg · L—1+蔗糖30 50g · L—1+瓊脂6. 0 7. Og · L-1中進行培養，所採用的培養基PH值為5. 5 6. 0，培養溫度為16 26°C、每天光照8 12小時、光照強度為1200 18001x，培養50 60天後，外植體表面上長出的白色或黃白色物即為愈傷組織。
2.根據權利要求1所述的一種以重樓根莖為外植體的愈傷組織培養方法，其特徵在於預培養的時間為20 30天。
全文摘要
本發明公開了一種以重樓芽鞘為外植體的愈傷組織誘導方法，該方法是先將重樓根莖上將萌發的隱芽進行消毒和預培養，再選取預培養後體積明顯膨大的芽體的白色內層芽鞘作為外植體接入愈傷組織誘導培養基MS+6-BA0.5～2.0mg·+NAA0.5～4mg·L-1+椰汁20～80mg·L-1+蔗糖30～50g·L-1+瓊脂6.0～7.0g·L-1中進行培養，培養50～60天後，外植體表面即長出白色或黃白色的質地緊密的愈傷組織。本發明較好的解決了重樓傳統生產方法中存在的生長時間長、成本高等問題，可有效緩解當前重樓藥材短缺現象。
文檔編號A01H4/00GK102301956SQ201110210590
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月26日 優先權日2011年7月26日
發明者付偉, 張珏, 張紅玉, 李文光, 楊軍, 王勇, 王躍華, 田夢良, 蔣亭亭, 陳燕 申請人:成都大學