四環素誘導的gus基因植物花葯特異性表達載體的製作方法
2023-10-25 18:17:32 1
專利名稱：四環素誘導的gus基因植物花葯特異性表達載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，即將GUS基因置於經過改造的植物花葯特異性表達的嵌合啟動子TA29-Tx的控制之下，使其在受到四環素誘導後，在植物花葯絨氈層中特異表達。利用該嵌合啟動子可使目的基因在特定的時間及空間內表達，從而有利於我們研究其基因產物的作用。
TA29是來自菸草samsum-TA29基因的啟動子1。該基因的表達是花葯特異性的，其產物集中在花葯絨氈層中，一般是在減數分裂後不久就出現，在小孢子有絲分裂之前含量達到最高，在開花期迅速下降。根據Koltunow等2的研究，TA29啟動子的轉錄控制序列位於其轉錄起始位點上遊的-279～-150bp之間。該段序列是保證TA29基因在花葯絨氈層中高效表達所必需的。而-207～-191之間的序列和-165～-158之間的序列是決定TA29特異表達的兩個關鍵序列。試驗表明TA29啟動子可以控制外源基因在植物花葯中特異性的表達3.4。
Tx是由三個重複序列插入CaMV的35S啟動子TATA框兩側形成，具體序列如下 其中 序列來源於大腸桿菌(E.coli)四環素抗性操縱子的啟動子區。轉座子Tn10編碼的TetR(tet repressor)蛋白可以與上述操縱序列緊密結合，阻止轉錄起始複合物的形成，從而達到從轉錄水平抑制下遊基因的表達。
該發明的意圖是將TA29啟動子和Tx/TetR系統的特性結合起來，從而創造一個新的系統，可以使目的基因既能夠被四環素誘導表達，又僅僅局限在植物花葯絨氈層表達。本發明的最終目的是通過構建可被四環素誘導的Barnase基因植物花葯特異性表達載體，即TA29-Tx-Barnase，利用基因槍或農杆茵侵染的辦法，使此載體整合到能組成型高水平表達TetR蛋白的植物基因組中，當用人為施加四環素誘導後，Barnase基因在植物花葯中高效而特異性的表達，破壞花葯絨氈層，導致花粉敗育，獲得植物雄性不育系，從而創造一種利用化學誘導獲得植物雄性不育方法，為兩系法育種中雄性不育系的獲得提供了一條嶄新的途徑。
本發明主要包括以下幾方面技術一.菸草總DNA的提取(參照王革嬌等提供的方法，植物遺傳轉化技術手冊，傅榮昭等1994)51.取0.5g新鮮菸草幼葉，加液氮研磨至乾粉狀，轉入事先已放入500μl尿素緩衝液的離心管中(8M尿素，500mM Tris.Cl pH8.0，350mM NaCl，20mMEDTA，抽濾滅菌)。
2.搖動離心管，使植物材料於緩衝液充分混合，加入500μl的酚∶氯仿(1∶1)。充分混勻。
3.10000rpm離心5分鐘，收集上清液，轉移到一乾淨的離心管中，加入500μl的氯仿，重新抽提一遍。
4.轉移上清到一乾淨的離心管中，加入2倍體積冰冷的無水乙醇，混勻，靜置沉澱10分鐘。
5.15000rpm離心5分鐘，收集沉澱，用75％的乙醇洗滌一遍，室溫乾燥10分鐘。加入200μl ddH2O溶解。
6.取5μl，用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測、定量。二·花葯特異性基因TA29啟動子的聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)根據已發表的TA29啟動子的全序列，我們選取了該基因5′區-826～-69之間的一段作為目標序列，該序列包含TA29花葯特異性表達所必需的-279～-150bp序列。設計P1，P2序列為PCR引物，5』端引物P15』---AGGAATTCAGTAATACACTTTTTGGT---3』；3』端引物P25』---TACCCGGGCTTTTGTTGGAGCATTTC---3』。反應體系為50μl，其中包括模板DNA 2μl(0.1μg/μl)，P1 1μl(25pM)，P2 1μl(25pM)，10xBuffer 5μl，dNTPs 2μl(2.5mM)，ddH2O 38μl，Taq酶1μl。反應程序為94℃預變性2分鐘；94℃變性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸1分鐘，30個循環；然後72℃延伸10分鐘，終止反應。三.嵌合啟動子的構建嵌合啟動子由兩部分組成TA29啟動子，它能使其控制基因在花葯絨氈層特異表達；Tx，可以與TetR蛋白緊密結合。當將Tx插入到TA29啟動子TATA框適當位置，使得嵌合啟動子既具有四環素誘導特性，又保持花葯絨氈層特異表達特性。四.四環素誘導的GUS基因花葯特異性表達裁體的構建我們以BinHygTx為載體，將TA29啟動子和Tx序列串接到該載體的多克隆位點之間，然後在其後加上GUS基因，在GUS基因的下遊連上Nos終止子。這樣便完成了四環素誘導的GUS基因花葯特異性表達裁體的構建。GUS基因的瞬間表達檢測表明，此載體不僅受四環素誘導，而且是花葯絨氈層特異表達的。該載體是一個雙元載體，含有農桿菌T-DNA的左右邊界，可以用農桿菌侵染方法導入植物。
圖例說明在圖例(1)中，TA29是以pGT89BN質粒為模板，根據陳潛等6的文章上的序列設計了引物P1，P2，通過PCR方法擴增得到，在其兩端分別加上EcoRI和SmaI酶切位點。pGEM-T為一種大腸桿菌質粒載體，Amp為氨苄青黴素抗性，其上的酶切位點標明如圖。
圖例(2)中，載體pGEM-TA29由pGEM-T構建而來，其多克隆位點中插入了TA29啟動子。質粒pUCA7-TX是德國Gottingen大學教授C.Gatz惠贈。
圖例(3)中，載體pUCA7-TA29-TX由pUCA7-TX構建而來，TX序列恰好位於TA29啟動子TATA box框處。
圖例(4)中，載體pBI221和pGEM7Zf均為本實驗室保存載體。
圖例(5)中，載體pGEM-GUS是將pBI221上GUS基因切下，插入pGEM7Zf載體多克隆位點構建而成，目的是使GUS基因兩端獲得新的酶切位點。
圖例(6)中，載體pUCA7-TA29-TX和pGEM-GUS分別為上述圖例(3)和(5)，Bin-Hyg-TX是德國Gottingen大學教授C.Gatz惠贈。將TA29-TX片斷和GUS基因分別從pUCA7-TA29-TX和pGEM-GUS上切下，置換掉Bin-Hyg-TX上35S-Tx片斷，構建成載體Bin-Hyg-TA29-TX-GUS，即四環素誘導的GUS基因植物花葯特異性表達載體。該載體既適合於農桿菌侵染轉化，也適合於基因槍轉化。
2.搖動離心管，使植物材料於緩衝液充分混合，加入500μl的酚∶氯仿(1∶1)。充分混勻。
3.10000rpm離心5分鐘，收集上清液，轉移到一乾淨的離心管中，加入500μl的氯仿，重新抽提一遍。
4.轉移上清波到一乾淨的離心管中，加入2倍體積冰冷的無水乙醇，混勻，靜置沉澱10分鐘。
5.15000rpm離心5分鐘，收集沉澱，用75％的乙醇洗滌一遍，室溫乾燥10分鐘。加入200μl ddH2O溶解。
6.取5μl，用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測、定量。
取40ulPCR擴增產物，1％瓊脂糖凝膠電泳，將合適大小的條帶切下，用DNA片段快速純化/回收試劑盒(由北京鼎國生物技術發展中心生產)回收PCR擴增產物。將回收的PCR產物與載體pGEM-7Z按摩爾比1∶1的比例混合，加入Gibico公司生產的T4 Ligase於4℃連接過夜。將連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆。
1.用EcoRI/SmaI雙酶從質粒pGEMT-TA29上切下TA29片段，瓊脂糖凝膠電泳、回收。
2.用EcoRI/EcoRV雙酶處理質粒pUCA7-Tx，瓊脂糖凝膠電泳並回收pUCA7-Tx載體。
3.將上述回收的TA29片斷和pUCA7-Tx載體以3∶1的摩爾比混勻，加入T4 DNA連接酶，4℃連接過夜。
4.將連接產物轉化處於感受態的大腸桿菌DH5α，在含有70μg/ml氨苄青黴素的LB培養基上37℃倒置培養過夜。
5.挑取陽性克隆，提取質粒，通過限制性內切酶圖譜分析，確認各個元件都處於正確連接，將該質粒命名為pUCA7-TA29-Tx。
6.將GUS片段(質粒pBI221經SacI酶切，T4 DNA聚合酶補平，再用BamHI酶切獲得)插入經過BamHI/SmaI雙酶處理的pGEM-7Z載體，獲得重組質粒pGEM-7ZGUS。
7.將TA29-Tx片段(pUCA7-TA29-Tx質粒經過EcoRI/BamHI雙酶處理後獲得)和GUS片段(pGEM-7ZGUS質粒經過BamHI/XbaI雙酶處理後獲得)插入經過EcoRI/XbaI雙酶切處理的BinHygTx載體中，這樣就使得TA29-Tx-GUS片斷處於T-DNA的LB和RB之間，可以用根癌農桿菌侵染的方法將此載體轉入植物。將該質粒命名BinHyg-TA29-Tx-GUS。略圖如下
微粒子彈的準備稱60mg金粉於1ml 70％酒精中，充分渦旋，靜置15min，1500rpm離心5min。去上清液，加1ml蒸餾水，充分渦旋，1500rpm離心5min，去上清液，重複三次。將金粉轉入1ml50％甘油中，製成60mg/ml的金粉懸浮液。取50μl懸浮液，按顧序加入1μg/μl質粒DNA 5μl、2.5mol/L CaCl250μl和0.1mol/L亞精胺20μl，渦旋10min，1500rpm離心5sec，去上清液。250μl 100％乙醇洗一次，渦旋，1500rpm離心5min，去上清液，重複一次。最後，金粉懸浮於60μl 100％乙醇中。
取6μl包被DNA的金粉懸浮液，裝備基因槍(PDS-1000型，美國BioRod公司製造)，每個培養皿轟擊一次，子彈與菸草細胞之間的距離為6cm。轟擊後，將培養皿於適宜條件下培養。整個轟擊過程在無菌狀態下進行。
與本發明相關的參考文獻1.Seurinck，J.et al.，1990，Trends Biochem.Sci.14，450-4542.A.M.Koltunow，J.Truettner，R.B.Goldberg et al.(1990)Different Temporaland Spatial Gene Expression Patterns Occur During Anther Development.ThePlant Cell 2.1201-12243.Mariani，C.et al.，1990，Nature 347，737-7414.mariani，C.et al.，1992，Nature 357，384-3875.傅榮昭等，1994，植物遺傳轉化技術手冊，中國科學技術出版社，北京6.陳潛，汪迎春，張利明等花葯特異嵌合啟動子的構建及雄性不育轉基因擬南芥的獲得農業生物技術學報，2001，9(1)62-6權利要求
1.一種質粒載體，含有受四環素誘導、花葯特異性表達的嵌合啟動子，β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUS)基因，終止子和篩選標記基因。其特徵在於處於該嵌合啟動子控制下的GUS基因，僅在受四環素誘導後才在植物花葯絨氈層特異表達。
2.根據權利要求1所述的載體質粒，其特徵在於GUS基因的5』端組裝了受四環素誘導、花葯絨氈層特異性表達的嵌合啟動子TA29-Tx，該嵌合啟動子可以調節GUS基因在受到四環素誘導後在植物花葯絨氈層中特異表達。
3.根據權利要求1所述的載體質粒，其特徵在於在GUS基因的3』端串聯組裝了增強表達能力的NOS終止子.
4.根據權利要求1所述的載體質粒，其特徵在於在該載體上組裝了HPT-II基因，作為轉基因植物的篩選標記，可以用潮黴素篩選；作為轉基因微生物的篩選標記，可以用卡那黴素篩選。
5.根據權利要求1所述的載體質粒，其特徵是在該載體上用核糖核酸酶基因(Barnase)置換GUS基因。受到四環素誘導後，Barnase基因在上述嵌合啟動子控制下在花葯絨氈層高效表達而獲得植物雄性不育系。
全文摘要
將菸草花葯特異性啟動子T29與四環素誘導系統結合，構建成既受四環素誘導又是花葯絨氈層特異表達的TA29－Tx/TetR系統。將barnase基因置於該系統控制下，施加四環素後，barnase基因在花葯絨氈層特異表達，其產物是一種核糖核酸酶，能夠是細胞致死，從而破壞了花葯絨氈層，導致植物雄性不育，為農業上作物雜交育種雄性不育系的獲得開闢了一條嶄新的途徑。
文檔編號C12N15/56GK1446917SQ02103788
公開日2003年10月8日 申請日期2002年3月25日 優先權日2002年3月25日
發明者李文彬, 唐孫勇, 孫勇如, 張利明, 王義琴 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所