一種用於檢測酪氨酸的電化學傳感器及其製備方法和應用與流程
2023-10-26 02:57:52
本發明涉及電化學檢測技術領域，具體涉及一種用於檢測酪氨酸的電化學傳感器及其製備方法和應用。
背景技術：
酪氨酸屬於芳香類胺基酸，是合成有機體內多種生成物的原料。酪氨酸雖是人體一種非必需的胺基酸，但它在機體內可通過不同代謝途徑轉化為不同的生理物質，對神經處於高度緊張，身體處於極度嚴寒、疲憊以及長時間工作的人群有很大的幫助。酪氨酸在許多領域發揮著重要作用，例如在醫學方面中，可用於醫治骨髓灰質炎、甲狀腺功能缺陷等症狀，還可用於治療焦急憂慮、心情鬱悶、皮膚性過敏、頭痛等症，幫助黑色素的製造、減輕白癜風等症狀；同時有助於防止細胞老化，維持身體健康。在食品領域中，常被用於食品和飲料的營養增補劑以及作為保鮮劑用於罐頭食品。總之，酪氨酸在食品、醫藥以及化工等領域應用極為廣泛。因此，對開展酪氨酸的定量檢測在臨床診斷、保障食品和藥品安全等方面有著重要作用。
目前，測量酪氨酸方法主要有微生物轉化法、微生物發酵法、化學合成法、化學發光法和離子色譜法等。這些方法雖然很重要，但都有一定的局限性。比如微生物轉化法易受酶活性影響導致穩定性差，微生物發酵法的代謝途徑調控機制複雜，化學合成法工藝較複雜，化學發光法選擇性差且對環境體系的各種因素要求極高，離子色譜法受ph影響大、酸鹼忍耐度差。而電化學分析法能克服上述傳統測定方法的缺點，且具有測定時間短、易操作、不需要前處理、低碳、投資小等優勢，酪氨酸自身具有電氧化活性這一特點也有利於其的電化學定量檢測。電化學測定方法中用到的工作電極若未經修飾直接使用，其較低的電催化活性將導致分析物的電化學響應信號弱，靈敏度和檢出限達不到痕量檢測要求。通常，將工作電極進行化學修飾以達到增強電化學響應的目的。目前用於酪氨酸的定量檢測的化學修飾電極有：樹枝狀銅修飾電極(檢測範圍為2.0×10-6～5.0×10-3mol/l、檢出限為6.0×10-7mol/l，王曉崗等,化學世界,2014,7(7):400-404)、聚蘇木精修飾電極(檢測範圍為5.0×10-6～1.0×10-4mol/l、檢出限為3.0×10-7mol/l，許春萱等,分析試驗室,2011,30(7):87-90)、電還原氧化石墨烯修飾電極(檢測範圍為5×10-7～8.0×10-5mol/l、檢出限為2.0×10-7mol/l，dengkqetal,colloids&surfacesbbiointerfaces,2013,101:183-18)、銪鐵氰化物膜修飾電極(檢測範圍為1×10-5～6.0×10-4mol/l、檢出限為8.0×10-6mol/l，liuyetal,appliedsurfacescience,2010,256(10):3148-3154)等。鑑於電化學方法的靈敏性，這些修飾電極檢測的結果還有進一步的提升空間。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是，提供一種用於檢測酪氨酸的化學修飾電極以及電化學傳感器。所述的化學修飾電極以及電化學傳感器具有較寬的檢測範圍和較低的檢出限。
本發明所要解決的上述技術問題，通過以下技術方案予以實現：
一種用於檢測酪氨酸的化學修飾電極的製備方法，包含如下步驟：
(1)取40～60mg氮摻雜石墨烯(n-rgo)，用40～60ml水分散均勻，形成溶液1；
(2)分別取10～11gk4[fe(cn)6]和0.7～0.8gkcl用8～12mlhcl溶解，形成溶液2；
(3)分別取0.1～0.2gfecl3和0.7～0.8gkcl用8～12mlhcl溶解，形成溶液3；
(4)在30～40℃水浴中，以300～600μl/min的速率同時往溶液1裡面滴加溶液2和溶液3，滴加結束後，攪拌20～60min；
(5)將步驟(4)得到的反應液分離、洗滌、乾燥後得普魯士藍/氮摻雜石墨烯納米複合材料(pb/n-rgo納米複合材料)；
(6)取2～5mg普魯士藍/氮摻雜石墨烯納米複合材料分散在4～8mln,n-二甲基甲醯胺中，取5～8μl該分散液塗覆在洗淨的直徑為2～5mm玻碳電極的表面，烤乾後得用於檢測酪氨酸的化學修飾電極(pb/n-rgo化學修飾電極)。
優選地，步驟(1)中取45～55mg氮摻雜石墨烯(n-rgo)，用45～55ml水分散均勻，形成溶液1。
最優選地，步驟(1)中取50mg氮摻雜石墨烯(n-rgo)，用50ml水分散均勻，形成溶液1。
優選地，步驟(2)中分別取10.2～10.6gk4[fe(cn)6]和0.72～0.76gkcl用8～12mlhcl溶解。
最優選地，步驟(2)中分別取10.423gk4[fe(cn)6]和0.7455gkcl用10mlhcl溶解。
優選地，步驟(3)中分別取0.15～0.2gfecl3和0.7～0.75gkcl用8～12mlhcl溶解。
最優選地，步驟(3)中分別取0.162gfecl3和0.7455gkcl用10mlhcl溶解。
優選地，步驟(4)中在35℃水浴中，以500μl/min的速率同時往溶液1裡面滴溶液2和溶液3，滴加結束後，攪拌30min。
優選地，步驟(6)中取3mg普魯士藍/氮摻雜石墨烯納米複合材料分散在5mln,n-二甲基甲醯胺中，取6μl該分散液塗覆在洗淨的直徑為3mm的玻碳電極的表面。
一種由上述製備方法製備得到的用於檢測酪氨酸的化學修飾電極。
對於使用納米複合材料製備測定具體某種化學成分含量的電極，則需要發明人根據具體待測定的化學物質的性質製備不同的納米複合材料。製備出的電極對所要測定物質的檢出限、靈敏度、穩定性和抗幹擾性等效果的好壞主要由納米複合材料的製備方法決定。納米複合材料的製備方法主要包括原材料的選擇、原材料的配比，以及各個步驟反應條件等。對於用作電極的納米複合材料，其製備方法中原材料的選擇、配比以及各個步驟反應條件的不同都會導致後續製備得到的電極電性能的巨大差異，從而導致檢出限、靈敏度、穩定性和抗幹擾性等效果的巨大差異。
根據酪氨酸的特性，為得到具有低檢出限的酪氨酸檢測電極，本發明發明人通過大量的實驗，不斷調整原料組成、配比以及製備過程中的工藝參數；製備得到粒徑為50～120nm的普魯士藍納米粒子並成功地將其高分散地負載在氮摻雜石墨烯上，該過程將成功增加複合納米材料的比表面積和催化活性，使得製備得到的pb/n-rgo化學修飾電極具有優異的電化學響應性能，可以顯著降低樣品中酪氨酸的檢出限，以及提高檢測的靈敏度、穩定性與抗幹擾性。
一種用於檢測酪氨酸的電化學傳感器，其包含上述用於檢測酪氨酸的化學修飾電極。
優選地，所述的用於檢測酪氨酸的電化學傳感器，其以上述用於檢測酪氨酸的化學修飾電極為工作電極，ag-agcl為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，利用三電極法組裝電極測試體系後連接電化學工作站得用於檢測酪氨酸的電化學傳感器。
一種酪氨酸的定量檢測方法，其使用上述電化學傳感器，用差分脈衝伏安法檢測樣品中的酪氨酸的含量。
優選地，所述的定量檢測方法，具體包含如下步驟：
配置待測樣品溶液；
使用上述電化學傳感器，用差分脈衝伏安法測定待測樣品溶液中酪氨酸的氧化峰電流值，根據線性方程換算出酪氨酸的濃度，進而得出樣品中酪氨酸的含量；
所述線性方程為ip＝1.65589×10-6logc+1.15645×10-5(r2＝0.9904)；方程中c為酪氨酸濃度，ip為差分脈衝伏安法得到的氧化峰電流值；
所述的差分脈衝伏安法的檢測條件為以ph為5.0的磷酸緩衝液為底液，攪拌富集時間為10s，靜止時間2s；所述的差分脈衝伏安法設置的操作條件為：電位掃描範圍0.0～1.1v、電位增量4mv、振幅50mv、一次脈衝寬度0.2s、二次脈衝寬度0.05s、測樣寬度0.0167s、脈衝周期0.5s。
有益效果：(1)本發明提供了一種全新的用於酪氨酸定量檢測的化學修飾電極以及電化學傳感器，該電極或傳感器對酪氨酸具有優異的電催化活性；(2)所述的用於酪氨酸定量檢測的化學修飾電極或電化學傳感器具有極低的檢出限(實施例表明其檢出限為2.086×10-10mol/l，遠遠低於現有技術中的6.0×10-7mol/l、3.0×10-7mol/l、2.0×10-7mol/l和8.0×10-6mol/l)和較寬的檢測範圍(1.0×10-8～8.0×10-4mol/l，寬於現有技術中的5.0×10-6～1.0×10-4mol/l、5×10-7～8.0×10-5mol/l和1×10-5～6.0×10-4mol/l)以及良好的穩定性、抗幹擾性和重現性；(3)基於本發明構建的酪氨酸電化學傳感器操作簡單、成本低廉，在藥品質量控制、食品安全和臨床醫療等方面有著廣泛的應用前景。
附圖說明
圖1為n-rgo(a)和本發明所述的pb/n-rgo納米複合材料(b)的掃描電鏡圖。
圖2為n-rgo(a)和本發明所述的pb/n-rgo納米複合材料(b)的紅外光譜圖(a)和紫外光譜圖(b)。
圖3為本發明所述的pb/n-rgo納米複合材料的能譜圖。
圖4為裸電極(a)、n-rgo修飾電極(b)和本發明所述的pb/n-rgo化學修飾電極(c)在5.0mmol/lk3[fe(cn)6]和0.1mol/lkcl底液中的交流阻抗(a)和循環伏安圖(b)。
圖5為裸電極(a)、n-rgo修飾電極(b)和本發明所述的pb/n-rgo化學修飾電極(c)在0.04mmol/l酪氨酸溶液中的循環伏安圖(a)和本發明所述的pb/n-rgo複合膜修飾電極在空白磷酸緩衝液(a)和含0.04mmol/l酪氨酸溶液(b)中的循環伏安圖(b)。
圖6為不同濃度的酪氨酸在pb/n-rgo化學修飾電極上的差分脈衝伏安圖(a)和酪氨酸氧化峰電流與其濃度對數值之間的線性關係圖(b)。
具體實施方式
以下結合具體實施例來進一步解釋本發明，但實施例對本發明不做任何形式的限定。
實施例1用於檢測酪氨酸的化學修飾電極的製備
(1)取50mg氮摻雜石墨烯(n-rgo)，加入50ml水超聲20min分散均勻，形成溶液1；
(2)分別取10.423gk4[fe(cn)6]和0.7455gkcl加入到10mlhcl中攪拌溶解形成溶液2；
(3)分別取0.162gfecl3和0.7455gkcl加入到10mlhcl中攪拌溶解形成溶液3；
(4)在35℃水浴中，以500μl/min的速率同時往溶液1裡面滴加溶液2和溶液3，滴加結束後，繼續攪拌30min；
(5)取出上述反應液離心分離，用水洗3次後再次離心分離，60℃烘箱中乾燥10h後即可得到普魯士藍/氮摻雜石墨烯納米複合材料(pb/n-rgo納米複合材料)；
(6)取3mgpb/n-rgo納米複合材料在5mln,n-二甲基甲醯胺中超聲分散後，取分散液6μl塗覆在洗淨的玻碳電極(直徑為3mm)的表面，在紅外燈下烤乾得用於檢測酪氨酸的化學修飾電極(pb/n-rgo化學修飾電極)。
圖1顯示的是n-rgo(a)和步驟(5)製備得到的pb/n-rgo納米複合材料(b)的掃描電鏡圖。從圖1(a)可以看到n-rgo具有典型的彎曲褶皺狀結構，從圖1(b)可以清楚地觀察到顆粒狀的普魯士藍顆粒附著在彎曲褶皺的片狀石墨烯上面，表明該pb/n-rgo納米複合材料已被成功製備。圖2(a)為n-rgo(a)、pb/n-rgo(b)的紅外光譜圖，兩圖中主要峰相似，但是pb/n-rgo在1950cm-1處出現明顯的普魯士藍的特徵峰；圖2(b)為n-rgo(a)、pb/n-rgo納米複合材料(b)的紫外光譜圖，比較發現普魯士藍在350nm處出現明顯的紫外特徵峰；證實了普魯士藍負載在氮摻雜石墨烯上。圖3顯示了步驟(5)製備得到的pb/n-rgo納米複合材料的能譜圖。從圖3可知，目標產物中主要含有c、o、fe等元素，進一步證實成功合成了pb/n-rgo納米複合材料；其它元素如k是合成過程中由反應物引入的，對材料的使用性能無影響。
實施例2一種用於檢測酪氨酸的電化學傳感器
將實施例1製備得到的pb/n-rgo化學修飾電極作為工作電極，以ag-agcl為參比電極、鉑絲電極為輔助電極組裝成三電極測試體系，並連接電化學工作站得用於檢測酪氨酸的電化學傳感器。
實施例3用於檢測酪氨酸的化學修飾電極或電化學傳感器的電學性能測試
(1)不同電極的電子傳遞性能對比
在如實施例2製備得到的三電極測試體系中，分別以裸玻碳電極(a)、n-rgo修飾電極(b)和實施例1製備得到的pb/n-rgo化學修飾電極(c)為工作電極在5.0mmol/lk3[fe(cn)6]混合了0.1mmol/lkcl的底液中進行交流阻抗和循環伏安測試。交流阻抗測試條件為：頻率範圍105～0.1hz、振幅5mv、電位0.17v；循環伏安測試條件為：電位範圍-0.2～0.6v，掃描速度0.1v/s，測試結果如圖2。從圖2(a)可見電化學阻抗在上述裸電極、n-rgo修飾電極和pb/n-rgo化學修飾電極上分別為1800ω、500ω和150ω，從圖2(b)可見氧化峰電流在上述三種工作電極分別為5μa、35μa和200μa，結果表明探針離子在本發明所述的pb/n-rgo化學修飾電極上的阻抗值最小、氧化峰電流最大，說明n-rgo上負載pb納米粒子後其電子傳遞性能和催化活性得到極大增強。
(2)不同電極對酪氨酸的電催化性能對比
在如實施例2製備得到的三電極測試體系中，分別以裸玻碳電極(a)、n-rgo修飾電極(b)和實施例1製備得到的pb/n-rgo化學修飾電極(c)為工作電極在0.04mmol/l酪氨酸溶液中的循環伏安測試，測試的電位範圍為-0.2～1.2v、掃描速度為0.1v/s，圖5(a)為測試結果。從圖中可見酪氨酸在本發明所述的pb/n-rgo化學修飾電極上的氧化峰電流為55.16μa，峰電位為0.851v。酪氨酸在n-rgo修飾電極和裸玻碳電極上的氧化峰電流分別為20.20μa和4.56μa，氧化峰電位分別為0.878v和0.915v。酪氨酸在本發明所述的pb/n-rgo化學修飾電極上的氧化峰電流值最大，氧化超電勢分別下降了27mv和64mv，說明了本發明所製備的pb/n-rgo化學修飾電極對酪氨酸有著最好的電催化活性，有利於提高傳感器的檢測靈敏度。圖5(b)為本發明所述的pb/n-rgo化學修飾電極在空白磷酸緩衝液(a)和含0.04mmol/l酪氨酸溶液(b)中的循環伏安圖。從該圖可知，pb/n-rgo化學修飾電極本身在pbs溶液中於1.10v處有pb的氧化峰，而當溶液中含有酪氨酸時會在0.851v處出現一新的氧化峰，即可證實該峰即為酪氨酸的氧化峰，利用該峰可對酪氨酸進行定量檢測。
(3)本發明製備得到的pb/n-rgo化學修飾電極對酪氨酸的檢測性能測試
以實施例1製備得到的pb/n-rgo化學修飾電極為工作電極、ag-agcl電極為參比電極和鉑絲電極為輔助電極，利用三電極法組裝電極測試體系，並連接電化學工作站(構建方法如實施例2所示)；在ph為5.0的磷酸緩衝液中，富集10s，靜止2s後對一系列酪氨酸溶液進行差分脈衝伏安法測試。差分脈衝伏安法設置的操作條件為：電位掃描範圍0.0～1.1v、電位增量4mv、振幅50mv、一次脈衝寬度0.2s、二次脈衝寬度0.05s、測樣寬度0.0167s、脈衝周期0.5s。結果表明(見圖6)酪氨酸的氧化峰電流隨其濃度增加而增大，在1.0×10-8～8.0×10-4mol/l濃度範圍內酪氨酸氧化峰電流與其濃度的對數值呈良好的線性關係，線性方程為：ip＝1.65589×10-6logc+1.15645×10-5，相關係數r2＝0.99039，該方程中c為酪氨酸濃度，ip為差分脈衝伏安法得到的氧化峰電流值。檢出限利用下面方程得到：
dl＝ksb/r
上式中，dl為檢出限；sb為空白液測定20次所得信號標準偏差，實驗中測得標準偏差為8.625×10-11；k為置信係數，通常k取3；r為方法的靈敏度；經計算可得檢出限為2.086×10-10mol/l。說明本發明所製備得到的電極具有良好的線性關係和極低的檢出限。
(4)本發明製備得到的pb/n-rgo化學修飾電極的穩定性和重現性測試
按照實施例1的步驟製備10支相同的pb/n-rgo化學修飾電極，分別以這10支電極為工作電極、ag-agcl為參比電極和鉑絲電極為輔助電極，用三電極法組裝電極測試系統並連接電化學工作站(構建方法如實施例2所示)，在ph為5.0的磷酸緩衝液中，富集10s，靜止2s，利用差分脈衝伏安法對同一濃度的酪氨酸進行測定。差分脈衝伏安法設置的操作條件為：電位掃描範圍0.0～1.1v、電位增量4mv、振幅50mv、一次脈衝寬度0.2s、二次脈衝寬度0.05s、測樣寬度0.0167s、脈衝周期0.5s，測定結果的相對標準偏差為3.66％。將其中一支bp/n-rgo修飾電極保存在4℃冰箱中，選取10個不同的時間段(保存前測試第1次，然後每隔2天測試1次)，利用上述同樣條件和方法對同一濃度的酪氨酸進行測定，測定的相對標準偏差為2.35％；表明本發明提供的pb/n-rgo化學修飾電極具有較好的穩定性和重現性。
(5)本發明製備得到的pb/n-rgo化學修飾電極的抗幹擾能力測試
將實施例1製備得到的pb/n-rgo化學修飾電極利用三電極法組裝電極測試體系，並連接電化學工作站構成電化學傳感器(構建方法如實施例2所示)，利用差分脈衝伏安法考察了外來幹擾物質對酪氨酸測定的影響。差分脈衝伏安法設置的操作條件為：電位掃描範圍0.0～1.1v、電位增量4mv、振幅50mv、一次脈衝寬度0.2s、二次脈衝寬度0.05s、測樣寬度0.0167s、脈衝周期0.5s。具體測試方法是，在4.5ml磷酸底液中加入0.5ml1mmol/l的酪氨酸，調節底液ph為5.0，在富集10s、靜止2s後通過差分脈衝伏安法測定其氧化峰電流值，再加入0.5ml1mol/l(或10mol/l)的幹擾物質，通過差分脈衝伏安法測定酪氨酸的氧化峰電流值。對比加入幹擾物質前後酪氨酸的氧化峰電流值的變化情況，如果偏差在±5％以內，可以認為幹擾物對分析物的檢測無影響。測試結果表明，本發明所製備的傳感器在10倍的葡萄糖、草酸、vb1、kcl、fecl3以及1倍的色氨酸，腺嘌呤，抗壞血酸、撲熱息痛和香草醛等物質的幹擾下對酪氨酸的檢測值偏差在±5％以內，說明本發明提供的pb/n-rgo化學修飾電極具有較好的抗幹擾能力，能有效地對酪氨酸進行定量檢測。
實施例4酪氨酸的定量檢測方法
(1)配置待測樣品溶液；
(2)使用實施例2所述的電化學傳感器，用差分脈衝伏安法測定待測樣品溶液中酪氨酸的峰電流值，根據線性方程換算出酪氨酸的濃度，進而得出樣品中酪氨酸的含量；
所述線性方程為ip＝1.65589×10-6logc+1.15645×10-5(r2＝0.9904)；方程中c為酪氨酸濃度，ip為差分脈衝伏安法得到的氧化峰電流值；
所述的差分脈衝伏安法的檢測條件為以ph為5.0的磷酸緩衝液為底液，攪拌富集時間為10s，靜止時間2s；所述的差分脈衝伏安法設置的操作條件為：電位掃描範圍0.0～1.1v、電位增量4mv、振幅50mv、一次脈衝寬度0.2s、二次脈衝寬度0.05s、測樣寬度0.0167s、脈衝周期0.5s。
實施例5實際樣品檢測
稱取0.9684g葡萄乾和1.1260g花生米為實際樣品進行酪氨酸的定量檢測，將實際樣品碾碎後分別加入20ml醋酸溶液浸泡24h後備用。分別取準備好的樣品溶液0.2ml，加入5ml磷酸緩衝液並調整ph為5.0後進行差分脈衝伏安測試，差分脈衝伏安測試的操作條件為：電位掃描範圍0.0～1.1v、電位增量4mv、振幅50mv、一次脈衝寬度0.2s、二次脈衝寬度0.05s、測樣寬度0.0167s、脈衝周期0.5s。先在樣品溶液中掃描測定一組數據後，再分別在葡萄乾樣品液中加入0.5ml濃度為10umol/l的和1.0ml、1.5ml濃度為20umol/l的酪氨酸標準液；在花生米樣品液中加入0.5ml濃度為1umol/l的和1.0ml、1.5ml濃度為2umol/l的酪氨酸標準液進一步進行差分脈衝伏安測試。測定結果顯示測樣品溶液有氧化峰電流出現，該峰電流值隨著酪氨酸標準溶液的加入而不斷增大且呈線性關係，說明葡萄乾和花生米樣品中含有酪氨酸且能利用pb/n-rgo化學修飾電極進行測定。通過樣品溶液中得到的標準加入曲線的延長線與濃度軸的交點，可求得酪氨酸在葡萄乾中的含量為9.65×10-6mol/l、在花生米中的含量為9.21×10-6mol/l；說明了本發明提供的化學修飾電極或電化學傳感器可用於食品、藥品等物質中酪氨酸含量的定量檢測。