一種篩選治療或預防癌症的藥物的方法

2023-10-25 23:50:12 2

專利名稱：一種篩選治療或預防癌症的藥物的方法
技術領域：
本發明涉及治療或預防癌症的方法和藥物以及抗癌藥物篩選方法。
背景技術：
人轉錄正輔因子4(PC4，也稱pl4、pl5、Subl的同源類似物等)是一種單鏈DNA結合蛋白，這種蛋白由127個胺基酸殘基組成且靠近N-端有數個絲氨酸富集區。PC4已被克隆並鑑定為一種能通過與許多序列特異性和細胞特異性調節子直接作用來介導許多基因的轉錄活化的通用正輔因子(參見文獻Ge等，Cell (1994) 78 :513-523 ；Kretzschmar, Μ.等， Cell (1994) 78 :525-534)。PC4直接作用的這些調節子包括許多核激素受體、腫瘤抑制子、 癌蛋白、以及腫瘤的發生過程和其他人類疾病的病變過程中所必須的重要因子。腫瘤抑制蛋白P53直接與PC4蛋白在轉錄水平發生相互作用，從而控制了 PC4的表達。另外，PC4作為P53的唯一激活子可以調節許多參與細胞周期、凋亡、DNA修復和其他細胞應答的基因的轉錄(參見文獻Kishore A. H.等，Biochem. J. (2007) BJ20070390 ； Banerjee, S.等，Mol. Cell Biol. (2004)24:2052-2062)。PC4 的活性受到翻譯後修飾的進一步調節，該翻譯後修飾的類型至少包括磷酸化修飾和乙醯化修飾。PC4被磷酸化修飾之後，其與目標激活因子作用的活性被抑制且能反向介導其輔激活因子的功能。質譜分析結果表明體內的PC4超磷酸化修飾主要由酪蛋白激酶II介導且僅發生在N-端絲氨酸富集區(參見文獻 Ge 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91 :12691-12695) PC4 的乙醯化修飾由P300介導且受到磷酸化修飾的抑制(Kumor, P. B. R.等，J. Biol. Chem. (2001)276 16804-16809)。到目前為止，大家還不清楚pc4在調節基因中所起的作用是否與癌症或腫瘤的發生有關。

發明內容
發明人採用了包括爪蟾卵母細胞系、人體組織、其他哺乳動物細胞系在內的不同的模式生物體系，驚奇地發現PC4具有癌蛋白的功能且在細胞分化、腫瘤發育和病變的過程中起重要作用，見圖10示出的PC4的多種功能，所有這些功能，尤其是圖10中標註下劃線的功能，都與癌症發病機理相關或者是癌症發病的基礎。特別是，發明人研究發現在很多惡性腫瘤組織中，如在肺癌組織、膀胱癌組織、結腸癌組織、乳腺癌組織、子宮內膜癌組織、 甲狀腺癌組織、小腸癌組織中，都發現PC4在蛋白水平被活化。相反，在相應的沒有經歷過快速生長的正常組織中的PC4的蛋白水平沒有升高。在癌細胞系和其他轉化細胞系中還發現了 PC4RNA水平的升高，但是在原代細胞系中並沒有發現。例如，發明人測定了非洲爪蟾的變態發育過程中的PC4的表達水平。測定方法如下收集不同發育階段的非洲爪蟾的整體溶解產物，監測每個溶解產物的蛋白含量，選取 50ug每個階段溶解產物中的總蛋白，上SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分析，然後將凝膠上的蛋白轉到硝酸纖維膜上，最後進行蛋白印跡分析，即採用抗PC4的多克隆抗體來檢測被轉到硝酸纖維膜上的蛋白。測定結果如圖5A、圖5B和圖5C所示，PC4的表達水平與非洲爪蟾蜍變態發育過程相關，當前變態發育開始時，PC4在56 58這個階段被顯著活化。發明人通過轉染檢測實驗證明PC4與細胞死亡相關。將人PC4編碼區(野生型的或絲氨酸富集區突變型的人PC4編碼區)與綠色螢光蛋白(GFP)的編碼區融合後，再亞克隆到包含有CMV啟動子哺乳動物表達載體(pcDNA3. 1)中，再將得到合成載體瞬時轉染到 HeLa 細胞(參見 Ge 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91 :12691-12695) 轉染後 M 小時，在雷射共聚焦顯微鏡下觀測樣本，能觀察到PC4在轉染的HeLa細胞中所起的作用。結果如圖6A、圖6B、圖6C所示，圖6A是對照組(未轉染的HeLa細胞)的螢光檢測結果，圖6B 是轉染了野生型PC4的HeLa細胞的螢光檢測結果，圖6C是轉染了 N-端絲氨酸區突變型卩〇4( 04-八3，其不能被磷酸化，所以應該是完全活化的)的HeLa細胞的螢光檢測結果。三幅圖對比可以看出，PC4位於細胞核中且能夠導致染色體凝集和細胞凋亡，尤其是從圖6C 可以判斷PC4的過量表達引發了凋亡，這一點與癌蛋白的作用是一致的。另外，發明人還採用蛋白印跡分析法測定了許多組織中的PC4水平。收集手術後切除的不同的組織(惡性腫瘤組織的記為「T」，正常組織記為「N」，由美國國立衛生研究院提供)，並快速冷藏到-80°C環境中直至使用。組織裂解液的製備過程如下向組織溶液中加入裂解緩衝液(裂解緩衝液體積為總體積的1/10)後，用微型高速攪拌器將其分散均勻。 離心後收集溶液部分。檢測所收集的溶液部分裂解物的蛋白濃度，可以採用Bradfort蛋白檢測方法(BioRad蛋白檢測儀)。為測定PC4的表達水平，取50ug正常組織或惡性組織的組織裂解物進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，將凝膠上的蛋白轉到硝酸纖維素膜上，最後進行蛋白印跡分析，即採用抗人PC4的多克隆抗體來檢測被轉到硝酸纖維膜上的蛋白。 結果如圖8B所示，該結果表明在很多人體腫瘤組織中，如肺癌組織、膀胱癌組織、結腸癌組織、乳腺癌組織、子宮內膜癌組織、甲狀腺癌組織和小腸癌組織，都發現了 PC4，但是在相應的正常人體組織中都沒有檢測到PC4。發明人還採用免疫組織化學分析檢測了正常肺組織和肺癌組織中PC4蛋白的表達水平。用美國國立衛生研究院提供的正常肺組織或肺癌組織切片的載玻片樣本做免疫組織化學分析。免疫組織化學分析過程如下先用二甲苯處理組織切片的載玻片，2次，每次 15分鐘；然後將其置入濃度依次遞減的(從100% 70%)的乙醇中，每次孵育5分鐘；在 95°C下烘乾5分鐘後，依次用水和PBS漂洗，然後用3%牛奶封閉液進行封片；加一抗(即抗PC4的抗體)，室溫孵育1小時；洗去多餘的一抗後，向切片加標記有螢光的二抗，室溫孵育30分鐘；最後，漂洗載玻片，放置在螢光顯微鏡下能檢測到PC4蛋白。如圖9A和圖9B所示，正常肺組織中沒有檢測到PC4蛋白，而在肺癌組織的所有癌細胞中都發現PC4蛋白的凝集。發明人在所有經檢測的轉化細胞系(cos、HeLaJ93)和三個乳腺癌細胞系 ((MCF7、MD231、MDA468)中都檢測到了 PC4的mRNA，但是在原代NIH3T3細胞系和非惡性的大鼠組織(腦組織m-Brain，睪丸組織m-Testis)沒有檢測到PC4的mRNA。檢測方法 (Northern印跡分析)如下從上述這些不同細胞系或組織中提取總RNA且通過1 %的甲醛-瓊脂糖凝膠進行分離，凝膠上的RNA轉到硝酸纖維膜上後，再將標記有32P的人PC4 DNA(h-PC4probe)和人p52 DNA(h-p52 probe)作為探針分別與所提取的總RNA雜交(將膜置於探針溶液環境中孵育一段時間)，用溴化乙錠(EtBr)染色法分別檢測出各樣品總RNA 中PC4 mRNA和p52 mRNA的表達水平，即觀測染色後的28S和18S核糖體RNA (參見文獻Ge 等，EMBO J. (1998) 17:6723-6729)。檢測結果如圖7A、圖7B、圖7C所示。所述的p52是另一種在上述的各種細胞系和組織中都存在的轉錄輔激活因子。發明人還將PC4在腫瘤組織中的活化與DNA拓撲異構酶I的活化進一步聯繫起來，如圖8A、圖8B所示。所述的DNA拓撲異構酶I是一種將DNA進行解旋的酶且為一些抗癌藥物如NB-506，J-I09，J-382，DB-67 的靶點(參見文獻Pilch，B.等，Cancer Res. (2001)61 6876-6884 ；Chen, Α. Y.等，Mol. Cancer Thera. (2005)4 :317-324)。許多癌基因和腫瘤抑制基因編碼的蛋白，例如C-myc、P53、DNA拓撲異構酶I，也是大家熟知的能作為轉錄調節因子的蛋白，發明人經研究發現，PC4能夠提高這些蛋白的活性。以上事實能得出一個結論除了能起到轉錄輔激活因子的作用，人轉錄正輔因子 4(PC4)還能作為一種癌蛋白來激活細胞發育、分化、惡性轉化和腫瘤侵襲生長。實際上，一些採用DNA陣列方法的其他研究中，也發現了癌症病變過程中PC4在RNA水平的活化(Das， C.等，Mol. Cell. Biol. (2006)26 :8303-8315 ；Kleivi, K. Mol. Cancer (2007)6 :1-16) 基於發現了 PC4作為一種癌蛋白能在不同類型的人腫瘤的形成過程中起到重要作用，發明人以PC4為研究靶點發明了一系列診斷癌症的方法，預防、治療癌症的方法和藥物，以及篩選抗癌藥物的方法。本發明提供了診斷受試者癌症或其他惡性腫瘤的方法，該方法包含以下內容從受試者身上收集合適的組織樣或液體樣，檢測所收集的樣本中作為生物標記的PC4的表達水平，若其中的PC4的表達水平比對照樣的高，說明樣本為癌組織或惡性組織。為進一步的確診，該方法還可以包含有檢測其他相關生物標記的水平的步驟，例如檢測DNA拓撲異構酶I的表達水平。本發明進一步提供了一種檢測受試者是否患有癌症或體內是否存在惡性腫瘤細胞的方法，該方法包含以下內容從受試者身上收集合適的樣本，檢測樣本中作為生物標記的DNA拓撲異構酶I的表達水平，若其中的DNA拓撲異構酶I的水平比對照樣的高，說明樣本為癌組織或惡性組織。上述的「受試者」包括人、其他可能會患癌症的動物。本發明提供了一種通過降低細胞內PC4水平或抑制PC4的功能來預防或治療癌症的藥物，該藥物中包含了有效劑量的合適的PC4拮抗劑。相應的，根據本發明的發明構思，本發明還提供了一種治療癌症的方法，即給患有癌症的受試者使用上述包含了有效劑量的合適的PC4拮抗劑的藥物。經發明人研究表明， 這類藥物或者說相應的治療方法可以被用來治療肺癌、膀胱癌、結腸癌、乳腺癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、小腸癌和其他惡性腫瘤(參見圖8B)。上述的包含有合適的PC4拮抗劑的藥物不僅可以由於治療，也可以用於預防目的，防止人腫瘤的發生。上述的治療癌症的方法包括化療、放療、免疫療法以及綜合治療。
上述的預防或治療癌症的藥物可以單獨使用、也可以聯合其他一種或多種抗癌藥物使用，共同達到預防或治療癌症的有效劑量。上述的預防或治療癌症的藥物中可以加入藥學上接受的載體。基於現有的生物學理論和技術，本發明進一步提供了一些合適的PC4拮抗劑已修飾的或無功能的PC4多肽或蛋白、抗PC4的抗體、合適的反義核苷酸分子、合適的小分子幹擾RNA分子(siRNA)。已修飾的或無功能的PC4多肽或蛋白上述的PC4拮抗劑可以選擇已修飾的或無功能PC4多肽或蛋白。PC4是大家所熟知的一種多功能蛋白，已經證明了其綁定DNA以及在綁定DNA的同時與其他蛋白發生相互作用的能力。目前大家已認識到一種已修飾的或無功能的PC4突變體或其中的部分片段可能被野生型的或者未修飾的PC4所顯性抑制，或者可能以隱性狀態存在於細胞中。或者，已修飾的或無功能的突變體、類似物或其中的部分片段可能與野生型或未修飾的蛋白競爭， 從而有效地削弱野生型或未修飾的蛋白的功能。例如，由於磷酸化的PC4是失活的(尤其是N-端絲氨酸富集區被磷酸化修飾後的PC4失活)，它也能夠被用來與未磷酸化的PC4 (活性形式)競爭從而達到治療目的；另外，目前研究表明，其中包含有第77個位點的苯丙氨酸單個胺基酸突變(F77P)或者與該突變等效的突變的PC4蛋白或多肽失去了與DNA綁定的活性，因此根據本發明的發明構思，可以推斷這種無功能PC4多肽或蛋白具有抗癌方面的藥學用途。有這種類似功能的模擬肽或模擬肽組合物可能會成為一種急需有待研發的癌症治療藥劑，由於它們能夠防止動物的免疫系統或蛋白代謝機制遭到破壞。本發明還進一步提供了一些突變型PC4蛋白作為PC4拮抗劑(治療依賴於PC4的腫瘤的藥物)。之前已經報導過N-端絲氨酸富集區對於PC4蛋白的活性來說是必需的，且受到酪氨酸激酶II的磷酸化作用的調節，刪除N-端區導致PC4蛋白的輔激活作用完全喪失(Ge 等，1994a ； 1994b ；Kretzschmar等，1994)。發明人通過製造一系列的單個胺基酸突變，定位了一些對PC4蛋白的活性來說是必不可少的重要胺基酸。由此，發明人篩選出7種突變型 PC4 蛋白，如圖 2 所示，mt-1 (K23I/K29A)、mt-2 (K35I/K41A)、mt-3 (R27A/K28I/K29A)、 mt-4 (R47N/K35I/K41A)、mt_5 (F77P)、mt_6 (K29A)、mt_7 (K41A)。經實驗研究證明，除了已知的第77個位點發生了單個胺基酸突變(F77P)的PC4喪失了結合DNA的能力和轉錄活性， 在N-端基本區發生雙重突變(K23I/K29A和K35I/K41A)和三重突變(R27A/K28I/I^9A)的 PC4蛋白的活性也大大降低了，因此PC4突變體F77P、K23I/I^9A、K35I/K41A、R27A/I^8I/ K29A能用作抗癌藥物，通過與內源的野生型PC4競爭來達到治療依賴於PC4的惡性腫瘤的效果。本發明還提供了與PC4的激活結構域的胺基酸序列同源的短多肽作為PC4拮抗劑。PC4，作為一個通用的轉錄輔激活因子，它的活性表現為與其他通用轉錄因子、轉錄激活因子、DNA模板之間的相互作用，因此激活結構域對於PC4實現其功能是必須的。由此，發明人設計合成了兩個多肽，它們的序列分別與兩個PC4激活結構域胺基酸序列一致， 這兩個多肽能與野生型PC4競爭結合其他激活子，從而達到抑制PC4活性的作用。這兩個多肽序列為PC4的胺基酸序列中第16-30個胺基酸(DSDSEVDKKLKRKKQ，見SEQ ID NO. 3)和第洸-40 個胺基酸(KRKKQVAPEKPVKKQ，見 SEQ ID NO. 1)序列。本發明還提供了能與PC4結合的模擬激活結構域多肽作為PC4拮抗劑。由於PC4的致癌活性是通過其作為轉錄輔激活因子去激活全部或絕大多數的癌基因、生長因子或其他致癌因子的表達來實現的(PC4與所述癌基因、生長因子或其他致癌因子的特異性激活子相互作用來激活它們的表達)，因此，抑制PC4蛋白去結合內源激活子能使PC4蛋白失去其輔激活子活性。發明人經研究發現了一個有15個胺基酸的兩親性螺旋多肽(amphipathic helix peptide, AH peptide)能夠模擬一種激活結構域與PC4發生強相互作用，從而封閉了 PC4的激活子結構域，抑制PC4與內源激活子作用，抑制了 PC4的功能，達到治療目的。該多肽的序列為ELQELQELQALLQQQ，見SEQ IDN0. 5。作為本發明的進一步改進，PC4拮抗劑還包括連接有遷移結構域的多肽或蛋白類 PC4拮抗劑。為了促進多肽或蛋白類PC4拮抗劑進入腫瘤細胞，使得其能夠靶向核內癌蛋白 PC4，可以通過將遷移結構域(translocation domain, TLD)與重組單克隆抗體、突變型PC4 蛋白、與PC4的激活結構域的胺基酸序列同源的多肽、能與PC4結合的模擬激活結構域或其他能夠抑制PC4活性的蛋白或多肽等融合來實現。本發明採用了一種包含有12個胺基酸的短多肽作為遷移結構域，其序列為 PLSSIFSRIGDP，見SEQ ID NO. 7，分子量為1288. 47，等電點pi = 6. 27。據報導，這種多肽對於B型肝炎病毒的感染和一些其他蛋白的細胞滲透性來說是必不可少的(Oess and Hildt 2000 ；Stoeckl et al.，2006)。抗體本發明提供了一些能夠抑制PC4蛋白或抑制PC4蛋白和DNA拓撲異構酶I (這兩個蛋白以下也稱靶蛋白)的生物學活性的中和抗體。本發明的抗體為基於現有生物學技術能夠得到的抗PC4抗體，優選單克隆抗PC4抗體，也可以選擇包含有所述單克隆抗PC4抗體的多克隆抗體。所述的單克隆抗PC4抗體包括了 PC4的亞型特異性抗體。根據本發明的發明構思，上述的單克隆抗PC4抗體為能夠特異性結合靶蛋白的抗體，抗體中的抗原結合片段也稱抗原性片段，抗原性片段可以是Fab片段、F (ab) 2片段、 Fab'片段、F(ab' ) 2片段、Fd片段、Fd'片段或者Fv片段。一般的單克隆抗PC4抗體中包含了抗原性片段，當然單克隆抗PC4抗體也可以選擇這些抗原性片段(即單價抗體)。最好選擇抗原表位，即當抗體進入體內後被抗原識別的位點。單克隆抗PC4抗體首選小鼠單克隆抗體或其中的抗原性片段、抗原表位。除了單價抗體，結構域抗體(dAbs)(參考文獻 Holt 等，Trends in Biotechnology (2003) 21 :484-490)也適用於本發明的抗 PC4 抗體。若為治療人，應該採用人源化抗體，最好是人源化天然抗體。製造已知抗原的抗體的方法有很多種，這是本領域技術人員所熟知技術(參見美
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)出片反的《Antibodies :A Laboratory Μειηιιει 》， Harlow and Lane, 1988 ；^ 利第 01/25437 號)。可以採用體內免疫法，用源自靶蛋白上的具有免疫原性的組分來免疫人或其他動物宿主，再從動物宿主中提取抗體；可以通過免疫人或除人以外的動物來獲得上述的抗體， 優選哺乳動物，例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、山羊、綿羊、豬，或者鳥類(如雞)，進一步優選小鼠。也可以採用體外免疫的方式從免疫細胞中提取抗體。體外免疫法優選採用重組表達技術生產抗體，例如用合適的編碼抗PC4抗體的DNA來轉化、轉染、感染或轉導適合的細胞系，得到重組系統能表達生產抗PC4抗體；也可以採用本領域所熟知的雜交瘤技術來製備抗體；或採用生物重建的方式，直接將已純化的重鏈和輕鏈構建成抗體；特別是，還可以選擇化學合成的方法獲得合適的抗體，或者採用細胞內免疫的方法(例如胞內抗體技術，在胞內表達抗PC4抗體)。另外，本發明的抗體還包括了嵌合抗體和雜合抗體。一些文獻中描述了製備嵌合抗體和雜合抗體的技術(Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1984)81 :6851-6855 ； Neuberger 等，Nature, (1984) 312 :604-608 ；Takeda 等，Nature (1985)，314 :452-454)。進一步的，單鏈抗體也適用於本發明(參見發明人為Huston的兩個美國專利 第 5，476，786 號和第 5，132，405 號；Huston 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1988) 85 5879-5883 ；發明人為 Ladner 等人的第 4，946，778 號美國專利；Bird, Science. (1988) 242 423-426 ；Ward等，Nature. (1989)334 :544-546)。所述的單鏈抗體是一種由單一肽鏈組成的小分子抗體，合成方法在抗體重鏈和輕鏈可變區(Fv)基因之間，用一段短肽基因將兩者連接成^Fv基因，該基因的表達產物可摺疊成具有抗原結合能力的單鏈多肽。抗體的給藥途徑可以採用本領域技術人員所熟知的一些藥物輸送途徑，例如直接注射可能比較適合將抗體釋放到需治療的位點。也可以採用其膜內包裹有抗體的脂質體，將脂質體定向輸送到靶點，從而使這裡的目標基因的表達或功能被抑制。除了單克隆抗 PC4抗體，所述的脂質體中還可以包含一些其他藥劑，例如上述的一些能夠被釋放到治療靶點的藥劑(參見文獻，Wolff 等，Biochem. et Biophys. Acta, (1984)802:259)。反義核苷酸分子在本發明還提供了採用反義寡聚核苷酸分子來抑制PC4基因或者抑制PC4基因和 DNA拓撲異構酶I基因(這兩個基因以下簡稱目標基因)的表達的方法。本領域公知的，細胞中的反義RNA的表達，特別是組成性表達，能夠抑制基因的表達(可能是通過阻斷翻譯或防止剪接的方式來抑制基因的表達)。基於這一點，幹擾剪接使得那些保守性較差而產生較強特異性的內含子序列能發揮作用，從而能抑制一個物種中相應基因產物的表達，但不抑制其他物種中的這種基因產物的同源物的表達。術語「反義組分」是指與一個特定的mRNA分子充分互補的RNA或DNA分子。反義 RNA分子是特異的，反義RNA與mRNA發生分子雜交會導致mRNA的翻譯受到抑制。所述的分子雜交能在體內環境下發生。本發明的反義RNA分子必須具有足夠的與目標基因互補的能力，長度大約15 30個核苷酸，這樣一來反義RNA分子能與目標基因(或者mRNA)雜交來抑制目標基因的表達，無論雜交是發生在剪接水平、轉錄水平還是翻譯水平。本發明的反義 RNA分子選擇能夠與目標cDNA中的包括編碼區序列、3』或5』非編碼區序列或其他內含子序列在內的任意一個部分雜交的RNA分子，或者是能夠與目標mRNA雜交的RNA分子。至於如何設計反義核酸分子，在已知mRNA序列的基礎上，根據已有技術，反義核酸分子序列可以很容易地設計出來。本發明的反義RNA分子，可以採用轉化或轉染的方式，由載體運送進入宿主細胞，所述的載體類型包括逆轉錄病毒載體和質粒，連接編碼反義RNA的DNA與合適的包含有啟動子的調節序列，連接後一同置入所述的載體中，從而反義RNA能在宿主細胞中表達。在一個實施方案中，包含有編碼反義RNA分子的cDNA片段的載體實現了穩定轉染和組成性表達，或者這種表達可能是在組織特異性或發育特異性的啟動子的控制下實現的。也可以使用脂質體將反義RNA分子運送進入細胞。針對體內治療，目前現有的首選方法是直接將反義RNA分子運送到靶點，而不是通過穩定轉染其上構建了編碼反義RNA分子的cDNA片段的表達載體。本發明的反義寡聚核苷酸分子具有15到30個鹼基的長度，其序列決定了該反義寡聚核苷酸分子是否能夠與目標cDNA中的包括編碼序列、3』或5』非編碼區或其他內含子序列在內的任意一個部分雜交，或者優選的，是否能與目標mRNA雜交。與目標基因雜交的反義寡聚核苷酸分子的序列最好選用那些具有最強的反義能力的序列。反義寡聚核苷酸序列分子上的反義能力由以下幾個因素來決定反義寡聚核苷酸的長度、綁定親和性、目標序列的可及性。在體外篩選反義能力強的反義寡聚核苷酸分子，可以通過體外檢測其抑制目標蛋白翻譯的能力和抑制與目標基因相關的顯型的能力，例如，抑制培養基中細胞增殖的能力。一般來說，目標cDNA的大多數區域(5』和3』非編碼區，AUG起始區，編碼區，剪接點和內含子序列)都能夠利用反義寡聚核苷酸來定位。本發明的反義寡聚核苷酸分子優選那些穩定的、有強抗核酸酶能力的、具有合適的藥物動力學性能使其能以無毒劑量到達目標組織、且有能力穿過質膜的寡聚核苷酸分子。根據現有技術，反義RNA分子的化學修飾主要集中在磷酸二酯骨架、鹼基、糖環， 這些修飾可以提高反義RNA分子的穩定性或與目標cDNA或mRNA雜交的能力。本發明的反義寡聚核苷酸分子優選磷硫醯化反義寡聚核苷酸分子(反義寡聚核苷酸分子的磷酸二酯鍵被磷硫醯化修飾後得到磷硫醯化反義寡聚核苷酸分子)。磷硫醯化反義寡聚核苷酸分子的基本結構也可以被修飾使其反義能力得到進一步優化。另外，也已經發現了 N3』 -P5』氨基磷酸酯鍵能夠使得寡聚核苷酸分子在核酸酶的存在下穩定且能提高反義寡聚核苷酸分子與RNA之間的綁定結合力。肽核酸鍵(PNA)全部取代了核糖和磷酸二酯骨架使其能夠在核酸酶的存在下穩定，不會被RNA H酶切，且提高了反義寡聚核苷酸分子與目標基因或 mRNA之間的親和力。關於鹼基的修飾，經證明，鹼基被一些雜環修飾後，能增強反義寡聚核苷酸分子的反義能力且使得反義寡聚核苷酸分子不會被RNA H降解，例如，C-5噻唑修飾。 最後，也可以考慮糖環的修飾，例如用2』-氧-丙烷基、2』甲氧乙氧基取代核糖使得寡聚核苷酸能在體外細胞培養基中或體內的環境中保持對核酸酶的穩定性。本發明的反義寡聚核酸分子的給藥途徑應選擇一些能提供最佳反義效果(根據上述的標準來測定)的途徑。反義寡聚核酸分子的體內和體外測試結果表明以陽離子脂質體、逆轉錄病毒載體為載體來輸送反義寡聚核酸或者直接給藥的藥效較好。另一種可能的給藥模式是利用能與靶細胞表面特異性標記結合的抗體來將反義寡聚核酸分子靶向輸送到目的細胞。抗體與靶細胞結合或與其上受體的結合都能達到靶向輸送的目的。小分子幹擾RNA在本發明還進一步提供了能夠抑制目標基因表達的小分子幹擾RNA(small interfering RNAs,簡稱siRNA，也稱RNAi，也稱RNA幹擾核酸)。小分子幹擾RNA是一種雙鏈RNA分子，典型長度為21個核苷酸(nt)，若其與目標基因同源，則可以幹擾目標基因的表達。RNAi技術與真核細胞中的序列特異性的轉錄後基因表達過程有關。一般來說，這個過程中涉及到特定序列的mRNA降解，該降解由與這段特定序列同源的雙鏈RNA(dsRNA) 所引發。例如，與特定的單鏈mRNA(SS mRNA)序列相對應的長dsRNA的表達會使得遺傳信息的傳遞變得不穩定，從而幹擾了相應基因的表達。引入與任意選定基因mRNA的全部或絕大部分序列相對應的dsRNA都會抑制該基因的表達。據目前的研究看來，當一段長dsRNA表達時，它首先被核糖核酸酶III酶切成長度僅為21 22個鹼基對的短dsRNA。因此，siRNA 會因為這些與之同源的短dsRNA的引入或表達受到直接影響。哺乳細胞中至少有兩條途徑受到dsRNA的影響。在序列特異性途徑中，如上所述的，初始dsRNA先被酶切成多個小分子幹擾 RNA(siRNA)。這些siRNA由長度約為21個核苷酸的正義鏈和反義鏈組成，每條鏈由19個起幹擾作用的核苷酸和3』端的兩個游離核苷酸組成。小分子幹擾RNA被認為是能夠提供了一定的序列信息使得相應特定序列的mRNA被靶向降解。相反，而非特異性途徑可以由任意序列的dsRNA引發，只要該dsRNA長度至少大於30個鹼基對。非特異途徑的引發是由於dsRNA激活了兩個酶PKR酶和2' ,5'寡腺苷酸合成酶0' ,5' -AQ。PKR酶處於活性狀態時，可以通過磷酸化翻譯起始因子eIF2來關閉所有蛋白的合成；2'，5'寡腺苷酸合成酶能合成一種激活核糖核酸酶L(RNase L)的分子，而RNase L是一種能降解所有mRNA的非特異性酶。非特異性途徑通常代表宿主對外界壓力和病毒感染的反應，一般來說，非特異性途徑的作用最好是被降到最低水平。很明顯，較長的dsRNA只能誘導非特異性途徑，因此，長度不足30個鹼基對的dsRNA最好是通過RNA幹擾(RNAi)即序列特異性途徑來影響基因的表達(參見Hunter等，J. Biol. Chem. (1975) 250 :409-417 ；Manche 等，Mol. Cell. Biol. (1992) 12 :5239-5248 ；Minks 等，J. Biol. Chem. (1979)254:10180-10183 ；Elbashir 等，Nature Q001) 411 :494-498)。經證明，RNA幹擾是一種降低基因表達水平的有效手段，且對大多數類型的細胞都適用，例如HeLa細胞，NIH/3T3細胞，COS細胞，293細胞和BHK-21細胞。特別是與採用反義核酸相比，siRNA能將目的基因表達降到更低水平，並且事實上，siRNA經常能使得目的基因完全不表達(參見Bass，Nature (2001) 411 =428-429) 0另外，對於降低哺乳細胞中目的基因表達水平，同等條件下，siRNA的有效劑量比反義RNA的有效劑量低幾個數量級 (Elbashir 等，Nature (2001) 411 :494-498)。RNA幹擾優選長度小於30個鹼基對的雙鏈寡聚核苷酸，進一步優選長度為25、24、 23、22、21、20、19、18、17個鹼基對的雙鏈RNA。長度為21個鹼基對的siRNA效果較好。包含有游離的3』端siRNA效果較好。典型的游離3』端有兩個游離的核苷酸，這兩個核苷酸可以由任何類型的核糖核苷酸殘基組成，優選2 『-脫氧核糖核苷酸，在細胞培養基中和轉染細胞中，採用2'-脫氧核糖核苷酸組成的游離3』端不僅降低了 RNA合成成本，並可增強 7 siRNA抵抗核酸酶酶切的能力(參見Elbashi等，Nature 0001)411 :494-498)。較長dsRNA分子，例如具有50個、75個、100個甚至是500個或更多的鹼基對的大分子dsRNA，也可以在本發明的特定的實施方案中得到應用。為達到RNA幹擾效果所採用的 dsRNA的標準濃度約為0. 05nm、0. lnm、0. 5nm、l. OnmU. 5nm、25nm或100nm，雖然也可以採用其他濃度，這取決於所處理的細胞類型、所針對的目標基因以及其他相關因素。較長dsRNA分子的合成可以從啟動子轉錄合成長鏈dsRNA，所述的啟動子如本領域熟知的T7RNA聚合酶啟動子。抑制單個目標基因的長dsRNA分子的合成從體外轉錄本的啟動子下遊的目標位點起，向兩個不同方向同時合成互補的RNA分子，並隨即組裝成相應的dsRNA。在設計上述這些dsRNA分子時，必須考慮到每個RNA分子都應該包含有一部分與目標基因mRNA同源的核苷酸序列。siRNA的基本合成方法採用化學方法合成或者構建合適的表達載體在體外或體內合成。化學方法合成的標準RNA由21個核糖核苷酸組成。合成的siRNA可以採用凝膠分離方法進行純化。(Elbashir 等，Genes Dev (2001) 15 :188-200)。在設計siRNA序列時，可以選擇與目標基因mRNA的編碼序列相鄰的任意一段核苷酸序列作為特異性序列，也就是說，設計本發明的siRNA時可以選擇與PC4mRNA上的編碼序列相鄰的任意一段核苷酸序列作為特異性序列。另外，如何從這些核苷酸序列中挑選最佳的特異性序列了？ 一般採用一些現有的序列設計軟體。首先利用這些軟體程序預測目標基因mRNA的二級結構，再來挑選那些很可能出現在摺疊mRNA上的裸露單鏈區的序列。設計合適的siRNA的所採用的方法和材料，可以參考美國專利第6，251，588號文件中記載的相應內容。雖然mRNA通常被認為是線性分子，其核苷酸序列中包含了直接指導蛋白合成的信息，但實際上，大部分的mRNA都顯示出包含有很多二級和三級立體結構。RNA上的二級結構單元是通過同一 RNA分子中的不同區域之間發生相互作用而形成，所述的相互作用主要是Watson-Crick類型的相互作用。重要的二級結構單元包括雙鏈RNA (dsRNA)以及內環區中由分子內形成的雙螺旋結構、髮夾結構、以及突環結構。當二級結構單元之間發生相互作用或二級結構單元與單鏈區發生作用時所形成的更為複雜的三維結構為三級結構單元。很多研究者測定大量RNA雙鏈體結構中的結合能量，因而得出了一系列能夠用來預測RNA 二級結構的規則(例如參見 Jaeger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86 :7706 ；Turner 等， Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. (1988) 17 :167)。這些規則能幫助識別 mRNA 結構單元， 特別是對於識別裸露單鏈區域，這些mRNA上的裸露單鏈區域可能會成為siRNA、核酶或反義RNA所靶向的最佳靶片段。相應的，識別PC4mRNA上的最佳靶片段能用來設計基於本發明構思的具有RNA幹擾效果的dsRNA寡聚核苷酸、合適的核酶和錘頭形核酶組合物。上述的具有RNA幹擾效果的dsRNA寡聚核苷酸可以連同一個異源的靶基因一起通過載體試劑轉染的方式導入細胞，所述的載體試劑如本領域熟知的脂質體一例如Life Technologies公司生產的針對貼壁細胞系的脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000。靶向內源基因的dsRNA寡聚核苷酸的轉染載體可以選用Life Technologies公司生產的脂質體轉染試劑Oligofectamine。轉染效率還可以通過如下方式檢測將dsRNA寡聚核苷酸和hGFP-encoding pAD3在哺乳細胞系共轉染表達後，利用螢光顯微鏡技術檢測其轉染效率 (參見 Kehlenback 等，J. Cell. Biol. (1998) 141 :863-874)。dsRNA 導入細胞後，其 RNA 幹擾效率可以採用很多方法來檢測。這些方法包括蛋白印跡分析(Western blot analysis)、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Northern雜交分析(Northern blot analysis)，所述的蛋白印跡分析是指等待內源基因庫完成一次周轉代謝，新一輪蛋白合成被抑制後，採用抗體來識別目標基因產物(PC4)的方法；逆轉錄聚合酶鏈反應和Northern雜交分析可以測定目標基因mRNA (PC4mRNA)的水平。關於RNAi技術所採用的試劑、方法和應用在美國專利第6278039、5723750和 5244805號中有進一步介紹，列在此處可作參考。本發明的另一個目的是提供抗癌藥物的篩選方法，該方法是基於PC4是一種癌蛋白且可以作為抗癌藥物靶點這一科學發現。基於啟動子的篩選方法本發明的篩選抗癌藥物的方法，該方法包含以下兩個依次發生的步驟(1)提供一種基因構建體，其包含PC4基因的啟動子序列以及與該啟動子序列有效連接的報告基因；( 將候選藥物和所述的基因構建體混合置於適合所述的報告基因表達的環境中，其中，抑制報告基因表達的候選藥物為抗癌藥物。PC4基因啟動子序列，參見圖1A。與該啟動子序列有效連接的合適報告基因，可以選擇如螢光素酶基因或綠色螢光蛋白基因。本領域的技術人員應該能認識到，除了本申請文件中所提供的示範序列以外，還有許多合適的PC4基因啟動子序列或一些PC4基因的其他順式作用轉錄因子也能應用到基於本發明構思的抗癌藥物篩選方法。除了上述的基於啟動子的篩選方法，本發明的抗癌藥物篩選方法還可以採用基於蛋白活性的檢測方法。依賴於PC4蛋白的轉錄活性檢測方法本發明還提供了一種篩選抗癌藥物的方法，該方法包含以下兩個依次發生的步驟(1)提供一種檢測PC4蛋白的轉錄水平的試驗；( 向上述的試驗中加入候選藥物，其中，降低PC4轉錄水平的候選藥物為一種抗癌藥物(參見Ge和Roeder，Cell (1994) 78 513-523)。基於蛋白質-蛋白質或蛋白質-DNA相互作用的檢測方法本發明還提供了另一種篩選抗癌藥物的方法，該方法包含以下兩個依次發生的步驟(1)提供檢測PC4與蛋白之間相互作用或PC4與DNA之間相互作用的試驗；(2)向上述的試驗中加入候選藥物，其中，降低PC4與蛋白之間相互作用或PC4與DNA之間相互作用的候選化合物為抗癌藥物(參見Ge，Nucleic Acids Res. (2000) 28，e3)。優選高通量系統(HTQ篩選抑制PC4蛋白活性的化合物。在高通量篩選檢測中，通常應用螢光共振能量轉移技術(fluorescence resonance energy transfer,FRET)來對分子動力學(例如蛋白-蛋白相互作用、蛋白-DNA 相互作用、蛋白構象轉化等)進行定量。基於螢光共振能量轉移技術的高通量篩選檢測系統一般採用96孔板或384孔板標準。篩選本發明的抑制PC4蛋白活性的化合物用標記有螢光的兩親性螺旋(AH)結構域多肽作為能量供體，標記螢光的PC4蛋白作為能量受體。一旦PC4和兩親性螺旋結構域多肽形成複合體，即由於兩個分子之間的相互作用力使得供體和受體之間距離很近(距離約1 lOnm)，此時觀測到的主要是PC4的發射光，因為分子間的螢光共振能量從兩親性螺旋結構域多肽轉移到PC4蛋白。兩親性螺旋結構域多肽的激發光和PC4的發射光受到螢光密度讀板儀的監測。任何化合物的抑制PC4蛋白活性的作用都能通過監測所讀取的螢光密度的變化來測定。一般篩選兩類化合物1)小分子合成物；幻天然化合物。當然，這些化合物還需得到進一步證實，證明其能夠成為一種有潛力的治療依賴於PC4的惡性腫瘤的候選抗癌藥。本發明的診斷癌症或篩選抗癌藥物的方法是基於蛋白質或基於核酸的檢測方法， 這些方法都是本領域技術人員所熟知的常規方法。抗PC4抗體和抗拓撲異構酶I抗體都是一些熟知的且能在市場上買到的抗體。例如，與納米金粒子共價交聯的抗體，可以從 Bioassayfforks公司買到(Ijamsville，Maryland)，這種抗體能夠用來快速地定量地監測 PC4蛋白的水平或拓撲異構酶I的水平。同樣的，反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)能夠在RNA 水平監測PC4和拓撲異構酶I的活化水平。綜上所述，發明人發現了 PC4與癌症相關，開拓了抗癌研究新領域，且由此發明了一系列的癌症診斷方法與試劑(基於檢測PC4的表達水平)，以及治療和預防癌症的方法與藥物(基於抑制PC4的功能與表達)、篩選抗癌藥物的方法等。


圖1A、圖1B、圖IC提供了人PC4基因的序列信息；其中，圖IA提供了人PC4 cDNA 序列以及啟動子區域，啟動子區域標註了下劃線(參見GenBank序列號NM_006713)；圖IB 提供了人PC4編碼區的DNA序列；圖IC提供了人PC4蛋白(127個胺基酸)的胺基酸序列， 第77個胺基酸(F 苯丙氨酸，被標註了下劃線)位點若發生單個胺基酸突變，會使得PC4喪失與單鏈DNA結合的能
圖2示出了 PC4N-端區突變分析圖譜，所述N-端區包含基本區和第77個胺基酸； 其中，WT表示野生型，mt表示突變型，mt-1 7分別代表了本發明的7個不同的突變型PC4 蛋白；圖3A、圖3B、圖3C示出了 PC4突變體(mt_l 7)的功能分析圖譜；其中，圖3A示出了各種純化的重組PC4蛋白的檢測標準化；圖:3B示出了圖3A所檢測的各種蛋白的電泳遷移率變動分析(EMSA)實驗結果，即檢測各蛋白與dsRNA的結合活性)，圖中的PC4+DNA是指PC4與dsDNA的複合體；圖3C示出了圖3A所檢測的各種蛋白的體外轉錄檢測實驗結果， 其中pG5HM是依賴於PC4的轉錄模板，pML Δ 53是不依賴於PC4的轉錄模板；圖4Α、圖4Β、圖4C、圖4D、圖4Ε、圖4F示出了野生型PC4蛋白和各種突變型PC4蛋白的蛋白陣列分析結果；其中圖譜左側的5和40代表了兩個不同的蛋白濃度(單位pmol)， 圖4C示出了各蛋白與轉錄因子TFIIA(p55)之間的相互作用結果；圖4E示出了各蛋白與轉錄因子Spl之間的相互作用結果；圖4F示出了各蛋白與ssDNA之間的相互作用結果；圖4A 示出了麗春紅(Ponceau S)染色結果，該實驗是檢測各蛋白是否已成功轉到硝酸纖維膜上； 圖4B示出了抗-PC4抗體(anti-PC4)與各蛋白之間的相互作用結果，該實驗是為了檢測轉到膜上的各蛋白的量是否一致；圖4D是空白對照結果，檢測各蛋白與(^14(1-94)之間是否有非特異性結合；圖5A、圖5B、圖5C的結果說明了 PC4的表達水平與非洲爪蟾變態發育的關係； 每列凝膠條帶代表不同的變態發育階段；其中，圖5A和圖5B分別示出了 2 58和56 64各階段的PC4的表達水平，圖5A中「0」代表了卵母細胞(oocytes)，「E」代表了胚胎 (embryos)，PC4-P表示磷酸化的PC4蛋白(失活的)；圖5C示出了 PC4活化與非洲爪蟾分化發育的關係，其中示出了甲狀腺激素(T3和T4)的表達水平曲線和甲狀腺激素受體 (TRaand TR β)的表達水平曲線與PC4表達水平曲線作為對照；
圖6A是對照組(未轉染的HeLa細胞)螢光檢測結果；圖6B是轉染了野生型PC4 的HeLa細胞的螢光檢測結果，圖6C是轉染了絲氨酸區突變型PC4 (PC4- Δ S)的螢光檢測結果，闡明了當PC4被轉染到Hela細胞中時，PC4位於細胞核中且能導致染色體凝集和細胞死亡。圖7示出了 PC4 mRNA的檢測結果；所選擇的檢測樣品如下轉化細胞系(cos，HeLa and 293)、三個乳腺癌細胞系((MCF7，MD231 and MDA468)、原代細胞系(NIH3T3)、大鼠正常組織(腦m-brain和睪丸組織m-Testis)；圖7A表示各樣品中總RNA的豐度測量結果；圖 7B示出了 p52 mRNA的表達水平(即p52的表達譜)作為對照；圖7C示出了 PC4 mRNA的表達水平；圖8A和圖8B分別示出了各種腫瘤組織以及相應的正常組織中DNA拓撲異構酶I和PC4的蛋白印跡分析結果，其中，Kidn (腎組織)、Lung(肺組織)、Bladd(膀胱組織)、Colon (結腸組織)、Prost (前列腺組織)、Breast (乳腺組織)、Pancrs (胰腺組織)、 Endomt (子宮內膜組織)、Thyro (甲狀腺組織)、S-Bow (小腸組織)，N表示正常組織，T表示惡性組織(腫瘤)，PC4a表示具有活性的野生型，PC4b表示具有活性的亞野生型；圖9A和圖9B分別示出了檢測人體正常肺組織和肺癌組織中PC4表達水平的免疫組織化學分析結果；圖10示出了 PC4的多種功能；所有的這些功能尤其是標註下劃線的與癌症相關或者與癌症的發病機理相關，因此PC4可能會成為很多抗癌藥物的治療靶點。
具體實施例方式以下結合實施例和附圖來進一步闡述本發明。實施例1突變型PC4蛋白發明人通過製造一系列的單個胺基酸突變，定位了一些對PC4蛋白的活性來說是必不可少的重要胺基酸。由此，發明人篩選出可以作為PC4拮抗劑的7種突變型PC4 蛋白，如圖 2 所示圖譜，mt-1 (K23I/K29A)、mt_2 (K35I/K41A)、mt_3 (R27A/K28I/K29A)、 mt-4 (R47N/K35I/K41A)、mt_5(F77P)、mt_6(K29A)、mt_7 (K41A)。發明人還將上述7種突變型PC4蛋白進行了重組構建、表達、純化、鑑定，具體如下。突變體的重組構建方法將細菌表達載體中的PC4野生型區置換成包含有特定點突變的雙鏈寡聚核苷酸從而產生各種不同的突變構建體(包含有特定點突變的雙鏈寡聚核苷酸可以商業合成得到)。每個突變構建體都要進行測序分析且在E coli中表達後才能被確認。在Ecoli 中的表達PC4蛋白(包括野生型和突變型)可以通過如下的2步純化法得到第一步P11 磷酸纖維素離子交換層析；第二步肝素親和層析。純化後蛋白的濃度可以通過Bradford 方法測定，純度可以通過聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定。純化後的PC4蛋白(WT， mt-1 7)上SDS-PAGE，電泳結果如圖3A所示。採用以下方法檢測純化後PC4蛋白的活性1)電泳遷移率變動分析實驗(結果見圖:3B) ；2)體外轉錄檢測實驗(結果見圖3C) ；3)蛋白陣列分析(結果見圖4)，這三種方法具體操作如下1)採用電泳遷移率變動分析法(Electrophoresis mobility shift assay,EMSA) 檢測PC4蛋白綁定dsDNA的能力EMSA的操作如下配置20ul反應體系(其中包含有IOng已純化的各種PC4蛋白樣品)和標記有32P的長度為64bp的dsDNA探針(來源於腺病毒主要晚期啟動子區)，將兩者混合後所得的反應混合物置於4°C溫育1小時後，上8%聚丙烯醯胺凝膠電泳，通過放射自顯影可以檢測到移動的PC4-dsDNA複合體。如圖:3B所示，mt-l、mt-2、mt-3、mt-5都喪失了與dsDNA綁定的能力。2)體外轉錄檢測實驗利用從HeLa細胞或從一個重組體系中純化的通用轉錄因子，如TFIIA，TFIIB， TFIID，TFIIF，TFIIH，RNA聚合酶II等來在體外重建轉錄檢測實驗。這個體外轉錄體系的激活依賴於PC4和其他激活子(參見Ge等，1996)。除了上述的這些通用轉錄因子，該轉錄體系還包含一個響應激活子的模板(PG5HM是依賴於PC4的轉錄模板)、一個不依賴於激活子的基本模板(PML Δ 53是不依賴於PC4的轉錄模板)和32P_CTP。該轉錄體系中30°C溫育 1小時後，萃取新合成的RNAs，將其進行SDS-PAGE分析，再放射自顯影。結果如圖3C所示， mt-1、mt-2、mt-3、mt-5基本喪失了 PC4蛋白作為轉錄輔激活子的功能。3)蛋白陣列分析實驗蛋白陣列分析實驗是基於「通用蛋白陣列」(也稱UPA)的方法(參見文獻Ge 2000)。將大量已純化的蛋白在按一定排列規律固定在硝酸纖維膜上，形成密集的點陣列， 每點直徑約1mm，包含有10 IOOng的蛋白(取決於蛋白的大小)。與點陣列上的PC4蛋白發生相互作用的靶蛋白能夠利用特異抗體(例如抗轉錄因子TFIIA、Gal4、Spl的抗體) 檢測出來，結果圖4C、圖4D、圖4E。若檢測蛋白與DNA的相互作用，利用放射自顯影技術監測標記有32P-ClCTP的探針 DNA和已被綁定的DNA。結果如圖4F所示。由圖4可以看出，第77位點的苯丙氨酸對於PC4結合SSDNA來說是必不可少的。 另外，F77P突變型PC4與轉錄因子TFIIA和Spl的相互作用顯著增強。綜上所述，除了第77個位點發生了單個胺基酸突變(F77P)的PC4喪失了結合DNA 的能力和轉錄活性，上述結果證明在N-端基本區發生雙重突變(K23I/K29A和K35I/K41A) 和三重突變(R27A/K28I/I^9A)的PC4蛋白的活性也大大降低了，因此PC4突變體F77P、 K231/K29A,K351/K41A,R27A/K281/K29A能用作抗癌藥物，通過與內源的野生型PC4競爭來達到治療依賴於PC4的癌症的效果。實施例2與PC4的激活結構域的胺基酸序列同源的短多肽發明人設計合成了兩種多肽，它們的序列分別與兩個PC4激活結構域胺基酸序列一致，經發明人通過上述的蛋白陣列分析(蛋白-蛋白之間相互作用檢測實驗)和體外轉錄檢測實驗證明了這兩種多肽能與野生型PC4競爭結合其他激活子，從而達到抑制PC4活性的作用。PC4-AD15，序歹Ij KRKKQVAPEKPVKKQ，見 SEQ ID No. 1 ；以及相應的連接有遷移結構域的短多肽，如TLD-AD15，序列PLSSIFSRIGDPKRKKQVAPEKPVKKQ,見 SEQ ID No. 2 ；PC4-S15，序歹Ij DSDSEVDKKLKRKKQ,見 SEQ ID No. 3 ；以及相應的連接有遷移結構域的短多肽，如TLD-S15，序列 PLSSIFSRI⑶PDSDSEVDKKLKRKKQ,見 SEQ ID No. 4。實施例3與PC4結合的模擬激活結構域多肽兩親性螺旋多肽(序列為ELQELQELQALLQQQ，見SEQ ID No.幻能夠模擬一種激活結構域與PC4發生強相互作用，封閉了 PC4的激活結構域，抑制PC4與內源激活子相互作用，從而抑制PC4活性；以及相應的連接有遷移結構域的短多肽，如TLD-AH15，序列 PLSSIFSRIGDPELQELQELQALLQQQ,見 SEQ ID No. 6。實施例4利用基於螢光共振能量轉移技術的高通量篩選檢測系統篩選抑制PC4蛋白活性的化合物。篩選本發明的抑制PC4蛋白活性的化合物用標記有螢光的兩親性螺旋(AH)結構域多肽作為能量供體，標記螢光的PC4蛋白作為能量受體。一旦PC4和兩親性螺旋結構域多肽形成複合體，即由於兩個分子之間的相互作用力使得供體和受體之間距離很近(距離約1 lOnm)，此時觀測到的主要是PC4的發射光，因為分子間的螢光共振能量從兩親性螺旋結構域多肽轉移到PC4蛋白。兩親性螺旋結構域多肽的激發光和PC4的發射光受到螢光密度讀板儀的監測。任何化合物的抑制PC4蛋白活性的作用都能通過監測所讀取的螢光密度的變化來測定。一般篩選兩類化合物1)小分子合成物；幻天然化合物。當然，這些化合物還需得到進一步證實，證明其能夠成為一種有潛力的治療依賴於PC4的惡性腫瘤的候選抗癌藥。小分子合成物包括商業上可合成得到的和一些科研機構內部研發出來的。將入選的化合物保存在96孔板或384孔板中，並建立一個它們的詳細資料庫。反應板上的每個孔都有10 50ul包含濃度為ImM的待檢測化合物(384孔板用IOul，96孔板用50ul)反應混合物，且反應混合物中還包含了標記有螢光的PC4蛋白和兩親性螺旋結構域多肽。每個板上都有4個陽性對照孔(用濃度為IOmM未標記的兩親性螺旋結構域多肽替代標記了螢光的)和4個陰性對照(用水來替代螢光標記的作為能量供體的兩親性螺旋結構域多肽)。 用螢光密度讀板儀(Molecular Dynamics公司生產的)讀取0D535的光密度值。篩選出來的陽性分子的抗癌效果需採用不同的檢測方法來進一步證實，所述的不同的檢測方法包括體外蛋白-蛋白相互作用檢測、轉錄檢測以及臨床試驗前採用細胞模型和動物模型進行的藥效檢測。大部分的處方藥都是天然化合物，市面上可以買到的50%以上的抗癌藥和抗感染藥都源於天然產物。為鑑定天然化合物能否抑制PC4蛋白的活性，可以選取一些來源於土壤微生物、 海洋微生物、植物或其他自然界物質的化合物，利用基於螢光共振能量轉移技術的高通量系統對它們篩選檢測。篩選出來的原材料可以再進一步純化、鑑定、且在一些上述的不同的檢測系統中再進一步確認。上述的發明內容和實施例只為闡明本發明的發明構思和要點，不能以此來限制本發明的保護範圍。凡根據本發明的實施例以及結合本發明的精神實質所作的等效變化或修飾，這些都是本領域技術人員能夠想到的，都應涵蓋在本發明的保護範圍內。再者，這裡所有引用的教材或其他文獻出版物等都已在文中相應位置標註。參考文獻1. 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權利要求
1.一種篩選治療或預防癌症的藥物的方法，所述的藥物包含了有效劑量的PC4拮抗劑，其特徵在於所述的PC4拮抗劑為已修飾或無功能PC4多肽或蛋白，該方法包含以下兩個依次發生的步驟(1)提供一種檢測PC4蛋白的轉錄水平的試驗；(2)向上述的試驗中加入候選藥物，其中，降低PC4轉錄水平的候選藥物為治療或預防癌症的藥物。
2.根據權利要求1所述的篩選治療或預防癌症的藥物的方法，其特徵在於所述的已修飾或無功能PC4蛋白為突變型PC4蛋白。
3.根據權利要求2所述的篩選治療或預防癌症的藥物的方法，其特徵在於所述的突變型 PC4 蛋白為 F77P、K23I/K29A, K35I/K41A、R27A/K28I/K29A 突變型 PC4 蛋白。
4.根據權利要求1或2或3所述的篩選治療或預防癌症的藥物的方法，其特徵在於 所述的已修飾或無功能PC4蛋白為磷酸化的PC4蛋白。
5.根據權利要求1所述的篩選治療或預防癌症的藥物的方法，其特徵在於所述的已修飾或無功能PC4多肽為與PC4激活結構域的胺基酸序列同源的短多肽。
6.根據權利要求1所述的篩選治療或預防癌症的藥物的方法，其特徵在於所述的已修飾或無功能PC4多肽為與PC4結合的模擬激活結構域多肽。
7.根據權利要求1、2、5或6所述的篩選治療或預防癌症的藥物的方法，其特徵在於 所述的PC4拮抗劑為連接有遷移結構域多肽的多肽或蛋白類PC4拮抗劑。
8.根據權利要求7所述的篩選治療或預防癌症的藥物的方法，其特徵在於所述的遷移結構域多肽序列如SEQ ID No. 7所示。
9.根據權利要求8所述的篩選治療或預防癌症的藥物的方法，其特徵在於所述的多肽類PC4拮抗劑的胺基酸序列如SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示。
全文摘要
本發明涉及一種篩選治療或預防癌症的藥物的方法，所述的藥物包含了有效劑量的PC4拮抗劑，所述的PC4拮抗劑為已修飾或無功能PC4多肽或蛋白，該方法包含以下兩個依次發生的步驟(1)提供一種檢測PC4蛋白的轉錄水平的試驗；(2)向上述的試驗中加入候選藥物，其中，降低PC4轉錄水平的候選藥物為治療或預防癌症的藥物。本發明篩選的藥物可通過抑制PC4的表達水平或功能來達到治療或預防癌症的目的。
文檔編號G01N33/68GK102323247SQ201110233910
公開日2012年1月18日 申請日期2008年9月7日 優先權日2008年9月7日
發明者葛輝 申請人:蘇州愛生基因有限公司