得到經過修飾降低了鼠抗體可變區之免疫原性的免疫球蛋白的方法及含有免疫球蛋白的...的製作方法

2023-10-25 21:41:12 3

專利名稱：得到經過修飾降低了鼠抗體可變區之免疫原性的免疫球蛋白的方法及含有免疫球蛋白的 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學領域，特別是涉及得到經過修飾降低了鼠抗體可變區之免疫原性的免疫球蛋白的方法及含有這些免疫球蛋白的組合物。
免疫系統產生以高親和力和特異性與很大範圍的抗原結合併激發效應細胞機制的抗體。醫學中已將抗體用作診斷和治療劑，並且隨著新技術的出現而成功地提高了它們的應用潛力。
雜交瘤技術的應用得以分離產生單一特異性抗體的細胞系(Koehler G.，Milstein C.(1975)，Natare(London)256，495—497)，並且基因技術允許自雜交瘤構建一系列工程化抗體。
抗體的區域結構有利於對抗體進行工程化改造，並且通過得到或丟失其某些性質而進一步改善許多抗體的實用性。抗體的抗原結構特性提供了識別功能，並可將其連接到一種或多種效應劑上。然後則必須基於效力、特異性和免疫原性標準來檢驗抗體是否同時具有這兩種性質。
已很容易從被免疫的齧齒動物得到產生單克隆抗體的雜交瘤。目前已將幾種鼠單克隆抗體廣泛用於惡性腫瘤的影像診斷和治療、抗中毒性休克預防給藥、修飾移植物排斥部分，以及緩解急性炎症反應。在使用齧齒動物抗體進行治療的大多數病例中，接受者體內都引發了針對抗體的免疫反應。這些反應已限制了治療期限和效果。
雖然存在幾種選擇，例如使用SCID—hu小鼠、體外免疫、重組的文庫，或這些方法的某些有用結合，但因為有許多已明確鑑定的齧齒動物單克隆抗體已可以得到(如果能夠排除免疫反應，即可將其用於臨床)，所以開發人來源的相似製劑的努力已受到挫拆，而生產工程化改造的抗體則引起了很大關注。
已設計了工程化抗體，以儘可能地用等同的人序列取代外源序列。在基團工程化抗體中，大都是將來自不同種的免疫球蛋白的片段連接在一起的嵌合抗體。
首先，構建了包含與人恆定區融合之齧齒動物可變區的嵌合抗體。特別是小鼠/人嵌合抗體因表現出同樣的特異性，但與其小鼠對應物相比又降低了免疫原性，故可用於免疫治療。下列參考文獻描述了嵌合抗體技術Lobuglio et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864220—4224(1989)；美國專利4,816,567；PCT國際公開WO 87/02671(1987年5月7日)；歐洲專利公開255,694(1988，2，10)；歐洲專利公開274,394(1988年7月13日)；歐洲專利公開323,806(1989年7月12日)；PCT國際專利公開WO89/00999(1989年2月9日)；歐洲專利公開327,000(1989年8月9日)；歐洲專利公開328,404(1989年8月16日)和歐洲專利公開332,424(1989年9月12日)。
值得注意的是，用人等同物取代恆定區也可能不降低它們的免疫原性，而仍有大約一半的接受者產生了對齧齒動物可變區的免疫反應。因此，已廣泛地操作齧齒動物抗體，以使之更加相似於人抗體。
已實現的進一步降低嵌合抗體之免疫原性的方法是，首先只將齧齒動物單克隆抗體的CDR(互補決定區)移植到人框架區上，然後再與適當的恆定區融合(Jones et al.，Nature 321522—525(1986))。這樣完成CDR移植的方法常常產生不完善的人抗體，即是說所得到的抗體失去了親和性，或者在保留其原有親和性的嘗試中，許多鼠框架殘基已取代了相應的被選擇之人框架的殘基(Winter，歐洲專利申請，239,400；Riechmann，et al.，Nature332323—327(1988))。
就鑑定用於轉移的最小數目的殘基，以達到對免疫原性有最小潛在影響的有用結合親和性這一目的來說，已經發展了許多戰略，但從所顯示的結果看，每個戰略都只在重建親本親和性中取得一定程度上的成功。
雖然也已發現某些鄰近框架殘基參予抗原結合，但主要還是根據CDR的結構和相對變位來確定抗體結合位點的配基結合特性(Davies et al.，Ann.Rev.Biochem.59439—473(1990))。因此，如果能夠嚴格地保留其CDR結構及某些鄰近殘基、它們彼此間的相互作用，以及它們與可變區的相互反應，便可以維持抗體的精確特異性。
Padlan(Padlan，歐洲專利申請0519596A1；Padlan，Molecular Immunology 28489—498(1991))提出了抗體人源化的進一步方法，該方法是基於蛋白質的抗原性取決於其表面的性質，並且其中在齧齒動物可變區中許多可接近溶劑的殘基被人抗體的殘基所取代這一事實。通過觀察人抗體KOL和鼠抗體J539的高解析度X射線結構來鑑定這些殘基的定位。通過鑑定最大同源性抗體群實現對人表面殘基的選擇。
蛋白質表面的性質對於其被抗原加工細胞，特別是抗原特異性B細胞識別和在這些細胞中內在化都是很重要的，由T細胞識別特定線性結構對於蛋白質的免疫原性也是很重要的。
已建立了幾組鑑定在輔助T細胞抗原肽的MHC限制中起作用的序列特徵和結構性決定基的計算機自動分析方法(Berssofskyetal.，The Journal of Immunology 1382213—2229(1987)；Elliott et al，J.Immunol.1382949—2952(1987)；Reyeset al，The Journal of Biological Chemistry 26412854—12858(1989))。使用這些計算方法有可能鑑定推測的T細胞提呈肽。
分析已知原子結構的抗體已闡明了抗體結合位點的序列與三維結構的關係(Chothia et al.，J.Biol.Chem.196901—917(1987))。這種關係揭示，在VH區中除第三區域外，結合位點環還具有小數目的主鏈構象之一，即「典型結構」(「CanonicalStructures」)。在特定環中形成的典型結構是根據其大小和在環與骨架區中的關鍵位點上存在某些殘基而確定的。
已將一個附加的骨架殘基亞組定義為「遊標」帶，其可能調整CDR結構並精調與抗原的配合性(Foot et al.，J.Mol.Biol.224487—499(1992))。取代這些殘基已顯示對於恢復CDR移動抗體的親和性是很重要的。因此遊標帶對於設計人源化抗體有著明顯的意義。
因此，本發明的目的是提供將一種哺乳動物的單克隆抗體轉化為另一個種的單克隆抗體的方法。另一個目的是推測可變區序列上的潛在的T抗原決定基。另一個目的是鑑定負責T免疫原性的單克隆抗體序列上，負責種特異性或免疫原性的胺基酸殘基。再一個目的是用第二個種的T抗原決定基序列上的胺基酸殘基取代第一個種的T抗原決定基序列上的胺基酸殘基，從而使第一個種的抗體在第二個種中不再有免疫原性。再一個目的只在重和輕鏈的框架區中而不在互補決定區中造成取代，屬於遊標帶的胺基酸和參予典型結構的胺基酸可不被取代。本發明的再一個目的是提供摻入取代胺基酸殘基的新的DNA序列。再一個目的是提供含有改變了抗體之DNA序列的載體。再一個目的是用含有被修飾的抗體之DNA序列的載體轉化的真核或原核宿主細胞。
公開了一種鑑定和取代T細胞抗原序列的獨特方法，該方法將第一種哺乳動物的免疫球蛋白抗原性轉變為第二種哺乳動物的免疫球蛋白抗原性。該方法將同時改變免疫原性並嚴格保留配基結合性質。審慎地取代可變區的T細胞抗原序列上的那些與三維結構未牽連的胺基酸殘基，沒有影響配基結合性質但大大改變了免疫原性。


圖1推測的IOR egf—IOR EGF—R3單克隆抗體之可變區的胺基酸序列。
(a)可變區κ輕鏈。
(b)可變區重輕鏈。
互補決定區已被劃下線並用粗體鉛字表示。
圖2和3對抗體IOR egf—R3重鏈和輕鏈可變區所作修飾的分析。
A鼠IOR egf—R3單克隆抗體可變區的序列。
B最同源的人免疫球蛋白之可變區的序列。
C經修飾的IOR egf—R3可變區的序列。
陰影部分推測的T細胞抗原序列。
加下線的胺基酸殘基參予三級結構的胺基酸。
粗體鉛字互補決定區。
方框中的胺基酸殘基提議的取代。
對於重鏈和輕鏈的描述同上。
圖4mAB IOR egf—R3可變區的分子模型。
以直方圖展示分子模型，其中VH在右邊並且比VL暗。該模型顯示了鼠殘基的側鏈，這些殘基經過突變以使預測的兩親和性片段人源化。
圖5通過RRA檢測嵌合和突變IOR egf—R3與EGF—R的結合。
以不同濃度的純化的鼠IOR egf—R3(—■—)、嵌合IOR egf—R3(+)和突變VHR3/muR3VK(—*—)進行抗原結合活性檢測，並將結合的125I—EGF的CPM數對各抗體濃度的對數作圖(以ELISA法定量IgG的濃度)。
圖6用鼠IOR egf—R3、嵌合IOR egf—R3和突變體IOREGF—R3免疫猴。
縱座標405nm吸光率。
橫座標採血的天數。
ELISA按實施例9所述步驟進行。
箭頭指示每種MAb各注射2mg的間隔時間。
使用的血清稀釋度為1/10,000。
圖7和8對抗體IOR—T1的重鏈和輕鏈可變區所作修飾的分析。
A鼠IOR—T1單克隆抗體可變區的序列。
B最同源的人免疫球蛋白可變區的序列。
C經修飾的IOR—T1抗體可變區的序列。
各標號的意義同圖2。
對重鏈和輕鏈的描述同上。
圖9和10對抗體IOR—CEA1重鏈和輕鏈可變區所作修飾的分析。
A鼠IOR—CEA1單克隆抗體可變區的序列。
B最同源的人免疫球蛋白可變區的序列。
C經修飾的IOR—CEA1抗體可變區的序列。
各標號的意義同圖2。
對重鏈和輕鏈的描述同上。
本發明涉及降低齧齒動物單克隆抗體的免疫原性，同時又在整體上保留其配基結合特性的方法。因為免疫球蛋白的抗原性取決於其序列上T細胞抗原肽的存在，故可經取代包括不同於通常見於另一種哺乳動物抗體中的T細胞抗原序列上的殘基，來降低異種或同種異體抗體的免疫原性。
殘基的取代並不包括參予到典型結構或遊標帶(VernierZone)中的殘基。這種殘基的適宜取代沒有影響結構決定基或區域內接觸，因此，配基結合性質沒有因只限於可變區框架殘基的改變而受到影響。
(1)可變區同源性的分析本方法中使用了由Kabat等人(「Sequence of ProteinsofImmunological Interest」Fifth edition Bethesda，Maryland；National Inst.of Health，1994)收集的人抗體可變區的序列資料。
第一步驟中，將第一種動物即小鼠的重或輕鏈可變區與第二種動物即人的相應可變區進行比較。預定本發明將允許對任何種動物的抗體進行抗原改變。
藉助自動化計算機分析方法(PC—DOS HIBIO PROSIS 06—00，Hitachi)進行比較。然後將最同源的人可變區殘基與相應的小鼠可變區殘基相比較。如此也將確定與各小鼠序列更加相類似的人可變區亞組。
(2)T—抗原決定基的預測第二步驟中，分析小鼠和人的兩同源可變區序列，以便預測T抗原序列。
AMPHI計算程序(Bersofsky el al.，The JournalofImmunology 1382213—2229，(1987))用於預測a螺旋序列。SOHHA計算程序則推測螺旋疏水性的條帶(Elliott et al，J.Immunol.1382949—2952，(1987))。這些計算程序可預測抗原蛋白質的T細胞提呈片段。
(3)對免疫原性降低的分析用人對應物中存在的殘基取代小鼠框架中不同於其人對應物的那些殘基。發生這種變換隻是涉及那些存在於T抗原序列上的殘基。
最後，取代負責典型結構的那些殘基或捲入遊標帶中的那些殘基可能對三級結構有重要影響。因此，它們不能被包括在該取代中。有關所提議的取代對三級結構或結合位點的影響的附加信息，可從可變區的分子模型中獲得。
在運行UNIX和利用分子模型包「QUANTA」(Polygen corp)的Silicon Graphics Iris 4D工作站構建所說的分子模型。
(4)構建和表達被改變之抗體的方法使用下述方法製備將第一種哺乳動物，小鼠mAb輕和重鏈的CDR摻入第二種哺乳動物人中的重組DNA序列，呈現可用於轉染哺乳動物細胞的框架，以表達有較小免疫原性並有該動物單克隆抗體之抗原特異性的重組抗體。
本發明進一步包括構建和表達經修飾的抗體的方法，該方法包括a)誘變並組裝包括CDR和FR區域的可變區。較好地使用PGR誘變方法(Kamman et al.，Nucleic Acids Res，175404—5409，(1989))以在不同的位置引入改變。
b)製備包括一個可變區和相應的人恆定區的表達載體，在將其轉染到細胞中後即導致分泌足可供親和性和特異性檢測的蛋白質。
c)將重和輕鍊表達載體共轉染到適當的細胞系中。約兩周後，用ELISA方法分析細胞上清液中有無人IgG產生。然後用任何已知方法分析樣品中能夠與特異性抗原結合的人IgG。
本發明提供了將動物單克隆抗體的CDR摻入似乎為天然人免疫球蛋白的框架中，從而使所得重組抗體在用於人時只有微弱免疫原性或無免疫原性的方法。當用於治療目的時，重組體免疫球蛋白被較好識別為自身蛋白質。因為重組體抗體在給人使用時將是有微弱免疫原性的或無免疫原性的，所以該方法可使重組抗體作為治療劑使用。
本發明還期望包括任何動物單克隆抗體向提供適當框架區之顯現重組人的單克隆抗體的重組轉化。
本發明意欲包括任何動物免疫球蛋白向顯現人的免疫球蛋白的轉化。另外還試圖使顯現人的免疫球蛋白不合有κ或λ輕鏈，或者下列任何重鏈異型(α、σ、ε、γ和μ)之一。
下列實施例旨在舉例說明本發明，而不是限制本發明的範圍。
實施例1測得的IOR egf—R3單克隆抗體DNA序列的鼠可變區按Faloro等人(Faloro，J.et al.，Methods in Enzymology65718—749(1989))所述方法從大約106個R3(抗表皮生長因子受體)雜交瘤細胞中提取胞漿RNA。
cDNA合成反應混合物由5μgRNA、50mM TrisHCl pH7.5、75mMKCl、10mMDTT、3mMMCl2、25pmol重鏈可變區的CG2AFOR引物(5′GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG3′)或輕鏈可變區的CK2FOR引物(5′GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3′)、各250μM dATP、dTTP、dCTP、dGTP、15U核糖核酸酶抑制劑(RNA保護劑，Pharmacia)組成，總體積50μl。樣品於70℃加熱10分鐘並經30分鐘緩慢冷卻至37℃。然後加入100單位MMLV反轉錄酶(BRL)並於37℃持續保溫1小時。
使用Orlandi等人(Orlandi，R.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833—3837(1989))所述PCR擴增VH和VKcDNA。用於VH的PCR擴增，DNA/引物混合物由5μl cDNA、25pmoles CG2A FOR (5′GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG 3′)和VH1BACK引物(5′AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG3′組成。用VK的PCR擴增，DNA/引物混合物由5μl cDNA、25pmoles CK2 FOR (5』GGAAGCTTGAAGATGGATA C AGTTGGTGCAGC3』)和KIOBACK(5』TTGAATTCCAGTGATGTTTTGATGACCCA3』)引物組成。向這些混合物中加入各2.5mM dATP、dCTP、dTTP和dGTP、5μl 10X嗜熱酶(thermolase)緩衝液成分和1單位嗜熱酶(IBI)，終體積為50μl。樣品在94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分鐘進行25次熱循環，並於72℃持續保溫5分鐘。在Prep.A Gene純化藥盒(BioRad)上純化擴增的VH和VK DNA。
將純化的VH和VK cDNA克隆到M13載體中。使用T7DNA Pol(Pharmacia)經二脫氧方法測定克隆的序列。結果見圖1。
實施例2嵌合基因的構建我們使用擴增VH的VH1 BACK(5′AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG3′)和VH1FOR(5′TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG 3′)引物，和用於擴增VK的VK3 BACK(5′GACATTCAGCTGACCCA3′)與VK3FOR(5′GTTAGATCTCCAGTTTGGTGCT3′)引物，經PCR再次擴增cDNA。用Pst I和BstEII消化VH基因的擴增的cDNA，或用PvuII和Bg1II消化VK基因的擴增的cDNA。將消化的片段克隆到M13—VHPCR1(用PstI和BstEII消化過的)中或M13—VKPCR1(用PvuII和Bc1I消化過的)中。有關這些載體詳見Orlandi等人的報導(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833—3837(1989))。經序列分析直接鑑定含有可變區基因的M13VHPCR—R3和M13VKPCR—R3。
經用HindIII和BamHI消化，從M13載體上切掉VH基因連同Ig重鏈啟動子、適用的切接位點及信號肽序列，並克隆到表達載體(pSVgpt)中。然後加進作為BamH I片段的人IgG1恆定區(Takahashi，N.et al.，Cell 29718—749(1982)。所得到的構建體是R3VH—pSVgpt。R3VK—pSVhyg的構建方法基本相同，不同的是用潮黴素抗性基因取代gpt基因，並加入人κ鏈恆定區(Hieter，P.A.et al.，Cell 22197—207(1980))。
實施例3修飾IOR egf—R3鼠單克隆抗體的可變區序列以使預測的T細胞抗原序列人源化。
根據T細胞抗原序列分析IOR egf—R3之重和輕鏈的可變區序列。使用計算機AMPHI計算程序進行分析，推測帶有兩親性螺旋結構的長度中序列11胺基酸的片段，該片段有一個疏水側和一個與MHCII分子結合的親水側。
推測重鏈可變區序列上有5個片段，它們是(使用Kabat的序列編號)1.胺基酸3—13間的FR1，
2.胺基酸8—20間的FR1，3.胺基酸39—55之間的FR2和CDR2，4.胺基酸74—84間的FR3，5.胺基酸100c—110之間的FR4和CDR3。
圖2顯示相當於重鏈的序列。
將該鼠序列與包括在GeneBank和EMBL資料庫中的免疫球蛋白序列相比較。確定最同源的人可變區序列並限定與小鼠序列最密切相似的人亞類序列。在這種情況下所發現的人序列是稱為HUMIGHVA的胎兒免疫球蛋白，其可變區與鼠免疫球蛋白IORegf—R3的FR區有75％的同源性。
然後比較人和鼠可變區序列的殘基，並選擇出那些在FR區不參予遊標帶或與典型結構相關的殘基。因此，它們可以被在人序列上同一位置的那些殘基所改變。
最後，該分析用結合位點的計算機模型設計而得以充實。基於該分子模型有可能限定那些擾亂結合位點之三級結構的取代。
對於鼠IOR egf—R3的重鏈，我們提出6處取代1.11位上的LEU被VAL取代，2.12位上的VAL被LYS取代，只有這兩處取代有可能破壞兩親性螺旋，因此推測的T抗原決定基在FR1處。
3.75位上的SER被THR取代，4.76位上的THR被SER取代，5.78位上的ALA被VAL取代，6.83位上的THR被ARG取代。
在這種情況下，取代提示在FR3中，其為人源化的。
FR2中的T細胞抗原序列包含兩個PRO，而它們在大多數螺旋抗原位點中是很罕見的胺基酸殘基，所以我們認為它不是真正的T細胞抗原決定基。
在FR4的108位中出現存在於某些人免疫球蛋白同一位置上的THR，在人免疫球蛋白中只有109位(LEU)是很罕見的，除了這一個點差異處，大多數推測的T細胞抗原決定基是人的，基於此不需要對其進行修飾。
圖3中顯示對鼠IOR egf—R3之輕鏈的分析結果。此序列中，推測相應於CDR2和FR3的殘基52—63之間只有一個兩親性螺旋，並在這個區域中，鼠和人序列間在63位只有一個點差異。因為該鼠輕鏈對人應是非免疫原性的，故沒有提出取代(見分子模型設計)。
實施例4mAb IORegf—R3 VK和VH的分子模型設計使用在150MHz Silicon Graphics Indigo Extreme工作站上運行的分子模型設計程序QUANTA/CHARm4.0(MolecularSimulations Inc.，(1994))，組構小鼠mAb IOR egf—R3可變區的模型。分別從Fab 26—10(Jeffrey，P.D.et al.，Proc Natl，Acad，Sci.USA，9010310(1993))和Fab36—71(Strong，R.K. et al.，Biochemistry 303739(1993))組構VK和VH框架。Fab 26—1O和mAb IOR egf—R3在VK框架中有92％同源性，在完整VK區中有88％同源性。Fab 36—71和R3 mAb的VH框架有85％同源性。從Brookhaven Protein Data Bank(入口II G1和6FAB)取得等同物(Coordinates)。將Fab 36—70的框架對接於Fab 26—10的架上，結果只有那些已發現常常捲入重和輕鏈可變區間界面中的殘基相匹配(Chotia，C et al.，J.Mol.Biol.186651(1985))。然後，刪除Fab 26—10的VH區和Fab 36—71的VK區以留下必須的雜合體。按最大交迭方法(Snow，M.E.et al.，Proteins 1；267(1986))進行側鏈取代，並且在可能時與其他結晶結構相比較。
構成IOR egf—R3—可變輕(VL)區(L1，L2和L3)的高可變區而保留如Fab 26—10中一樣的主鏈構象，因兩種抗體中相應的CDR是高度同源的，並且都屬於同一典型結構組群(Chotia，C.etal，Nature.342877(1989))。在mAb IOR egf—R3的VH區中，CDRH1同在Fab 36—71中一樣屬於典型結構組群1，所以保持了親代分子的主鏈扭轉角。CDR H2相當於典型結構組群2並且該環的主鏈構象是從Fv片段4D5(入口IFVC)取得的，因為其H2環基礎與Fab 36—71的框架能良好匹配，所以它是從其他高分辨的結構中選擇的。將所有上文提到的環與Data Bank中的其他CDR比較，以確定側鏈的方向。
為了構建在mAb R3中有14胺基酸長的CDR H3模型，使用高溫度分子動力學進行構象選擇(Bruccoler，R.E.et al.，Biopolymers，291847(1990))。首先，對沒有CDR H3的整個結構進行能量最小化處理以保持被固定的殘基H—94和H—103，並對主鏈原子使用10Kcal/(mole原子A2)的諧振抑制。然後，從兩個原先固定的胺基酸開始構成一個有隨機構象的環。放置這些靠近框架的殘基時考慮到其他晶體結構，並且構成有伸展構象的環的頂部，以避免與分子其他部分的強的空間作用。對於下一個模型設計步驟，只允許CDR H3和鄰近側鏈在5A°的距離內運動。首先完成能量最小化，然後在800K進行分子動力學運行150微微秒。運行的時間間隔定為0.001微微秒，並且每100次間隔存貯協調數據。提取從動力學運行中得到的120個最低能量構象，並使之受到使結構中所有原子均可運動的能量最小化限制。得到幾個低能量構象並將其中一個有最低能量者用於繼後的分析。就IOR egf—R3抗體的鼠和人變異體間的差異個別設計模型，以研究它們對CDR構象可能產生的影響。
重鏈可變區中11，12(FR1)和83(FR3)位的胺基酸取代距CDR—FR邊緣足夠遠，並且對結合親和性不應有任何影響。SER75殘基指向外側，因些被THR取代對結合能力似乎並不重要。相反THR76則易受分子頂部的影響，並且可能參予與抗原的相互作用。但是由SER取代THR 76是一個保守的改變，在結合親和性上可能不會導致大的變化。
由VAL取代ALA 78將不需要空間重排。但VAL 78可能向前「推動」ILE 34(HI)。一般說來，根據計算機輔助的分子模型設計研究(圖4)，所提出的點突變不應影響結合親和性。
對IOR EGF—R3的輕鏈可變區作同樣分析，分子模型設計表明於該區域的任何改變都是不必要的。
實施例5用PCR誘變法構建IOR egf—R3的突變體重鏈可變區使用PCR誘變技術(Kammann，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，864220—4224(1989))構成突變重鏈可變區胺基酸的改變。
簡單地說，經PCR進行兩次擴增反應混合物是0.5μl在M13中克隆的單股DNA的VH上清液、25pmole誘變的Oligo 1或2、25pmole誘變的Oligo 3或4引物(見下示引物序列)。向這些混合物中加入各2.5mM dATP、dCTP、dTTP和dGTP、5μl 10XVent聚合酶緩衝液(NEB)的成分及1單位Vent DNA聚合酶(NEB)，終體積為50μl。樣品於94℃，30秒；50℃，30秒；75℃，1分鐘進行12—15次熱循環；並於75℃持續保溫5分鐘。將兩次PCR的產物連接到第二個只使用外部引物(3和4)的PCR產物中。用Prep.A Gene純化試劑盒(BioRad)純化擴增的VH DNA。
為造成FR1中由VAL和LYS分別取代LEU11和VAL12的改變，所用引物是引物15′GAAGCCCCAGGCTTCTTCACTTCAGCCCCAGGCTG 3′引物35′GTAAAACGACGGCCAGT 3′這些引物合用於一個PCR中。引物25′CAGCCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCA 3′引物45′ACTGGCCGTCGTTTTAC 3′。這些引物合用在一個PCR中。
然後，兩PCR的產物合用在一個使用引物3和4的PCR中。
為造成FR3中分別由THR、SER、VAL和ARG取代SER75，THR76、VAL78和THR86的改變，所設計的引物是引物15′GCAGAGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTGAGTTGCATGTAGACTGTGCTGGTGGATTCGTCTACCGT 3′，引物35′GTAAAACGACGGCCAGT 3′。這些引物合用在一個PCR中。引物25′ACGGTAGACGAATCCACCAGCACAGTCTACATGCAACTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACTCTGC3′引物45′ACTGGCCGTCGTTTTAC 3′。這些引物合用在一個PCR中。
然後，將兩PCR的產物合併在一個使用引物3和4的PCR中。
誘變後，將VH基因克隆到表達載體(pSVgpt)中產生質粒IORegf—R3 mut VH—pSVgpt。
實施例6將DNA轉染到NSO細胞中用Pvu I消化後，將4μg R3VH—pSVgpt和8μg R3VK—pSVhyg(嵌合體)或R3突變體VH—pSVgpt和鼠R3Vk—pSVhyg切成線性。將DNA混合在一起，用乙醇沉澱，溶解於25μl水中。使約107個NSO細胞(大鼠骨髓瘤NSO是不分泌Ig的細胞系)生長至半會合，離心收穫細胞並連同經消化的DNA一起重新懸浮在電穿孔容器內的0.5ml DMEN中。在冰上放置5分鐘後，在960μF下給細胞170V的單一脈衝(Gene—Pulser，Bio—Kad)，並繼續在冰上放置30分鐘。然後將細胞倒入20ml DMEN加10％胎牛血清中並使之復原24小時。此時將細胞分配到96小井平板中並加入選擇培養基，14天後裸眼可見有轉染的克隆。
實施例7人IgG產生的定量分析用ELISA方法檢測含被轉染克隆之小井的培養基中存在的人抗體。用羊抗人IgG(重鏈特異性的)抗體(Sera—Lab)包被微量滴定板的小井。用PBST(含有0.02％吐溫20的磷酸鹽緩衝鹽水，pH7.5)洗滌後，向各小井中加入20μl在100μlPBST稀釋的從含轉化體小井中得到的培養基，於37℃保溫1小時。然後排空各小井，用PBST洗並加入過氧化物酶結合的羊抗人к(輕鏈特異性的)區域抗體(Sera—Lab)，37℃保溫1小時，然後排空各小井，用PBST洗並加入含鄰苯二胺的底物緩衝液。幾分鐘後加入硫酸終止反應，並檢測492nm吸光率。
實施例8EGF受體放射配基競爭試驗用人胎盤微粒體部分，經同源性放射受體分析方法(RRA)(Macias，A.et al.，Interferony Biotechnologia 2115—127(1985))檢測鼠IOR egf—R，嵌合抗體和經破壞抗原決定基T突變的抗體對與其受體結合的125I—EGF的親和常數和影響。
使用該技術檢測嵌合抗體和破壞抗原決定基T抗體的突變體結合EGF—R的能力(圖5)。兩種抗體均以如原始鼠抗體的同樣親和力(1O—9M)與EGF—R結合，進一步證實已克隆了正確的小鼠可變區，並且新的抗體異型沒有影響結合。進一步說，突變抗體中的改變並沒有影響與抗原的結合。
實施例9用鼠抗體、嵌合抗體和VH突變抗體免疫CercopithecusAethiops猴三個處理組各有2隻Cercopithecus aethiops猴，各組分別用鼠IOR egf—R3 mAb、嵌合IOR egf—R3抗體和突變VH IOR egf—R3抗體免疫。在0、14、28和42天，用2mg吸附到5mg氫氧化鋁上的抗體經皮內注射免疫各組動物。第—次免疫前和每次免疫後1周從所有各組動物體內採血，從每份樣品分離血清並於-20℃保存。以ELISA技術檢測抗鼠IOR egf—R3 mAb之抗體的滴度。
用50μl鼠IOR egf—R3單克隆抗體(在碳酸氫鹽緩衝液(pH9.6)中濃度為10μg/ml)包被Costar平板(Inc.highbinding)，並保溫過夜。然後用PBST洗平板，用含有1％BSA的同樣緩衝液於室溫下封閉1小時。
重複洗滌步驟並加入50μl/小井不同的血清稀釋液。37℃保溫2小時後，再次洗平板並加鹼性磷酸酶結合的抗人IgG Fc區域特異性抗血清(Sigma，Inc.)37C保溫1小時。用PBST洗滌後各小並加50μl底物緩衝液(在二乙醇胺緩衝液(pH9.8)中稀釋的1mg/ml對硝基苯磷酸)保溫。在ELISA記錄儀(Organon Teknika，Inc.)中讀出405nm吸光率。
當使用該抗體作為免疫原時得到對鼠IOR egf—R3抗體的高IgG反應。當用嵌合抗體免疫猴時，與用突變體VH譯本免疫相反，得到較低的但仍可檢測到的抗鼠IOR egf—R3抗體的IgG反應(1/10,000)(圖6)。用突變的VH IOR egf—R3抗體免疫二次後沒有檢測到抗體反應，且在經4次免疫後只測得很小的反應(1/10,000)。
實施例10修飾IOR—T1鼠單克隆抗體的可變區序列以使推測的T細胞抗原序列人源化分析IOR—T1重和輕鏈可變區序列的T細胞抗原序列。
預測了重鏈可變區上的3個片段，它們是1.胺基酸2—21間的FR—1，2.胺基酸29—43間的FR1，CDR1，FR2，3.胺基酸97—111間的FR4、CDR3。
圖7中顯示與最同源的人序列的比較和所提出的取代，在FR1上5處，FR2上2處，FR4上2處。
對於輕鏈(圖8)以同樣方法提出下列T細胞抗原片段1.胺基酸60—65間的FR3，2.胺基酸79—90間的FR3、CDR3，3.胺基酸93—95A間的CDR3。
分析後，我們提出在FR3中的60，63，83，85和87位上的5處取代。
實施例11修飾I0R—CEA1鼠單克隆抗體的可變區序列，以使推測的T細胞抗原序列人源化分析IOR—CEA1重和輕鏈可變區序列中的T細胞抗原序列。
推測重鏈可變區上的2個片段，它們是1.胺基酸1—16間的FR1，2.殘基96—110間的FR4和CDR3。
圖9中，顯示與最同源的人序列的比較，和所提出的取代，其FR1上7處(在2，3，5，6，9，10和15位)且在FR4上2處(在108和109位)。
對輕鏈作同樣分析(圖10)，提出下列T細胞抗原片段
1.胺基酸1—14間的FR1，2.胺基酸55—70間的FR3—CDR2，3.殘基74—100間的FR—3—CDR 3—FR4。
分析後，我們提出FR1中9，10，11和13位上的4處取代，FR3中58，60，63，70，75，76，78，81，83，85和87位上的11處取代，以及FR4中100位上的1處取代。
實施例12分析免疫球蛋白家族的可變區中的兩親性片段AMPHI程序以子程序的形式被包括在一個為閱讀和加工來自Kabat資料庫的免疫球蛋白序列而編制的程序中。在加工序列中製得下列重排—將未限定的GLX型胺基酸(可能是GLN或GLU)限定為GLN(GLN和GLU有相似的親水性(hydrofilicity)指數分別為—0.22和—0.64)。
—將未限定的ASX型胺基酸(可能是ASN或ASP，分別具有—0.60和—0.77的親水指數)限定為ASN。
—其他未限定的胺基酸(序列中的空位或「奇形」符號)被限定為XXX(未知)。對該胺基酸，程序AMPHI指定親水值為0.0。
該分析中不包括有5個以上未知胺基酸(XXX)的序列。
該初步分析後，用程序AMPHI處理各序列，並且對每個免疫球蛋白家族以表格形式示出所得結果。
表I至VI中顯示對6個小鼠重鏈家族的分析結果。基於那些數據，可以限定「優勢兩親性區域」(PAR)在90％以上的可變區序列屬於每個家族。例如，比較框架結構1(FR1)，家族I和II的PAR可限定在11和16個胺基酸殘基之間，相反，家族III和IV一般從第1個胺基酸到第30個胺基酸沒有兩親性區域。在家族V和VI中，較小的PAR可分別限定在12—14和12—15個殘基。
PAR的人源化將降低在病人體內的免疫原性。兩親性區域群集在免疫球蛋白可變區框架中，支持所提出的方法的普遍適用性，即通過幾個點突變使這些預測的T細胞抗原決定基人源化。
小鼠重鏈族I名稱 5 10 1520 25 30 35 40 45 5055 60 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-TF5-139′CL ** ****** *** **--************* ***2-E7′CL** ****** *** **--************* *---------*******3-DFB-6l11′** ****** *** **--************* *----------******4-BALB/C121 ** ****** *** **--*************5-MOPC 450′C ** ****** *** **--************* ********** *** ***6-TF2-36′CL** **--************* ***** ********7-D35′CL ** ****** *** **--************* ** ***8-A/J GERMLI** **********--*************9-H37-92′CL** ****** *** **--*************---*****10-H37-85′CL********** *** **--*************11-36-60 CRI-** **********--******* ******12-JD31′CL ** ****** *** **--************13-H37-78′CL** ****** *** **--*************---*********14-H37-68′CL** ****** *** **--*************---*** *---------*******15-D7′CL** ****** *--*************16-42.7C.11.2*************--************ *****----------------*****17-42.BE.9.2′ *************--************ *****----------------*****18-H37-96′CL** ****** **--************* ****19-HF5.49′CL** **********--******************20-H37-24′CL** ****** *** **--*****************21-H37-42′CL***** *** *******---* *******22-42.7B3.2a′ *************--*****************---------------*****23-A10′CL ** **********--******* *******24-H37-88′CL** ****** *** **--***********25-JD21′CL *** **********--******* ******26-L69′CL ****** *** ************ **----------** ***27-VMS9′CL ********* **--****** ***********--* ***28-264″CL ********* **--****** ***********--***********29-VFM11′CL ********* **--****** ***********--* ***30-VMS2′CL ********* **--****** ********* ******31-VFM1′CL ********* ********* ******32-VMS1′CL *********** **** **** ***33-N-T151′CL****** ** *********--------*****
表2小鼠中鏈族II名稱 5 10 15 20 25 30 3540 45 50 5560 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-LB8′CL ****** *-***************------------******2-DF4-29.4′ ** **** *-************ *** ***3-mAb D′CL ****** *-***************** ****4-BAT123′CL ****** *-************ *****--------------****5-35-20 ****** *-******************6-AN02*********-************7-AN02′CL*********-************8-40-120 ****** *-*************---***** ***------------*******9-40-40 ****** *-*************---***** ***------------*******10-H146-24E9** ****** *-*** ***********11-AN07′CL ** ****** *-****** *****12-40-160 ****** *********-********* ***---******------------*******13-S1.2′CL****** *-*************---***** **--------------*****14-40-140 ****** *-*** *******---***** ***------------*******15-37.1.1′CL ****** ****-************------------*****16-GAM3-2′CL ******* *-*** ****** ********------------***17-8-1-12-58′ ****** *-************ ******-------------------------*******18-S27′CL ****** *-************ **--------------*****19-AN03′CL****** ****-************ **----------******20-L11-1A1′CL ****** *-**************--******21-AN01′CL****** ****-************ *---------******22-VHIF′CL****** *-*** ****** *** **----------*****23-MOPC 315′C ****** *****-***************** *******24-MOPC315 ****** *****-************ *** *****
表3小鼠重鏈族III名稱 5 10 15 20 25 30 35 40 45505560 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-H220-22′CL **--*** *** ********* ***2-DB1-453.2 **--*** *** ***3-H61-15′CL**--*** *** ******* ***4-1G7′CL **--*** *** ***5-NQ2 20.5.3**--*** *** ***6-E′CL **--*** *** ***7-NQ5 4.3.1′ **--*** *** ***8-NQ2 17.4.1**--*** *** ***9-H26′CL **--*** *** ***10-18G8′CL **--*** *** ****** **--------------**11-NQ5 61.1.2*** *** ****12-NQ2 48.2.2**--*** *** ***13-9G6′CL **--*** *** *** **--------------*14-3B6′CL **--*** *** ***15-2B2′CL **--*** *** ***16-F5-1419′CL **--*** *** ***17-E3′CL*** *** ***-------* ***18-20G9′CL **--*** *** ******19-3E3′CL **--*** *** ***20-12G10′CL **--*** ***21-5.4K 1y p′ **--*** ****--------**** ***22-17s.145′CL **--*** *** *** ******23-NC19FB′CL**--****** *** *** ***24-NPYI-125.3 *** **--*** *** *** *** **** ***25-NPYII-14.1 *** **--*** *** ***** ***-----------*****26-Lym-1′CL **--*** ****27-18-2-3′CL**--*** *** *********-------* *** ***28-PJ14′CL **--****** *** **** ****29-185.6′CL ******* **** *******30-185.6′CL ******* **** *******31-48.2.1′CL *** *** *** ***32-D1.3 **--****** *** *** ****33-PCG1-1′CL ***** *** **** **** *--------** ****34-F5-1336′CL **--****** *********---------**35-F5-444′CL ****--****** ****** *******--------*****36-F5-1126′CL ****--****** **********--------*****37-VD2H9′CL*** *** *** ***38-MOPC141J′CL **--****** *********---*******33-NPYII-269*** **--****** *** *****40-H220-22′CL **--*** *** *** ****** ***
表4小鼠重鏈族IV名稱51015 20 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 8085 90 95 100 1011-FAC1′CL *** ** ***2-D23′CL *********3-AB.1′CL *** ****-------------*******4-AB.2′CL *** *** *****---------*****5-JV10′CL*** *** ********6-MA-1505′CL **** *** *****-------------*****7-163.69′CL *** **-----------*******8-Mik-81(Fv) **** *** ***-----------**9-VH101′CL*** *** ***----------***10-MC101′CL*** *** ***----------***11-BPPI-6.4′C *** ***12-36.1.2D′CL *** **** ******13-36.5.7Bu′C *** **** ******
表5小鼠重鏈族V名稱 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-HDEX31 **** ****--****** *** *** ***2-MOPC104E **** ****--****** *** *** ***3-HDEX1**** ****--****** *** ****----------******4-HDEX25 **** ****--****** *** *** ***5-HDEX4**** ****--****** *** *** *****6-HDEX7**** ****--****** *** *** ***7-HDEX5**** ****--****** *** ****----------*****8-HDEX6**** ****--****** *** *** ***9-HDEX11 **** ****--****** *** *** *****10-HDEX3**** *****--***** *** *** ***11-HDEX24 **** ****--****** *** ****----------*****12-J558 **** ****--****** *** *** ***13-HDEX37 **** ****--****** *** ****----------*****14-HDEX2**** ****--****** *** *** ***15-HDEX12 **** ****--****** *** *** ***16-414.2′CL**** ****--****** ******** ****----------*****17-262.9′CL**** ****--****** ***** *** ***18-126.33′CL **** ****--****** ***** *** ****----------*****19-9.14.7′CL *******--****** *** ***20-HDEX10 **** ****--****** *** *** ***21-HDEX14 **** ****--****** *** *** ***22-16.3′CL **** ****--****** ***** **** ***23-HDEX9**** ****--****** *** *** ***24-AC38 205.1 *******--****** *** *** ***---------******25-9.4.5′CL*******--****** *** ****--------*******26-4.1.3C4′CL *******--****** *** ******* ***27-3.2.3E5′CL *******--****** *** *** ***28-45.21.1′CL *******--****** *** ***29-4.8.1′CL*******--****** *** *** ***30-3.4.1G6′CL *******--****** *** ***31-42.5D4.2a′ *******--****** *** *** *******32-4.3F1′CL*******--****** *** ***33-37.1E5.2a′ *******--****** *** ***34-59.102.2′C *******--****** *** ***35-2.31.1′CL *******--****** *** ****---------** ***36-MRA1OH′CL **** ****--****** ******** ** *****37-165.60′CL **** ****--****** ******** ** *******38-A5.B12.1′C *******--****** *** *** **---------** ***39-A6/24′CL ****--****** *** *** **---------******40-163.72′CL******* ****--****** ******* *** ********---------******41-17s.93g′CL **** ****--****** ******** ** ***42-A20/44′CL ****--****** *** ***43-106-10E′CL ***********--****** ******** **44-I.29′CL **** **** *********--****** *** ********* ***45-L1.15′CL**** **** *********--****** ***46-HDEX8**** ****--****** *** *** ***
表6小鼠重鏈族VI名稱 5 10 15 20 25 30 3540 45 50 5560 65 70 7580 85 90 95 10010l1-202.135′CL ******* **********--****** *** ****----------*******2-202.61′CL******* **********--****** *** *** **-----------******3-202.80′CL******* **********--****** *** *** *******4-202s.38′CL ******* **********--****** *** *** *** ***5-111.34′CL******* **********--****** *** *** ** ***6-111.109′CL********** **********--****** *** ******* *----------***7-17p.101′CL********** **********--****** *** *******---------------** ***8-C′CL ******* **********--****** *** **********9-AN11′CL ******* **********--****** ******* ***10-D44′CL **** **** **** **********--****** *** *** ***11-D14A031VH ******* **********--*********** *** ***12-AM29′CL **** ** *********** *** ******--------** ***13-AM28′CL ******* ******** *--******* *** ******--------** ***14-BWR4.H′CL*********** *** **-------------******15-D444′CL ******* *********--****** ******** **---------------******16-PL2-8′CL **** **** ***** *** ***---------*****17-PL2-3′CL ********* *** *** ***---------*****18-PL2-6′CL ********* *** *** ***---------*****19-34-28′CL ******* **********--** ******
權利要求
1.鑑定免疫球蛋白的T細胞抗原序列上哺乳動物種特異性胺基酸殘基的差異的方法，包括a.比較第一種哺乳動物的可變區框架胺基酸與第二種哺乳動物的可變區的框架胺基酸；b.確定與第一種哺乳動物最密切對應的第二種哺乳動物的亞群；c.確定最相似於第一種哺乳動物序列的第二種哺乳動物序列；d.鑑定不同於第二種哺乳動物之胺基酸殘基的第一種哺乳動物的胺基酸殘基，其中所說的胺基酸是在免疫球蛋白可變區中的T細胞抗原序列上；e.只鑑定不在互補區域內或不直接與典型結構或遊標帶相關聯的那些胺基酸殘基。
2.根據權利要求1的方法，其中第一種哺乳動物是小鼠。
3.根據權利要求1的方法，其中第二種哺乳動物是人。
4.將具有第一種哺乳動物之免疫原性的免疫球蛋白轉化成具有第二種哺乳動物之免疫原性的抗體的方法，包括用按權利要求1方法鑑定的最相似的第二種哺乳動物的相應胺基酸殘基取代第一種哺乳動物框架中不同於第二種哺乳動物之胺基酸殘基的胺基酸殘基。
5.根據權利要求4的方法，其中第一種哺乳動物是小鼠。
6.根據權利要求4的方法，其中第二種哺乳動物是人。
7.一種方法，包括a.製備編碼對已知抗原有特異性的經修飾的免疫球蛋白的DNA序列，其中不同於第二種哺乳動物同一位置上的胺基酸殘基的第一種哺乳動物的T細胞抗原序列上的某些殘基被按權利要求1的方法鑑定的最相似的第二種哺乳動物的相應胺基酸殘基取代；b.將該序列插入經操作連接到與宿主細胞相容之適當啟動子上的可複製的表達載體中；c.用b的載體轉化宿主細胞；d.培養該宿主細胞；e.從宿主細胞培養物中回收經修飾的免疫球蛋白。
8.根據權利要求7的方法，其中第一種哺乳動物是小鼠。
9.根據權利要求7的方法，其中第二種哺乳動物是人。
10.一種包含對已知抗原有特異性之修飾的免疫球蛋白的組合物。
11.編碼識別EGF—R之鼠IOR—R3抗體的DNA序列。
12.編碼按權利要求1、4和7的方法得到的經修飾之嵌合IOR—R3抗體的DNA序列。
13.按權利要求1、4和7的方法得到的表現有人抗體之抗原性的經修飾的嵌合IOR—R3抗體。
14.根據權利要求13的經修飾的嵌合IOR—R3抗體，其重鏈框架區中有下列點突變FR1.11位LEU由VAL取代，12位VAL由LYS取代，FR3.75位SER由THR取代，76位THR由SER取代，78位ALA由VAL取代，且83位THR由ARG取代。
15.包含根據權利要求13的經修飾的嵌合單克隆抗體的藥物組合物。
16.編碼按權利要求1、4和7的方法得到的經修飾的嵌合IOR—T1抗體的DNA序列。
17.按權利要求1、4和7的方法得到的表現有人抗體之抗原性的經修飾的嵌合IOR—T1抗體。18.根據權利要求17的經修飾的嵌合IOR—T1抗體，其兩鏈的框架區域中有下列點突變重鏈FR13位上LYS被GLN取代5位上VAL被LEU取代6位上GLN被GLU取代13位上LYS被GLN取代19位上LYS被ARG取代FR240位上THR被ALA取代42位上GLU被GLY取代FR4108位上THR被LEU取代109位上LEU被VAL取代輕鏈FR360位上ASP被ALA取代63位上THR被SER取代83位上LEU被PHE取代85位上GLU被VAL取代87位上PHE被TYR取代。
19.包含根據權利要求17之經修飾的嵌合單克隆抗體的醫藥組合物。
20.編碼按權利要求1、4和7的方法製得的經修飾之嵌合IOR—CEA1抗體的DNA序列。
21.按權利要求1、4和7的方法製得的表現有人抗體之抗原性的經修飾的嵌合IOR—CEA1抗體。
22.根據權利要求21的經修飾的嵌合IOR—CEA1抗體，其兩鏈的框架區域中有下列點突變重鏈FR12位上的PRO被VAL取代3位上的LYS被GLN取代5位上的LEU被VAL取代6位上的GLU被GLN取代9位上的GLY被ALA取代10位上的ASP被GLU取代15位上的GLU被GLY取代FR4108位上的THR被LEU取代109位上的LEU被VAL取代輕鏈FR19位上的LYS被SER取代10位上的PHE被THR取代11位上的SER被LEU取代13位上的THR被ALA取代FR358位上的VAL被ILE取代60位上的ASP被SER取代63位上的THR被SER取代70位上的ASP被GLU取代75位上的ILE被VAL取代76位上的SER被ILE取代78位上的VAL被LEU取代81位上的GLN被ASP取代83位上的LEU被PHE取代85位上的GLU被THR取代87位上的PHE被TYR取代FR4100位上的ALA被GLN取代。
23.包含根據權利要求21或22的經修飾的單克隆抗體的藥物組合物。
24.根據權利要求13、14、17、18、21和22的經修飾的嵌合單克隆抗體的治療應用。
25.根據權利要求13、14、17、18、21和22的經修飾的嵌合抗體用於製造抗腫瘤藥物。
26.包括衍生於第一種哺乳動物的重和輕鏈可變區及衍生於第二種哺乳動物的重和輕鏈恆定區的經修飾的嵌合抗體，其中在T細胞抗原序列內重鏈可變區或輕鏈可變區，或兩者被修飾，以使此胺基酸序列與衍生於所說的第二種哺乳動物之抗體相應區域中的胺基酸序列相適應，並除外在互補決定區中的修飾，以及在框架區內典型結構或遊標帶中的修飾。
27.包括衍生於第一種哺乳動物的重鏈可變區和衍生於第二種哺乳動物的重鏈恆定區的經修飾的嵌合抗體重鏈，其中T細胞抗原序列內的重鏈可變區被修飾，以使此胺基酸序列與衍生於所說的第二種哺乳動物之抗體的相應重鏈區域中的胺基酸序列相適應，但除外在互補決定區的修飾以及在框架區內典型結構或遊標帶中的修飾。
28.包括衍生於第一種哺乳動物的輕鏈可變區和衍生於第二種哺乳動物的輕鏈恆定區的經修飾的嵌合抗體輕鏈，其中T細胞抗原序列內的輕鏈可變區被修飾，以使此胺基酸序列與衍生於所說的第二種哺乳動物之抗體的相應輕鏈區域中的胺基酸序列相適應，並且其中除外在互補決定區中的修飾以及在框架區內的典型結構或遊標帶中的修飾。
全文摘要
本發明涉及鑑定免疫球蛋白的T細胞抗原序列上哺乳動物種特異性胺基酸殘基的差異的方法，它包括a.比較第一種哺乳動物和第二種哺乳動物的可變區框架胺基酸；b.確定與第一種哺乳動物最密切對應的第二種哺乳動物的亞群；c.確定最相似於第一種哺乳動物序列的第二種哺乳動物序列；d.鑑定不同於第二種哺乳動物之胺基酸殘基的第一種哺乳動物的胺基酸殘基。
文檔編號C07K19/00GK1133886SQ95109148
公開日1996年10月23日 申請日期1995年6月30日 優先權日1994年6月30日
發明者R·P·羅德裡古, C·M·德考思塔·戴裡奧, J·L·瓦拉達列 申請人:分子免疫中心