人體血液中微量乙醇的氣相色譜分析方法
2023-10-09 21:21:59 1
專利名稱：人體血液中微量乙醇的氣相色譜分析方法
技術領域：
本發明涉及一種人體血液中微量乙醇的氣相色譜分析方法。
背景技術：
酒後駕車是城市交通安全的重要隱患之一，所以人體血液中乙醇(酒精)的準確定量檢測顯得非常重要。乙醇通過人體消化系統進入血液遍及全身各組織，對人體的作用主要是麻痺和抑制中樞神經系統，而作用的強弱與血液中乙醇含量密切相關。由於飲食和代謝的複雜過程，在沒有飲酒的常人血液中有時也可檢測出微量乙醇。因此歐美許多國家對駕駛員血液中乙醇濃度最低限都制定有法定標準，一般在50-80mg/100ml。我國現行法規嚴令禁止酒後駕車，凡發現駕駛員有酒精反應，均可按酒後駕車予以處罰，然而，若沒有血液中乙醇濃度數據則缺乏判罰依據，常引起爭議，因此建立血液中乙醇快速準確且適合中國儀器設備情況的分析方法具有實際意義。
目前檢驗駕駛員是否飲酒有兩類方法，第一類是檢驗吹(或哈)氣中乙醇含量的，主要有以下幾種方法1)車載式酒精濃度控制器，在確認駕駛員呼氣中乙醇含量合格時才接通電路啟動車輛；2)利用化學反應使乙醇和顯色劑作用(如將黃色的六價鉻還原成藍色的三價鉻)，使乙醇呼氣檢測管顯色的小型測試器，根據顯色不同與標準比色卡進行比較確定乙醇大致濃度範圍；3)採用半導體(多數是二氧化錫)作為氣敏元件測量酒精的可攜式酒精測試儀；4)利用燃料電池作傳感器的可攜式檢測儀。其中前兩種方法普遍存在測量值不穩定、可靠性差、測量誤差大等缺點，只能定性不能定量，檢測結果易出現假陽性而不能普遍使用；可攜式半導體酒精測試儀的氣敏元件易受其它氣體幹擾，尤其是對溼度非常敏感，很難排除影響，而且其比較短的輸出衰落周期和相對較小的線性區段，使得它測量準確性差，線性和穩定性也不能完全達到要求，近年來各國也相繼取消用這種設備來檢測酒後駕車；以燃料電池作傳感器的酒精檢測儀，由於其具有良好的線性和很高的精密度，作為計量檢測設備為世界各國所採用，然這種進口產品，價格昂貴，還需要經常校準，校準周期為一至六個月，為使結果達到較高的精度，必須保證每次採樣體積一致，並且由於燃料電池的特性，在連續測量時輸出數據有下降現象。以上方法都是檢測吹氣中的乙醇含量，再由吹氣中乙醇含量推算血醇濃度。由吹氣中的乙醇含量推算血醇濃度，受溫度、溼度、吹氣壓力和吹氣量等因素、以及人的個體差異，特別是飲酒後在體內的消化時間長短的影響，準確度和穩定性不高，只可做為可疑飲酒者的預備檢驗，其結論不具備法律效力。第二類是氣相色譜法，可測定乙醇在血液中的濃度，是較為準確的方法，按其血樣的處理方法又可分為頂空法，溶劑萃取法，沉澱蛋白法，稀釋法等。其中頂空法報導最多，該法不引入幹擾物質，但定量準確性較多依賴於頂空設備的自動化程度，簡易設備往往定量準確性較差。溶劑萃取法設備簡單，但要引入溶劑，易造成幹擾和色譜分離上的困難，濃縮時也易造成乙醇損失。沉澱蛋白法是將離心分離後的血液上清液再加入試劑，以沉澱其中的蛋白，目的是保護色譜柱，方法較簡便，但引入的試劑也可能造成幹擾或汙染色譜系統。稀釋法因稀釋了血液，降低了血樣對進樣系統和色譜柱的汙染，但同時會降低方法的靈敏度。
發明內容
本發明的目的就是為了解決現有技術中存在的不足之處，提供一種人體血液中微量乙醇的氣相色譜分析方法。
本發明通過如下措施來實現本發明的思路是要求分析方法操作簡便，準確度高，不需要對血樣進行特殊處理，數分鐘內即可完成從採樣、預處理、樣品進樣與分析步驟。
一種人體血液中微量乙醇的氣相色譜分析方法，其特徵在於抽取人體血樣0.5微升～2毫升於含抗凝劑的針或容器中；選擇色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相，或者選擇擔載5％甲基聚矽氧烷的白色硅藻土固定相和色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相兩種固定相，製備色譜柱；控制色譜條件為柱溫150℃；汽化室溫度150℃；FID檢測器溫度160℃；載氣流量22ml/min；柱前壓0.14MPa；氫氣42ml/min；空氣270ml/min；進樣方式柱上進樣；進樣量0.5-5μl；對人體血液中微量乙醇進行氣相色譜分析。
以上所述「擔載5％甲基聚矽氧烷的白色硅藻土固定相」製備過程為將5份重量的甲基聚矽氧烷溶解於與100份重量白色硅藻土擔體等體積的二氯甲烷中，再將100份重量粒度80～140目的白色硅藻土擔體浸入溶液，待溶劑自然揮發使甲基聚矽氧烷均勻地塗布在白色硅藻土擔體上，製成擔載5％甲基聚矽氧烷的白色硅藻土固定相。
本發明所說的色譜柱總柱長0.6～2米，外徑φ1～4毫米。
本發明製備色譜柱的固定相可以單一選擇色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相，填充到玻璃或不鏽鋼管中製備色譜柱；同樣地也可以選擇擔載5％甲基聚矽氧烷的白色硅藻土固定相和色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相製備色譜柱，其中擔載5％甲基聚矽氧烷的白色硅藻土固定相填充柱頭部分8～15釐米，其餘部分填充色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相。
本發明所用的載氣選自N2，H2，He，Ar中任意一種氣體。
本發明所述血液抗凝劑，選自醫用商品肝素或者枸櫞酸鈉溶液。
為進一步說明本發明，現進行更加詳細的描述本發明涉及色譜分析儀器系統和血樣分析方法兩個部分。色譜分析儀器系統由裝有色譜柱的氣相色譜儀及數據處理機或色譜工作站構成；血樣分析方法包括血樣採集處理和將樣品注入分析系統分析兩個步驟。
一.色譜分析儀器系統本發明所述色譜分析儀器系統為裝配有填充柱進樣口和氫火焰離子化檢測器(FID)或光離子化檢測器(PID)的常規或微型氣相色譜儀，色譜爐內裝有本發明所提及的色譜柱。色譜數據由數據處理機或色譜工作站計算處理。
1)色譜柱製備將5份重量的甲基聚矽氧烷溶解於與100份重量白色硅藻土擔體等體積的二氯甲烷中，再將100份重量粒度80～140目的白色硅藻土擔體浸入溶液，待溶劑自然揮發使甲基聚矽氧烷均勻地塗布在白色硅藻土擔體上，製成擔載5％甲基聚矽氧烷的白色硅藻土固定相。
單一選擇色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相，填充到玻璃或不鏽鋼管中製備成色譜柱；同樣地也可以選擇擔載5％甲基聚矽氧烷的白色硅藻土固定相和色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相製備成色譜柱，擔載5％甲基聚矽氧烷的白色硅藻土固定相填充柱頭部分8～15釐米，其餘部分填充色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相。
色譜柱總柱長0.6～2米，外徑φ1～4毫米。
兩種色譜柱性能一致，通過更換柱頭部分擔載5％甲基聚矽氧烷的白色硅藻土固定相可以延長專用色譜柱壽命。
2)色譜柱老化在色譜柱中通N2，H2，He，Ar中任意一種氣體，流量10～50ml/分鐘，程序升溫50℃保持5分鐘，以10℃/min升溫至100℃(保持5分鐘)，以5℃/min升溫至150℃(保持5分鐘)，再以2℃/min升溫至250℃(保持60～120分鐘)。
3)色譜條件柱溫150℃(恆溫)；汽化室溫度150℃；FID檢測器溫度160℃；載氣(N2，H2，He，Ar中任意一種氣體)流量22ml/min；柱前壓0.14MPa；氫氣42ml/min；空氣270ml/min；進樣方式柱上進樣；進樣量0.5-5μl。
二.血樣分析方法1)取一滴人指尖血或耳垂血可進行單次快速分析，如需進行多次分析，並需留樣以備復檢，則需靜脈抽取血樣1～2毫升。分述如下a.以1～5微升的微量進樣器抽/排常規血液抗凝劑溶液(如肝素、枸櫞酸鈉溶液等)數次，使針管內部表面有極薄一層抗凝劑；以1～5微升微量進樣器取一滴人指尖血或耳垂血中0.5～5微升，直接注入已準備好的氣相色譜儀進樣口中進行分析，進樣後微量進樣器繼續抽/排血液抗凝溶液數次，以備後用。
b.抽取人靜脈血樣1～2毫升注入抗凝管中，置於離心機中在3500-6000轉/分鐘轉速下離心2-7分鐘使血樣分層；吸取所得上清液0.5-5微升注入到已準備好的氣相色譜儀進樣口中進行分析。所述處理後的血樣應儘快測定，以免乙醇揮發及與血樣中的酶或微生物發生作用導致濃度變化影響準確測定，如確需保存，可放置於4℃冰箱內保存兩天，以備復檢。
2)乙醇出峰時間在0.7～0.8分鐘之間，定量方法為外標法，以乙醇保留時間定性，以峰面積或峰高定量，以配製的乙醇標準水溶液分析建立標準曲線，利用數據處理機或色譜工作站處理數據輸出報告。
本發明與現有方技術相比，具有如下實質性特點1)本發明無需對血液進行蛋白沉澱，無需使用有機溶劑對血樣進行萃取等，減少了大量樣品預處理工作。
2)本發明對儀器設備無特殊要求，具備配置有填充柱進樣口和氫火焰離子化檢測器(FID)或光離子化檢測器(PID)的常規或微型氣相色譜儀，以及常規數據處理設備，一根色譜柱，一臺普通離心機，以及幾支1～5微升微量進樣器等主要設備後即可開展快速檢測工作。
3)本發明只需指尖或耳垂血一滴即可完成一次快速分析；當抽取1～2ml的靜脈血時，在多次做樣分析後還可對樣品進行短期保存，以便有異議時進行復檢。
4)本發明線性範圍超過103，線性相關係數R為0.9999，回收率範圍為98～105％，6次分析的相對標準偏差RSD小於2.6。
5)本發明測定血液中乙醇含量的最低檢測限是1mg/100ml。
6)本發明簡便快速，數分鐘內即可完成體內血液中乙醇含量的分析檢測工作。
同樣，本發明也適用於動物血液中乙醇的快速測定，還適用於人及動物尿液等體液中乙醇的快速測定，同時也適用於血液和體液中其他醇類如甲醇的測定。
圖1為實施例1中人體血液中微量乙醇快速測定色譜圖。
具體實施例方式
實施例11)色譜柱的製備將玻璃或不鏽鋼色譜柱空管進行清洗並用氮氣吹乾，柱尾一端填塞少許玻璃或石英纖維後接真空泵，在柱頭一端連接玻璃漏鬥，色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相倒入玻璃漏鬥內，在柱尾抽氣的同時以合適的力度敲擊柱管，分批將固定相裝入色譜柱空管，裝好後柱頭一端填塞少許玻璃或石英纖維封堵製備成專用色譜柱。色譜柱長1米，外徑φ3毫米。
2)色譜柱的老化將已填裝好的色譜柱安裝到氣相色譜爐箱內，柱頭一端接汽化室，柱尾一端不接，柱尾測得載氣流量為10～50ml/分鐘，程序升溫50℃保持5分鐘，以10℃/min升溫至100℃(保持5分鐘)，以5℃/min升溫至150℃(保持5分鐘)，再以2℃/min升溫至250℃(保持60～120分鐘)。
3)血樣分析對3名飲酒者進行了血液中乙醇含量的實際分析測定。
採用配製有填充柱進樣口和FID檢測器的氣相色譜儀進行分析；用色譜工作站進行數據採集和處理；用含有色譜純乙醇的水溶液作為外標溶液分析建立外標標準曲線，乙醇濃度分別為1000、500、100、10、1mg/100ml，分析時的操作條件為柱溫150℃(恆溫)；汽化室溫度150℃；FID檢測器溫度160℃；載氣N2流量22ml/min；柱前壓0.14MPa；H242ml/min；空氣r270ml/min；進樣方式柱上進樣；進樣量1μl。
在上述操作條件下，用微量進樣器從稀到濃依次分別準確吸取1μl上述標準溶液，以乙醇的峰面積對數值和濃度對數值繪製雙對數標準曲線，該曲線在1mg/100ml到1000mg/100ml範圍內有良好線性，線性方程為y＝1.0226x+2.6892，線性相關係數R＝0.9999。向不含乙醇的血清中加入一定量的乙醇並混勻，6次測定乙醇保留時間和濃度的重複性，可知本方法的相對標準偏差RSD小於2.6％。在空白血樣和含一定量乙醇的血樣中等體積加入一定濃度的乙醇標準溶液，將血清稀釋一倍後進樣以測試方法的回收率，得到本方法平均回收率為98-105％。
有3位體重約55kg的男性青年，分別飲用瀘州老窖白酒各約20、20和30ml，分別在30、40和50分鐘後靜脈抽血2ml置於加有抗凝劑的管中，4000轉/分鐘轉速下離心5分鐘，用微量進樣器吸取上清液1μl進樣，按上述操作條件進行分析，乙醇在0.75分鐘左右出峰，基本無幹擾，所得譜圖如圖1所示，3人血液中分別含乙醇10.3、2.49和6.12mg/100ml。
實施例21)色譜柱製備將玻璃或不鏽鋼色譜柱空管進行清洗並用氮氣吹乾，柱尾一端填塞少許玻璃或石英纖維後接真空泵，在柱頭一端連接小玻璃漏鬥，色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相倒入玻璃漏鬥內，在柱尾抽氣的同時以合適的力度敲擊柱管，分批將固定相裝入色譜柱空管，柱頭部分留空10釐米同樣方法填充擔載5％甲基聚矽氧烷的白色硅藻土固定相，兩種固定相之間填塞少許玻璃或石英纖維分隔，裝好後柱頭一端填塞少許玻璃或石英纖維封堵製備成有預柱的色譜柱。色譜柱長1.5米，外徑φ1毫米。
2)色譜柱的老化同實施例1。
3)血樣分析同實施例1。
權利要求
1.一種人體血液中微量乙醇的氣相色譜分析方法，其特徵在於抽取人體血樣0.5微升～2毫升於含抗凝劑的針或容器中；選擇色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相，或者選擇擔載5％甲基聚矽氧烷的白色硅藻土固定相和色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相兩種固定相，製備色譜柱；控制色譜條件為柱溫150℃；汽化室溫度150℃；FID檢測器溫度160℃；載氣流量22ml/min；柱前壓0.14MPa；氫氣42ml/min；空氣270ml/min；進樣方式柱上進樣；進樣量0.5-5μl；對人體血液中微量乙醇進行氣相色譜分析。
2.如權利要求1所說的方法，其特徵在於色譜柱總柱長0.6～2米，外徑φ1～4毫米。
3.如權利要求1或2所說的方法，其特徵在於擔載5％甲基聚矽氧烷的白色硅藻土固定相填充柱頭部分8～15釐米，其餘部分填充色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相。
4.如權利要求1所說的方法，其特徵在於載氣選自N2，H2，He，Ar中任意一種氣體。
5.如權利要求1所說的方法，其特徵在於血液抗凝劑選自醫用商品肝素或者枸櫞酸鈉溶液。
全文摘要
本發明公開了一種人體血液中微量乙醇的氣相色譜分析方法。該方法選擇色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相，或者選擇擔載5％甲基聚矽氧烷的白色硅藻土固定相和色譜級二乙烯基苯多孔聚合物固定相兩種固定相，製備色譜柱；控制色譜條件為柱溫150℃；汽化室溫度150℃；FID檢測器溫度160℃；載氣流量22ml/min；柱前壓0.14MPa；氫氣42ml/min；空氣270ml/min；進樣方式柱上進樣；進樣量0.5－5μl；對人體血液中微量乙醇進行氣相色譜分析。本發明操作簡便，準確度高，不需要對血樣進行特殊處理，數分鐘內即可完成從採樣、預處理、樣品進樣與分析步驟。
文檔編號G01N30/60GK1715907SQ200410062970
公開日2006年1月4日 申請日期2004年7月2日 優先權日2004年7月2日
發明者梁冰, 李辰 申請人:中國科學院蘭州化學物理研究所