一種關於甘草的薄層色譜鑑別方法及其應用與流程
2023-10-09 19:05:22
本發明屬於薄層色譜領域，具體涉及一種關於甘草的薄層色譜鑑別方法及其應用。
背景技術：
：甘草為豆科植物甘草、脹果甘草、光果甘草的乾燥根和根莖。春秋二季採挖，除去鬚根，曬乾所得。甘草具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥等作用，用於脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，脘腹攣急疼痛，癰腫瘡毒，緩解藥物毒性、烈性，主要成分有甘草酸銨、甘草甙、甘草甜素、甘草次酸等。為了更有效地控制該產品質量，保證臨床用藥效果，本文根據甘草的理化性質甘草進行了薄層色譜定性鑑別，確定了可行的質量控制方法。薄層色譜鑑別方法是目前國家中藥製劑標準中最常見的鑑別方法，它具有所用設備簡單，操作簡便、快捷，專屬性強的特點，能在複雜成分中檢測出某單一成分，特別適用於中成藥製劑中某單一中藥或成分的確認。中藥製劑大多缺乏質量控制指標，根據傳統中成藥成分多的特點，應側重研究建立薄層色譜鑑別方法，以鑑別中成藥中比較明確的主要藥液成分或已知成分。由於中成藥成分複雜，應選擇合適的薄層板、展開劑及顯色方法等色譜條件，使用恰當的方法提取純化檢測品，儘量把幹擾成分減至最低程度，使所得圖譜達到清晰度高、分離度好、斑點明顯、重現性好的要求。為建立簡便快速、專屬性強和重現好的薄層鑑別方法，本試驗參考《中華人民共和國獸藥典》2010版第二部及相關文獻報導，對甘草的薄層鑑別方法進行了研究和改進，進而建立甘草質量標準控制的薄層鑑別方法。但是藥典方法採用乙醚處理樣品，乙醚易糊化於玻璃容器中，難以過濾；並且將提取後的濾液揮去乙醚，樣品中含有水，難以確定乙醚揮發的程度，從而影響到樣品後續的提取，且對樣品中成分提取不充分，同時乙醚對人體有一定的危害。改進後的方法減去了樣品用乙醚處理的步驟並增強了分離效果，既沒有影響色譜斑點的檢出，又解決了樣品糊化黏附和過濾的問題，減少了對人體的危害。所以亟需對現有的甘草薄層鑑別方法進行研究和改進，提供一種清晰度高、分離度好、斑點明顯、重現性好的甘草薄層色譜方法。技術實現要素：有鑑於此，本發明的目的在於提供一種關於甘草的薄層色譜鑑別方法及其應用。為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：一種關於甘草的薄層色譜鑑別方法，操作方法如下：取1～2ul甘草檢測品、對照藥材及標準品溶液點樣於薄層板，在展開缸中加入展開劑，所述的展開劑為氯仿、甲醇、甲酸和乙酸乙酯以體積比10:3:2:3混勻，待展開劑飽和展開缸後將點好樣的薄層板放置其中，展開至13cm處取出薄層板晾乾，噴10％硫酸乙醇溶液顯色，105℃加熱至斑點顯色清晰，在365nm紫外光下視檢。進一步，點樣基線距底1.0cm，點間距離為大於1.2cm。進一步，所述的甘草檢測品製備方法為：甘草粉碎過12目篩，所得粉末加甲醇回流1h，放至18～25℃過濾，濾液過中性氧化鋁柱，用甲醇洗脫，收集洗脫液並用水飽和正丁醇液提取，最後蒸乾正丁醇液，再加甲醇製得甘草檢測品。進一步，所述的甘草檢測品製備方法為：(1)甘草粉碎過12目篩，所得粉末加甲醇加熱回流1h，所述甘草粉末和甲醇質量體積比(mg：ml)為1:10，放至18～25℃過濾，濾液過中性氧化鋁柱，再用與甘草粉末體積比(mg：ml)為1:10的40％甲醇洗脫，收集洗脫液；(2)將步驟(1)洗脫液蒸乾，殘渣加水，用水飽和正丁醇液提取2次，每次體積為甘草粉末質量的6倍，合併正丁醇液，用水洗滌2次，棄去水液，蒸乾正丁醇液，殘渣加甲醇溶解，所述水、甲醇和水飽和正丁醇液體積比為2:0.3:3。進一步，以上所述的薄層色譜鑑別方法在甘草質量鑑定中的應用。本發明的有益效果在於：根據本發明提供的甘草薄層色譜鑑別方法鑑別甘草，確定更可靠的質量控制方法，本發明提供的甘草薄層色譜鑑別方法所得圖譜清晰度高、分離度好、斑點明顯、重現性好。附圖說明為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行說明：圖1為檢測品製備方法1、2、3、4、5所製備的甘草檢測品點樣後置於展開劑1中所得到的圖片；圖2為檢測品製備方法1、2、3、4、5所製備的甘草檢測品點樣後置於展開劑2中所得到的圖片；圖3為檢測品製備方法1、2、3、4、5所製備的甘草檢測品點樣後置於展開劑3中所得到的圖片；圖4為檢測品製備方法1、2、3、4、5所製備的甘草檢測品點樣後置於展開劑4中所得到的圖片；圖5為檢測品製備方法1、2、3、4、5所製備的甘草檢測品點樣後置於展開劑5中所得到的圖片；圖6為檢測品製備方法1製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑1中所得圖片；圖7為檢測品製備方法1製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑2中所得圖片；圖8為檢測品製備方法1製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑3中所得圖片；圖9為檢測品製備方法1製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑5中所得圖片；圖10為檢測品製備方法2製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑1中所得圖片；圖11為檢測品製備方法2製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑2中所得圖片；圖12為檢測品製備方法2製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑3中所得圖片；圖13為檢測品製備方法2製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑5中所得圖片；圖14為檢測品製備方法4製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑1中所得圖片；圖15為檢測品製備方法4製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑2中所得圖片；圖16為檢測品製備方法4製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑3中所得圖片；圖17為檢測品製備方法4製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑5中所得圖片；圖18為檢測品製備方法5製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑1中所得圖片；圖19為檢測品製備方法5製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑2中所得圖片；圖20為檢測品製備方法5製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑3中所得圖片；圖21為檢測品製備方法5製備的甘草檢測品、對照藥材及標準品點樣後置於展開劑5中所得圖片；圖22為按照薄層色譜鑑別方法4-5專屬性考察結果圖片；其中：各照片中數字為對應的檢測品製備方法所提取的甘草檢測品，S為標準品，P為對照藥材，B為空白溶劑。具體實施方式下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例1甘草薄層色譜鑑別方法用毛細管分別吸取1～2ul甘草檢測品、對照藥材及標準品溶液點樣於薄層板，點樣基線距底1.0cm，點間距離為大於1.2cm，在展開缸中加入展開劑，輕輕混勻，待展開劑飽和展開缸後將點好樣的薄層板輕輕放置其中，展開至13cm處取出薄層板晾乾，噴10％硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點顯色清晰，在紫外光燈(365nm)下視檢。實施例2檢測品製備方法和展開劑考察方案根據影響薄層色譜鑑定效果的檢測品溶液製備、展開劑等兩個條件進行考察，以確定最佳方案，甘草檢測品均重複3次。甘草檢測品的製備方法詳見表1，展開劑的配方詳見表2，由不同檢測品製備方法和展開劑組合的薄層色譜鑑別方法詳見表3，分別為1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、5-1、5-2、5-3、5-4、5-5等25種方法，同時依據表4配製相關的對照藥材溶液，標準品溶液及採用相應的顯色方法。表1甘草檢測品的製備方法表2薄層色譜展開劑的配方展開劑1乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)展開劑2正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(10:2:0.5)展開劑3氯仿-甲醇(10:1)展開劑4正丁醇-冰醋酸-水(2:1:1)展開劑5氯仿-甲醇-甲酸-乙酸乙酯(10:3:2:3)表3不同檢測品製備方法和展開劑組合薄層色譜鑑別方法表4對照藥材溶液、標準品溶液的配製及顯色方法實施例3製備方法及展開劑的初步篩選圖1-5為按照甘草檢測品製備方法1、2、3、4、5所製備的檢測品溶液和標準品點樣於同一預製薄層板上後分別置於展開劑1、2、3、4、5號中所得到的圖片。根據圖1、圖4、圖5可以觀察到檢測品色譜中與對照品色譜中存在相應的斑點，可知改變展開劑，可能使檢測品和對照品目標斑點更加明確。圖1、圖4色譜圖中在與對照品色譜相應的位置上，斑點不清晰，對應位置不明確，顯示可疑斑點，分析認為：在分離過程中，沒有將有效成分與其他成分很好的分離開。圖2、圖3中沒有出現對照品色譜，但檢測品分離效果較好。圖1-5中提取方法3所對應的條帶較不清晰，說明其有效成分含量較低，不滿足試驗條件，捨棄第3種提取方法。通過圖4可觀察到展開劑4分離度較其它展開劑較差，又因為展開劑4展開速度較慢，所需時間較長，所以捨棄展開劑4，在下面的試驗過程中將針對展開劑1、2、3、5篩選出最好的甘草薄層色譜鑑別條件。實施例4檢測品製備方法及展開劑的再篩選1製備方法1取1g甘草粉末加乙醚40mL，加熱回流1h，濾液，藥渣加甲醇30mL，加熱回流1h，濾過，濾液蒸乾，殘渣加水40mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20mL，合併正丁醇液，用水洗滌3次，正丁醇液蒸乾，殘渣加甲醇5mL溶解，作為檢測品。採用相同的方法製備對照藥材溶液，甘草酸銨加甲醇製成濃度為2mg/ml的甘草標準品溶液。用毛細管分別吸取1～2ul甘草檢測品、對照藥材及標準品溶液滴加至薄層板，在4個展開缸中按表2分別配製展開劑1號(乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水按體積比15:1:1:2混合)，展開劑2號(正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸按體積比10:2:0.5混合)，展開劑3號(氯仿-甲醇按體積比10:1混合)，展開劑5號(氯仿-甲醇-甲酸-乙酸乙酯按體積比10:3:2:3混合)，輕輕混勻，待展開劑飽和展開缸後將點好樣的薄層板分別輕輕放置其中，展開至13cm處取出薄層板晾乾，噴10％硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點顯色清晰，在紫外光燈(365nm)下視檢，由以上製備方法所得甘草檢測品、對照品和標準品在展開劑1、2、3、5的條件下所得薄層色譜圖片見附圖6-9。由圖6、圖7、圖8比較可看出，方法1-1中檢測品及對照藥材分離度較好，但是與標準品相同位置上無對應斑點，標準品斑點上移；方法1-2、方法1-3均沒有出現標準品，且邊緣效應較明顯，和展開劑有關。圖9中方法1-5分離度較好，與標準品相同的位置上出現斑點，但是不清晰，是因為製備的檢測品濃度較低所致。由於提取方法1對待測樣品中檢測成分沒有充分的提取或對其它成分提取過多，因此導致其出現邊緣效應和目標斑點不清晰的，所以對提取方法1進行捨棄。2.製備方法2取甘草粉末5g，加8倍量95％乙醇加熱回流2次，1h/次，濾液回收乙醇，水浴蒸乾，用甲醇定容至5ml，即為檢測品溶液。採用相同的方法製備對照藥材溶液，甘草酸銨加甲醇製成濃度為2mg/ml的甘草標準品溶液。用毛細管分別吸取1～2ul甘草檢測品、對照藥材及標準品溶液滴加至薄層板，在4個展開缸中按表2分別配製展開劑1號(乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水按體積比15:1:1:2混合)，展開劑2號(正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸按體積比10:2:0.5混合)，展開劑3號(氯仿-甲醇按體積比10:1混合)，展開劑5號(氯仿-甲醇-甲酸-乙酸乙酯按體積比10:3:2:3混合)，輕輕混勻，待展開劑飽和展開缸後將點好樣的薄層板分別輕輕放置其中，展開至13cm處取出薄層板晾乾，噴10％硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點顯色清晰，在紫外光燈(365nm)下視檢，由以上製備方法所得甘草檢測品、對照藥材和標準品在展開劑1、2、3、5的條件下所得薄層色譜圖片見附圖10-13。由圖10、圖11、圖12、圖13比較可看出，分離度均較好，在與標準品相同的位置上圖13出現斑點，但比移值較小；圖10雖有斑點出現，但與標準品出現位置較不一致；圖11、圖12沒有出現標準品斑點，且圖12邊緣效應明顯可能與點樣量過多有關。3.製備方法4取5g過12目篩的甘草粉末，加50ml甲醇加熱回流1h，放至18～25℃過濾，濾液加於中性氧化鋁柱上，用50ml40％甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸乾，殘渣加水30ml，用水飽和的正丁醇液提取2次，每次30ml，合併正丁醇液，用水洗滌2次，每次20ml，棄去水液，蒸乾正丁醇液，殘渣加3ml甲醇即製得檢測品溶液。採用相同的方法製備對照藥材溶液，甘草酸銨加甲醇製成濃度為2mg/ml的甘草標準品溶液。用毛細管分別吸取1～2ul甘草檢測品、對照藥材及標準品溶液滴加至薄層板，在4個展開缸中按表2分別配製展開劑1號(乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水以體積比15:1:1:2混合)，展開劑2號(正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸以體積比10:2:0.5混合)，展開劑3號(氯仿-甲醇以體積比10:1混合)，展開劑5號(氯仿-甲醇-甲酸-乙酸乙酯以體積比10:3:2:3混合)，輕輕混勻，待展開劑飽和展開缸後將點好樣的薄層板分別輕輕放置其中，展開至13cm處取出薄層板晾乾，噴10％硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點顯色清晰，在紫外光燈(365nm)下視檢，由以上製備方法所得甘草檢測品、對照藥材和標準品在展開劑1、2、3、5的條件下所得薄層色譜圖片見附圖14-17。由圖14、圖15、圖16、圖17可看出，該提取方法在展開劑1、2、3、5中均有較好的分離度，無拖尾現象，圖15、16中沒有標準品斑點出現；圖14、17肉眼下觀看，在與標準品相同的位置上出現橙色斑點，但圖14中標準品與之對應的位置不明確，圖17中標準品斑點及檢測品斑點均比較清晰。本提取方法利用水飽和的正丁醇溶液來增加正丁醇的溶解度使檢測成分能夠更多的溶解在溶劑中，同時利用中性氧化鋁柱對甘草檢測品進行處理，利用其吸附解吸附原理將樣品中成分進行粗分離，另展開劑5號可以更好的溶解樣品，且與其極性大小相接近，所以圖17顯示甘草檢測品分離效果好、斑點清晰。4.製備方法5取6g甘草加飽和正丁醇30ml，超聲20min，濾過，濾液蒸乾，加3ml甲醇即製得檢測品溶液。採用相同的方法製備對照藥材溶液，甘草酸銨加甲醇製成濃度為2mg/ml的甘草標準品溶液。用毛細管分別吸取1～2ul甘草檢測品、對照藥材及標準品溶液滴加至薄層板，在4個展開缸中按表2分別配製展開劑1號(乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水以體積比15:1:1:2混合)，展開劑2號(正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸以體積比10:2:0.5混合)，展開劑3號(氯仿-甲醇以體積比10:1混合)，展開劑5號(氯仿-甲醇-甲酸-乙酸乙酯以體積比10:3:2:3混合)，輕輕混勻，待展開劑飽和展開缸後將點好樣的薄層板分別輕輕放置其中，展開至13cm處取出薄層板晾乾，噴10％硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點顯色清晰，在紫外光燈(365nm)下視檢，由以上製備方法所得甘草檢測品、對照藥材和標準品在展開劑1、2、3、5的條件下所得薄層色譜圖片見附圖18-21。由圖18、19、20、21可觀察到，圖18、19、21檢測品條帶分離度較好，但圖19與標準品斑點相同的位置上沒有出現相似的斑點，圖18、21中出現標準品斑點，與圖18相比圖21中斑點位置與標準品斑點出現位置更加一致，圖20中有拖尾現象。由以上試驗結果可得出薄層色譜鑑別方法4-5在點樣量為1-2ul，以10％硫酸乙醇溶液為顯色劑，顯色後在105℃加熱至斑點顯色清晰，紫外光燈(365nm)下視檢所得甘草色譜圖分離效果良好，斑點顯色清晰，重複性好，精密度高。且檢測品製備方法為過12目篩的5g甘草粉末，加50ml甲醇加熱回流1h，放至18～25℃過濾，濾液加於中性氧化鋁柱上，用50ml質量分數為40％甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸乾，殘渣加水30ml，用水飽和的正丁醇提取2次，每次30ml，合併正丁醇液，用水洗滌2次，每次20ml，棄去水液，蒸乾正丁醇液，殘渣加3ml甲醇得甘草檢測品，再以氯仿-甲醇-甲酸-乙酸乙酯體積比為10:3:2:3混合為展開劑，可得到分離度高、重複性好的清晰斑點，可用於甘草中甘草的薄層色譜鑑別。實施例5專屬性考察取甘草粉末適量，按照薄層色譜鑑別方法4-5進行檢測品溶液和展開劑的配製，點樣，展開和顯色，考察此方法的專屬性。檢測品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的橙黃色螢光斑點，試驗結果如圖22所示。由圖22測量原點中心至斑點中心的距離(s1)和原點中心至展開前沿的距離(s2)，用s1/s2計算可得：甘草酸銨組分比移值Rf＝0.275±0.06(n＝9)。分離度(R)的計算公式為：R＝2(d2-d1)/(W1+W2)，式中d2為相鄰兩斑點中後一斑點與原點的距離，d1為相鄰兩斑點中前一斑點與原點的距離，W1及W2為相鄰兩斑點各自的斑點寬。圖22測量分離度R＝3.674±0.361(n＝9)，符合薄層色譜鑑別方法對0.2＜Rf＜0.8，R＞1的要求。實施例6重複性考察按製備方法4配製3份檢測品溶液，點樣、展開和顯色，每個檢測品做3個重複，對9個試驗結果進行評價，考察此法的重複性，試驗結果數據參見表5。表5重複性試驗結果由表5可知，製備方法4配製的3份檢測品溶液平均比移值為0.246，標準差為0.041；平均分離度為3.503，標準差為0.154，標準差均較小，說明製備方法4配製的檢測品溶液有較好的重複性。實施例7耐用性考察在試驗方法基礎上，對其相應色譜條件進行改變，對測定結果的色譜圖中目標組分的比移至、分離度進行測評，考察此方法的耐用性，改變條件及結果見表6。表6耐用性試驗結果根據表6可知，將製備方法4中加熱回流1h此處理條件分別改為超聲處理1h，加熱回流30min或超聲處理40min後，平均比移值、分離度分別為0.242、3.312，標準差分別為0.042、0.114；將展開溫度由室溫分別改為10℃、20℃、30℃，其平均比移值、分離度分別為0.212、3.232，標準差分別為0.038、0.412。根據以上結果可知不管是改變樣品處理時間或展開溫度其標準差均較小，說明製備方法4有較好的耐用性。最後說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的範圍。當前第1頁1 2 3