通過共同給予血管生成抑制劑增強抗體－細胞因子融合蛋白介導的免疫應答的製作方法

2023-10-10 01:13:44 1

專利名稱：通過共同給予血管生成抑制劑增強抗體－細胞因子融合蛋白介導的免疫應答的製作方法
技術領域：
本發明一般而言涉及免疫綴合物，特別是可用於定向免疫治療和普遍性免疫刺激的抗體-細胞因子融合蛋白。更具體地講，本發明涉及應用血管生成抑制劑增強抗體-細胞因子融合蛋白介導的針對預定細胞類型(例如實體瘤中的細胞)的免疫應答。
背景技術：
多年來已經用抗體治療人類疾病，主要是提供針對病毒或細菌感染的被動免疫。然而最近，已經用抗體和抗體綴合物作為抗腫瘤劑。在大多數腫瘤類型中難以證明抗腫瘤活性，除非臨床狀態是一種最小殘餘的疾病(Reithmuller等，Lancet 94:1177-1183)，或當所述腫瘤為循環中的抗體可及時，例如在B-淋巴瘤的情況下(Maloney等(1994)Blood84:2457-2466)。對於抗體介導的治療幹涉而言，實體瘤比最小殘餘疾病狀態中發現的微轉移病灶頑固得多。
早期研究表明，可以通過將免疫刺激性細胞因子融合至抗體分子，增強用抗體對腫瘤的體內治療。然而，抗體-細胞因子融合蛋白在破壞較大的實體瘤方面遠不如對彌散性轉移病灶有效(Xiang等(1997)Cancer Reseach 57:4948-4955和Lode等(1998)Blood 91:1706-1715)。
因此，本領域仍需要增強針對預定細胞類型(例如實體瘤中存在的細胞類型)的抗體-細胞因子融合蛋白介導的免疫應答的組合物和使用這類組合物的方法。
發明概述本發明部分基於這樣的發現如果將免疫綴合物與血管生成抑制劑一起給予，當將所述疫綴合物給予哺乳動物時，可能產生更有效的針對預定細胞類型的免疫應答。特別是，已經發現，這類組合物在預定細胞類型(諸如實體瘤中發現的細胞類型)和病毒感染的細胞中介導免疫破壞方面特別有用。
一方面，本發明提供在哺乳動物中誘導針對預定細胞類型的殺細胞免疫應答。該方法包括給予所述哺乳動物(ⅰ)免疫綴合物，包含一個能夠結合預定細胞類型的抗體結合位點和一個能夠誘導這種針對預定細胞類型的免疫應答的細胞因子，和(ⅱ)血管生成抑制劑，其量足以相對於僅用免疫綴合物而言增強所述免疫應答。
在一個優選實施方案中，所述預定細胞類型可以是例如在實體瘤中、更優選在較大的實體瘤(即大於約100mm3)中存在的癌細胞。或者，所述預定細胞類型可以是病毒感染的細胞，例如人免疫缺陷病毒(HIV)感染的細胞。
在另一個優選實施方案中，可以將血管生成抑制劑與所述免疫綴合物同時給予。或者，所述血管生成抑制劑可以在給予免疫綴合物之前給予。此外，設想免疫綴合物可以與多種不同的血管生成抑制劑一起給予。或者，設想所述血管生成抑制劑可以與多種不同的免疫綴合物一起給予。
另一方面，本發明提供用於在哺乳動物中誘導針對預定細胞類型的殺細胞免疫應答的組合物。所述組合物結合包含(ⅰ)免疫綴合物，包含一個能夠結合預定細胞類型的抗體結合位點和一個能夠誘導這種針對所述預定細胞類型的免疫應答的細胞因子，和(ⅱ)血管生成抑制劑，其量足以相對於僅用免疫綴合物而言增強所述免疫應答。
在另一優選實施方案中，所述免疫綴合物的抗體結合位點最好包含免疫球蛋白重鏈或其抗原結合片段。所述免疫球蛋白重鏈最好以氨基末端至羧基末端的方向包含能夠結合預定抗原的一個免疫球蛋白可變區(VH)結構域、一個免疫球蛋白重鏈恆定區1(CH1)結構域、一個免疫球蛋白重鏈恆定區2(CH2)結構域，可選地可以還包含一個免疫球蛋白重鏈恆定區3(CH3)結構域。在一個更優選的實施方案中，所述免疫綴合物是包含通過一個多肽鍵融合至需細胞因子的免疫球蛋白重鏈或其抗原結合片段的融合蛋白。因此，有效的抗體-細胞因子融合蛋白以氨基末端至羧基末端的方法包含(ⅰ)抗體結合位點，包含一個能夠結合預定細胞類型上的細胞表面抗原的免疫球蛋白可變區、一個免疫球蛋白CH1結構域、一個免疫球蛋白CH2結構域(可選的CH3結構域)，和(ⅱ)所述細胞因子。在Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1428-1432；Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203和美國專利第5,650,150號中，詳細描述了製備和使用這類融合蛋白的方法。
免疫球蛋白恆定區結構域(即CH1、CH2和/或CH3結構域)可以是天然產生的抗體中的與可變區正常相連的恆定區結構域。或者，一個或多個所述免疫球蛋白恆定區結構域可以衍生自與用作可變區結構域來源的抗體不同的抗體。換句話說，所述免疫球蛋白可變區結構域和恆定區結構域可以衍生自不同的抗體，例如，衍生自不同物種的抗體。參見例如美國專利第4,816,567號。此外，所述免疫球蛋白可變區可以包含衍生自一個物種(例如人類)的構架區(FR)序列和插入所述FR之間、衍生自第二個不同物種(例如小鼠)的互補決定區(CDR)序列。例如在美國專利第5,225,539號和第5,585,089號中公開了用於製備和使用這類嵌合免疫球蛋白可變區的方法。
基於抗體的免疫綴合物最好還包含免疫球蛋白輕鏈,所述輕鏈最好通過例如二硫鍵共價連接至所述免疫球蛋白重鏈。所連接的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區一起確定結合預定抗原的單一完整的結合位點。在其它實施方案中，所述免疫球蛋白包含兩個嵌合鏈，每個鏈包含融合至細胞因子的至少一部分免疫球蛋白重鏈。所述兩個嵌合鏈最好通過例如一個或多個鏈間二硫鍵共價連接。
本發明因此提供其中將抗體的所述抗原結合特異性和活性與細胞因子的有效生物活性結合的融合蛋白。本發明的融合蛋白可以用來將所述細胞因子選擇性地體內傳遞至靶細胞，使得所述細胞因子可以在所述靶細胞附近發揮局部的生物學效應。在一個優選實施方案中，所述融合蛋白的抗體組分特異性地結合癌細胞上的抗原，結果所述融合蛋白發揮局部抗腫瘤活性。在一個替代的優選實施方案中，所述融合蛋白的抗體組分特異性地結合病毒感染的細胞，諸如HIV感染的細胞，結果所述融合蛋白發揮局部抗病毒活性。
可以加入本發明免疫綴合物中的優選的細胞因子包括例如腫瘤壞死因子、白介素、集落刺激因子和淋巴因子。優選的腫瘤壞死因子包括例如組織壞死因子α(THFα)。優選的白介素包括例如白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-7(IL-7)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)和白介素-18(IL-18)。優選的集落刺激因子包括例如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)。優選的淋巴因子包括例如淋巴毒素(LT)。其它有用的細胞因子包括幹擾素，包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ，所有這些均具有免疫效應以及不依賴於抗病毒活性的抗血管生成效應。
可用於實施本發明的優選的血管生成抑制劑包括例如endostatin、制管張素、對αvβ3整聯蛋白具有結合親和性的肽、對αvβ3整聯蛋白具有結合親和性的抗體或其片段、對表皮生長因子(EGF)受體具有結合親和性的肽、對EGF受體具有結合親和性的抗體或其片段、COX-2抑制劑、夫馬潔林、沙利度胺、抗血管生成細胞因子(例如IFN-α、IFN-β和IFN-γ)和包含這種抗血管生成細胞因子的細胞因子融合蛋白。
也提供用於聯合所述血管生成抑制劑給予免疫綴合物的劑量和給藥方法。
附圖簡述當結合附圖一起閱讀時，根據以下優選實施方案的描述，可以更全面地理解本發明前述的和其它的目的、特徵和優點以及發明本身。


圖1是示意圖，表示可用於實施本發明的示例性免疫綴合物；圖2A和2B圖示通過螢光激活細胞分類術(FACS)分析的人EpCAM在轉染的小鼠Lewis肺癌(LLC)細胞中的表達。等數目的轉染細胞或者僅用異硫氰酸螢光素(FITC)標記的第二抗人Fc特異性抗體染色(A組)，或者首先用huKS-huIL2抗體融合蛋白染色，然後用FITC標記的抗人Fc特異性抗體染色(B組)；圖3是一曲線圖，描述或者單獨給予的或者聯合第二抗體-細胞因子融合蛋白給予的抗體-細胞因子融合蛋白對皮下腫瘤的效應，其中所述細胞因子具有抗血管生成活性。在植入LLC細胞後13天開始5天的處理。用以下物質處理小鼠磷酸緩衝鹽水(空心菱形)；單獨的15μg/天huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白(實心方形)；10μg/天huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白(實心三角形)；和7.5μg/天huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白和5μg/天huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白的組合(打叉)；圖4是一曲線圖，描述或者單獨給予的或者聯合endostatin融合蛋白給予的抗體-細胞因子融合蛋白對皮下腫瘤的效應。在用以下物質處理的小鼠中監測CT26/EpCAM皮下腫瘤的大小磷酸緩衝鹽水(實心菱形)、muFc-muEndo融合蛋白(實心方形)、huKS-huγ4-huIL2融合蛋白(空心菱形)以及muFc-muEndo融合蛋白和huKS-huγ4-huIL2融合蛋白的組合(打叉)；且圖5是一曲線圖，描述或者單獨給予的或者聯合吲哚美辛給予的抗體-細胞因子融合蛋白對皮下腫瘤的效應。在用以下物質處理的小鼠中監測LLC-EpCAM皮下腫瘤的大小磷酸緩衝鹽水(實心菱形)、huKS-huγ4-huIL2融合蛋白(實心方形)、吲哚美辛(實心三角形)以及huKS-huγ4-huIL2融合蛋白和吲哚美辛的組合(打叉)。
發明詳述現在已經發現，可以通過將免疫綴合物與血管生成抑制劑一起給予，顯著增強由所述免疫綴合物引發的針對預定細胞類型的殺細胞免疫應答。聯合療法在介導對患病組織(諸如建立的腫瘤或病毒感染的細胞)的免疫破壞方面特別有效。本發明描述了用於製備和使用有用的免疫綴合物的方法以及用於測試當將其與合適的血管生成抑制劑聯合時其在臨床前體內動物模型中的藥代動力學活性的測定。
本文所用的術語「殺細胞免疫應答」應理解為是指在哺乳動物中由本發明的免疫綴合物刺激的、或者殺傷哺乳動物中預定細胞類型或者降低其生存力的任何免疫應答，在性質上或為體液免疫應答或為細胞免疫應答。所述免疫應答可以包括一種或多種細胞類型，包括T細胞、天然殺傷(NK)細胞和巨噬細胞。
本文所用的術語「免疫綴合物」應理解為是指(ⅰ)抗體結合位點和(ⅱ)細胞因子的綴合物，其中所述抗體結合位點對於癌細胞或病毒感染細胞上的表面抗原具有結合特異性並能夠結合所述表面抗原，而所述細胞因子能夠誘導或刺激針對所述癌細胞或病毒感染細胞的殺細胞免疫應答。因此，所述免疫綴合物能夠選擇性地將所述細胞因子體內傳遞至靶細胞，使得所述細胞因子可以介導針對所述靶細胞的局部免疫應答。例如，如果所述免疫綴合物的抗體組分選擇性地結合癌細胞上的抗原，例如實體瘤(特別是大於約100mm3的較大的實體瘤)中的癌細胞，則所述免疫綴合物發揮局部抗癌活性。或者，如果所述免疫綴合物的抗體組分選擇性地結合病毒感染細胞上的抗原，諸如人免疫缺陷病毒(HIV)感染的細胞，則所述免疫綴合物發揮局部抗病毒活性。
本文所用的術語「抗體結合位點」應理解為是指免疫球蛋白重鏈的至少一部分，例如能夠結合預定細胞類型的免疫球蛋白可變區。所述抗體結合位點也最好包含免疫球蛋白恆定區的至少一部分，包括例如CH1結構域、CH2結構域和可選的CH3結構域。此外，所述免疫球蛋白重鏈可以或者共價或者非共價結合至免疫球蛋白輕鏈，例如免疫球蛋白輕鏈可變區和可選的輕鏈恆定區。因此，設想所述抗體結合位點可以包含能夠結合預定細胞類型的完整的抗體或其片段。
關於所述免疫綴合物，設想所述抗體片段可以通過多種本領域技術人員熟知的方法連接至細胞因子。例如，在融合蛋白構成物中，抗體結合位點最好通過多肽鍵連接至細胞因子。或者，抗體結合位點可以通過反應基化學偶聯至細胞因子，所述反應基例如為所述抗體結合位點和所述細胞因子內存在的胺基酸側鏈中的巰基。
本文所用的術語「細胞因子」應理解為是指能夠在哺乳動物中刺激或誘導針對預定細胞類型(例如癌細胞或病毒感染細胞)的殺細胞免疫應答的任何蛋白或肽、其類似物或功能片段。因此，設想可以將多種細胞因子摻入本發明的免疫綴合物中。有用的細胞因子包括例如腫瘤壞死因子、白介素、淋巴因子、集落刺激因子、幹擾素，包括能夠刺激或誘導這類殺細胞免疫應答的其物種變異體、截短的類似物。有用的腫瘤壞死因子包括例如THFα。有用的淋巴因子包括例如LT。有用的集落刺激因子包括例如GM-CSF和M-CSF。有用的白介素包括例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18。有用的幹擾素包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ。
編碼特定目的細胞因子的基因可以重新克隆、得自可利用的來源，或根據已知的核苷酸序列通過標準的DNA合成來合成。例如，LT的DNA序列是已知的(參見例如Nedwin等(1985)Nucleic Acids Res.13:6361),IL-2(參見例如Taniguchi等(1983)Nature 302:305-318)、GM-CSF(參見例如Gasson等(1984)Science 266:1339-1342)和TNFα(參見例如Nedwin等(1985)Nucleic Acids Res.13:6361)的序列也是已知的。
在一個優選實施方案中，所述免疫綴合物為通過常規重組DNA方法產生的重組融合蛋白，即通過形成編碼所述嵌合免疫綴合物的核酸構成物產生的重組融合蛋白。在現有技術中已經描述了重組抗體-細胞因子融合蛋白的構建。參見例如Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1428-1432；Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203；和美國專利第5,650,150號。編碼本發明免疫綴合物的基因構成物最好以5』至3』方向包含編碼一個疫球蛋白重鏈可變區結構域的DNA區段、編碼一個疫球蛋白重鏈恆定區結構域的DNA區段和編碼所述細胞因子的DNA。將所融合的基因裝配到或插入表達載體中，以轉染入合適的表達所融合基因的受體細胞中。雜種多肽鏈最好與一條免疫球蛋白輕鏈結合，使得所述免疫球蛋白重鏈可變區(VH)和免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)結合，產生單一完整的結合預定抗原的位點。在一個優選實施方案中，所述免疫球蛋白重鏈和輕鏈例如通過鏈間二硫鍵共價偶聯。此外，或者其中之一或兩者融合至細胞因子的兩條免疫球蛋白重鏈可以例如通過一個或多個鏈間二硫鍵共價偶聯。
圖1顯示示例性免疫綴合物10的示意圖。在該實施方案中，細胞因子分子2和4為連接至抗體重鏈14和16的CH3區10和12的羧基末端6和8。VL區26和28顯示以典型的IgG構型與VH區18和20配對，由此在免疫綴合物10的氨基末端提供抗原結合位點30和32，並在免疫綴合物10的羧基末端提供2個細胞因子受體結合位點40和42。當然，在更廣泛的意義上，所述免疫綴合物不必如所述一樣配對，或兩條免疫球蛋白重鏈中僅一條需要融合至細胞因子分子。
本發明的免疫綴合物根據其結構的兩個方面可以被認為是嵌合的。首先，所述免疫綴合物是嵌合的，因為它包含連接至給定細胞因子的具有抗原結合特異性的一條免疫球蛋白重鏈。其次，本發明的免疫綴合物在以下意義上是嵌合的它包含一個免疫球蛋白可變區(V)和一個免疫球蛋白恆定區(C)，它們均得自不同的抗體，使得所產生的蛋白為V/C嵌合體。例如，所述可變區和恆定區可以得自天然產生的可分離自不同物種的抗體分子。參見例如美國專利第4,816,567號。也包括這樣的構成物其中所述免疫球蛋白可變區中任一個或兩個包含得自不同物種的構架區(FR)序列和互補決定區(CDR)序列。這類構成物公開於例如Jones等(1986)Nature 321:522-525,Verhoyen等(1988)Science 239:1534-1535和美國專利第5,225,539號和第5,585,089號。而且，設想可以通過從文庫(例如噬菌體呈現文庫)篩選以所需親和性結合預定抗原的可變區序列，來衍生所述可變區序列。用於製備和篩選噬菌體呈現文庫的方法公開於例如Huse等(1989)Science 246:1275-1281和Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:11120-11123。
所述免疫綴合物的免疫球蛋白重鏈恆定區結構域可以選自5類免疫球蛋白，即IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)、IgG(Igγ)和IgM(Igμ)。然而，最好是得自IgG類的免疫球蛋白重鏈恆定區。此外，設想所述免疫球蛋白重鏈可以得自本領域內稱為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的任何一個IgG抗體亞類。正如所知的，每個免疫球蛋白重鏈恆定區包括4個或5個結構域。所述結構域按順序名為CH1-鉸鏈區-CH2-CH3-(-CH4)。CH4存在於IgM中，IgM沒有鉸鏈區。在各類免疫球蛋白中所述重鏈結構域的DNA序列具有交叉同源性，例如IgG的CH2結構域與IgA和IgD的CH2結構域同源，與IgM和IgE的CH3結構域同源。所述免疫球蛋白輕鏈可以具有或者κ或者λ恆定鏈。這些免疫球蛋白區的序列和序列對比是本領域眾所周知的(參見例如Kabat等，「Sequences of Proteins of Immunological Interest，」美國健康和人類服務部，第三版1983，第四版1987,Huck等(1986)Nuc.Acids Res.14:1779-1789)。
在優選實施方案中，所述可變區得自對預定細胞表面抗原(與患病細胞諸如癌細胞或病毒感染細胞有關的抗原)特異性的抗體，而所述恆定區包含來自與所述可變區來源的抗體相同或不同的抗體的CH1和CH2(和可選的CH3)結構域。在本發明實施中，所述免疫綴合物的抗體部分最好在計劃的受體中無免疫原性或免疫原性弱。因此，所述抗體部分最好儘可能地得自與計劃的受體相同的物種。例如，如果所述免疫綴合物將給予人類，則所述恆定區結構域最好來自人類。參見例如美國專利第4,816,567號。此外，當所述免疫球蛋白可變區序列得自非計劃受體的物種時，例如當所述可變區序列來源於鼠而計劃受體為人類時，則所述可變區最好包含人FR序列與插入所述FR序列之間的鼠CDR序列，以產生對預定抗原具有特異性、但在計劃宿主中的免疫反應性最小的嵌合可變區。這類嵌合可變區的設計和合成公開於例如Jones等(1986)Nature 321:522-525,Verhoyen等(1988)Science 239:1534-1535和美國專利第5,225,539號和第5,585,089號。Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203中已經描述了人源化抗體-細胞因子融合蛋白KS-1/4抗EpCAM抗體-IL-12融合蛋白的克隆和表達及其根除建立的結腸癌轉移癌的能力。
編碼所述細胞因子的基因或者直接或者通過接頭(例如通過編碼(Gly4-Ser)3接頭的DNA)符合讀框地連接至編碼免疫球蛋白恆定區的基因(例如CH2或CH3外顯子)的3』端。在某些實施方案中，所述接頭可以包含編碼蛋白水解切割位點的核苷酸序列。該位點當插入免疫球蛋白恆定區和細胞因子之間時，可以用來保證於靶位點蛋白水解釋放所述細胞因子。例如，眾所周知，血纖溶酶和胰蛋白酶於蛋白酶可及的位點在賴氨酸和精氨酸之後切割。許多其它位點專一性內切蛋白酶和它們切割的胺基酸序列是本領域眾所周知的。優選的蛋白水解切割位點和與這類切割位點反應的蛋白水解酶公開於美國專利第5,541,087號和第5,726,044號。
所述核酸構成物可選地可以包括所述可變區編碼基因的內源啟動子和增強子，以調節所述嵌合免疫球蛋白鏈的表達。例如，可變區編碼基因可以作為DNA片段獲得，包含前導肽、輕鏈的VJ基因(功能性重排的可變(V)區與連接(J)區段)或重鏈的VDJ基因、以及這些基因的內源啟動子和增強子。或者，編碼所述可變區的基因可以與內源調節元件分開獲得，並用於提供這些元件的表達載體中。
可以通過標準DNA克隆方法，從產生所需抗體的細胞獲得可變區基因。使用合適的DNA探針，諸如含有J區DNA序列和下遊序列的DNA區段，可以根據特定的功能重排的可變區篩選基因組文庫。通過對所克隆基因測序並將該序列與相應的全長的、正確剪接的mRNA序列進行比較，完成正確克隆的鑑定和證實。
靶抗原可以是腫瘤細胞、癌細胞、病毒感染細胞或另一患病細胞的細胞表面抗原。編碼合適可變區的基因一般可以得自產生免疫球蛋白的淋巴細胞系。例如，通過本領域眾所周知的標準的體細胞雜交技術(參見例如美國專利第4,196,265號)，可以獲得產生對腫瘤相關抗原或病毒抗原特異性的免疫球蛋白的淋巴瘤細胞系。這些產生免疫球蛋白的細胞系提供功能性重排形式可變區基因來源。所述可變區基因通常來源於鼠，因為該鼠系統使其產生種類繁多的所需特異性的免疫球蛋白。此外，通過根據以所需親和性結合預定抗原的可變區序列篩選文庫(例如噬菌體呈現文庫)，可以衍生可變區序列。製備和篩選噬菌體呈現文庫的方法公開於例如Huse等(1989)Science 246:1275-1281和Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:11120-11123。
將編碼含功能活性可變區的基因的DNA片段連接至含所需恆定區編碼基因的DNA片段(或其部分)。可以通過標準的基因克隆技術，從產生抗體的細胞獲得免疫球蛋白恆定區(重鏈和輕鏈)。已經克隆了兩類人類輕鏈(κ和λ)和5類人重鏈(α、δ、ε、γ和μ)的基因，因此，容易由這些克隆獲得的人類來源的恆定區。
將編碼雜交免疫球蛋白重鏈的融合基因裝配或插入到用於引入受體細胞的表達載體中。將基因構成物引入質粒載體可以通過標準基因剪接方法完成。所述嵌合免疫球蛋白重鏈可以與相應的免疫球蛋白輕鏈在相同的細胞中共同表達，使得可以同時表達和裝配完整的免疫球蛋白。為此，所述重鏈和輕鏈構成物可以置於相同或分開的載體中。
受體細胞系一般為淋巴細胞。優選的受體細胞為骨髓瘤(或雜交瘤)。骨髓瘤可以合成、裝配和分泌由轉染基因編碼的且為糖基化蛋白的免疫球蛋白。特別優選的受體或宿主細胞包括Sp2/0骨髓瘤(它通常不產生內源免疫球蛋白)和小鼠骨髓瘤NS/0細胞。當轉染時，所述細胞僅產生由所轉染基因構成物編碼的免疫球蛋白。可以在培養物中培養轉染的骨髓瘤，或在小鼠腹膜中培養，在這種情況下可以從腹水中回收分泌的免疫綴合物。其它淋巴細胞諸如B淋巴細胞可以用作受體細胞。
有幾種方法用於用含編碼所述嵌合免疫球蛋白鏈的核酸構成物的載體轉染淋巴細胞。例如，可以將載體通過球芽融合引入淋巴細胞(參見例如Gillies等(1989)Biotechnol.7:798-804)。其它有用的方法包括電穿孔或磷酸鈣沉澱(參見例如Sambrook等編輯(1989)「MolecularCloning:A Laboratory Manual,」Cold Spring Harbor Press)。
其它有用的產生免疫綴合物的方法包括製備編碼所述構成物的RNA序列並使其在合適的體內或體外表達系統中翻譯。考慮到，用於合成編碼抗體-細胞因子融合蛋白的基因、將基因引入宿主細胞、在宿主中表達所述基因和收穫所產生的融合蛋白的重組DNA方法是本領域眾所周知並且已有大量文獻記載。具體的方案例如描述於Sambrook等編輯(1989)「Molecular Cloning:A Laboratory Manual,」Cold SpringHarbor Press。
應該理解，採用多種本領域技術人員熟知的方法，可以產生化學偶聯的免疫綴合物。例如，可以利用所述抗體或抗體片段和所述細胞因子中的化學反應性胺基酸側鏈，將所述抗體或其片段化學偶聯至所述細胞因子。所述胺基酸側鏈可以通過例如二硫鍵或通過同或異雙功能交聯試劑共價連接，所述交聯試劑例如為N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀酸酯、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺基酯和1,4-二[3』-(2』-吡啶硫基)丙醯氨基]丁烷，所有這些均可在商業上得自Pierce,Rockford,IL。
應該理解，本文所用的術語「血管生成抑制劑」是指減少或抑制哺乳動物中新血管形成的任何分子。在癌症治療方面，所述血管生成抑制劑減少或抑制腫瘤內或腫瘤上的新血管形成，最好是減少或抑制實體瘤中或實體瘤上新血管的形成。設想可以採用多種本領域熟知和使用的測定，鑑定有用的血管生成抑制劑。這類測定包括例如牛毛細血管內皮細胞增生測定、雞尿囊絨膜(CAM)測定或小鼠角膜測定。然而，最好是CAM 測定(參見例如O』Reilly等(1994)Cell 79:315-328和O』Reilly等(1997)Cell 88:277-285)。簡而言之，從受精3天的白色的卵中取出具有完整卵黃的胚並將其置於培養皿中。於37℃、3％CO2下培育3天後，將含有假定血管生成抑制劑的甲基纖維素圓片置於各個胚的尿囊絨膜上。培育約48小時後，在顯微鏡下觀察尿囊絨膜中抑制帶的證據。
許多血管生成抑制劑是本領域熟知的並有大量的記載。可用於實施本發明的血管生成抑制劑的實例包括例如血管生成的蛋白/肽抑制劑，諸如制管張素，即血纖溶酶原的一種蛋白水解片段(O』Reilly等(1994)Cell 79:315-328和美國專利第5,733,876、5,837,682和5,885,795號)；endostatin，即膠原蛋白ⅩⅧ的一種蛋白水解片段(O』Reilly等(1997)Cell 88:277-285和美國專利第5,854,205號)；含RGD三肽序列並能夠結合αvβ3整聯蛋白的肽(Brooks等(1994)Cell 79:1157-1164)；和某些抗體及其抗原結合片段以及與腫瘤血管上皮細胞上發現的αvβ3整聯蛋白(Brooks等，見上文)或EGF受體(Ciardello等(1996)J.Natl.Cancer Inst.88 1770-1776)相互作用的肽。其它血管生成抑制劑的實例包括COX-2抑制劑(Masferrer等(1998)Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.39:271)；夫馬潔林和類似物，諸如AGM-1470(Inger等(1990)Nature 348:555-557)；和其它小分子，諸如沙利度胺(D』Amato等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:4082-4085)。然後，目前最好使用endostatin和制管張素。
也已經報導了幾種細胞因子、包括其物種變異體及其截短的類似物具有抗血管生成活性，因此可用於實施本發明。實例包括IL-12，據報導通過依賴於IFN-γ的機制起作用(Voest等(1995)J.Natl.Canc.Inst.87:581-586)；和IFN-γ自身，它誘導一種具有血管抑制活性的趨化因子(IP-10)(Arenberg等(1996)J.Exp.Med.184:981-992)。因此，IL-12、IFN-γ和IP-10代表於同一抑制途徑不同點的血管生成抑制劑。已經表明其它幹擾素、尤其是IFN-α單獨或聯合其它抑制劑時是血管抑制性的(Brem等(1993)J.Pediatr.Surg.28:1253-1257)。幹擾素IFN-α、IFN-β和IFN-γ均具有免疫學效應以及不依賴於其抗病毒活性的抗血管生成特性。據報導另一細胞因子GM-CSF通過誘導制管張素抑制血管生成(Kumar等(1998)Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.39:271)。
應該理解，如本文所用的，如果對於所述抗原或受體的結合親和性大於105M-1，更優選大於107M-1，則所述免疫綴合物的抗體部分特異性地結合預定抗原，細胞因子特異性地結合所述細胞因子的受體，或血管生成抑制劑特異性地結合所述抑制劑的受體。本文所用的術語制管張素、endostatin、TNF、IL、GM-CSF、M-CSF、LT和IFN不僅是指完整的蛋白，也是指其生物活性片段和/或類似物。生物活性片段是指具有完整蛋白生物活性的至少30％、更優選至少70％、最優選至少90％的完整蛋白部分。類似物是指所述完整蛋白的物種變異體和等位基因變異體、或具有所述完整蛋白生物活性的至少30％、更優選至少70％、最優選至少90％的胺基酸取代體、插入體或缺失體。
血管生成抑制劑可以與所述免疫綴合物同時給予，或分別通過不同的給藥途徑給予。本發明的化合物可以通過與特定分子相匹配的任何途徑給予。因此，合適時，可以口服或胃腸外給予，包括靜脈內和腹膜內給藥途徑。
可以將本發明的組合物通過任何合適的方法直接(例如局部如通過注射、植入或體表給予組織部位)或系統(例如胃腸外或口服)提供給動物。當所述組合物待胃腸外提供時，諸如通過靜脈內、皮下、經眼、腹膜內、肌內、經頰、直腸、陰道、眶內、腦內、顱內、脊柱內、心室內、鞘內、腦池內、囊內、鼻內或通過氣霧劑給予，所述組合物最好包含部分水性或生理上相容的流體懸浮液或溶液。因此，所述載體或溶媒是生理上可接受的，使得除將所需組合物傳遞至患者外，它不會另外不利地影響患者的電解質和/體積平衡。所述藥物的所述流體介質因此可以包含通常的生理鹽水(例如9.85％NaCl水溶液，0.15M,pH7-7.4)。
每次給予的免疫綴合物的優選劑量範圍為0.1mg/m2-100mg/m2，更優選為1mg/m2-20mg/m2，最優選為2mg/m2-6mg/m2。血管生成抑制劑的優選劑量一般將取決於所用的血管生成抑制劑的類型，然而，可以用常規試驗確定最適劑量。免疫綴合物和/或血管生成抑制劑的給予可以通過定期大劑量注射，或從外部儲器(例如從靜脈內袋)或內部(例如從可生物消化的植入物)通過連續靜脈內或腹膜內給予。此外，設想了本發明的免疫綴合物也可以與多種不同的血管生成抑制劑一起給予計劃的受體。然而，設想了免疫綴合物和血管生成抑制劑的最佳組合、給藥模式、劑量可以通過常規試驗確定，這在本領域技術人員的技術水平之內。
可以用多種方法，評估採用抗體-細胞因子融合蛋白和血管生成抑制劑的聯合療法對免疫應答的效力。例如，技術人員可以實施例1描述的動物模型或其它合適的動物模型來測試哪種血管生成抑制劑、或血管生成抑制劑的組合在與免疫綴合物(例如抗體-IL-2融合蛋白)協同作用以增強對建立的腫瘤的免疫破壞方面最有效。所述血管生成抑制劑或血管生成抑制劑的組合可以在免疫綴合物治療之前或同時給予，通過測定體積可以方便地監測對腫瘤的效應。此外，當鑑定出新的血管生成抑制劑時，技術人員將能夠使用本文所述的方法來評估這些新抑制劑增強抗體-細胞因子融合蛋白抗癌活性的潛力。
或者，在治療後，可以切下腫瘤，將其切片並通過標準組織學方法染色，或通過特異性的免疫組織試劑染色，以評價所述聯合療法對免疫應答的效應。例如，用蘇木精和曙紅的簡單染色可能揭示出為細胞免疫應答的指標的淋巴細胞浸潤到實體瘤中的差異。此外，用針對特定免疫細胞類別的抗體將切片免疫染色，可以揭示出所誘導的應答的性質。例如，結合CD45(一種通常的白細胞標記)、CD4和CD8(用於T細胞亞類鑑定)和NK1.1(NK細胞上的一種標記)的抗體可以用來評估由本發明免疫綴合物介導的免疫應答類型。
或者，通過例如在Lode等(1998)Blood 91:1706-1715中描述的常規的細胞亞群排除研究，可以評估由所述免疫綴合物介導的免疫應答類型。排除抗體的實例包括與T細胞標記CD4和CD8反應的抗體，以及結合NK標記NK1.1以及脫唾液酸(asialo)GM的抗體。簡而言之，在開始相當高的劑量(例如約0.5mg/小鼠的劑量)進行抗體-細胞因子處理之前，給所述哺乳動物注射這些抗體，以每周1次的間隔給予，此後直至試驗完成。該技術可以鑑定引發所觀察的哺乳動物的免疫應答所需的細胞類型。
在另一途徑中，將從已經用聯合療法處理的動物中分離的脾細胞的細胞毒活性與其它處理組的細胞毒性活性相比。通過用在大多數免疫學實驗室手冊中找到的標準技術機械切碎回收的、無菌的脾，製備脾細胞培養物。參見例如Coligan等(編輯)(1988)「Current Protocols inImmunology」John Wiley Sons,Inc。然後在合適的含有血清、抗生素和低濃度IL-2(約10U/ml)的細胞培養基(例如得自GIBCO的DMEM)中培養所產生的細胞。例如，為了比較NK活性，3天的培養物通常是最適的，而為了比較T細胞細胞毒活性，5天的培養物通常是最適的。通過用51Cr放射標記腫瘤靶細胞(例如LLC)30分鐘，可以測定細胞毒性活性。在去除過量的放射標記後，將標記細胞與不同濃度的培養脾細胞混合4小時。溫育結束時，用γ計數器測量來自所述細胞的51Cr，然後將其用來定量由所述免疫細胞誘導的細胞裂解的程度。以該方式測定常規的細胞毒T淋巴細胞(或CTL)活性。
通過以下非限制性實施例進一步描述本發明。
用含編碼人EpCAM抗原(由KS-1/4抗體識別，如Vurki等(1984)Cancer Res.44:681中描述)、並由巨細胞病毒(CMV)早期啟動子(Immunogen,Carlsbad,CA)驅動的cDNA的表達質粒轉染LLC細胞。通過PCR，從由人前列腺癌細胞LnCAP製備的cDNA克隆所述KS抗原(KSA或EpCAM)。正向引物具有核苷酸序列5』TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC(SEQ ID NO:1)，其中ATG為翻譯起始密碼子，而反向引物具有核苷酸序列5』CTCGAGTTATGCATTGAGTTCCCT(SEQ ID NO:2)，其中TTA為翻譯終止的反密碼子。EpCAM cDNA克隆入反轉錄病毒載體pLNCS(Clontech,Palo Alto,CA)中，並按照已建立的方案(Ausubel等(編輯)「Current Protocols in Molecular Biology」,John Wiley Sons)進行轉染。簡而言之，通過磷酸鈣共沉澱法，用pLNCX-EpCAM轉染包裝細胞系PA317(ATCC CRL 9078)，含有所述病毒的條件培養基用來轉染LLC細胞。將G418(Sigma Chemical Co.)加入轉染細胞至1mg/ml，以選擇穩定的克隆。通過免疫染色和螢光激活細胞分類術(FACS)分析，鑑定表達人EpCAM抗原的克隆(LLC-Ep)。
如圖1描述，首先用hu-KS-IL2抗體融合蛋白(參見以下實施例2)染色、然後用異硫氰酸螢光素(FITC)標記的抗人Fc特異性抗體(JacksonImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)染色的LLC-Ep克隆，表現出相當均一的人EpCAM表達水平。在這些克隆中的表達水平遠高於單獨用FITC標記的抗人Fc特異性抗體染色的克隆所觀察到的水平。
為了表明人細胞表面蛋白的表達不增加LLC-Ep細胞的免疫原性，給C57B1/6小鼠皮下注射不同數目的細胞。發現所有小鼠在注射5×105細胞後均快速產生進行性腫瘤，其生長動力學與用親代LLC細胞系觀察的大致相同。所有動物均為垂死的，將其處死以避免不必要的受苦。實施例2．抗體-細胞因子融合蛋白或抗體-血管生成抑制劑融合蛋白的製備在以下實施例中討論多種抗體-細胞因子融合蛋白。具體地說，實施例3公開了人源化KS-鼠γ2a-鼠IL2(huKS-muγ2a-muIL2)和人源化KS-鼠γ2a-鼠IL12(huKS-muγ2a-muIL12)融合蛋白的應用。實施例4公開了huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白和鼠Fc-鼠制管張素(muFc-muAngio)以及鼠Fc-鼠endostatin(muFc-muEndo)融合蛋白一起應用。實施例5公開了人源化KS-人γ4-人IL2(huKS-huγ4-huIL2)和鼠Fc-鼠endostatin(muFc-muEndo)融合蛋白的應用。最後，實施例6公開了人源化KS-人huγ1-人IL2(huKS-huγ1-huIL2)融合蛋白與吲哚美辛的應用。下面討論這些融合蛋白的構建。huKS-huγ1-huIL2基本上按Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203和美國專利第5,650,150號描述的方法，製備並表達編碼huKS-huγ1-huIL2融合蛋白的基因。簡而言之，用Jones等(1986)Nature 321:522-525中公開的方法，製備小鼠KS-1/4抗體的人源化可變區(Varki等，(1984)Cancer Res.44:681-687)的模型，所述公開的方法涉及將每個KS1/4可變區的CDR插入人可變區具有最高程度同源性的共有框架序列中。用運行BioSym軟體的Silicon Graphics Indigo工作站的分子模擬證實所述CDR的形狀得到保持。然後反向翻譯所述蛋白的序列，通過連接重疊的寡核苷酸構建基因。
基本上按照Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1428-1432中所述，將產生的可變區插入含有人κ輕鏈和人Cγ1重鏈恆定區的表達載體中，只是用CMV啟動子/增強子取代所述金屬硫蛋白啟動子和免疫球蛋白重鏈增強子，以表達兩條鏈。按Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1428-1432中所述，製備IL-2的成熟序列融合至人重鏈的羧基末端的融合體，只是所述IL-2基因的3』非翻譯區得自SV40 poly(A)區。
通過將所產生的質粒轉染入NS/0骨髓瘤細胞系，用含0.1μM氨甲蝶呤的選擇培養基，表達所述IL-2融合蛋白。簡而言之，為了獲得穩定轉染的克隆，通過電穿孔將質粒DNA引入小鼠骨髓瘤NS/0細胞。NS/0細胞在補充10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養基中培養。用PBS洗滌約5×106細胞，再懸浮於0.5ml PBS中。然後在GenePulser Cuvette(0.4cm電極間距，BioRad)中將10μg線性化質粒DNA與所述細胞一起在冰上孵育10分鐘。用Gene Pulser(BioRad,Hercules,CA)，設定0.25V和500μF進行電穿孔。讓細胞在冰上恢復10分鐘，此後將其再懸浮於生長培養基中，然後鋪到2個96孔板上。通過在100nM氨甲蝶呤(MTX)存在下，通過生長選擇穩定轉染的克隆，所述氨甲蝶呤在轉染後2天加入。每3天飼餵細胞一次，再飼餵3次，在2-3周內出現MTX抗性克隆。
用合適的抗體，通過Fc或細胞因子ELISA鑑定表達克隆(參見例如Gillies等(1989)Biotechnol.7:798-804)。按生產商的說明，通過結合、然後從A蛋白Sepharose(Pharmacia)洗脫，純化所產生的融合蛋白。huKS-huγ4-huIL2基本上按照1999年2月24日申請的U.S.S.N 09/256,156(該申請要求1998年2月25日申請的U.S.S.N 60/075,887的優先權)所述，構建並表達編碼huKS.huγ4.huIL2融合蛋白的基因。
簡而言之，通過從huKS-huγ1-huIL2表達載體中去除免疫球蛋白恆定區Cγ1基因片段，並用來自人Cγ4基因的相應序列取代，製備如上所述的huKS-huγ1-huIL2融合蛋白的Igγ4形式。人重鏈恆定區Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4的序列和序列對比公開於Huck等(1986)Nuc.AcidsRes.14:1779-1789。
通過用HindⅢ和XhoⅠ消化原始的含Cγ1質粒DNA，並通過瓊脂糖凝膠電泳純化大的7.8kb片段，完成Cγ1和Cγ4片段的交換。含所述Cγ4的第二質粒用HindⅢ和NsiⅠ消化，並純化1.75kb片段。含有融合至人Cγ1基因羧基末端的人IL-2 cDNA和SV40 poly A位點的第三質粒用XhoⅠ和NsiⅠ消化，並純化小的470bp片段。以大致等摩爾的量連接所有三種片段，連接產物用來轉化感受態大腸桿菌。用連接產物轉化感受態大腸桿菌，通過在含氨苄青黴素的平板上生長選擇菌落。通過得自分離轉化子的質粒DNA製備物的限制分析，並用FspⅠ消化來區別Cγ1(無FspⅠ)和Cγ4(一個位點)基因插入片段，鑑定正確裝配的重組質粒。
將含有Cγ4-IL2重鏈取代的最終載體通過電穿孔(0.25V和500μF)引入NS/0小鼠骨髓瘤細胞，並通過在含氨甲蝶呤(0.1μM)的培養基中生長選擇轉染子。鑑定、擴增表達高水平huKS-huγ4-huIL2融合蛋白的細胞克隆，並用A蛋白Sepharose色譜從培養上清液中純化所述融合蛋白。通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳測定Cγ4融合蛋白的純度和完整性。在T細胞增生測定(Gillis等(1978)J.Immunol.120:2027-2032)中測量IL-2活性，發現與γ1構成物的活性相同。huKS-muγ2a-muIL2通過用相應的鼠序列取代如上所述的huKS-huγ1-huIL2融合蛋白的人抗體恆定區和人IL-2，構建編碼huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白的基因。具體地說，用融合至編碼鼠IL-2的DNA的鼠Cγ2a cDNA片段取代人Cγ1-IL2 DNA。簡而言之，用重疊寡核苷酸引物，通過進行重疊PCR，將huKS的VH區符合讀框地融合至鼠γ2a cDNA，所述引物為(有義)5』CC GTC TCC TCA GCC AAA ACA ACA GCC CCA TCG GTC(SEQ ID NO:3)；(反義)5』GG GGC TGT TGT TTT GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA CG(SEQ IDNO:4)；(有義)5』C TTA AGC CAG ATC CAG TTG GTG CAG(SEQ ID NO:5)；和(反義)5』CC CGG GGT CCG GGA GAA GCT CTT AGT C(SEQ ID NO:6)。
設計SEQ ID NO:3和4的寡核苷酸，以雜交至huKS的所述VH結構域和鼠γ2a恆定區cDNA的接點(斜體)。在第一輪PCR中，有兩個單獨的反應。在一個反應中，huKS VHDNA用作模板，採用SEQ IDNO:4和5的寡核苷酸。SEQ ID NO:5的引物在編碼huKS VH的成熟氨基末端的序列上遊引入一個AflⅡ(CTTAAG)限制位點(粗體)。在另一反應中，鼠γ2a cDNA用作模板，使用寡核苷酸SEQ ID NO:3和6。SEQ ID NO:6的引物雜交至編碼γ2a C末端周圍區域的cNDA，並引入一個XmaⅠ(CCCGGG)限制位點，以隨後連接至muIL2 cDNA。混合得自這兩個反應的PCR產物，並採用SEQ ID NO:5和6的寡核苷酸進行第二輪的PCR。克隆所產生的PCR產物，在序列證實後，將編碼huKS的VH和鼠γ2a恆定區的AflⅡ-XmaⅠ片段用來在AflⅡ位點連接至編碼信號肽的DNA並在XmaⅠ位點連接至編碼muIL2 cDNA。
用SEQ ID NO:7和8中敘述的寡核苷酸，從鼠外周血單核細胞的mRNA克隆鼠IL2 cDNA，所述寡核苷酸為:(有義)5』GGC CCG GGT AAA GCA CCC ACT TCA AGC TCC(SEQ ID NO:7)；和(反義)5』CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG(SEQ ID NO.8)。
SEQ ID NO:7的引物改變於XmaⅠ限制位點(CCCGGG)連接至muγ2a的muIL2(粗體的序列)。SEQ ID NO:8的引物在緊接翻譯終止密碼子(反義序列中的粗體)之後引入一個XhoⅠ限制位點(CTCGAG)。
同樣，通過重疊PCR將huKS的輕鏈可變區(VL)連接至muκcDNA序列。所用的重疊寡核苷酸包括(有義)5』G GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT G(SEQ ID NO:9)；(反義)5』GC AGC ATC AGC CCGTT TTA TTT CCA GCT TGG TCC(SEQ ID NO:10)；(有義)5』C TTA AGC GAG ATC GTG CTG ACC CAG(SEQ ID NO:11)；和(反義)5』CTC GAG CTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GC(SEQ ID NO:12)。
所述寡核苷酸用來雜交至huKS的VL和鼠κcDNA恆定區的接點(斜體)。在第一輪PCR中，有兩個單獨的反應。在一個反應中，huKSDNA的VL用作模板，採用SEQ ID NO:10和11中提出的寡核苷酸，所述寡核苷酸在編碼huKS VL的成熟氨基末端的序列上遊引入一個AflⅡ(CTTAAG)限制位點。在另一個反應中，用鼠κcDNA作為模板，採用SEQ D NO:9和12中提出的寡核苷酸，所述寡核苷酸在翻譯終止密碼子(反義引物中的粗體)後引入一個XhoⅠ限制位點。
混合得自這兩個反應的PCR反應，並採用SEQ D NO:11和12中提出的寡核苷酸引物進行第二輪PCR。克隆所產生的PCR產物，在證實序列後，將編碼huKS的VL和鼠κ恆定區的AflⅡ-XhoⅠ片段在AflⅡ位點連接至編碼信號肽的DNA。
用鼠重鏈序列和輕鏈序列取代pdHL7中的人序列。將產生的包含dhfr選擇標記基因的抗體表達載體進行電穿孔(0.25V,500μF)進鼠NS/0骨髓瘤細胞中，並通過在含0.1μM氨甲蝶呤的培養基中培養而選擇克隆。採用標準ELISA方法測試抗氨甲蝶呤的轉染克隆中抗體決定簇的分泌。按照生產商的說明，通過A蛋白Sepharose色譜純化所述融合蛋白。huKS-muγ2a-muIL12基本上按照1997年12月8日申請的U.S.S.N.08/986,997和Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203中所述，構建和表達編碼huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白的基因。簡而言之，通過將鼠p35IL-12亞單位cDNA融合至先前製備的huKS-muγ2a重鏈編碼區，完成這一步驟。然後將所產生的載體轉染入NS/0骨髓瘤細胞系中，所述細胞系用p40IL-12亞單位預先轉染並能夠表達p40IL-12亞單位。換句話說，單獨用p40轉染細胞系，選擇穩定的高表達細胞，然後用其作為含p35融合蛋白轉染的受體(即順序轉染(sequential transfection))。
從用伴刀豆凝集素A(5μg/ml，在培養基中3天)激活的脾細胞製備的mRNA，通過PCR分離鼠p35和p40 IL-12亞單位。所述PCR引物用於分離編碼p35的核酸序列，同時將p35 cDNA修改為XmaⅠ-XhoⅠ限制片段，所述引物包括:5』CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG(SEQ ID NO:13)；和5』CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC(SEQ ID NO:14)。
用於分離編碼p40的核酸序列的PCR引物包括5』TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC(SEQ ID NO:15)；和5』CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG(SEQ ID NO:16)。
按照所述(Gillies等J.Immunol.Methods 125:191)構建質粒載體(pdHL7-huKS-muγ2a-p35)，它含有dhfr選擇標記基因、一個編碼人源化KS抗體輕鏈的轉錄單位和一個編碼融合至鼠IL-12的p35亞單位的鼠重鏈的轉錄單位。通過將修改的p35亞單位cDNA的XmaⅠ至XhoⅠ片段連接至先前製備的鼠γ2a基因CH3外顯子末端的單一XmaⅠ位點，完成融合。H鏈和L鏈轉錄單位均於5』端包含一個巨細胞病毒(CMV)啟動子(取代原始參比序列中金屬硫蛋白啟動子)，於3』端包含一個聚腺苷酸化位點。
構建相似的載體(pNC-p40)以表達游離的p40亞單位，所述載體包含一個選擇標記基因(新黴素抗性基因)、但仍使用CMV啟動子用於轉錄。在這種情況下的編碼區包括p40亞單位的天然前導序列，以正確地轉運至內質網並與所述融合蛋白一起裝配。將質粒pNC-p40電穿孔到細胞中，將細胞鋪平板，並在含G418的培養基中選擇。在這種情況下，通過ELISA測試來自抗藥性克隆的培養上清液的p40亞單位的產生。
按Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203中所述，將pdHL7-huKS-muγ2a-p35表達載體電穿孔到已經表達鼠p40的NS/0細胞系中。通過標準ELISA方法，測試抗氨甲蝶呤的轉染克隆的抗體決定簇和鼠IL-12的分泌。按照生產商的說明，通過結合至A蛋白Sepharose柱，並從該柱洗脫，純化所產生的蛋白。muFc-muEndo基本上按照1998年8月25日申請的U.S.S.N.60/097,883所述，構建和表達編碼muFc-muEndo融合蛋白的基因。
簡而言之，將鼠endostatin和鼠Fc作為muFc-muEndostatin融合蛋白表達。用PCR改變endostatin基因以在pdCs-muFc(D4K)載體中表達(Lo等(1998)Protein Engineering 11:495-500)，該載體含有一個腸激酶識別位點Asp4-Lys(LaVallie等(1993)J.Biol.Chem.268:23311-23317)。正向引物為5』-C CCC AAG CTT CAT ACT CAT CAG GAC TTT C(SEQ ID NO:17)，其中在AAGCTT(HindⅢ位點)之後接編碼endostatinN末端的序列(粗體)。反向引物為5』-CCC CTC GAG CTA TTT GGAGAA AGA GGT C(SEQ ID NO:18)，該引物用來將翻譯終止密碼子(反密碼子，CTA)緊接endostatin C末端後放置，此後為一個XhoⅠ位點(CTCGAG)。
將PCR產物克隆並測序，將編碼endostatin的HindⅢ-XhoⅠ片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體中。用抗muFc ELISA選擇穩定的表達muFc(D4K)-muEndo的NS/0克隆並對其分析。表達所產生的融合蛋白，並通過A蛋白Sepharose色譜純化所述融合蛋白。muFc-muAngio基本上按照1998年8月25日申請的U.S.S.N.60/097,883所述，構建和表達編碼muFc-muAngio融合蛋白的基因。
簡而言之，將鼠制管張素和鼠Fc作為muFc-mu制管張素融合蛋白表達。用PCR改變由Judah Folkman博士的實驗室(Childrens Hospital,Boston,MA)友好提供的制管張素序列NA，用於在pdCs-muFc(D4K)載體(Lo等(1998)Protein Engineering 11:495-500)中表達。正向引物為5』-C CCC AAG CTT GTG TAT CTG TCA GAA TGT AAG CCC TCCTGT CTC TGA GCA(SEQ D NO:19)，其中在AAGCTT(HindⅢ位點)之後接編碼制管張素N末端的序列(粗體)。反向引物為5』-CCC CTCGAG CTA CCC TCC TGT CTC TGA GCA(SEQ D NO:20)，該引物設計用來將翻譯終止密碼子(反密碼子，CTA)緊接制管張素C末端後放置，此後為一個XhoⅠ位點(CTCGAG)。
將PCR產物克隆並測序，將編碼制管張素的HindⅢ-XhoⅠ片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體中。用抗muFc ELISA選擇穩定的表達muFc(D4K)-muAngio的NS/0克隆並對其分析。表達所產生的融合蛋白，並通過A蛋白Sepharose色譜純化所述融合蛋白。實施例3．採用KS-IL2和KS-IL12融合蛋白的聯合療法用於治療LLC-Ep腫瘤。
在C57B1/6雌性小鼠中背部皮下注射在細胞培養物中培養的LLC-Ep細胞(5×105/小鼠)。約2周後，將具有範圍為150-400mm3的可觸知腫瘤的動物分為4組，各組之間腫瘤大小的分布相同。對動物如下處理:在組1中，動物僅接受PBS(對照組)；在組2中，動物僅接受huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白；在組3中，動物僅接受huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白；在組4中，動物接受huKS-muγ2a-muIL2和huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白。通過測量體積監測腫瘤生長，直至對照組的動物瀕死並將其無痛致死。用測徑規測量腫瘤體積，並按以下公式計算:V=4π/3(0.5L×0.5W×0.5H)，其中L為腫瘤長度，W為腫瘤寬度，而H為腫瘤高度。
圖3概述了結果。用PBS處理的小鼠用空心菱形表示，用15μg/天huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白處理的小鼠用實心方形表示，用10μg/天huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白處理的小鼠由實心三角形表示，而用7.5μg/天huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白和5μg/天huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白的組合處理的小鼠用打叉表示。
如圖3所示，用huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白(15μg連續5天)處理不延遲或減少LLC-Ep腫瘤的生長(實心方形)。在單獨用10μghuKS-muγ2a-muIL12融合蛋白/劑連續5天處理的小鼠中觀察到僅略有抗腫瘤效應(實心三角形)。然而，當以每種融合蛋白各一半原始量(分別為7.5μg huKS-muγ2a-muIL2和5μg huKS-muγ2a-muIL12)將這兩種融合蛋白組合時，觀察到顯著的生長延遲(打叉)，提示在這兩種融合蛋白之間有協同作用。實施例4．用抗體-細胞因子融合蛋白和制管張素與endostatin組合的療法。
在C57B1/6雌性小鼠中背部皮下注射在細胞培養物中培養的LLC-Ep細胞(5×105/小鼠)。約2周後，將具有範圍為150-400mm3的可觸知腫瘤的動物分為4組並如下處理(1)動物僅接受PBS；(2)動物接受muFc-Angio和muFc-Endo的混合物；(3)動物接受huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白；和(4)動物接受huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白和muFc-Angio與muFc-Endo的組合。動物以其相應的處理連續注射5天。
將muFc-Angio和muFc-Endo以5mg/kg的劑量給予帶腫瘤的小鼠。接受huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白的動物用日劑量為10μg的huKS-muγ2a-muIL2處理總共5天。通過測量體積監測腫瘤的生長。
預期僅用muFc-Angio和muFc-Endo的混合物處理將在2周處理期間內有效地使LLC腫瘤皺縮。然而，預期這種處理在短時間內如5天內不是那麼有效(as effective)。也預期僅用muKS-muIL2融合蛋白處理的動物將表現出最小的抗腫瘤活性。然而，預期與或者接受muFc-Angio和muFc-Endo的組，或者接受huKS-muγ2a-muIL2的組相比，既接受huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白也接受muFc-Angio與muFc-Endo的混合物的組將表現出顯著減小的腫瘤生長。實施例5．抗體-細胞因子融合蛋白和endostatin的聯合療法。
將表達人EpCAM的小鼠CT26癌細胞皮下注射BALB/c小鼠已剃毛的背部(2×106細胞/注射)。當腫瘤的大小達到100-200mm3(約7-14天)時，將小鼠隨機分為4組，每組4隻。組1每日接受0.2ml PBS的靜脈注射。組2每日接受muFc-muEndostatin(320μg/小鼠)的PBS溶液的靜脈注射。組3僅接受huKS-huγ4-huIL2融合蛋白(10μg/小鼠)的PBS溶液的靜脈注射，注射5天。組4接受PBS中的huKS-huγ4-huIL2(10μg/小鼠)和muFc-Endo(320μg/小鼠)靜脈注射5天，此後每天接受PBS中的muFc-Endo(320μg/小鼠)靜脈注射。按實施例3所述測量腫瘤體積。
圖4總結了結果。用PBS處理的小鼠用實心菱形表示，用muFc-muEndo融合蛋白處理的小鼠用實心方形表示，用huKS-huγ4-huIL2融合蛋白處理的小鼠由實心菱形表示，而用muFc-muEndo融合蛋白和huKS-huγ4-huIL2融合蛋白的組合處理的小鼠用打叉表示。
圖4表明 ，所述抗體-細胞因子融合蛋白和所述血管生成(前列腺素)蛋白muFc-muEndo的組合優於這兩種因子本身中任一種。處理19天後，huKS-huγ4-huIL2和muFc-muEndo聯合療法的T/C比(處理組的平均腫瘤大小/對照組的平均腫瘤大小)為0.25，這與huKS-huγ4-huIL2的T/C為0.31以及muFc-muEndo的T/C為0.42相比，有顯著提高。實施例6．抗體-細胞因子融合蛋白和吲哚美辛的聯合療法。
在C57B1/6雌性小鼠中背部皮下注射LLC-Ep細胞(2×106/注射)。當腫瘤達到600-1200mm3時處死小鼠。用聚烯吡酮碘和乙醇清潔覆蓋腫瘤的皮膚，切下腫瘤並棄去壞死組織。通過使活腫瘤組織通過篩網，然後通過一系列連續變小的22-30號低溫針，製備腫瘤細胞在磷酸緩衝鹽水中的懸浮液。調節細胞的濃度為1×107細胞/ml，並置於冰上。然後在C57B1/6、鼠背部近中線皮下注射0.1ml新鮮在再懸浮的細胞(1×106細胞/小鼠)。
當腫瘤的大小達到100-200mm3(約7-14天)時，將小鼠隨機分為4組，每組5隻。組1每日接受0.2ml PBS的靜脈注射。組2每日接受PBS中的huKS-huγ1-huIL2(25μg/小鼠)靜脈注射共5天。組3在整個處理期間在飲用水中口服接受吲哚美辛(20μg/ml，或每日消費約60-70μg吲哚美辛/小鼠)。組4每日接受huKS-huγ1-huIL2(25μg/小鼠)的靜脈注射共5天，在整個處理期間在飲用水中口服吲哚美辛(20μg/ml)。按實施例3所述測量腫瘤體積。
圖5展示了結果。用PBS處理的小鼠用實心菱形表示，用huKS-huγ1-huIL2融合蛋白處理的小鼠用實心方形表示，用吲哚美辛處理的小鼠由實心三角形表示，而用huKS-huγ1-huIL2融合蛋白和吲哚美辛的組合處理的小鼠用打叉表示。
圖5表明，抗體-細胞因子融合蛋白和所述抗血管生成化學化合物吲哚美辛的組合由優於這兩種因子本身中的任一種。處理22天後，huKS-huγ4-huIL2和吲哚美辛聯合療法的T/C比為0.40，這與huKS-huγ4-huIL2的T/C為0.61以及吲哚美辛的T/C為0.60相比，有顯著提高。
等同方案在不違背本發明的精神和基本特徵的情況下，本發明可以具體體現為其中具體形式。因此，上述實施方案在所有方面應被認為是說明性的，而不限制本文所述的發明。因此，本發明的範圍由所附的權利要求書指明，而不是由前述說明書指明，在所述權利要求書等同方案意義和範圍內的所有變化均包括在本發明內。
通過引用而結合上文公開的每個專利文獻和科學出版物均通過引用結合到本文中。
序列表110Gillies, Stephen D120通過共同給予血管生成抑制劑增強抗體-細胞因子融合蛋白介導的免疫應答130LEX-004PC14014115060/081,8631511998-04-1416020170PatentIn Ver. 2.0210121124212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物220221misc_特徵222(12)...(14)223翻譯起始密碼子4001tctagagcag catggcgccc ccgc 24210221124212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物220221misc_特徵222(7)...(9)223翻譯終止反密碼子4002ctcgagttat gcattgagtt ccct 24210321135212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物4003ccgtctcctc agccaaaaca acagccccat cggtc 35210421137212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物4004ggggctgttg ttttggctga ggagacggtg actgacg 37210521125212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物4005cttaagccag atccagttgg tgcag 25210621127212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物4006cccggggtcc gggagaagct cttagtc27210721130212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物4007ggcccgggta aagcacccac ttcaagctcc 30210821125212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物4008ccctcgagtt attgagggct tgttg 25210921132212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物4009ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tg 322101021134212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40010gcagcatcag cccgttttat ttccagcttg gtcc 342101121125212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40011cttaagcgag atcgtgctga cccag 252101221129212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40012ctcgagctaa cactcattcc tgttgaagc 292101321128212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40013ccccgggtag ggtcattcca gtctctgg 282101421126212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40014ctcgagtcag gcggagctca gatagc 262101521128212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40015tctagaccat gtgtcctcag aagctaac282101621125212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40016ctcgagctag gatcggaccc tgcag 252101721129212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40017ccccaagctt catactcatc aggactttc 292101821128212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40018cccctcgagc tatttggaga aagaggtc282101921149212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40019ccccaagctt gtgtatctgt cagaatgtaa gccctcctgt ctctgagca 492102021130212DNA213人工序列220223人工序列的描述PCR引物40020cccctcgagc taccctcctg tctctgagca 30
權利要求
1．在哺乳動物中誘導針對預定細胞類型的殺細胞免疫應答的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物(ⅰ)免疫綴合物，包含一個能夠結合預定細胞類型的抗體結合位點和一個能夠誘導針對所述預定細胞類型的所述免疫應答的細胞因子，和(ⅱ)血管生成抑制劑，其量足以相對於僅用免疫綴合物而言而增強所述免疫應答。
2．權利要求1的方法，其中所述預定細胞類型為癌細胞。
3．權利要求1的方法，其中所述預定細胞類型為病毒感染的細胞。
4．權利要求1的方法，其中所述血管生成抑制劑與所述免疫綴合物一起共同給予。
5．權利要求1的方法，其中所述血管生成抑制劑在給予所述免疫綴合物之前給予。
6．權利要求1的方法，其中所述抗體結合位點以氨基末端至羧基末端的方向包含一個免疫球蛋白可變區、一個CH1結構域和一個CH2結構域。
7．權利要求6的方法，其中所述抗體結合位點還包含連接至所述CH2結構域羧基末端的一個CH3結構域。
8．權利要求1的方法，其中所述免疫綴合物為一種融合蛋白，所述融合蛋白以氨基末端至羧基末端的方法包含(ⅰ)抗體結合位點，包含一個能夠結合預定細胞類型上的細胞表面抗原的免疫球蛋白可變區、一個免疫球蛋白CH1結構域、一個免疫球蛋白CH2結構域，和(ⅱ)所述細胞因子。
9．權利要求8的方法，其中所述抗體結合位點還包含插入所述CH2結構域和所述細胞因子之間的一個CH3結構域。
10．權利要求1的方法，其中所述免疫綴合物的所述細胞因子選自腫瘤壞死因子、白介素、集落刺激因子和淋巴因子。
11．權利要求1的方法，其中所述血管生成抑制劑選自endostatin、制管張素、對αvβ3整聯蛋白具有結合親和性的肽、對αvβ3整聯蛋白具有結合親和性的抗體、對EGF受體具有結合親和性的肽、對EGF受體具有結合親和性的抗體、COX-2抑制劑、夫馬潔林、沙利度胺、抗血管生成細胞因子和細胞因子融合蛋白。
12．在哺乳動物中誘導針對癌細胞的殺細胞免疫應答的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物(ⅰ)免疫綴合物，包含一個能夠結合所述癌細胞的抗體結合位點和一個能夠誘導針對所述腫瘤細胞的所述免疫應答的細胞因子，和(ⅱ)選自endostatin和制管張素的一種血管生成抑制劑，其量足以相對於僅用免疫綴合物而言而增強所述免疫應答。
13．權利要求12的方法，其中所述血管生成抑制劑與所述免疫綴合物一起共同給予。
14．權利要求12的方法，其中所述血管生成抑制劑在給予所述免疫綴合物之前給予。
15．權利要求12的方法，其中所述抗體結合位點以氨基末端至羧基末端的方向包含一個免疫球蛋白可變區、一個CH1結構域和一個CH2結構域。
16．權利要求15的方法，其中所述抗體結合位點還包含連接至所述CH2結構域羧基末端的一個CH3結構域。
17．權利要求12的方法，其中所述免疫綴合物為一種融合蛋白，所述融合蛋白以氨基末端至羧基末端的方法包含(ⅰ)抗體結合位點，包含一個能夠結合預定細胞類型上的細胞表面抗原的免疫球蛋白可變區、一個免疫球蛋白CH1結構域、一個免疫球蛋白CH2結構域，和(ⅱ)所述細胞因子。
18．權利要求17的方法，其中所述抗體結合位點還包含插入所述CH2結構域和所述細胞因子之間的一個CH3結構域。
19．權利要求12的方法，其中所述免疫綴合物的所述細胞因子選自腫瘤壞死因子、白介素、集落刺激因子和淋巴因子。
20．在哺乳動物中誘導針對預定細胞類型的免疫應答的組合物。所述組合物結合包含(ⅰ)免疫綴合物，包含一個能夠結合預定細胞類型的抗體結合位點和一個能夠在所述哺乳動物中誘導針對所述預定細胞類型的免疫應答的細胞因子，和(ⅱ)血管生成抑制劑，其量足以相對於僅用免疫綴合物而言而增強所述免疫應答。
21．權利要求20的組合物，其中所述抗體結合位點以氨基末端至羧基末端的方向包含一個免疫球蛋白可變區、一個CH1結構域和一個CH2結構域。
22．權利要求21的組合物，其中所述抗體結合位點還包含連接至所述CH2結構域羧基末端的一個CH3結構域。
23．權利要求20的組合物，其中所述免疫綴合物為一種融合蛋白，所述融合蛋白以氨基末端至羧基末端的方向包含(ⅰ)抗體結合位點，包含一個能夠結合預定細胞類型上的細胞表面抗原的免疫球蛋白可變區、一個免疫球蛋白CH1結構域、一個免疫球蛋白CH2結構域，和(ⅱ)所述細胞因子。
24．權利要求23的組合物，其中所述抗體結合位點還包含插入所述CH2結構域和所述細胞因子之間的一個CH3結構域。
25．權利要求20的組合物，其中所述免疫綴合物的所述細胞因子選自腫瘤壞死因子、白介素、集落刺激因子和淋巴因子。
26．權利要求20的組合物，其中所述血管生成抑制劑選自endostatin、制管張素、對αvβ3整聯蛋白具有結合親和性的肽、對αvβ3整聯蛋白具有結合親和性的抗體、對EGF受體具有結合親和性的肽、對EGF受體具有結合親和性的抗體、COX-2抑制劑、夫馬潔林、沙利度胺、抗血管生成細胞因子和細胞因子融合蛋白。
27．權利要求20的組合物，其中所述預定細胞類型為癌細胞。
全文摘要
公開了在哺乳動物中增強針對預定細胞類型的殺細胞免疫應答的組合物和方法。所述方法和組合物依賴於抗體—細胞因子免疫綴合物和血管生成抑制劑的組合。一旦給予所述哺乳動物後;由於所述免疫綴合物與所述血管生成抑制劑有協同作用,所述免疫綴合物誘導的針對所述預定細胞類型(例如癌細胞)的免疫應答大於僅用所述免疫綴合物誘導的免疫應答。所述方法和組合物在殺傷哺乳動物中的實體瘤或病毒感染細胞方面特別有用。
文檔編號C07K19/00GK1305386SQ99807249
公開日2001年7月25日 申請日期1999年4月15日 優先權日1998年4月15日
發明者S·D·吉利斯 申請人:利思進藥品公司