作為芥酸生物反應器的轉基因油菜的生產方法

2023-10-09 07:17:14 3

專利名稱：作為芥酸生物反應器的轉基因油菜的生產方法
技術領域：
本發明涉及植物育種，特別是利用基因工程技術改變油菜籽粒脂肪酸合成途徑，以利用油菜作為芥酸的生物反應器。
背景技術：
除食用外，世界上生產的植物油近三分之一用於非食用製品。從油料植物種子中分離和提取各種油脂化合物非常簡便，避免了對環境有害物質的產生[1，2]。
芥酸是重要的化工原料。油菜種子含有約40％(w/w)的油脂，是所有油料作物中油脂含量最高的[3]，其中芥酸含量的理論最高值佔油脂的66.6％(w/w)。以油菜作為芥酸的生物反應器，培育高芥酸特種工業用油菜品種，不僅為農業生產開闢了一個嶄新的領域，也為工業生產提供了廉價、可再生的原料。目前美國、加拿大、德國等主要油菜生產國家都投入巨資，應用基因工程技術培育超高芥油菜[4]。現已取得的主要研究結果有1.篩選到了具有高芥酸含量的植物材料高芥品種油菜其籽粒的芥酸含量佔所含油脂總量的50％左右，而生長在太平洋西北地區的一年生草本植物草地泡沫(Limnanthesa1b1)種子貯藏脂中C20脂肪酸和C22脂肪酸之和大於95％，在美國已開始進行該植物的培育、選種、種質評價和油的開發利用等方面的研究。此外，海甘蘭(Crambe abyssinica，芥酸含量為油脂量的55～63％)、鍛花(Lunaria annua，)、旱金蓮(Tropaeolum majus，芥酸含量為油脂量的78％，是迄今為止發現的唯一芥酸含量高於66％的植物資源)等也很有研究價值[5]。目前海甘蘭在中國的四川省已有小規模種植，並進行開發和研究[6]。
B、對芥酸生物合成途徑及相關酶系、基因有了較為完整的了解在油菜種子的發育過程中，光合器官合成的碳源轉運到種子細胞後，通過糖酵解途徑經磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)等前體，轉化成乙醯輔酶A，進入脂肪酸合成途徑。在質體中經乙醯Co-A羧化酶(ACCase)將乙醯Co-A合成為丙二酸單醯Co-A，在脂肪酸合成酶系複合體(FAS)作用下，經多次聚合，形成C181脂肪酸；碳鏈的延伸在醯基-ACP硫脂酶的作用下終止。C181脂肪酸從質體轉運到內質網或胞質中，在酮酯醯Co-A合成酶(KCS，即延伸酶)的作用下，C181脂肪酸轉化成C221脂肪酸，最後在內質網上通過三種不同的醯基轉移酶，即甘油3-磷酸醯基轉移酶(G3PAT)、溶磷脂醯基轉移酶(LPAAT)和二醯甘油醯基轉移酶(DAGAT)，分別在甘油上附連脂肪酸以合成甘油三酯(TAG)[7， 8，9，10，11，12]。該「從頭合成」途徑的多個關鍵酶基因已被克隆，其中PEP基因參與籽粒蛋白質、油脂含量比率調控；LPAAT基因調控芥酸與3-磷酸甘油結合成TAG的能力；而KCS基因與油菜籽粒貯藏脂中芥酸含量有很直接的關係[13，14，15，16]。綜上所述，可以認為，油菜籽粒中芥酸的高含量積累，主要依賴於如下幾個方面的因素1、籽粒油脂的高含量積累；2、C181脂肪酸向芥酸的高效轉化能力；3、合成的芥酸與3-磷酸甘油各位高效結合形成甘油三酯的能力。
C、探明了制約油菜芥酸含量的限制因素自然界的油菜，其芥酸的最高含量均在66％以下，這是由於十字花科植物中的溶磷脂醯基轉移酶(LPAAT)對181脂肪酸具有很強的底物特異性，不能在3-磷酸甘油的sn-2位上插入芥酸，使油菜籽粒中芥酸含量佔油脂量的理論最高值為66.6％[17]。必須在油菜中導入能在3-磷酸甘油sn-2位置上插入芥酸的LPAAT基因，才能使其芥酸含量極限值從66.6％提高至100％。這樣的基因已在池花屬植物草地泡沫(Limnanthes alba)和酵母中發現並被克隆，導入該基因的油菜轉化植株其油脂sn-2位上的芥酸含量的確明顯提高，最高可佔芥酸總量的22.3％[18，19，20]。
雖然利用基因工程技術培育超高芥油菜的研究已有諸多報導，但獲得的轉基因油菜，其油脂中芥酸含量也都在60％以下。國外現有高芥酸油菜(HEAR)品種其油脂中芥酸含量一般在53％左右，油脂量則約為42％，均為常規育種方法選育而成。國內有關工業用高芥酸油菜的育種近年來已開始受到重視，並通過常規育種途徑育成多個高芥酸油菜新品種，其油酯中芥酸含量為53～55％，但其籽粒油脂含量較低，一般在37％～40％之間。
綜上所述，可以認為，油菜籽粒中的芥酸含量(％)＝籽粒油脂含量(％)×油脂中芥酸含量(％)。油菜籽粒中芥酸的高含量積累，主要依賴於以下幾個方面的因素1)籽粒油脂的高含量積累；2)C181脂肪酸向芥酸的高效轉化能力；3)合成的芥酸與3-磷酸甘油各位高效結合形成貯藏酯的能力。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是在篩選的高芥酸油菜基因組中導入新的基因，並增強或抑制其原有基因的表達，獲得一種油菜品系，以提高其油脂合成能力並使之特異地高效合成和積累芥酸，使其籽粒中能超量蓄積芥酸，使這種油菜成為芥酸的生物反應器。
本發明採用的技術方案其一是包括篩選高芥酸油菜品種，其特殊之處是採用步驟①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenopyruvatecarboxylase；EC.4.1.1.31)基因PEP片段，並將其構建成Anti-PEP基因植物表達載體，②運用基因轉化技術將所述的Anti-PEP基因導入油菜基因組，獲得籽粒具有油脂高效合成特性的「高油」油菜，③製取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸醯基轉移酶(LPAAT)基因，並與植物表達載體中啟動子正向連接，構建成LPAAT基因植物表達載體，④運用基因轉化技術將所述的LPAAT基因導入油菜基因組，獲得籽粒具有芥酸與3-磷酸甘油高效結合特性的「高芥酸」油菜，⑤將所述的「高油」油菜和「高芥酸」油菜雜交，產生具有「高油」+「高芥酸」的「雙高」特性的F1代油菜植株。
本發明可以對所述的F1代植株進行篩選，以獲得穩定表達LPAAT基因和Anti-PEP基因的油菜植株。
所述的製取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸醯基轉移酶(LPAAT)基因，可以是人工合成該基因，也可以是從低等生物克隆該基因。
所述的籽粒具有油脂高效合成特性的「高油」油菜，是指經導入Anti-PEP基因，使油菜合成油脂/蛋白質過程中產生調控性，具有比原先更高效地合成油脂的特性所獲得的油脂含量高的油菜。
所述的「高芥酸」油菜，是指經導入LPAAT基因，油菜合成的芥酸能與3-磷酸甘油sn-2位高效結合所獲得的芥酸含量高的油菜。
所述的Anti-PEP基因導入油菜，此油菜優選的是人工篩選的籽粒油脂含量相對高的油菜，所述的LPAAT基因導入油菜，此油菜優選的是人工篩選的芥酸含量相對高的油菜。
本發明的技術方案其二是包括篩選高芥酸油菜品種，其特殊之處是採用步驟①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenopyruvatecarboxylase；EC.4.1.1.31)基因PEP片段，並將其構建成Anti-PEP基因植物表達載體，②製取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸醯基轉移酶(LPAAT)基因，並與植物表達載體中啟動子正向連接，構建成LPAAT基因植物表達載體，③將Anti-PEP基因、LPAAT基因轉入同一高芥酸油菜基因組，獲得其種子能超量合成和積累芥酸的雙轉基因油菜。
所述的製取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸醯基轉移酶(LPAAT)基因，可以是人工合成該基因，也可以是從低等生物克隆該基因。
所述的同一油菜，優選的是人工篩選的籽粒油脂和芥酸含量相對高的油菜。
具體地說，首先篩選出油脂含量相對高的油菜品種，在這種油菜中導入Anti-PEP基因，調控籽粒蛋白質/油脂含量比率，使更多糖酵解產物流入油脂合成途徑，以提高油菜種子油脂含量，獲得所述的「高油」油菜；篩選出芥酸含量相對高的油菜品種，以利用其高活性的KCS酶活性，使油菜籽粒能高效合成芥酸，在這種油菜菜中導入人工合成或從低等生物中克隆的能將芥酸連接到3-磷酸甘油sn-2位的LPAAT基因，使油菜籽粒中合成的芥酸能高效合成三芥醯甘油。Anti-PEP轉基因高油油菜與LPAAT轉基因高芥酸油菜雜交產生F1代油菜可同時表達anti-PEP基因與LPAAT基因，同時具有油脂高效合成能力、芥酸高效合成能力和將芥酸高效結合成三芥醯甘油的能力，因此能夠超量蓄積芥酸。將Anti-PEP基因、LPAAT基因轉入同一油菜基因組，獲得雙轉基因油菜種子具有超量合成和積累芥酸的特性。
通過對油菜基因組進行的上述改造，可大幅度提高油菜種子中芥酸的含量，使之成為芥酸的生物反應器。
本發明所述的人工篩選的籽粒油脂含量相對高的油菜和芥酸含量相對高油菜可通過常規育種途徑或轉基因途徑獲得。
本發明所述的PEP基因或其片段包括全基因，3｀或5｀端非翻譯區，內含子序列或編碼序列。所述的基因或其片段可以用市售的DNA合成儀人工合成。或者從油菜基因文庫篩選得到。或者採用PCR法擴增得到。優選的是套組PCR。PCR所用的引物是根據油菜PEP基因序列設計的。
本發明所述的LPAAT基因可為全基因。可從低等生物基因文庫中篩選得到，或者是經PCR擴增出的DNA、DNA片段，或採用人工合成的方法獲得。
本發明所述的構建anti-PEP基因植物表達載體和LPAAT基因植物表達載體包括從亞克隆中酶切出目的基因片段，電泳回收後與植物表達載體，例如pIG121或pBI121連接成轉化質粒，然後轉化大腸桿菌例如E.coliHB101感受態細胞，並進行抗性篩選。參見(Sambrook，T，TanaKa K，Monma T.Molecular CloningA LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory après，New York，1989)。
本發明所述的轉基因方法，可採用農桿菌介導法、基因槍法或花粉管引入法。其中，優選農桿菌介導法(參見，Sambrook T，TanaKaK，Monma T.Molecular CloningA Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory après，New York，1989)。經由農桿菌感染的油菜外植體(如無菌苗下胚軸)再生為正常植株(參見文獻22)。
本發明用於作為anti-PEP基因、LPAAT基因轉化受體親本的芥酸含量相對高的油菜可以是同一品種或不同品種，也可是雜交油菜組合。
具體實施例方式
以下舉例詳細說明利用本發明的實施方案，但本發明不限於下面提供的應用，以下描述不對本發明的保護範圍構成任何意義上的限定。
材料植物材料採用油脂和芥酸含量相對高的甘藍型油菜(Brassicanapus)品種。
菌株和質粒E.coli HB101、E.coli JM109、根癌農桿菌A.Tumefaciens EHA101、質粒pBS SK+、pUC19、超級雙元載體pIG121和pBI121。
酶和化學試劑限制性內切酶、小牛腸鹼性磷酸酶、T4-DNA連接酶、TaqDNA聚合酶購自MBI公司，DNA分子量標記λDNA/HindIII、PCR Marker購自華美生物技術公司，PCR引物由Sangon生物技術公司合成，X-gal、IPTG、X-glue購自Sigma公司，隨機引物標記試劑盒購自TaKaRa公司，γ-32PdCTP購自亞輝生物工程公司。
分子生物學技術除非另有說明，所有分子生物學技術一般按Sambrook T等在分子克隆實驗手冊(Sambrook T，TanaKa K，Monma T.MolecularCloningA Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratoryaprès，New York，1989)中提供的方法進行。
步驟與結果1.PEP基因片段的克隆根據Yanai等(Biosci Biotech Biochem，58(5)147-159)報導的油菜PEP基因序列，設計內外兩組引物Primer PEP1(5』-引物)5』-GGAATCTAAAGTAAACCGGC-3』(20-mer)Primer PEP2(5』-引物)5』-CTCTCTGAATCCTTCTGTAG-3』(20-mer)
Primer PEP3(3』-引物)5』-AACCGACGGCCGTGACTGTA-3』(20-mer)。
PCR反應條件50μl的反應體系中，含10×PCR buffer5μl，25mmol/L Mg2+3μl，2mmol/L dNTP5μl，Primer5』-、Primer3』各2.5μl，Taq DNA聚合酶1U，模板DNA50μg，94℃預變性10min後，94℃、30S，55℃、30S，72℃、30S，經30輪循環後，72℃延伸5min。
先用外側引物(Primer1，Primer3)擴增到了約610bp的DNA片段，再以此為模板，用內側引物(Primer2，Primer3)擴增到了一個530bp的DNA片段，與預期片段長度相符。擴增片段經T4DNA聚合酶補平3′端，用平端克隆法克隆至載體pBS SK+，用CaCl2法轉化E.coli JM109株感受態細胞。轉化子在含Amp、X-gal/IPTG的選擇平板上37℃生長過夜，挑取白色陽性重組菌落。提取質粒，經EcoRI和BamHI雙酶切，進行瓊脂糖製備性電泳。挑選克隆片段長度正確的重組子，進行Sanger的末端終止法(MBI公司370測序儀)DNA測序。其中一重組子的外源DNA片段序列與報導的油菜PEP基因相應的序列完全一致，以此重組子pPEP8作為進一步工作之用。
2.Anti-PEP(反義PEP)基因植物表達載體的構建選擇Xbal位點定向。在從pPEP8質粒中分離PEP基因片段時，先用內切酶EcoRI進行酶切，將酶切產物的5′粘性末端用T4-DNA聚合酶補平，再用XbaI酶切3′末端。用低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收所需片段。同理，用內切酶SmaI切開超級雙元載體pIG121產生平端，然後用XbaI酶切其3′末端。用T4DNA聚合酶將這兩個片段連接。這樣構建的重組質粒保證了PEP基因片段位於CaMV35S啟動子下遊、GUS報告基因下上遊，並與35S啟動子反向連接，得到重組質粒pPEPA5。
3.LPAAT基因的人工合成參照酵母LPAA(S)基因編碼的胺基酸序列，根據草地泡沫LPAAT(M)芥酸結合位點序列特徵，改變活性部位胺基酸，使產生的溶磷脂酸醯基轉移酶在3一磷酸甘油sn-2位具有強的芥酸結合活性；選擇油菜偏好密碼子，設計並人工合成LPAAT基因，並在5′端和3′分別加上BamH I限制性酶切位點。將合成產物克隆到pUC19的BamH I位點，用CaCl2法轉化E.coli JM109株感受態細胞。轉化子在含Amp、X-gal/IPTG的LB選擇平板上37℃生長過夜，挑取白色陽性重組菌落。小量提取質粒，經BamHI酶切，瓊脂糖電泳驗證。挑選克隆片段長度正確的重組子，採用Sanger的末端終止法用MBI公司370測序儀進行DNA測序。挑選外源DNA片段序列與預期的LPAAT基因序列完全一致的重組子作為進一步工作之用。
4.LPAAT基因植物表達載體的構建超級雙元載體pBI121含有由35S啟動子驅動的GUS基因及NOS啟動子驅動的NPTII基因，在其35S啟動子中加入種子特異性和發育調控元件SDRE，改造成種子特異表達載體質粒p189。質粒p189帶有籽粒特異表達啟動子ProSDRE，該質粒用Hind III+BamHI雙酶切，酶切產物經0.8％低熔點瓊脂糖凝膠電泳後回收含ProSDRE的DNA片段F189(長度為1.1kb)；質粒pLPAAT用BamHI酶切，0.8％低熔點瓊脂糖凝膠電泳，回收LPAAT基因片段FLPAAT(長度為～900bp)；FLPAAT用小牛腸鹼性磷酸酶(CIAP)脫磷，F189、FLPAAT採用T4DNA連接酶連接，連接產物亞克隆到SK+載體；LPAAT-A基因5′端375位有一Bgl II酶切位點，小量提取各重組子質粒，用Hind III+Bgl II雙酶切，獲得1.4～1.5kb長度DNA片段的質粒為連接方向正確的重組子，選擇該重組子(pLPAAT2)作為後繼工作之用。
質粒pLPAAT2用Hind III+Sac I雙酶切，酶切產物用0.8％低熔點瓊脂糖凝膠電泳，回收啟動子ProSDRE與LPAAT基因的連接片段(2.1kb)。植物表達載體pIG121用Hind III+Sac I雙酶切，切除載體原有的35S啟動子+GUS基因部分，酶切產物用0.8％低熔點瓊脂糖凝膠電泳，回收21kb片段，回收產物用CIAP脫磷。脫磷後的載體與ProSDRE+LPAAT基因片段用T4DNA連接酶連接，得到重組質粒。用以上重組質粒轉化E.coli HB101感受態細胞，在含100μg/ml Km的LB平板上進行抗性篩選，陽性克隆用PCR法進行鑑定。分別在pLPAAT中籽粒特異表達啟動子部分和LPAAT基因中選擇部分序列來設計PCR引物。
Primer LPAAT 1(5』-引物)5』-CACCAACTCAACCCATCA-3』(18-mer)，Primer LPAAT 2(3』-引物)5』-GGGTCTATATACTACTCT-3』(18-mer)。
經PCR鑑定為正確的重組子(命名為pLPAAT)，即為LPAAT基因籽粒特異表達載體。用三親交配法將pLPAAT導入根癌農桿菌EHA101，獲得EHA101/pLPAAT，用作進行植物轉化。
5.Antu-PEP、LPAAT基因導入油菜基因組①植物表達載體導入根癌農桿菌用鹼法從大腸桿菌HB101/pPEPA5和HB101/pLPAAT中分別提取質粒pPEPA5和pLPAAT。
用電擊法將pPEPA5導入根癌農桿菌EHA101，獲得EHA101/pPEPA5，將pLPAAT導入根癌農桿菌EHA101，獲得EHA101/pLPAAT，將pPEPA5和pLPAAT同時導入同一根癌農桿菌EHA101，獲得EHA101/pPEPA5+pLPAAT；以上導入植物表達載體的農桿菌分別用作油菜轉化。
②油菜的轉化及植株再生載體pIG121帶有由35S啟動子驅動的GUS基因和潮黴素抗性基因及NOS啟動子驅動的NPTII基因，因此轉基因油菜植株可用潮黴素進行篩選，並可通過GUS基因的檢測來判斷外源基因的整合。超級雙元載體pBI121含有由35S啟動子驅動的GUS基因及NOS啟動子驅動的NPTII基因，轉化油菜植株可用潮黴素進行篩選，後代可通過PCR方法檢測。以生長8天的油菜無菌苗下胚軸為轉化外源基因的受體，用生長至對數期限的農桿菌EHA101/pPEPA5(或EHA101/pLPAAT或EHA101/pPEPA5+pLPAAT)感染外植體，共培養2天後，轉至含500mg/L羧苄青黴素(Cb)的MS培養基上，一周後轉到含500mg/LCb和10mg/L潮黴素(hgr)的MS分化培養基上進行抗性篩選。經3～4周的培養，下胚軸兩端長出小愈傷，並逐漸產生綠色的抗性芽和白色的非抗性芽。待芽長至1cm高，轉入含相同抗生素的生根培養基，2周後出根長成完整小植株。小植株經煉苗後，移栽入土中，植株可進一步生長，發育並產生種子。
6.轉基因油菜的鑑定PCR方法可以快速地測定外源基因在轉化再生植株中的整合。
Anti-PEP轉基因植株的PCR擴增由於油菜本身帶有內源PEP基因，因此，在用PCR方法檢測anti-PEP轉基因植株時，不能用PEP基因本身的序列來設計引物。本研究採用GUS報告基因的兩端引物來進行PCR擴增。
Primer GUS1(5』-引物)5』-CGTAAGGGATGACGCACAAT-3』(20-mer)，Primer GUS2(3』-引物)5』-CGCAAGACCGGCAACAGG-3』(18-mer)。
提取再生植株總DNA，以此為模板，進行PCR。Anti-PEP轉基因植株擴增出了與含Anti-PEP基因的重組質粒PEPA5擴增片段相同分子量的條帶，而對照植株未擴增出相應條帶。
LPAAT基因轉基因植株的PCR擴增分別在pLPAAT中籽粒特異表達啟動子部分和LPAAT基因中選擇部分序列來設計PCR引物。
Primer LPAAT 1(5』-引物)5』-CACCAACTCAACCCATCA-3』(18-mer)，Primer LPAAT2(3』-引物)5』-GGGTCTATATACTACTCT-3』(18-mer)。
LPAAT轉基因植株擴增出了與含LPAAT基因的重組質粒pLPAAT擴增片段相同分子量的條帶，而對照植株未擴增出相應條帶。
Anti-PEP基因、LPAAT基因雙價雙轉植株的PCR檢測由於質粒pLPAAT中不帶有GUS基因，對GUS引物和LPAAT引物PCR擴增均為陽性的植株同時具有Anti-PEP基因和LPAAT基因。
7.Anti-PEP轉基因油菜×LPAAT轉基因油菜雜交法以Anti-PEP轉基因油菜和LPAAT轉基因油菜分別為父母本，進行雜交制種。
制種技術①掌握父母本的行比母本適當密植，促使開花集中，並抑制後期再發可育分枝。父母本行比均以2∶3較為適宜。父本行株距33cm×33cm，母本行株距26-33×13-17cm，父母本間行距40cm。
②適當調整播種期，促使父母本花期相遇。
③對母本進行輔助授粉，提高制種量花期採取推株並壟，使父母本花序接近。在上午10-12時，撥動父本花序使花粉散落於母本花序上。可起到輔助授粉、提高結實率的作用。
④成熟時在母本行收F1代雜交種子。
雙價雙轉油菜的篩選收穫的F1代種子播種後，用PCR方法對F1代植株進行篩選，對GUS引物和LPAAT引物PCR擴增均為陽性的植株為Anti-PEP×LPAAT雙價雙轉油菜。
8.LPAAT-A/anti-PEP基因雙轉法將採用上述步驟與結果中1.-4.所述方法構建的pPEPA5和p LPAAT用電擊法導入同一根癌農桿菌EHA101，採用5.-②所述方法，用帶有pPEPA5和pLPAAT兩個雙元載體的根癌農桿菌轉化高芥酸油菜，並採用6.所述方法進行PCR檢測對GUS引物和LPAAT引物PCR擴增均為陽性的植株同時具有Anti-PEP基因和LPAAT基因，為LPAAT-A/anti-PEP基因雙價雙轉油菜。
9.轉基因油菜種子油脂、芥酸含量的測定種子含油量測定 採用改良索氏法測定。
種子芥酸含量測定 按GB10219，採用氣相色譜法測定。
表1.Anti-PEP轉基因油菜含油量株系含油量(％乾重) 含油量提高值(％)對照141.7超油2-1 52.826.6超油2-2 51.824.2超油2-3 51.523.5超油2-4 51.122.5表2.LPAAT轉基因油菜芥酸含量株系芥酸含量(W/W) 芥酸提高值(％)對照245.48超芥1-1 53.9418.6超芥1-2 52.1114.6超芥1-3 51.6013.5超芥1-4 50.9612.0
以上以舉例方式詳細描述了本發明的實施過程，但對本領域熟練技術人員來說，顯而易見的是，在實施過程中可進行許多等效的修改和替換。因此，本發明的範圍僅以權利要求書的限定為準。
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22.陳錦清等.1999，反義PEP基因調控油菜籽粒油脂蛋白質含量比率的研究.農業生物技術學報，7(4)316-320.
權利要求
1.作為芥酸生物反應器的轉基因油菜的生產方法，其特徵是採用步驟①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenopyruvatecarboxylase；EC.4.1.1.31)基因PEP片段，並將其構建成Anti-PEP基因植物表達載體，②運用基因轉化技術將所述的Anti-PEP基因導入油菜基因組，獲得籽粒具有油脂高效合成特性的「高油」油菜，③製取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸醯基轉移酶(LPAAT)基因，並與植物表達載體中啟動子正向連接，構建成LPAAT基因植物表達載體，④運用基因轉化技術將所述的LPAAT基因導入油菜基因組，獲得籽粒具有芥酸與3-磷酸甘油高效結合特性的「高芥酸」油菜，⑤將所述的「高油」油菜和「高芥酸」油菜雜交，產生具有「高油」+「高芥酸」的「雙高」特性的F1代油菜植株。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵是對所述的F1代植株進行篩選，獲得穩定表達LPAAT基因、Anti-PEP基因的油菜植株。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵是所述的製取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸醯基轉移酶(LPAAT)基因，是指人工合成該基因或從低等生物克隆該基因。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵是供Anti-PEP基因導入的油菜是人工篩選的籽粒油脂合成量相對高的油菜，供LPAAT基因導入的油菜是人工篩的籽粒芥酸含量相對高的油菜。
5.作為芥酸生物反應器的轉基因油菜的生產方法，其特徵是採用步驟①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenopyruvatecarboxylase；EC.4.1.1.31)基因PEP片段，並將其構建成Anti-PEP基因植物表達載體，②製取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸醯基轉移酶(LPAAT)基因，並與植物表達載體中啟動子正向連接，構建成LPAAT基因植物表達載體，③將Anti-PEP基因、LPAAT基因轉入同一油菜基因組，獲得籽粒具有「雙高」特性的雙轉基因油菜。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵是所述的製取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸醯基轉移酶(LPAAT)基因，是指人工合成該基因或從低等生物克隆該基因。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵是所述的同一油菜是人工篩選的籽粒油脂和芥酸含量相對高的油菜。
全文摘要
作為芥酸生物反應器的轉基因油菜的生產方法，採用步驟①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因PEP片段，將其構建成Anti－PEP基因植物表達載體，②運用基因轉化技術將Anti－PEP基因導入油菜基因組，獲得籽粒具有油脂高效合成特性的「高油」油菜，③製取能將芥酸高效連接到3－磷酸甘油sn－2位的溶磷脂酸醯基轉移酶(LPAAT)基因，並與植物表達載體中啟動子正向連接，構建LPAAT基因植物表達載體，④運用基因轉化技術將LPAAT基因導入油菜基因組，獲得籽粒具有芥酸與3－磷酸甘油高效結合特性的「高芥酸」油菜，⑤將「高油」油菜和「高芥酸」油菜雜交，產生具有「高油」+「高芥酸」特性的F
文檔編號A01H1/02GK1436849SQ0210297
公開日2003年8月20日 申請日期2002年2月9日 優先權日2002年2月9日
發明者陳錦清, 黃銳之, 朗春秀, 劉智宏, 胡張華 申請人:浙江綠洲農業股份有限公司