一種新型微生物天然色素的製備方法
2023-10-09 11:45:34 1
專利名稱：一種新型微生物天然色素的製備方法
技術領域：
本發明涉及的技術領域為微生物工程(或工業生物技術)，具體為一種天然色素的微生物製備方法，包括微生物菌種選擇、微生物規模培養工藝和天然色素提取工藝三大部分。本發明形成的產品(天然色素)主要用作食品、飲料、藥品、化妝品的著色劑和抗氧化劑，也可作為一些保健食品和藥品的功效成分。
背景技術：
天然色素與人工合成色素是食品、藥品、化妝品著色劑的兩大類型，是改善產品外觀和產品質量的重要原料。當前，東方國家的色素消費以天然色素為主，西方國家以合成色素為主。隨著世界色素消費朝「天然、健康、安全」方向發展，合成色素在未來有被全面禁用的可能，應用天然色素將成為未來著色劑市場的主流和大趨勢。研究表明，許多天然色素是生理活性物質，具有營養作用、疾病預防與治療作用等功能。天然色素主要來源於植物、動物和微生物三大生物材料，其中絕大部分來自於植物；按其有效成分的化學結構特點可分為卟啉類化合物、異戊二烯化合物、多酚類化合物、酮類化合物和醌類化合物等類別，目前市場上的主要商品品種有β-胡蘿蔔素、辣椒紅、葉黃素、葉綠素銅鈉鹽、高梁紅、紅曲紅、甜菜紅等。
面對天然色素的強勁市場需求和科學技術的迅猛發展，研發人員和生產商有必要在原材料的來源和色素的提取工藝兩方面開展工作，開發出更多更好的天然色素。本發明生產的天然色素是一種微生物天然色素，是由幾種異戊二烯化合物組成的混合物。
1、生產菌種——紫色非硫細菌利用微生物生產色素的工藝具有很多優點，如微生物繁殖速度快、培養設置簡單，培養原料廣泛、價格低，培養過程能耗少，使得色素原料供應穩定可靠、成本低。所以，微生物色素的研究與開發具有廣闊的前景與發展潛力。目前已被商品開發的微生物色素非常少，僅有紅曲紅、紅曲黃、法夫酵母色素等幾種，被開發的微生物也僅紅曲屬、法夫酵母等真菌，而在細菌等原核生物中進行微生物色素研究開發現在還是空白。新型微生物天然色素的生產菌種為紫色非硫細菌(PNB，Purple nonsulfur bacteria)，分類上屬於原核生物界細菌門真細菌綱紅螺菌目紅螺菌科(Rhodospirillaceae)的所有細菌，包括沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、嗜酸紅假單胞菌(Rhodopseudomonasacidophila)、膠質紅假單胞菌(Rhodopseudomonas gelatinosa)、莢膜紅假單胞菌(Rhodopseudomonas capsulate)、球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonassphaeroides)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、萬尼氏紅微菌(Rhodomicrobium vannielii)等菌種。
2、原料生產——紫色非硫細菌的規模培養工藝紫色非硫細菌的規模培養工藝主要包括以下幾個技術構成發酵或培養裝置、培養方式、培養基配方與原料、培養環境參數、代謝調控方法等。
用於紫色非硫細菌(PNB)的裝置常稱為光合反應器，必需考慮到光源和光照的分布。目前的裝置大都簡單、簡陋，採用透明材料直接利用太陽光。從開發高附加值的產品的角度，未來的光合反應器應該配置有人工光源和智能控制系統，以保證培養物的質量和數量。總的來說，現在還沒有比較理想的光合反應器，有待科研人員進一步設計開發。液體培養或發酵方式主要有批次培養、批次-補料培養、半連續培養與連續培養類型，這些類型均已應用於化能異養型微生物(酵母、芽孢桿菌、放線菌等)的培養。但是，目前的PNB培養方式主要以批次培養為主，連續培養方式還很少採用。微生物的培養基主要構成為碳源、氮源、磷源、生長因子、無機鹽、微量元素。對於PNB的培養基研究報導很多，其中以簡單的低分子有機物作為供氫體和碳源是紫色非硫細菌培養基的主要特色。已有報導指出，有機酸(乙酸、丙酸、C4二羧酸、丙氨酸、胺基酸)及其相應的有機酸鹽、雙糖(果糖等)都可被紫色非硫細菌很好利用，但是大多不能利用單糖(葡萄糖等)。對於從PNB中開發高附加值產品而言，有必要尋求較高衛生要求的、更為廉價充足的培養基原料。批次培養時，光照、氧、溫度、pH、接種量等都是PNB培養工藝中的環境參數，對PNB的產率有顯著影響。光照在2000lux左右、溶氧0.5ppm以下、溫度30-37℃、pH 5.5-8.5、接種量有利於PNB的增殖，經過4-7天培養，可達到培養液OD660吸光值1.5以上，收穫菌體乾重4.2--7.5g/L培養液。過高過低的光照明顯影響PNB的生物量，其他參數也有相同的抑制效應。連續培養時，除了以上參數外，培養液流量、培養液濃度也是重要的參數。目前這種方式沒有採用，也沒有相應的參數總結。
3、天然色素的提取工藝紫色非硫細菌是光能異養型的格蘭氏陰性菌，細胞結構非常簡單，使得提取容易、工藝簡單和費用低，提取的回收率高；另外提取後廢物少，無環境影響，綜合開發價值大。
天然色素很多是混合物，傳統的色素提取主要有下列方法溶劑提取法、粉碎壓榨法、酶反應法、培養提取法等。溶劑提取法的工藝簡單、設備投資少、技術易掌握、適用範圍廣，是目前較普遍採用的方法。在此方法中，一般用水或親水性有機溶劑乙醇、甲醇、丙酮等提取水溶性色素，而用己烷、二氯甲烷、石油醚等提取脂溶性色素。粉碎壓榨法，利用擠壓的方法將粉碎後的新鮮植物的葉、果、皮中色素成分隨植物漿液擠壓出來，適宜於水溶性色素的提取，但壓榨出的成分過於複雜，需要其他方法精製。酶反應法，即通過對原料進行酶反應產生所需的顏色，再用其他方法提取出來，如經過酶處理產生的梔子藍、紅色素。培養提取法，將菌株散布於培養基中，培養後乾燥、粉碎、浸提得到色素，如藍藻色素。
在色素提取中，近年發展起來許多先進的新技術，如微波萃取、超臨界流體萃取、膜分離技術、冷凍萃取等，得到的色素質量一般很好。通過這些新工藝的工藝選擇、參數優化、設備設計及製造，實現了色素製造的連續化、自動化和清潔化，達到了食品GMP要求。膜分離技術的應用是化學工業、食品工業和製藥工業中新興的一項分離技術，它利用高分子膜材料，從液體中分離和純化有效成分，與傳統的精製提純法相比，其優點是降低成本，縮短工時，減少汙染。缺點是設備投資較大，目前國內外已有廠家使用該工藝生產天然色素產品。超臨界流體萃取是一項新興的萃取和分離技術，其優點是無化學溶劑消耗和殘留、無汙染、避免萃取物在高溫下的熱劣化、保護生理活性物質的活性。一些研究結果表明，超臨界CO2萃取異戊二烯化合物等脂溶性物質是非常適合的，且工藝簡單，能耗低，易回收，提取效率高達90％以上；並總結給出了多種生物材料(水果、蔬菜、藻類等)中異戊二烯化合物最高萃取率時的工藝參數(萃取壓力、溫度、流量、萃取時間)。但是，利用超臨界CO2萃取光合細菌中異戊二烯化合物的工作還沒有開展。
4、天然色素的分離純化工藝近年來分離、純化新技術的應用使得複雜天然色素組分的分離和純化工作取得了突破性進展，一些純度很高的單體化合物色素已開始被生產。這些技術(如液滴逆流色譜法、大網格樹脂吸附色譜法、凝膠色譜法、高效液相色譜法等)目前還存在投資大、運行費用高、技術難度大等缺點，很少在工業上採用。隨著天然色素在安全性方面的優越性日益受到重視，隨著技術的進步和設備的先進，單體化合物天然色素的開發與應用將更加深入，更加廣泛。
發明內容
本發明的目的在於提供一種微生物天然色素的生產工藝，包括微生物菌種選擇、微生物規模培養和色素提取三個主要工藝環節。形成的產品是全新的天然色素品種，而且生產設備設施、技術等方面相對成熟，可實現微生物天然色素的產品化、商業化和規模化。
本發明的目的可以通過以下措施來達到一種新型微生物天然色素的製備方法，其特徵在於主要包括以下步驟a、用來製備天然色素的微生物菌種為紫色非硫細菌。
b、培養紫色非硫細菌的裝置為光合反應器，確定相應的培養環境參數、培養基配方與原料。
c、使用絮凝技術收集細菌體，使用噴霧乾燥技術乾燥細菌。
d、使用超臨界二氧化碳萃取技術提取乾燥細菌中的天然色素。
e、使用大豆油溶解保存天然色素或者用棕色玻璃瓶冷凍保存天然色素。
本發明的目的還可以通過以下措施來達到①選用的微生物菌種包括沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、嗜酸紅假單胞菌(Rhodopseudomonas acidophila)、膠質紅假單胞菌(Rhodopseudomonas gelatinosa)、莢膜紅假單胞菌(Rhodopseudomonascapsulate)、球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、萬尼氏紅微菌(Rhodomicrobium vannielii)等。這些細菌菌體中類胡蘿蔔素不低於30-60mg/g幹細胞。
②所用光合反應器由三個連續的單元組成5升容量的擴大培養單元、50升容量的種子培養單元、4000升容量的規模培養單元，三個單元均為長方體形狀，兩個對稱的並立箱體組成一個單元，並立箱體中間分布配置了光照系統。箱體所用材料主要為鋼化透明玻璃、不鏽鋼鋼材。
③培養劑配方和原料主要為蛋白腖2～4％、酵母膏1～2％、食鹽0.5％、碳酸氫鈉0.2～0.5％、對氨基苯甲酸鈉0.01～0.03％。培養環境參數主要為起始接種量8～10％、光照2000～3000lux、溶氧0.5ppm以下、溫度30～37℃、pH5.5～8.5。收穫時的參數為培養液在660nm波長下吸光值大於1.5以上。
④使用絮凝技術收集細菌體，採用的絮凝劑為高分子有機物——聚丙烯醯胺，使用量為每噸培養液10公斤。使用噴霧乾燥技術乾燥細菌，乾燥參數為設置溫度160～180℃，空氣流量為每小時20個立方。至少可收穫幹細胞不低於5-8克/L培養液。
⑤超臨界二氧化碳萃取技術提取幹菌體中的天然色素。所使用的流體為純度99％的二氧化碳，萃取壓力為15～25Mpa、溫度40～50℃、流量20kg/h，萃取時間為1～2h，天然色素的提取率可達90％以上。該色素主要含有螺菌黃素、紫菌紅醇化合物，含量分別在60％、30％以上。
⑥使用大豆油溶解保存天然色素，配製的濃度為20～30％；或者用棕色玻璃瓶保存天然色素，保存條件為避光、充氮氣、密封、冷凍(-20℃左右)。
⑦天然色素的濃度可使用可見光分光光度法和高壓液相色譜法來測定。
本發明相比現有技術具有如下優點細菌培養原料簡單，價格低，能耗少，培養成本低；細菌繁殖速度快，培養設置簡單、多樣，可進行工廠化高密度培養，提取原料供應穩定可靠；細菌細胞結構簡單，提取容易，回收率高，提取工藝簡單和提取費用低；超臨界流體萃取的色素無溶劑殘留，天然健康。本方明方法生產的產品，可以提供全新的色素品種，可以滿足不斷增長的天然色素的市場需求。
具體實施例方式
本發明下面將結合實施例作進一步詳述具體操作工藝如下(1)建立細菌培養車間，安裝光合反應器。最小規格的培養車間規格為30×10×3m(長×寬×高)，可以布置一套由三個連續單元組成的光合反應器，5升容量的擴大培養單元、50升容量的種子培養單元、4000升容量的規模培養單元串聯排列。安裝水電、光照和控溫系統。
(2)準備菌種液。在實驗室提純、復壯紫色非硫細菌，在光照培養箱中培養到不低於5升的接種液。選用的微生物菌種包括沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、嗜酸紅假單胞菌(Rhodopseudomonasacidophila)、膠質紅假單胞菌(Rhodopseudomonas gelatinosa)、莢膜紅假單胞菌(Rhodopseudomonas capsulate)、球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonassphaeroides)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、萬尼氏紅微菌(Rhodomicrobium vannielii)等。
(3)準備培養基原料，按培養基配方配製培養基。培養劑配方和原料主要為蛋白腖2～4％、酵母膏1～2％、食鹽0.5％、碳酸氫鈉0.2～0.5％、對氨基苯甲酸鈉0.01～0.03％。
(4)起始培養時，首先在擴大培養單元接種菌種，添加培養基，培養4～6天然後培養液灌入種子培養單元，添加培養基，培養4～6天；再把培養液灌入規模培養單元，添加培養基，培養4～6天。起始培養完成後，三個單元均可連續、獨立運行，進行生產。三個單元的培養環境參數均相同，主要為起始接種量8～10％、光照2000～3000lux、溶氧0.5ppm以下、溫度30～37℃、pH5.5～8.5。收穫時的參數為培養液在660nm波長下吸光值大於1.5以上。
(4)建設菌體預處理車間，安裝圓柱形容器。最小規格的預處理車間規格為20×10×3m(長×寬×高)，可以布置幾個獨立的圓柱形容器。容器直徑為2m，高度為2.5m。培養液泵入容器中，加入絮凝劑聚丙烯醯胺，使用量為每噸培養液10公斤。靜置30min以後，抽排上層清夜到培養車間再利用，然後收集容器底的細菌體。
(5)建設乾燥車間，安裝噴霧乾燥機器。最小規格的乾燥車間規格為15×15×8m(長×寬×高)，安裝乾燥能力50kg/h的噴霧乾燥機。通過噴霧乾燥工藝，把預處理車間收集到的溼菌體乾燥為幹菌體，含水量在1～4％。
(6)建設提取車間，安裝超臨界流體萃取設備。最小規格的提取車間規格為30×15×4m(長×寬×高)，安裝萃取釜容量為50升的超臨界流體萃取設備。把乾燥後的菌體填入萃取斧，採用99％純度食品級二氧化碳為萃取介質，啟動超臨界萃取設備，設萃取參數為壓力15～25Mpa、溫度40～50℃、流量20kg/h，萃取時間為1～2h。之後在分離斧收集提取的天然色素，天然色素的提取率可達90％以上。主要含有螺菌黃素、紫菌紅醇化合物，含量分別在60％、30％以上。
(7)建設劑型車間，安裝溶解裝置和液體灌裝線，還可布置大容量冷凍冰櫃。最小規格的提取車間規格為30×30×4m(長×寬×高)。使用大豆油從分離斧中溶解出天然色素，然後配製濃度為20～30％的天然色素大豆溶液，通過灌裝線灌入小容量的容器中，包裝後產品放在陰涼、避光處儲存；或者把分離斧中的天然色素倒入棕色玻璃瓶中，充入氮氣後密封，在大容量冷凍冰櫃(-20℃左右)中保存天然色素。
(8)天然色素的濃度可使用可見光分光光度法和高壓液相色譜法來測定。
權利要求
1.一種新型微生物天然色素的製備方法，其特徵在於主要包括以下步驟a、用來製備天然色素的微生物菌種為紫色非硫細菌。b、培養紫色非硫細菌的裝置為光合反應器，確定相應的培養環境參數、培養基配方與原料。c、使用絮凝技術收集細菌體，使用噴霧乾燥技術乾燥細菌。d、使用超臨界二氧化碳萃取技術提取乾燥細菌中的天然色素。e、使用大豆油溶解保存天然色素或者用棕色玻璃瓶冷凍保存天然色素。
2.根據權利要求1所述的工藝，其特徵在於所用菌種為紫色非硫細菌，包括沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、嗜酸紅假單胞菌(Rhodopseudomonas acidophila)、膠質紅假單胞菌(Rhodopseudomonasgelatinosa)、莢膜紅假單胞菌(Rhodopseudomonas capsulate)、球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、萬尼氏紅微菌(Rhodomicrobium vannielii)等菌種。
3.根據權利要求1所述的工藝，其特徵在於所用光合反應器由三個連續的單元組成5升容量的擴大培養單元、50升容量的種子培養單元、4000升容量的規模培養單元，三個單元均為長方體形狀，兩個對稱的並立箱體組成一個單元，並立箱體中間分布配置了光照系統。箱體所用材料主要為鋼化透明玻璃、不鏽鋼鋼材。
4.根據權利要求1所述的工藝，其特徵在於培養劑配方和原料主要為蛋白腖2～4％、酵母膏1～2％、食鹽0.5％、碳酸氫鈉0.2～0.5％、對氨基苯甲酸鈉0.01～0.03％。培養環境參數主要為起始接種量8～10％、光照2000～3000lux、溶氧0.5ppm以下、溫度30～37℃、pH 5.5～8.5。
5.根據權利要求1所述的工藝，其特徵在於超臨界二氧化碳萃取技術提取幹菌體中的天然色素。所使用的流體為純度99％的二氧化碳，萃取壓力為15～25Mpa、溫度40～50℃、流量20kg/h，萃取時間為1～2h。
6.根據權利要求1所述的工藝，其特徵在於主要含有螺菌黃素、紫菌紅醇化合物，含量分別在60％、30％以上。
7.根據權利要求1所述的工藝，其特徵在於使用大豆油溶解保存天然色素，配製的濃度為20～30％。
全文摘要
一種新型微生物天然色素的製備方法，其特徵在於①用來製備天然色素的微生物菌種為紫色非硫細菌，天然色素主要含有螺菌黃素、紫菌紅醇，含量分別在60％、30％以上。②培養裝置為並立箱體和光照系統組成光合反應器。③培養劑配方和原料主要為蛋白腖2～4％、酵母膏1～2％、食鹽0.5％、碳酸氫鈉0.2～0.5％、對氨基苯甲酸鈉0.01～0.03％。培養環境參數主要為起始接種量8～10％、光照2000～3000lux、溶氧0.5ppm以下、溫度30～37℃、pH5.5～8.5。④使用絮凝技術收集菌體、噴霧乾燥技術乾燥細菌⑤使用超臨界二氧化碳萃取技術提取乾燥細菌中的天然色素；萃取壓力為15～25Mpa、溫度40～50℃、流量20kg/h，萃取時間為1～2h。⑥使用大豆油溶解保存天然色素或者用棕色玻璃瓶冷凍保存天然色素。
文檔編號C12N1/20GK1948400SQ20061003225
公開日2007年4月18日 申請日期2006年9月15日 優先權日2006年9月15日
發明者劉飛, 何農躍, 趙謀明, 邱深山, 楊雄 申請人:湖南工業大學