一種表達載體及其構建和應用的製作方法

2023-10-10 07:47:14 1

專利名稱：一種表達載體及其構建和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子遺傳學技術領域，具體地說是一種表達載體及其構建和應用。
背景技術：
具有優良性狀的良種家畜一直是畜牧業的重要資源，但是優良性狀的培育是一個漫長的過程，而且不確定因素還很多。通過轉基因技術可以定向、快速的培育良種家畜的優良性狀，2006年8月，世界第一個利用轉基因羊乳腺生物反應器生產的人藥重組蛋白在歐洲獲得上市，它標誌著轉基因動物是可以為人類服務的。目前，世界各國紛紛加大投資和研發力度，力求在轉基因育種技術的激烈國際競爭中取得領先，中國也啟動了「轉基因重大專項」，可見轉基因技術已經成為我國和世界研究和發展的熱點。轉基因細胞和轉基因動物的生產需要通過載體來導入外源DNA，為了從眾多的非轉基因細胞中篩選出轉基因細胞，幾乎所有的導入載體都帶有標記基因，對轉基因動物生產的應用等方面存在潛在的安全隱患，限制了轉基因動物安全證書的申請。Cre酶可以識別兩段Loxp序列，如果同一段DNA上兩個Loxp序列方向一致，Cre 酶會將兩個Loxp序列間的DNA切除。目前將cre-loxp系統應用於轉基因的方式，是將Cre 酶和Ioxp系統分開轉染，增加了工作量，同時，由於Cre/Loxp系統的可逆性，降低了細胞轉基因和轉基因動物的成功率。由此可見，上述現有的表達載體在結構與使用上，顯然仍存在有不便與缺陷，而亟待加以進一步改進。為了解決現有的表達載體存在的問題，本發明人基於從事此類技術研究多年豐富的實務經驗及專業知識，並配合學理的運用，積極加以研究創新，以創設一種新型結構的表達載體，以改進一般現有轉基因表達載體存在的缺陷，使其更具有實用性。

發明內容
為了解決現有技術中存在的上述問題，本發明提供了一種表達載體，增加了轉基因動物的安全性。為了解決上述技術問題，本發明採用了如下技術方案一種表達載體，在線性化載體的非目的基因的兩端加入Loxp序列，同時引入誘導表達啟動子組分，啟動Cre酶的表達。進一步，所述表達載體包括Ptight (bp 33-348)選擇性啟動子，由Tet-On Advanced蛋白亞基與四環素類似物共同啟動；Cre (bp 371-1402)表達Cre酶，識別兩段Loxp序列，並發生同源重組；SV40 PolyA (bp 1403-1603)多聚腺苷酸信號；LoxP (bp 1619-1652)、(bp 1690-1723)，Cre 酶識別序列；MCS(bp 1654-1689)多克隆位點，用於插入目的基因；CMV 啟動子(bp 1829-2429)，啟動 Tet-On Advanced、TK、DsRed 的表達；
Tet-On Advanced (bp 2381-3124)表達Tet-On Advanced蛋白亞基，在四環素的共同作用下，可以激活Ptight啟動子，啟動Cre酶轉錄和表達；T2A 序列(bp 3134-3193)； TK胸苷激酶(bp 3194-4324)，使丙氧鳥苷三磷酸化，抑制DNA聚合酶活性；IRES 序列(bp 4357-4941)；DsRed2 (bp 4961-5638)紅色螢光蛋白基因，選擇標記基因；Psv40啟動子(bp 65514-6784)，啟動抗性基因的表達；KanR/NeoR(bp 6867-7661)是卡那黴素和新黴素的抗性基因；HSV TK PolyA (bp 7897-7915)多聚腺苷酸信號。進一步，所述表達載體的序列如序列表SEQ =ID NO 1所示。本發明的另一目的為提供一種上述表達載體的構建方法。其技術方案如下一種表達載體的構建方法，包括如下步驟1)合成IoxP-MCS-IoxP序列，並通過EcoRI和SalI酶切連接到pDsRed2_l質粒， 得到的質粒命名為pDsRed-LoxP ；2)從pIRES2-EGFP上通過PCR得到CMV啟動子，在引物的兩端引物Sal I和Asp 718 I酶切位點，命名為Pcmv;3)將PCR所得片段經酶切後連接到pDsRed-LoxP質粒中，得到pDsRed-LoxP-CMV 質粒；4)對已知質粒查詢，獲得Tet-On Advanced組件、TK基因和IRES序列，並在Tet-On Advanced和TK基因之間引入T2A多肽，並在整體片段的兩端設計Asp718 I和BamH I酶切位點，命名為Tet-On TK ；5)將步驟4中所合成基因片段雙酶切後連接到pDsRed-Loxp-CMV質粒中，命名為 pTet-On RL 質粒；6)查詢GeneBank中Cre酶基因，通過密碼子優化後並在兩端加入EcoR I和Xba I酶切位點，合成後命名為Cre ；7)將步驟6合成的Cre酶基因經EcoR I和Xba I雙酶切，連接到pTRE_Tight質粒中，經Xho I單酶切後得到的片段命名為Ptight-Cre ；8)將質粒pTet-On RL用Xho I單酶切後，與Ptight-Cre片段連接，得到名稱為 pTRE Tet-On RL 的質粒。本發明還提供了一種上述表達載體的應用。增加了轉基因動物的安全性。其技術方案如下上述載體在製備轉基因動物中的應用。進一步，所述表達載體在製備轉基因動物中的應用包括如下步驟a.基因轉染細胞，表達載體連接目的基因併線性化後，轉染細胞並插入到細胞基因組中，啟動子同時驅動Tet-On Advanced蛋白亞基、胸苷激酶和紅色螢光蛋白基因的表達；b.轉基因細胞的富集，基因轉染48小時後，添加G418(氨基糖苷類抗生素)篩選；c.紅色螢光蛋白進行二次篩選；d.轉基因細胞中外源標記基因的刪除，經12-15天培養後，挑選穩定表達紅色螢光蛋白的細胞團，經擴大培養後，在培養液中添加強力黴素，強力黴素與Tet-On Advanced 蛋白亞基的共同作用下激活Ptight啟動子轉錄表達Cre酶，Cre酶識別兩個同向Loxp序列並引起同源重組，刪除載體中非目的基因的序列，而原位點只保留了目的基因；e.同源重組細胞的富集，由於TK基因單獨表達不會表現出細胞毒性，在丙氧鳥苷 (GCV)的作用下，阻止DNA合成而導致細胞死亡，細胞培養液中添加強力黴素後，經傳代培養1-2代後加入GCV，在TK基因的作用下，未發生重組和重組刪除後又重新連接到基因組中的細胞因DNA合成受阻而死亡，得到成功轉染目的基因，同時又能成功刪除螢光蛋白和抗性基因等存在生物安全隱患的外源基因的細胞；f.然後再利用步驟e得到的外源基因的細胞用於核移植供體，從而得到無外源標記基因的安全型轉基因動物。與現有技術相比，本發明的有益效果在於本發明的表達載體，可以通過一次轉染成功之後實現標記基因與抗性基因等DNA 序列的切除，同時利用TK基因的特點，可以將重新連接的細胞以及未發生重組刪除的細胞殺死，實現目的基因轉入，從而增加了轉基因動物的安全性。


圖1為本發明的表達載體的構造圖，圖中標示了各元件的名稱和位置；圖2為本發明的表達載體連接目的基因線性化後的構造圖；圖3為本發明的表達載體構建過程中利用的pDsRed2-l質粒的圖譜；圖4為本發明的表達載體構建過程中得到的pDsRed-LoxP的圖譜；圖5為本發明的表達載體構建過程中得到Pcmv的DNA片段圖；圖6為本發明的表達載體構建過程中得到Tet-On TK的DNA片段圖；圖7為本發明的表達載體構建過程中得到的pTet-On RL質粒的圖譜；圖8為本發明的表達載體構建過程中設計的Cre酶及酶切位點的DNA片段圖；圖9為本發明的表達載體構建過程中Cre酶基因經雙酶切後連接到pTRE_Tight 質粒中的示意圖；圖10為本發明的表達載體構建過程中得到的Ptight-Cre的DNA片段圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細描述，但不作為對本發明的限定。圖1為本發明的表達載體的構造圖，圖中標示了各元件的 名稱和位置；圖2為本發明的表達載體連接目的基因線性化後的構造圖。如圖1和圖2所示，一種表達載體，在線性化載體的標記基因和抗性基因的非目的基因的兩端加入Loxp序列，同時引入誘導表達啟動子和TK基因組分。本發明的表達載體具體包括如下部分Ptight (bp 33-348)選擇性啟動子，由Tet-On Advanced蛋白亞基與四環素類似物共同啟動；Cre (bp 371-1402)表達Cre酶，識別兩段Loxp序列，並發生同源重組；SV40 PolyA (bp 1403-1603)多聚腺苷酸信號；
LoxP (bp 1619-1652 )、(bp 1690-1723)，Cre 酶識別序列；MCS(bp 1654-1689)多克隆位點，用於插入目的基因；CMV 啟動子(bp 1829-2429)，啟動 Tet-On Advanced、TK、DsRed 的表達；Tet-On Advanced (bp 2381-3124)表達Tet-On Advanced蛋白亞基，在四環素的共同作用下，可以激活Ptight啟動子，啟動Cre酶轉錄和表達；T2A 序列(bp 3134-3193)；TK胸苷激酶(bp 3194-4324)，使丙氧鳥苷三磷酸化，抑制DNA聚合酶活性；IRES 序歹Ij (bp 4357-4941)；DsRed2 (bp 4961-5638)紅色螢光蛋白基因，選擇標記基因；Psv40啟動子(bp 65514-6784)，啟動抗性基因的表達；KanR/NeoR(bp 6867-7661)是卡那黴素和新黴素的抗性基因；HSV TK PolyA (bp 7897-7915)多聚腺苷酸信號。本發明的表達載體的序列如序列表SEQ =ID NO 1所示。本發明的表達載體的構建包括如下步驟1)合成 ioxp-MCS-ioxp 序列GAATTC 5' -ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3『EcoRIACGCGT CGATCG CCCGGG CGGGCC CCGCGG GATATCMluI PVUI SmaI ApaI SacII EcoR V5' -ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3 GTCGACSal 1通過EcoRI和SalI酶切連接到pDsRed2-l質粒(如圖3)，得到的質粒命名為 pDsRed-LoxP，其圖譜如圖4所示。2)參見圖5，從pIRES2-EGFP上通過PCR得到CMV啟動子，在引物的兩端引物Sal I和Asp718 I酶切位點，命名為Pcmv CMF primer :5，-CGG GTCGAC TCTTTCCTGCGTTATCCC-3，(F-Sal I)CMR primer :5，-CGC GGTACC GATCTGACGGTTCACTAAA-3，(R_Asp718I)3)將PCR所得片段經酶切後連接到pDsRed-LoxP質粒中，得到pDsRed-LoxP-CMV 質粒。4)如圖6所示，經過對已知質粒查詢，獲得Tet-On Advanced組件、TK基因和 IRES序列，並在Tet-On Advanced和TK基因之間引入T2A多肽，並在整體片段的兩端設計 Asp718I和BamH I酶切位點，命名為Tet-On TK，其序列如下GGTACCACCA TGTCTAGGCT GGACAAATCT AAAGTGATCA ACGGTGCTCTGGAACTCCTG AACGGTGTGG GAATCGAGGG ACTGACCACC CGCAAACTGGCCCAGAAGCT CGGTGTGGAA CAGCCCACCC TGTACTGGCA TGTGAAGAACAAACGCGCCC TGCTCGACGC TCTGCCTATC GAGATGCTCG ACAGACATCACACCCACTTT TGCCCACTCG AGGGCGAAAG CTGGCAGGAC TTCCTGAGAAACAACGCTAA ATCCTTTCGA TGTGCACTGC TCTCTCATCG AGACGGAGCTAAGGTGCACC TCGGAACCCG ACCTACCGAG AAACAGTACG AGACCCTGGA
AAACCAGCTG GCCTTCCTCT GCCAGCAGGG ATTTTCCCTG GAGAACGCACTGTATGCCCT CTCTGCTGTG GGGCATTTTA CCCTGGGCTG TGTGCTCGAGGAACAGGAAC ACCAGGTGGC TAAGGAGGAA CGGGAGACCC CCACCACCGACAGTATGCCC CCTCTGCTCC GTCAGGCCAT CGAGCTCTTC GACAGGCAGGGTGCAGAACC TGCCTTCCTG TTTGGACTGG AGCTCATCAT CTGCGGTCTGGAGAAGCAGC TCAAATGTGA ATCCGGCGGA CCAGCTGACG CACTCGACGACTTCGACCTG GACATGCTCC CTGCCGACGC TCTGGACGAC TTTGACCTGGACATGCTCCC AGCAGACGCC CTGGATGATT TCGACCTGGA CATGCTGCCTGGTGGGAGCG GAGAAGGACG AGGTAGTCTG CTCACCTGCG GGGACGTGGAGGAAAACCCA GGACCTCTGG AGATGGCAAG CTACCCAGGG CATCAGCACGCTAGTGCATT CGACCAGGCA GCTAGGTCCC GAGGACATTC TAACAGGCGAACCGCACTGA GACCAAGACG ACAGCAGGAG GCTACCGAAG TGCGACCCGAGCAGAAGATG CCTACCCTGC TCCGGGTGTA CATCGACGGG CCTCACGGGATGGGCAAAAC CACCACCACC CAGCTGCTCG TGGCACTGGG TTCCCGTGACGACATCGTGT ACGTGCCAGA ACCCATGACC TATTGGAGGG TGCTGGGAGCTAGCGAGACC ATCGCAAACA TCTACACCAC CCAGCATCGC CTGGACCAGGGAGAGATCTC CGCTGGTGAC GCAGCCGTGG TCATGACCTC TGCACAGATCACCATGGGAA TGCCCTATGC CGTGACCGAC GCTGTGCTGG CACCTCATATCGGTGGGGAG GCAGGTAGCA GTCACGCACC ACCCCCTGCA CTGACCCTCATCTTTGACCG ACATCCTATC GCTGCACTGC TCTGCTACCC AGCCGCTCGGTATCTGATGG GAAGCATGAC CCCACAGGCA GTGCTGGCTT TCGTGGCACTCATCCCACCC ACCCTGCCAG GAACCAACAT CGTGCTGGGT GCTCTCCCCGAAGACAGGCA CATCGACCGC CTGGCCAAGA GACAGCGACC TGGAGAGAGGCTGGACCTCG CTATGCTCGC AGCCATCCGG CGTGTGTACG GTCTGCTCGCCAACACCGTG CGCTATCTGC AGTGTGGCGG AAGCTGGAGA GAAGACTGGGGACAGCTCAG TGGAACCGCA GTGCCTCCAC AGGGAGCTGA GCCACAGAGTAACGCAGGAC CTCGTCCACA CATCGGCGAC ACCCTGTTCA CCCTCTTTAGGGCACCAGAG CTGCTCGCTC CAAACGGAGA CCTGTACAAC GTGTTTGCATGGGCTCTGGA CGTGCTCGCA AAGCGACTCC GTAGCATGCA TGTGTTCATCCTGGACTATG ACCAGAGTCC TGCAGGATGC AGGGACGCAC TGCTCCAGCTGACCTCCGGA ATGGTGCAGA CCCACGTGAC CACCCCAGGT TCTATCCCTACCATCTGTGA CCTCGCTCGT ACCTTTGCTC GTGAAATGGG TGAAGCCAACTAGGAATTCT GCAGATATCC ATCACACTGG CGGCCGCCCC TCTCCCTCCCCCCCCCCTAA CGTTACTGGC CGAAGCCGCT TGGAATAAGG CCGGTGTGCGTTTGTCTATA TGTTATTTTC CACCATATTG CCGTCTTTTG GCAATGTGAGGGCCCGGAAA CCTGGCCCTG TCTTCTTGAC GAGCATTCCT AGAGGAAGCAGTTCCTCTGG AAGCTTCTTG AAGACAAACA ACGTCTGTAG CGACCCTTTG CAGGCAGCGG AACCCCCCAC CTGGCGACAG GTGCCTCTGC GGCCAAAAGCCACGTGTATA AGATACACCT GCAAAGGCGG CACAACCCCA GTGCCACGTT
GTGAGTTGGA TAGTTGTGGA AAGAGTCAAA TGGCTCTCCT CAAGCGTATTCAACAAGGGG CTGAAGGATG CCCAGAAGGT ACCCCATTGT ATGGGATCTGATCTGGGGCC TCGGTGCACA TGCTTTACAT GTGTTTAGTC GAGGTTAAAAAAACGTCTAG GCCCCCCGAA CCACGGGGAC GTGGTTTTCC TTTGAAAAACACGATGATAA TATGGCCACA GGATCC 5)將步驟4中所合成基因片段雙酶切後連接到pDsRed-Loxp-CMV質粒中，命名為 pTet-OnRL質粒。pTet-On RL質粒的圖譜如圖7所示。6)查詢GeneBank中Cre酶基因，通過密碼子優化後並在兩端加入EcoR I和Xba I酶切位點，如下圖8所示。合成後命名為Cre，其序列如下GAATTCAGGA GGGTCTCAAT GTCTAACCTG CTCACCGTGC ATCAGAACCTGCCCGCTCTC CCCGTGGACG CTACCTCCGA CGAAGTGCGT AAAAACCTCATGGACATGTT CCGGGACCGT CAGGCCTTTA GTGAGCATAC CTGGAAGATGCTGCTCAGTG TGTGCAGGTC CTGGGCCGCT TGGTGTAAGC TGAACAACCGCAAATGGTTC CCAGCTGAGC CCGAAGACGT GAGGGACTAC CTGCTCTATCTCCAGGCCCG CGGTCTGGCT GTGAAGACCA TCCAGCAGCA TCTGGGTCAGCTCAACATGC TGCACAGGCG ATCTGGACTC CCAAGACCTA GCGACAGTAACGCCGTGAGT CTGGTGATGA GACGAATCAG AAAGGAGAAC GTGGACGCAGGCGAACGAGC CAAACAGGCC CTCGCTTTCG AGCGGACCGA CTTTGACCAAGTGCGTTCTC TGATGGAAAA CAGCGACAGG TGCCAGGACA TCCGCAACCTCGCTTTTCTG GGGATCGCAT ACAACACCCT GCTCAGGATC GCTGAGATCGCAAGGATCCG CGTGAAGGAC ATCAGCAGAA CCGACGGCGG ACGAATGCTCATCCACATCG GAAGGACCAA AACCCTCGTG AGTACCGCAG GAGTGGAGAAGGCTCTGTCC CTCGGAGTGA CCAAACTGGT GGAACGGTGG ATCTCCGTGTCTGGCGTGGC CGACGACCCT AACAACTATC TGTTCTGTAG AGTGCGAAAGAACGGAGTGG CAGCCCCAAG CGCTACCAGT CAGCTCTCCA CCAGAGCTCTGGAGGGTATC TTTGAAGCAA CCCATCGACT CATCTACGGC GCCAAAGACGACTCCGGACA GCGGTATCTG GCATGGTCTG GTCACAGCGC ACGTGTGGGAGCTGCACGAG ACATGGCACG TGCAGGAGTG AGCATCCCCG AGATCATGCAGGCTGGTGGG TGGACCAACG TGAACATCGT GATGAACTAC ATCAGAAACCTGGACAGTGA AACCGGGGCT ATGGTGCGAC TCCTGGAAGA CGGCGACTAG TCTAGA7)如圖9所示，將步驟6合成的Cre酶基因經EcoR I和Xba I雙酶切，連接到 pTRE-Tight質粒中，經Xho I單酶切後得到如圖10所示的片段，命名為Ptight-Cre。8)將質粒pTet-On RL用Xho I單酶切後，與Ptight-Cre片段連接，得到正反兩種情況的pTRE Tet-On RL質粒，以其中一種為例，產物的圖譜如圖1所示。本發明的表達載體的序列如序列表SEQ =ID NO 1所示。上述表達載體在轉基因中的應用，具體包括如下步驟a.基因轉染細胞。載體連接目的基因併線性化後(如圖2所示)，採用 Lipofectamine 2000轉染細胞，6小時後換到10%血清加10ng/mlEGF和IGF生長因子的培
養液中。
b.轉基因細胞的富集。基因轉染48小時後，添加800 μ g/ml的G418，培養1周後， 降低為300 μ g/ml繼續培養5-7天。G418會對細胞產生毒性作用，將未轉染成功的細胞殺死，轉染成功的細胞對G418具有抗性，能夠正常存活。c.紅色螢光蛋白二次篩選。由於Neo抗性基因的產物會有旁側效應，B比鄰未轉染成功細胞也會繼續生存而影響轉基因細胞的富集，在螢光顯微鏡下，挑選帶紅色螢光的細胞團用於擴大培養，從而進一步篩選基因穩定轉染的細胞。d.轉基因細胞中外源標記基因的刪除。篩選得到既表達G418抗性，又能 穩定表達紅色螢光蛋白的細胞團，經擴大培養後，在培養液中添加1 μ g/ml強力黴素，在強力黴素與 Tet-On Advanced蛋白亞基的共同作用下激活Ptight啟動子轉錄表達Cre酶，引發兩個同向Loxp序列發生同源重組，而原位點保留了目的基因。e.同源重組細胞的富集。在培養液中加入強力黴素後，細胞經傳代培養1-2代，， 培養液中添加20 μ g/ml丙氧鳥苷(GCV)，在TK基因的作用下，未發生重組和重組刪除後又重新連接到基因組中的細胞，tk基因的產物使細胞利用丙氧鳥苷轉變為毒性物質導致細胞死亡，通過此負篩選得到成功轉染目的基因，同時又能成功刪除螢光蛋白和抗性基因等存在生物安全隱患的外源基因的細胞，然後再利用這種細胞用於核移植供體，從而為製作無外源標記基因的安全型轉基因動物提供基本的手段和技術方案。以上實施例僅為本發明的示例性實施例，不用於限制本發明，本發明的保護範圍由權利要求書限定。本領域技術人員可以在本發明的實質和保護範圍內，對本發明做出各種修改或等同替換，這種修改或等同替換也應視為落在本發明的保護範圍內。
權利要求
1.一種表達載體，其特徵在於，在線性化載體的非目的基因的兩端加入Loxp序列，同時引入誘導表達啟動子組分，啟動Cre酶表達。
2.根據權利要求1所述的表達載體，其特徵在於，所述表達載體包括Ptight (bp 33-348)選擇性啟動子，由Tet-On Advanced蛋白亞基與四環素類似物共同啟動；Cre (bp 371-1402)表達Cre酶，識別兩段Loxp序列，並發生同源重組； SV40 PolyA (bp 1403-1603)多聚腺苷酸信號; LoxP (bp 1619-1652)、(bp 1690-1723)，Cre 酶識別序列; MCS(bp 1654-1689)多克隆位點，用於插入目的基因； CMV 啟動子(bp 1829-2429)，啟動 Tet-On Advanced、TK、DsRed 的表達； Tet-On Advanced (bp 2381-3124)表達Tet-On Advanced蛋白亞基，在四環素的共同作用下，可以激活Ptight啟動子，啟動Cre酶轉錄和表達； T2A 序列(bp 3134-3193)；TK胸苷激酶(bp 3194-4324)，使丙氧鳥苷三磷酸化，抑制DNA聚合酶活性； IRES 序列(bp 4357-4941)；DsRed2 (bp 4961-5638)紅色螢光蛋白基因，選擇標記基因； Psv40啟動子(bp 65514-6784)，啟動抗性基因的表達； KanR/NeoR(bp 6867-7661)是卡那黴素和新黴素的抗性基因； HSV TK PolyA (bp 7897-7915)多聚腺苷酸信號。
3.根據權利要求1所述表達載體，其特徵在於，其序列如序列表SEQ=ID NO 1所示。
4.一種表達載體的構建方法，其特徵在於，包括如下步驟1)合成IoxP-MCS-IoxP序列，並通過EcoRI和SalI酶切連接到pDsRed2_l質粒，得到的質粒命名為PDsRed-LoxP ；2)從pIRES2-EGFP上通過PCR得到CMV啟動子，在引物的兩端引物SalI和Asp 718 I酶切位點，命名為Pcmv;3)將PCR所得片段經酶切後連接到pDsRed-LoxP質粒中，得到pDsRed-LoxP-CMV質粒；4)對已知質粒查詢，獲得Tet-OnAdvanced組件、TK基因和IRES序列，並在Tet-On Advanced和TK基因之間引入T2A多肽，並在整體片段的兩端設計Asp718 I和BamH I酶切位點，命名為Tet-On TK ；5)將步驟4中所合成基因片段雙酶切後連接到pDsRed-Loxp-CMV質粒中，命名為 pTet-On RL 質粒；6)查詢GeneBank中Cre酶基因，通過密碼子優化後並在兩端加入EcoRI和Xba I酶切位點，合成後命名為Cre ；7)將步驟6合成的Cre酶基因經EcoRI和Xba I雙酶切，連接到pTRE_Tight質粒中， 經Xho I單酶切後得到的片段命名為Ptight-Cre ；8)將質粒pTet-OnRL用Xho I單酶切後，與Ptight-Cre片段連接，得到名稱為pTRE Tet-On RL的質粒。
5.權利要求1至3任一所述的表達載體在製備轉基因動物中的應用。
6.根據權利要求5所述的載體在製備轉基因動物中的應用，包括如下步驟a.基因轉染細胞，表達載體連接 目的基因併線性化後，轉染細胞並插入到細胞基因組中，啟動子同時驅動Tet-On Advanced蛋白亞基、胸苷激酶和紅色螢光蛋白基因的表達；b.轉基因細胞的富集，基因轉染48小時後，添加G418篩選；c.紅色螢光蛋白進行二次篩選；d.轉基因細胞中外源標記基因的刪除，經12-15天培養後，挑選穩定表達紅色螢光蛋白的細胞團，經擴大培養後，在培養液中添加強力黴素，強力黴素與Tet-On Advanced蛋白亞基的共同作用下激活Ptight啟動子轉錄表達Cre酶，Cre酶識別兩個同向Loxp序列並引起同源重組，刪除載體中非目的基因的序列，而原位點只保留了目的基因；e.同源重組細胞的富集，由於TK基因單獨表達不會表現出細胞毒性，在丙氧鳥苷的作用下，阻止DNA合成而導致細胞死亡，細胞培養液中添加強力黴素後，經傳代培養1-2代後加入丙氧鳥苷，在TK基因的作用下，未發生重組和重組刪除後又重新連接到基因組中的細胞因DNA合成受阻而死亡，得到成功轉染目的基因，同時又能成功刪除螢光蛋白和抗性基因等存在生物安全隱患的外源基因的細胞；f.然後再利用步驟e得到的外源基因的細胞用於核移植供體，從而得到無外源標記基因的安全型轉基因動物。
全文摘要
本發明公開了一種表達載體及其構建和應用，其中表達載體為在線性化載體的非目的基因的兩端加入Loxp序列，同時引入誘導表達Cre酶和TK自殺基因組分。本發明的表達載體增加了轉基因動物的安全性。
文檔編號C12N15/85GK102226201SQ201110117708
公開日2011年10月26日 申請日期2011年5月9日 優先權日2011年5月9日
發明者代蓉, 劉守仁, 周平, 唐紅, 王新華, 王立民 申請人:新疆農墾科學院