真核生物中原卟啉原氧化酶酶活力的操作的製作方法

2023-10-10 21:55:14

專利名稱：真核生物中原卟啉原氧化酶酶活力的操作的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及一種酶活力的操作，該酶在所有真核生物的普通生物合成途徑中負責將原卟啉原IX轉化成原啉啉IX。一方面，本發明可用於發展植物，植物組織，種子對除草劑的抗性，另一方面，本發明可用於發展對動物，尤其是人類缺乏這種酶活力的診斷和治療。
導致產生葉綠素和血紅素的生物合成途徑有許多相同步驟。葉綠素是所有綠色光合生物中的光收集色素。血紅素是血紅蛋白，細胞色素，P450混合功能單加氧酶、過氧化物酶及過氧化物酶的輔助因子(見如Lehninger，「生物化學」Wroth出版公司，紐約(1975))，並且是所有需氧生物的必需組份。
葉綠素和血紅素生物合成的最後相同步驟是原卟啉原IX到原卟啉IX的氧化。原卟啉原氧化酶(本文稱為」Protox」)是催化這個最後步驟的酶(Matringe等人，生物化學雜誌260231(1989))。
這個原卟啉原氧化酶已從許多種生物中或完全純化，這些生物包括釀酒酵母(Labbe-Bios和Labbe，見「血紅素和葉綠素的合成」，E.H.Dailey ed.McGraw Hill紐約.pp 235-285(1990))，大麥白色體(Jacobs和Jacobs，「生物化學雜誌」244219(1987))和小鼠肝臟(Dailey和Karr，生物化學262697(1987))。編碼原卟啉原氧化酶(Protox)的基因已從兩種原核生物中分離出，這兩種原核生物是大腸桿菌(E.coli)(Sasarman等人，加拿大微生物學雜誌391155(1993))和枯草芽孢桿菌(Dailey等人，生物化學雜誌269813(1994))。這些基因沒有序列相似性，它們推定的蛋白質產物也沒有任何胺基酸序列相似性。大腸桿菌的蛋白約21KDa，並與細胞膜相聯。枯草芽孢桿菌蛋白為51KDa，是一個可溶的，細胞質中表現活力的蛋白。
目前，對原卟啉原氧化酶了解太少，因而還不能用已知的方法從較高等的真核生物(也就是動物，植物和其它除了如酵母，單細胞藻類，原生動物等的低等真核微生物以外的所有多細胞具核的生物)中分離編碼原卟啉原氧化酶(protox)的基因。
具體的說，一些分離新蛋白和基因的標準技術是建立在假定它們的初級結構(也就是胺基酸和DNA序列)與具有相同功能的已知蛋白和基因有高度相似性基礎上的。那些標準方法包括核酸雜交和聚合酶鏈式反應擴增，其中聚合酶鏈式反應採用與保守的胺基酸序列基序(motif)對應的寡聚核苷酸引物。這些技術如果採用目前局限於原核原卟啉原氧化酶基因的結構信息對真核原卟啉原氧化酶基因的分離是沒有用的。因為即使在知道的原核原卟啉原氧化酶基因和蛋白中都沒有明顯的結構相似性。
另一個曾經用於從高等真核生物的其它代謝途徑中分離生物合成基因的方法是對所需活力缺陷的微生物突變型進行互補。對於這個方法，一個高等真核生物的cDNA文庫克隆在一個能在受體微生物中直接表達該cDNA的載體中。然後將這個載體轉化或導入突變微生物中，選出表型不再是突變型的菌落。
在一些代謝路徑中採用了這種策略從高等真核生物中分離基因，包括組氨酸生物合成(如本文引入其全文作為參考的美國專利5290926和WO 94/026909至Ward等人.)，賴氨酸生物合成(如Frisch等人，分子基因遺傳228287(1991))，嘌呤生物合成(如，Aimi等人，生物化學雜誌2659011(1990))，色氨酸生物合成(如Nigogi等人，植物細胞51011(1993))。然而儘管可以獲得認為是原卟啉原氧化酶活力缺陷的微生物突變型(如大腸桿菌(Sasar-man.等人，基因微生物雜誌113297(1979)，鼠傷寒沙門氏菌(Xu等人，細菌學雜誌1743953(1992))和釀酒酵母(Camadro等人，生化生物物理研究通報106724(1982))，在已知信息基礎上採用這種技術去分離編碼真核原卟啉原氧化酶活性的cDNA是最不可預知的。
這樣說是有幾個原因的，首先真核原卟啉原氧化酶cDNA序列在突變微生物中不能達到足夠水平的表達。比如因為使用的密碼子與受體微生物採用的密碼子不一致。第二克隆的真核編碼序列的初始轉譯產物可能不能產生有功能的多肽。如如果活力要求一個轉譯後修飾，比如糖基化，而這不能在微生物中進行。第三這個真核蛋白在微生物受體中不能形成其有活力的構象。比如如果這個蛋白通常作用於一個專一的細胞器膜系統，而微生物受體專一性缺乏這個系統。最後一種可能性對於植物原卟啉原氧化酶更為可能，因為此酶在植物細胞中是與補償測試中微生物受體不具有的細胞器相聯的。具體地說，植物原卟啉原氧化酶是與葉綠體膜和類體膜相聯繫的(Matringe等人，生物化學雜誌2674646(1992))，並且可以假定以包括N-末端轉譯(transit)序列和成熟多肽內部特性轉譯後靶向機制為結果到達那些膜(見如Kohorn和Tobin，植物細胞1159(1989)；Li等人，植物細胞3709(1991)；Li等人，生物化學雜誌26718999(1992))這些原卟啉原氧化酶已知在一些人類疾病中起作用。在患有雜色卟啉症，一種以神經精神病症狀和皮膚損傷為特徵的常染色體顯性紊亂病的病人中，原卟啉原氧化酶活力水平下降(Brenner和Bloomer，新英格蘭醫學雜誌302765(1980))。由於缺乏關於人類原卟啉原氧化酶及其對應基因的知識，對這種紊亂的診斷和治療的選擇在目前是很有限的。
採用除草劑控制不想要的的植被，如作物中的雜草或植物，這幾乎已得到廣泛的應用。相關的交易額每年超過了十億美元。儘管廣泛使用除草劑，對於農民控制雜草仍是一個巨大的且耗資的問題。
有效地使用除草劑要求良好的管理。比如施用除草劑的時間和方法以及雜草植物生長階段對更好的控制雜草是關鍵的。因為許多種類雜草對除草劑有抗性，生產有效的除草劑變得越來越重要。
不幸的是，那些表現很大潛力，有廣譜除草和在土壤中快速降解的除草劑對作物有較大的植物毒性。一個解決這個問題的方法就是建立能夠抵抗或耐受殺草劑的作物。對除草劑有抗性的作物雜交種或變種允許使用除草劑而不會提高破壞作物的危險。建立抗性可採用對作物施用除草劑的方法，而這種除草劑由於是作物敏感的而事先或有限的施用的(如出現前施用)。如美國專利4,761,373至Anderson等人，教導丁對咪唑啉酮或硫基硫胺類除草劑有抗性的植物。這種抗性可以通過一個改變了的乙醯羥基酸合成酶(AHAS)證實。Goodman等人 的美國專利No.4,975,374涉及包含一種編碼一個突變谷胺醯胺合成酶(GS)的基因的植物細胞和植物能夠對已知抑制GS的除草劑，如phosphinothrici和蛋氨酸硫氧亞胺的抑制產生抗性Bedbrook等人的美國專利No.5,013,659指導的能夠表達一種突變乙醯乳酸合成酶的植物對磺醯脲除草劑的抑制有抗性。Somers等人的美國專利No.5,162,602發現一些植物對環己二酮和芳基氧基苯氧基丙酸除草劑的抑制能夠耐受，這個耐受性能通過一個改變了的乙醯輔酶A羧化酶(Accase)證實。
原卟啉原氧化酶是多種除草劑類化合物的靶點。除草劑在酶分子的不同結構層次上抑制原卟啉原氧化酶(protox)(Duke等人，雜草科學(Weed Sci.)39465(1991)；Nandihalli等人，農藥生化生理43193(1992)；Matringe等人，FEBS Left.24535(1989)；Yanase和An-doh，農藥生化生理3570(1989)。這些除草劑類化合物包括二苯醚{如acifluorfen.5-〔2-氯-4-(三氟甲基)苯酚〕-2-硝基苯甲酸；它的甲基酯；或Oxyfluorfen，2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯酚)-4-(三氟基苯)}，Oxidiozoles，(如Oxidiazon；3-〔2，4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯〕-5-(1，1-二甲基乙基)-1，3，4-惡二唑-2-(3H)-one)，環狀亞胺(如S-23142，N-(4-氯-2-氟-5-炔丙基氧基苯)-3，4，5，6-四氫鄰苯二亞胺；Chlorophthal-im，N-(4-氯苯)-3，4，5，6-四氫鄰苯二亞胺)，苯基吡唑(如TNPP-乙基，乙基2-〔1-(2，3，4-三氯苯)-4-硝基吡唑-5-氧〕丙酸；MB 39279)，吡啶衍生物(如LS 82-556)，和phenopy-late和它的O-苯基吡咯烷基-和哌啶氨基甲酸酯類似物。這些化合物中的一些競爭性的抑制催化正常反應的酶，可以是以底物類似物作用。
原卟啉原氧化酶抑制型除草劑作用方式的預測包括葉綠體中原卟啉原IX的積累。這種積累被認為導致原卟啉原IX洩漏到細胞溶質，在那兒，原卟啉原被過氧化物酶氧化成原卟啉IX。光照時，原卟啉IX能導致細胞溶質中單線態氧的形成，這種單線態氧能依次導致其他氧化反應種類的形成，如能使脂類過氧化和細胞膜崩潰而導致快速細胞死亡(Lee等人，植物生理學102881(1993))並不是所有的原卟啉原氧化酶對抑制植物原卟啉原氧化酶的除草劑敏感。從大腸桿菌(Sasarman等人，加拿大生生物學雜誌391155(1993))和枯草芽孢桿菌(Dailey等人，生物化學雜誌269813(1994))中分離的基因編碼的原卟啉原氧化酶對這些除草劑類抑制物有抗性。另外，也有報導說單細胞藻類萊因衣藻(Chlomydomonasreinhardtii)的突變體對苯亞胺除草劑S-23142有抗性(Kataoka等人，農藥科學雜誌15449(1990)；Shibata等人，見「光合作用研究」-Vol.111，N.Murata.ed.Kluwer荷蘭，pp.567-570(1992))。這些突變體中至少有一種表現出具有改變了的原卟啉原酶活力，從而不僅對選擇突變體的除草劑類抑制劑有抗性，而且對其他類原卟啉原氧化酶抑制劑有抗性(Oshio等人，Z.Naturforsch.48C339(1993)；Sato等人.見「卟啉農藥學術討論會」，S.Duke.ed.學術評論華盛頓，D.C.(1994))。一個菸草突變細胞系也曾被報導對抑制劑S-21432有抗性(Che等人，Z.Naturforsch.48C350(1993))。
本發明提供了一類真核生物中分離出的編碼原卟啉原氧化酶(protox)的DNA分子，它的優點是來自高等真核生物。具體地說，本發明提供的編碼原卟啉原氧化酶(protox)的DNA分子來源於植物或人。
本發明範圍內優選從雙子葉植物中分離出的編碼原卟啉原氧化酶(protox)的DNA分子，但是尤其是來自擬南芥類植物的，如在SEQ ID NOS1，3和9給出的DNA分子。
也優選從單子葉植物中分離出的編碼原卟啉氧化酶(protox)的DNA分子，但是尤其是來自玉米的，如在SEQ ID NOS5和7中給出的。特別在本發明中優選的是一類分離到的DNA分子編碼的雙子葉植物的原卟啉原氧化酶蛋白，其中所說的蛋白質包含選自SEDID NOS 2.4和10的胺基酸序列。也優選一類分離的DNA分子，它編碼單子葉植物原卟啉原氧化酶蛋白質，其中所說的蛋白質包含選自SEQ ID Nos 6和8的胺基酸序列。
採用本發明提供的信息，任何真核生物的的原卟啉原氧化酶(protox)的DNA編碼序列都可通過標準方法獲得。因此，本發明的進一步實施方案是提供能與編碼原卟啉原氧化酶的真核DNA序列或各個mRNA特異性雜交的探針，並且提供了本發明的探針在真核生物中測定上述DNA序列的方法。
本發明進一步提供了表達框(Cassetts)和包含上述表達框的重組載體，而表達框又包含了一個必須的啟動子，根據本發明這個啟動子特別是在植物中有活力，而且可與編碼真核生物原卟啉原氧化酶(protox)的DNA分子有效相連。根據本發明的表達框另外還包含一個可與上述DNA分子有效相連的信號序列，而這個信號序列能夠將上述DNA分子編碼的蛋白質導入葉綠體或線粒體。
另外，本發明還提供了具有改變了的原卟啉原氧化酶活性的植株，植物細胞，植物組織和植物種子，它們能對一定水平的除草劑的抑制有抗性或至少有耐受性，在此除草劑水平下植物中自然產生的原卟啉原氧化酶通常受到了抑制。具體的說，本發明提供的植物其中已改變的的原卟啉原氧化酶可以通過過度表達野生型原卟啉原氧化酶或通過編碼耐受除草劑的原卟啉原氧化酶的表達來證實。上述耐受除草劑的原卟啉原氧化酶可以是真核或原核生物中自然產生的原卟啉原氧化酶的修飾形式，或者是上述植物中自然產生的原卟啉原氧化酶的修飾形式，或者上述耐受除草劑的原卟啉原氧化酶可以是在原核生物中天然產生的。本發明採用的植物包括單子葉和雙子葉植物，但尤其是雜交植物。優選的那些植物是具有能夠抑制原卟啉原氧化酶的除草劑的潛在靶位點的，特別是農業上很重要的作物如玉米和其它穀類作物比如小麥，燕麥，黑麥，高梁，水稻，大麥，小米，turf，和牧草及類似物，以及棉花，菸草，甘蔗，甜菜，油菜和大豆。
本發明進一步包括了根據本發明的植物的繁殖材料，較優選的為用一種保護劑膜處理的植物種子，尤其是採用一種從一組包含除草劑，殺蟲劑，殺真菌劑，殺細菌劑，殺線蟲劑，殺軟體動物劑或其混合物中選出的製品組成的保護劑膜。
本發明還指導生產含有能抵抗或耐受一定濃度除草劑抑制的原卟啉原氧化酶的植株，植物細胞，植物組織，植物種子和其轉基團後代，而此濃度下的除草劑能抑制自然產生的原卟啉原氧化酶。上述的抗性或耐受性可以通過編碼真核生物中自然產生的原卟啉原氧化酶修飾形式的DNA分子的表達，或編碼上述植物中自然產生的原卟啉原氧化酶修飾形式的DNA分子的表達，或通過一種原核生物中自然產生的原卟啉原氧化酶的DNA分子的表達，或編碼一種原核生物中自然產生的一種蛋白的修飾形式的原卟啉氧化酶的DNA分子的表達來獲得。
本發明的一個具體實施方案是指導了被包含合適啟動子的重組DNA分子穩定轉化的轉基因玉米植株，玉米組織或玉米種子及其轉基因後代的製備。這個在植物中起作用的合適的啟動子與一個編碼對除草劑有抗性的未修飾的原核原卟啉原氧化酶的結構基因有效相連。
本發明進一步指導了製備被包含與一個編碼未修飾的真核原卟啉原氧化酶的結構基因有效相連的能在植物中作用的合適啟動子之重組DNA分子穩定轉化的轉基因植株，植物細胞，植物組織和植物種子及轉基因後代。在這種植物中未修飾原卟啉原氧化酶過度表達的結果足以克服除草劑對此酶的抑制作用。
本發明也提供了能表達一種對在野生型未改變的原卟啉原氧化酶活力通常有抑制的濃度下的除草劑的抑制作用有耐受性的改變了的原卟啉原氧化酶的植物產物。在這個實施方案中，植物可被包含一個編碼抗性原卟啉原氧化酶的結構基因的重組DNA分子穩定轉化，或採用直接挑選技術分離，測定和建立除草劑抗性系來製備。
本發明進一步指導了控制不需要的植物的生長的方法，此方法包括對具有改變的原卟啉原氧化酶的植物群體施用有效量的原卟啉原氧化酶抑制型除草劑，這種改變了的原卟啉原氧化酶能抵抗對上述植物自然產生原卟啉氧化酶有抑制作用水平的除草劑的抑制作用。上述方法中保護的植物特別是那些對原卟啉原氧化酶型除草劑有潛在靶位點的，具體的是農業重要作物如玉米和其它穀物作物，如小麥，燕麥，黑麥，高梁，水稻，大麥，小米，turf和牧草等以及棉花，甘蔗，甜菜，油菜和大豆。原卟啉原氧化酶抑制劑型除草劑選自ary-luracil，二苯醚，oxidiazole，亞胺，苯吡唑，吡啶衍生物，phenopylate和O-苯吡咯烷-和呱啶氨基甲酸酯的所謂phenopylate類似物。
本發明也提供了原卟啉原氧化酶的重組生產和重組產生的原卟啉原氧化酶的使用方法。本發明進一步提供了受體細胞，尤其那些選自植物細胞，動物細胞，細菌細胞，酵母細胞和昆蟲細胞的細胞，它們都被包含能在各受體細胞中作用並與修飾或未修飾的真核原卟啉原氧化酶的結構基因有效相連的合適的啟動子的重組DNA分子穩定轉化；其中所述受體細胞能夠表達上述DNA分子。
本發明進一步提供了使用純化的原卟啉原氧化酶篩選影響原卟啉原氧化酶活力的新型除草劑的方法，以及鑑定抗除草劑的原卟啉原氧化酶的突變型的方法。
具體地說，此發明指導了一個測試一種化學物質能否抑制植物中原卟啉原氧化酶活力的方法，包括(a)在上述原卟啉原氧化酶能催化原卟啉原IX轉化為原卟啉IX條件下，將上述原卟啉原氧化酶與原卟啉原IX在第一反應混合物中混合。
(b)在與上述第一反應混合物相同的條件下，將所述化學物質，上述原卟啉原氧化酶和原卟啉原IX在第二反應混合物中混合。
(c)在約395-410nM處激發上述第一和第二反應混合物。
(d)比較上述第一和第二反應混合物在約622-635nM處的螢光。
其中如果上述第二反應混合物的螢光遠小於上述第一反應混合物螢光，那麼上述化學物質有抑制上述原卟啉原氧化酶活力的能力。
本發明進一步提供了鑑定在細胞群體中能夠抵抗原卟啉原氧化酶抑制劑的修飾原卟啉原氧化酶的方法，包括以下步驟(a)將上述群體培養在含量能夠抑制上述原卟啉原氧化酶未修飾形式的上述原卟啉原氧化酶抑制劑中；
(b)選擇步驟(a)中生長未受抑制的細胞。
(c)分離和鑑定步驟(b)中選出細胞中的原卟啉原氧化酶。
在植物細胞轉化方法中，編碼改變了的原卟啉原氧化酶的基因可以用作可選擇的標記。本發明進一步提供了一個從非轉化植物中挑選用所需轉移基因轉化的植株，植物組織或植物細胞的方法，包括以下步驟。
(a)用一個此植物能表達的所需轉移基因和一個編碼對原卟啉原氧化酶抑制劑有抗性的改變了的原卟啉原氧化酶的基因轉化一類植株、植物組織或植物細胞。
(b)將這些轉化了的植物或植物細胞轉移到含原卟啉原氧化酶抑制劑的培養基上。
(c)挑選出在培養基上存活的植物或植物細胞。
本發明進一步提供了測定生物中原卟啉原氧化酶的存在和形式以及原卟啉原氧化酶轉錄的數量水平的探針和方法，這些方法可用於對與原卟啉原氧化酶改變了的形式或原卟啉原氧化酶改變了的表達水平相聯的疾病條件的診斷。
一方面，本發明提供了編碼一類真核型原卟啉原氧化酶(本文稱為protox)已分離的DNA分子，此酶能催化原卟啉原IX轉化成原卟啉IX。擬南芥菜(Arobidopsis thaliana)的原卟啉原氧化酶的DNA編碼序列和對應胺基酸序列已在SEQ ID Nos.1-4和9-10提供。玉米的原卟啉原氧化酶的DNA編碼序列和對應胺基酸序列在SEQID Nos 5-8中提供。
根據本發明，任何需要的編碼原卟啉原氧化酶的真核DNA都可分離到。一個提供分離真核原卟啉原氧化酶編碼序列的方法以實施例1為代表。在此方法中能將編碼原卟啉原氧化酶的cDNA克隆從感興趣的真核生物cDNA文庫克隆中鑑定出來。該方法基於對原卟啉原氧化酶缺陷型突變受體生物提供原卟啉原氧化酶的能力。用於本方法的合適的受體生物是那些能用於篩選cDNA表達文庫和可以採用或可正常繁殖的原卟啉原氧化酶缺陷型突變的生物。這樣的受體生物包括大腸桿菌(Sasarman等人，基因遺傳微生物學雜誌113297(1979))，鼠傷寒沙門氏菌(Xu等人，細菌學雜誌1743953(1992))和釀酒酵母(Camadro等人，生化生物物理研究通報106724(1982))，但不只限於這些。
作為選擇，真核生物原卟啉原氧化酶編碼序列可以按眾所周知的方法以它們序列與本發明提供的擬南芥菜SEQ ID Nos.1，3和9)和Eea mays SEQ ID Nos 5和7)原卟啉原氧化酶編碼序列的同源性來分離。在這些技術中，全部或部分已知原卟啉原氧化酶編碼序列可用於能與所選生物的基因組DNA片段或cDNA片段(即基因組或cDNA文庫)種群中其它原卟啉原氧化酶編碼序列選擇性雜交的探針。那些技術包括雜交篩選平板DNA文庫(噬菌斑或菌落；見，如Sambrook等人，分子克隆，eds.冷泉港實驗室報導(1989))和以與已知原卟啉原氧化酶胺基酸序列保守區域對應的寡聚核苷酸為引物的PCR擴增(見如Innis，等人.PCR方案方法與應用指南eds.學術指導(1990))。這些方法特別適於從與獲得探針序列的生物相關的生物中分離原卟啉原氧化酶編碼序列，比如採用本方法並以擬南芥(Arabidopsis)或玉米(Zeamays)編碼序列為探針將特別適於從其他植物種類中分離原卟啉原氧化酶編碼序列。
本發明教導的已分離的真核原卟啉原氧化酶序列可以按照標準基因工程技術適合任何目的操作。比如完整或部分原卟啉原氧化酶序列可用作與原卟啉原氧化酶編碼序列和信使RNA專一性雜交的探針。為了在各種條件下得到專一性雜交，那些包含原卟啉原氧化酶編碼序列中唯一序列的探針優選至少10個核苷酸長度，最優選的是至少20個核苷酸長度。這些探針可採用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)方法從選定的生物中擴增和分析原卟啉原氧化酶編碼序列。這項技術可用於從一個需要的生物中分離另外的原卟啉原氧化酶，或作為測定一種生物中是否存在原卟啉原氧化酶編碼序列和與改變的編碼序列相聯的不利條件如，以神經生理症狀和皮膚損傷為特徵的原卟啉原氧化酶活力下降的人類常染色體顯性紊亂疾病的診斷測試(Brenner和Bloomer，新英格蘭醫學雜誌302765(1980))。
原卟啉原氧化酶的專一性雜交探針可用於使用以與原卟啉原氧化酶基因組序列選擇性雜交探針為基礎的標準技術決定選定的生物的基因組中自然真核原卟啉原氧化酶基因的位置。這些技術包括同等或包含在原卟啉原氧化酶探針序列中DNA多態性的鑑定和使用這些多態性去跟蹤來自兩個多態性親本系雜交的自受精圖譜種群中與其他已知圖譜位置標記相關的原卟啉原氧化酶基因的分離(見如Helentjaris等人，植物分子生物學(Plant Mol.Biol.)5109(1985)，Sommer等人，生物技術1282(1992)D』Ovidio等人，植物分子生物學15169(1990))，儘管任何真核原卟啉原氧化酶序列可考慮用作測定任何真核生物原卟啉原氧化酶基因圖譜的探針，優選的探針是從與選定生物親緩較近的生物的那些原卟啉原氧化酶序列，最優選的探針是選定的生物中的那些原卟啉原氧化酶序列。這種形式的原卟啉原氧化酶圖譜被認為在用於養殖目的植物中特別有用，比如知道了一個導致除草劑抗性的原卟啉原氧化酶突變基因的基因圖譜位置，側向DNA標計可從參考基因圖譜中鑑定出(見如Helent-jaris，趨勢遺傳學，3217(1987)。在除草劑抗性特徵進入新的培養系時，這些標記可用於監測在每輪迴交後現在親本中原卟啉原氧化酶相關染色體DNA仍存在的程度。
原卟啉原氧化酶專一性雜交探針也可用於通過Northern印跡(Nothern blot)分析等標準技術測定生物中原卟啉原氧化酶mRNA的量的水平。這項技術可用於可能與具體不良狀況有關的原卟啉原氧化酶表達水平改變測定的診斷測試。比如對以神經生理症狀和皮膚損傷為特徵，原卟啉原氧化酶活力下降為特徵的人類常染色體顯性病的診斷測試。(Brenner和Bloomer，新英格蘭醫學雜誌302765(1980))。
對於在一個受體生物中酶的重組生產，原卟啉原氧化酶編碼序列可插入到一個為選定的受體設計的表達框中，並導入受體，在那兒重組產物產生。專一性調控序列如啟動子，信號序列；5′和3′非轉譯序列，增強的選擇是本領域的普通技術人員已知的。包含連接在合適閱讀框中的各個元件的分子產物可插入到能被轉化到受體細胞中的載體中。合適的表達載體和蛋白質的重組生產方法對於受體生物如大腸桿菌(見如Studier和Moffatt，分子生物學雜誌J.Mol.Biol.189113(1986)；Brosius，DNA 8759(1989))，酵母(見，如Schneider和Guarente，酶學方法(Meth，Enzynol.)199373(1991))和昆蟲細胞(見，如Luckow和Summers，生物技術647(1988))是眾所周知的。具體的例子包括質粒如pBluescript(stratagene.LaJolla，(A)，pFLAG(國際生物技術公司，New Haven，CT)，pTrcHis(Invitrogen，La Jolla，CA)和杆狀病毒(baculovirus)表達載體，如那些來自Autographica californica核多角體病毒(AcMNPV)基因組的載體。優選的杆狀病毒/昆蟲系統是pVI11392/sf21細胞(Invitro-gen，La Jolla，CA)。
重組產生的真核原卟啉原氧化酶可用於多種目的。比如它可以體外提供原卟啉原氧化酶，它也可用於篩選靶點未知的已知除草劑化學物質是否抑制原卟啉原氧化酶的體外測試。這樣的體外測試也可用於更常規的篩選化學物質是否抑制原卟啉原氧化酶和是否能成為除草劑候選者。作為選擇，重組產生的原卟啉原氧化酶可用於進一步確定與已知抑制的聯繫，以便有效地設計新的抑制型除草劑以及酶的除草劑耐受型。
典型的，原卟啉原氧化酶的抑制作用是通過測定在約395-410nM激發後，約622-635nM處的螢光來測定的。(見，如Jacobs和Jacobs，酶28206(1982)；Sherman等人，植物生理學97280(1991))。這個測試是基於這個事實原卟啉IX是螢光色素，原卟啉原是非螢光的。從選出的亞細胞部分如白色體，線粒體，微粒體或質膜通過差速離心製備蛋白提取物(見如Lee等人.植物生理學.102881(1993)；Prado等人.植物生理學.65956(1979)；Jackson和Moore見「植物細胞器」.Reid.ed.pp 1-12；Jacobs和Jacobs，植物生理學1011181(1993))。原卟啉原通過Jacobs和Jacobs(1982)描述的用鈉汞齊還原原卟啉製備。典型的反應混合物包括100mM Hep-es(pH7.5)，5mM EDTA，2mM DTT，約2M原卟啉原1X，和約1mg/ml蛋白提取物。各種濃度的抑制溶液如1mM，100uM，10uM，1uM，100nM，10nM，1nM，100pM，在酶反應開始前加入到酶提取液中。一旦蛋白提取液加入，螢光要監測幾分鐘，從斜線的線性區計算斜率(反應速度)。通過比較抑制反應的斜率與對照反應的斜率測試IC50。
本發明的另一方案包括在鑑定抑制抗性原卟啉原氧化酶突變體的測定中使用原卟啉原氧化酶。典型的測試如下(a)將原卟啉原氧化酶第一份樣品和它的底物原卟啉原IX在含有原卟啉原氧化酶抑制劑的第二份樣品存在條件下保溫；(b)測定步驟(a)中原卟啉原氧化酶的酶活力；(c)將突變的原卟啉原氧化酶第一份樣品和它的底物在含有相同原卟啉原氧化酶抑制劑的第二份樣品存在條件下保溫。
(d)測試步驟(c)中突變原卟啉原氧化酶的酶活力。
(e)將突變原卟啉原氧化酶酶活力與未突變原卟啉原氧化酶活力比較。
在以下改進中，反應混合物和反應條件與鑑定原卟啉原氧化酶抑制劑(抑制劑測定)的測定相同。首先，一種按上述方法得到的突變原卟啉原氧化酶代替抑制劑測試反應混合物中野生型原卟啉原氧化酶，第二在兩個反應混合物中都加入野生型原卟啉原氧化酶的抑制劑。第三突變酶活力(有抑制劑和突變原卟啉原氧化酶的酶活力)和未突變酶活力(抑制劑和野生型原卟啉原氧化酶存在下酶活力)相比較以決定突變酶活力與未突變酶活力相比酶活是否觀察到有很大提高。突變酶活力就是在合適底物和抑制劑存在下任何測到的突變原卟啉原氧化酶酶活力，未突變酶活力就是在合適底物和抑制劑存在下任何測到的野生型原卟啉原氧化酶酶活力。一個大於測定技術的內在誤差的百上上升可定為酶活力提高，優選的是比抑制劑存在下野生型酶活力提高2倍。更優選的是提高約5倍，最優的是提高大於10倍。
抑制原卟啉原氧化酶的除草劑包括許多不同結構層次的分子(Duke等人，雜草科學39465(1991)；Nandihalli等人，農藥生化生理學Resticide Biochem.physiol.43193(1992)；Natringe等人，FEBS Left 24535(1989)；Yanase和Andoh，農藥生化生理學3570(1989))。包括二苯醚{如acifluorifen，5-〔2-氯-4-(三氟甲基)苯酚〕-2-硝基苯甲酸；它的甲酯；或oxyfluorfen 2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯酚)-4-(三氟苯)}，Oxidiazoles(如oxcliazon，3-〔2，4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯〕-5-(1，1-二甲基乙基)-1，3，4-oxadiozol-2-(3H)-one)，環亞胺(如S-23142，N-(4-氯-2-氟-5-炔丙基苯)-3，4，5，6-四氫鄰苯二醯亞胺；chlorophthalim，N-(4-氯苯)-3，4，5，6-四氫鄰苯二醯亞胺)，苯吡唑(如TNPP-乙基，乙基2-〔1-(2，3，4-三氯苯)-4-硝基吡唑基-5-氧〕丙酸鹽；MQB 39279)；吡啶衍生物(如LS 82-556)，和phenopylate及其O-苯吡咯烷和呱啶氨基甲酸酯類似物。
二苯醚特別標誌是那些具有下面通式的分子 (式I)其中R為-COONa(結構式II)，-CONHSO2CH3(結構式III)或-COOCH2COOC2H5(結構式IV；見Maigrot等人，布賴頓公司植保會議-雜草47-51(1989))另外一些有興趣的二苯醚是那些R為 (結構式IVa見Hayashi等人，布賴頓公司植保會議-雜草53-58(1989))。另外一類有興趣的二苯醚有結構式 (結構式IVbbifenox，見Dest等人，東北雜草科學會議彙編2731(1973))已知的亞胺類除草劑也有意義，具有一般結構式 (結構式V)其中Q可為 (結構式VI) (結構式VII) (結構式VIII)(結構式IX) (結構式IXa) (結構式IXb)(見Hemper等人(1995)見「第8屆國際農藥化學會議彙編」，Rag-dale，等人.，eds.美國化學學會華盛頓，D.C.pp 42-48(1994))。
而R1為H，Cl或F，R2為Cl，R3可被醚，硫醚，酯，氨基或烷基任意取代。並且R2和R3可形成一個5或6元雜環。特別有益的亞胺類除草劑例子有 (結構式X) (結構式XI) (結構式XII)(見Miura等人，布賴頓作物保護會議-雜草35-40(1993)) (結構式XIII) (結構式XIV) (結構式XV)(結構式XVI)
以上化合物的除草劑活力在以下文獻中有描述1991布賴頓作物保護會議-雜草(英國作物保護委員會)(結構式X和XVI)，1993 布賴頓作物保護會議-雜草(英國作物保護委員會)(結構式XII和XIII)。美國專利No.4,746,352(結構式XI)和Abstracts of美國雜草科學協會vol.33 pg 9(1993)(結構式XIV)。
最優選的亞胺類除草劑是那些稱為aryluracils並具有下面通式的分子 (結構式XVII)其中R表示基團(C2-6-烷氧基)羰基-C1-4-烷基。正如在美國專利No.5,183,492中所公開的，本文引入作為參考。
具有結構通式如下的除草劑也具意義 (結構式XVIII，thiadiazimin)(見Weileretal，布賴頓作物保護會議-雜草pp.29-34(1993))； (結構式XIXCarfentrazone)(見Van Saun等人，布賴頓作物保護會議-雜草pp.19-22(1993))；N-取代S的吡唑的通式 (結構式XX)(見國際專利出版物94/08999，WO 93/10100，和美國專利No.5,405,829轉讓給Schering)；N-苯基吡唑，如
(結構式XXI，nipyraclofen)(見農藥手冊第621頁，9th ed.ed.by C.P.Worthing，英國作物保護委員會，Surrey(1991))；和3-取代-2-芳基-4，5，6，7-四氫吲哚(Lyga等人，PesticideSci 4229-36(1994))。
一般對原卟啉原氧化酶活性有抑制的除草劑水平包括本領域中已知的使用比利，並且依賴於外部因子如環境、時間和使用方法。比如對於結構式V～IX代表的亞胺類除草劑，更具體的那些結構式X～XVII代表的除草劑，施用比例範圍為0.0001～10kg/na，優選的為0.005～2kg/na。除草劑的劑量比例或濃度可以不同，這依賴於需要的作用和具體所用的化合物，並且可用本領域中已知的方法來確定。
本發明進一步提供能耐受除草劑的植株，植物組織和植物種子，而這些植物中自然產生的原卟啉原氧化酶可被除草劑抑制，並且這種耐受作用是通過改變了的原卟啉原氧化酶而獲得。代表性的植物包括按一般目的的施用除草劑的任何植物。優選的是在農業上較重要的作物，即重要的被子植物和裸子植物如棉花，大豆，油菜，甜菜，玉米，水稻，小麥，大麥，燕麥，黑麥，高梁，小米，turf，牧草，turf草等。
改變了的原卟啉原氧化酶活性表示一種與植物自然產生的(即沒有人直接或間接對此酶進行操作的自然產生的原卟啉原氧化酶)原卟啉原氧化酶不同的原卟啉原氧化酶，這種酶對能抑制自然產生的酶的除草劑有抗性。改變了的原卟啉原氧化酶可通過本發明的以下方法在植物中獲得，提高野生型，對除草劑敏感的原卟啉原氧化酶的表達，在此植物中表達一類改變了的耐受除草劑的真核原卟啉原氧化酶，表達在植物中抗除草劑的修飾或未修飾的細菌原卟啉原氧化酶，或將以上技術聯合使用。
通過提高植物細胞中原卟啉原氧化酶表達水平而獲得改變的原卟啉原氧化酶活力足以克服除草劑引起的生長抑制。這樣的原卟啉原氧化酶表達水平通常為自然表達的2倍，優選的為5倍，更優選的為至少10倍。表達的提高可能因為原卟啉原氧化酶基因份數增加，基因增加可發生在原卟啉原氧化酶基因內編碼序列(即基因擴增)或植物細胞中內生原卟啉原氧化酶基因的非編碼，調節序列的突變。包含這樣原卟啉原氧化酶的植物可直接從植物中選擇而獲得。此方法在本領域中是已知的。見，如Somers等人，見美國專利5,162,602和Anderson等人，見美國專利4,761,373及其中引用的參考文獻。這些植物亦可採用本領域已知的基因工程方法獲得。
除草劑敏感型原卟啉原氧化酶表達的提高也可通過重組或嵌合DNA分子穩定轉化植物細胞而獲得。重組或嵌合DNA分子包含一個與同源或異源的原卟啉原氧化酶結構基因相連並能使與之相聯結構基因表達的啟動子。「同源性」表示此原卟啉原氧化酶基因是從與靶植物細胞分類學上相同的生物中分離的。「非同源性」表示此原卟啉原氧化酶基因是從與靶植物細胞分類學上不同的生物中分離的。同源原卟啉原氧化酶基因可通過細菌或酵母的缺陷型突變體與靶植物的cDNA文庫互補而獲得。見，如實施例1和Snustad等人，遺傳學1201111-1114(1988)(玉米穀氨酸合成酶)；Delauney等人，分子遺傳學221299-305(1990)(大豆-二氫吡咯-5-碳酸還原酶)，Frish等人，Mol Gen.Genet.228287-293(1991)(玉米二氫吡啶二羧酸合成酶)；Eller等人.植物分子生物學.18557-566(1992)(油菜葉綠體3-異丙基蘋果酸脫氫酶)；美國自然科學研究彙編881731-1735(1991)；Minet·等人，植物雜誌2417-422(1992)(二氫乳清酸脫氫酶)和其中引用的參考文獻。其他已知方法包括在高等植物的基因組或cDNA文庫中篩選，如可以與特異核酸探針雜交的序列，或在表達文庫篩選能與特異性抗體探針交叉反應的原卟啉原氧化酶。一個優選的方法包括將大腸桿菌hemG缺陷型突變體與玉米或擬南芥(Arabidopsis thaliana)cDNA文庫進行互補實驗。
能在植物或植物細胞中作用的啟動子，即那些能使與之相聯的結構基因如原卟啉原氧化酶基因在植物中表達的啟動子實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)的19S或35S啟動子和CaMV的雙重啟動子，核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(ssuRUBISO)啟動子等，優選的有水稻肌動蛋白啟動子(McElroy等人，分子基因遺傳學231150(1991))，玉米泛素啟動子(EP 0342 926；Taylor等人，植物細胞繁殖12491(1993))，及菸草，Arabidopsis或玉米的Pr-1啟動子(見Ryds等人.的國際專利申請No.PCT/IB 95/00002，本文引入其全文作為參考)，優選的還有Koy等人，科學2361299-1302(1987)中描述35S啟動子和一個增強的或雙重35S啟動子，此雙重35S啟動子克隆在pCGN2113中，以ATCC 40587保存，在EP-A 0392225中公開，相關說明書以其全文在本文中引用作為參考。啟動子本身可按技術可行步驟被修飾以增強啟動子提高原卟啉原氧化酶表達的強度。
信號或轉移肽可與本發明嵌合DNA結構中原卟啉原氧化酶編碼序列融合以指導表達的原卟啉原氧化酶到要作用的位點。信號肽的實例包括那些與植物的致病相關蛋白相連繫的，如PR-1，PR-2等，見如Payne等人，植物分子生物學.1189-94(1988)。轉移肽的實例包括Von Heijne等人，植物分子生物學Rep.9104-126(1991)；Mazur等人，植物生理學851110(1987).Vorst等人，基因6559(1988)中描述的葉綠體轉移肽和Boutry等人，自然328340-342(1987)中描述的線粒體轉移肽。對於本發明，葉綠體和線粒體轉移肽被認為對線粒體和葉綠體內典型的原卟啉原氧化酶的產生特別有用。最優選的是採用葉綠體轉移肽，因為葉綠體中原卟啉原氧化酶的抑制被認為是原卟啉原氧化酶抑制型除草劑作用的最初基礎(Witkowski和Halling植物生理學，87632(1988)；Lehnen等人，農藥生化生理37239(1990)Duke等人.野草科學.39465(1991).也包括導致編碼的蛋白定位於如液泡等各種細胞組分的序列，見例如Neuhaus等人，美國自然科學研究彙編8810362-10366(1991)和Chrispeels.Ann.Rev.植物生理、植物分子生物學，4221-53(1991).相關的公開出版物在此引入作為參考。
本發明的嵌合DNA結構可包含多拷貝的啟動子和多拷貝的原卟啉原氧化酶結構基因。另外，此結構中可包括標記的編碼序列，以及其他如信號或轉移肽；在合適閱讀框中與其他作用原件一起在DNA分子中的序列。製備這樣的構建體是本領域的普通技術人員已知的。
有用的標記包括提供除草劑，抗生素或藥物抗性的肽，例如對潮黴素、卡納黴素、G 418、慶大黴素、林肯黴素、氨甲蝶呤，glyphosate，phosphinothricin等抗性。這些標記可用於從未轉化細胞中選擇用本發明嵌合DNA構建體轉化的細胞。其它有用的標記為可通過如顏色反應等可見反應觀測到的多肽酶，如熒蟲素酶，β-葡萄糖醛酸酶，或β-半乳糖苷酶。
改變了的原卟啉原氧化酶也可通過分離了的真核原卟啉原氧化酶編碼序列修飾形式的產生和鑑定而獲得。此編碼序列至少有一個胺基酸取代，增加或刪除，且編碼對能抑制未改變自然產生形式(即沒有直接通過基因重組方法或間接選擇培育方法等操作過在真核生物中自發產生的形式)的除草劑有抗性的改變了的原卟啉原氧化酶。編碼那些酶的基因可通過本領域中已知的多種方案獲得。第一個普通方法包括直接或間接對微生物進行突變。如一種基因可操作的微生物如大腸桿菌和釀酒酵母用如紫外光.乙基或甲基甲烷硫酸隨機誘變。誘變步驟在以下文獻中有描述如Miller分子遺傳學實驗，冷泉港實驗室，紐約冷泉港(1972).Davis等人，高等細菌遺傳學，冷泉港實驗室紐約冷泉港(1980)；Sherman等人，酵母遺傳學方法，冷泉港實驗室，紐約冷泉港(1983)；和U-S.Patent No.4,975,374(Goodman等人)。被選用誘變的微生物包含正常除草劑敏感真核原卟啉原氧化酶基因，並且依賴於由此基因而獲得到卟啉原氧化酶。誘變後細胞培養在能抑制未改變原卟啉原氧化酶濃度的除草劑中，誘變微生物菌落在除草劑存在下長得比未誘變微生物好的(即表現對抑制抗性)選出來進一步分析。這些菌落中原卟啉原氧化酶基因通過克隆或PCR擴增而分離並且測序。編碼已改變了的原卟啉氧化酶的序列再克隆回微生物以證實它們能產生抑制劑抗性的能力。
第二個獲得真核原卟啉原氧化酶除草劑抗性等位突變基因的方法包括直接從植物中選取，如，上面描述的原卟啉原氧化酶抑制劑對植物生長(如Arabidopsis，大豆、玉米)的抑制作用可採用技術可行的方法將種子接種到含抑制劑濃度不斷上升的簡單基本鹽培養基平板中進行測定，這些濃度包括，0.001，0.003，0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10.30，110.300，1000，3000ppm。在最低劑量有顯著生長抑制的用於以後試驗。
植物材料的誘變可用於提高選定種群中抗性等位基因發生的頻率。誘變的種子材料可從各個來源獲得包括化學或物質誘變或種子，或化學或物質誘變花粉(Neutter，見「進行生物研究的玉米」Sheridan，ed.Univ.Press.Grand Forks.ND.pp61-64(1982)；此花粉可用於植物受精而收集到M1代突變種子，對於擬南芥(Arabidop-sis)M2種子(Lehle Seeds.Tusson.AZ)即採用如EMS等化學物質或γ射線或快中子等物理方法誘變的種子長出的植物的後代種子以高達10,000個/平皿(直徑10cm)的密度放在包含合適濃度的用於選擇抗性的抑制劑的基礎鹽培養基中。在平皿中植物被轉移到土壤並生長至成熟和產生種子仍要繼續生長和保持綠色7-21天。這些種子的後代要測試對除草劑的抗性。如果抗性特徵為顯性，種子抗性與敏感以3∶1分離的植物可假定在M2代抗性是雜合的，產生種子全為抗性的植物可假定M2代抗性是純合的。作用在相關種子上的那引些誘變劑和M2後代種子的篩選亦可在其他種類上使用，如大豆(見，如U.S.Pat.No.5.084.082(Sebastian))，篩選的對除草劑有抗性的種子也可由物理或化學方法誘變的花粉受精而獲得。
有兩種方法可用於證實抗性的遺傳基礎是改變了的原卟啉原氧化酶基因。首先，將對抑制劑表現抗性的原卟啉原氧化酶等位基因通過DCR分離，引物是以SEQ ID，NOS1，3，5，7中Arabidopsis和玉米原卟啉原氧化酶cDNA序列保守區域或更優選的是以用於產生抗性等位基因的植物中未改變原卟啉原氧化酶基因的序列為基礎。在對等位基因進行測序以決定編碼序列中存在的突變後，等位基因用於測試採用推斷為提供抗性等位基因轉化的植物中提供對抑制劑抗性的能力。這些植物可以是Arabidopsis或任何其他生產對抑制劑敏感的植物。第二，原卟啉原氧化酶基因可以建立已知限制性片段長度多態性(RFLPS)相關的圖譜(見，如Chang等人，美國自然科學彙編85；6856-6860(1988)；Nam等人，植物細胞1699-705(1989).抗性特徵可用相同標記獨立地建立圖譜。如果抗性是由於原卟啉原氧化酶中的突變，抗性特徵圖譜將標在與原卟啉原氧化酶相同位置。
第三個獲得原卟啉原氧化酶除草劑抗性的等位基因的方法是從植物細胞培養中選擇，植物組織如胚胎，葉片，等外植體或快速生長愈傷組織或感興趣植物的懸浮培養物在無血紅素，有濃度不斷上升的除草劑性抑制物或適用於實驗室環境的抑制劑類似物的有限培養基上生長。在不同培養物中有不同生長程度的記錄，在一些培養物中，產生的快速生長克隆即使在一般抑制濃度的抑制劑中繼續生長。這樣快速生長改變株發生的頻率在將植物組織或細胞加入除草劑前用物理或化學誘變劑處理會得到提高。推論為原卟啉原氧化酶基因提供抗性的等位基因按前面各段描述的方法分離和測試。那些肯定為提供除草劑抗性的等位基因可通過工程學達最佳表達並轉化入植物。另外，植物可由包含這些等位基因的組織或細胞培養再生形成。
第四種方法包括對細菌或酵母中野生型，除草劑敏感的原卟啉原氧化酶基因的誘變，接著將此微生物在缺乏血紅素但包含抑制濃度的抑制劑的培養基上培養，挑選在抑制劑存在下生長的那些克隆。更具體地說，編碼原卟啉原氧化酶的植物cDNA.，如Arabidopsis或玉米cDNA克隆到否則缺乏原卟啉原氧化酶活性的微生物中。這類微生物的實例包括大腸桿菌，鼠傷寒沙門氏菌和釀酒酵母的缺陷型突變，包括大腸桿菌菌株SAS×38(Sasarman等人，遺傳微生物學雜誌113297(1979)，鼠傷寒沙門氏菌菌株TE2483.或TT13680(Xu等人，細菌學雜誌1743953(1992))和hem14-1酵母突變株(Ca-madro.等人，生化生理研究通報106724(1982))。轉化的微生物用如上面剛描述的體內誘變處理，或者用各種本領域中已知的化學或酶學方法的體外誘變處理，如二硫化鈉(Shortle等人.酶學方法100457-468(1983))；甲氧基胺(Kadonaga等人，核酸研究131733-1745(1985))；寡聚核苷酸直接飽和誘變(Hutchinson等人.美國自然科學研究彙編83710-714(1986))；或各種不聯合種類的聚合酶(見，如Shortle等人，美國自然科學研究彙編791588-1592(1982)Shiraishi等人，基因64313-319(1988)和Leung等人，技術111-15(1989)。在有一般抑制濃度的抑制劑中生長的菌落被挑選出與用重複劃線純化。它們的質粒進行純化並且轉化到缺乏原卟啉原氧化酶的微生物中以測試提供對抑制劑抗性的能力。通過這個測試的質粒中原卟啉原氧化酶cDNA插入的DNA序列進行測序。
一但一個除草劑抗性原卟啉原氧化酶等位基因鑑定了，它可用基因工程方法在作物植物中達最適表達。這可包括改變抗性等位基因編碼序列使之在感興趣作物種類中最適表達，修飾編碼序列以獲得在特定作物中的最適表達的方法是眾所周知的(見，如Perlak等人，美國自然科學研究彙編883324(1991)；Koziel等人，生物技術11194(1993))。原卟啉原氧化酶等位基因最適表達的基因工程也包括聯上合適的調控基因序列(即容動子，信號序列，轉錄終止子)。優選的啟動子是那些能高水平組成型表達的啟動子或更優選的是那些在除草劑可能破壞的組織中特異性高水平表達的啟動子。
重組DNA分子可用許多技術上可行的方法導入植物細胞。本領域的技術人員可預料到方法的選擇取決於所要轉化的植物類型即單子葉或雙子葉。轉化植物細胞的合適方法包括顯微注射(Crossway等人，生物技術4320-334(1986))、電穿孔(Riggs等人.美國自然科學彙編USA 835602-5606(1986))、土壤桿菌介導的轉化(Hinchee.等人，生物技術6915-921(1988))，直接基因轉移(Paszkowski等人，EMBO雜誌J.32717-2722(1984))和使用來自Agracetus公司，Madison.Wisconsin和Dupont公司.Wilm-ington.Delaware的設備進行導道微粒加速(見，如Sanford等人，Datent.4,945,050.和McCobe等人，生物技術6923-926(1988))。也可見，Weissinger等人，遺傳學年鑑22421-477(1988)；Sanford等人，顆粒科學及技術527-37(1987)(洋蔥)；Christou等人.植物生理.87671-674(1988)(大豆)；Mc Cabe等人，生物/技術6923-926(1988)(大豆)；Datta等人，生物/技術8736-740(1990)(水稻)；Klein等人.美國自然科學研究彙編，854305-4309(1988)(玉米)，Klein等人，生物/技術6559-563(1988)(玉米)；Kleim等人，植物生理91440-444(1988)(玉米)；Fromm等人，生物/技術8833-839(1990)，和Gordon-Kamm等人，植物細胞2603-618(1990)(玉米)。
本發明的範圍還包括轉基因植物，具體的轉基因可育植物為用上述方法轉化的植物及其無性和/或有性後代，它們仍然對抑制植物中自然產生原卟啉原氧化酶抑制的除草劑的抑制有抗性，至少有耐受性。尤其較優的是對植物中自然產生的原卟啉原氧化酶抑制水平的除草劑的抑制有抗性，至少有耐受性的雜交植物。
根據本發明的轉基因植物可以是雙子葉或單子葉植物。優選的單子葉植物是禾本科植物，包括黑麥草、玉米，小麥，Triticale，高梁，甘蔗，雀麥，稻，燕麥，大麥和黑麥。
特別優選的有轉基因玉米、小麥、大麥、高梁、黑麥、燕麥、苔草(turf)和水稻。
在雙子葉植物中，本文特別優選大豆，棉花，菸草，甜菜，油菜和向日葵。
「後代」表達意思為包括轉基因植物產生的無性或有性後代。這個定義也意味著包括所有通過已知方法獲得的突變體或變種，如通過仍表現初始轉化植物特徵的細胞融合與突變體選擇，以及所有轉化植物材料的雜交或融合產物。
本發明的另一涉及轉基因植物的繁植材料。
轉基因植物的繁殖材料對於本發明定義為任何可在體外或體內有性或無性繁殖的植物材料。在本發明範圍中較優的為原生質體，細胞，愈傷組織，組織，器官，種子，胚胎，花粉，卵細胞，合子及其他任何轉基因植物來源的繁殖材料。
植物的部分，如來源於轉基因植物或通過本發明方法轉化的後代花、莖、果實、葉、根，並至少包含部分轉基因細胞，也是本發明的一個主題。
在植物繁殖材料[果實、塊莖、穀粒、種子]，尤其是種子在作為商業產品出售前，它們要用一種包含除草劑，殺蟲劑，殺真菌劑、殺細菌劑、殺線蟲劑，殺軟體動物劑或這幾種物質混合物的保護劑覆蓋物處理，如要需要與其它載體一起，保護使免受細菌、真菌或害獸破壞的工藝中還採用表面活性劑和使用增高配料。
為了處理這些種子，保護劑覆蓋物可通過用液體配方處理塊莖和穀粒或聯合的溼或幹的配方覆蓋而使用於種子。另外，在一些特殊例子中，其他用於植物的方法也是可行的，如直接處理花蕾和果實。
根據本發明包含編碼一類真核的具有根據本發明原卟啉原氧化酶(protox)活力的蛋白質的DNA序列的植物種子常用包含一類種子處理化合物的種子保護劑覆蓋物處理，這些種子處理化合物包括如Captan，Carboxin，二硫化四甲秋蘭姆(TMTD)，methalaxyl(Apron)和pirimiphos-methyl(Actellic)及其他常用於種子處理的複合物。
本發明還有一個目的是提供種植植物的植物繁殖材料，但尤其是常用於種子處理的種子保護劑覆蓋物處理的植物種子。
一旦一個除草劑抗性原卟啉原氧化酶等位基因在作物植物或能再生成作物植物的植物細胞培養物中通過直接選擇獲得，它能夠採用傳統培養技術移入商業變種中建立除草劑耐受性作物而無需對等位基因進行基因工程處理並轉化入植物。也就是，除草劑抗性等位基因可以分離，並通過遺傳工程達最適表達並轉化到所需變種。
編碼抵抗原卟啉原氧化酶抑制劑的改變了的原卟啉原氧化酶基因而作為植物細胞轉化方法中可選擇的標記。如用轉移基因轉化的植物，植物組織或植物細胞也可用編碼能夠在植物中表達的改變了的原卟啉原氧化酶的基因轉化，然後轉化的細胞轉移到包含原卟啉原氧化酶的抑制劑的培養基上，只有轉化了的細胞才能存活。原卟啉原氧化酶抑制劑中作為特別有用的選擇性試劑的有二苯醚{如acifluorfen，5-〔2-氯-4-(三氟甲基)苯酚〕-2-硝基苯甲酸；其甲基酯，或Oxyfluorfen，2-氯-1-(3-2氧基-4-硝基苯氧基)-4-(三氟基苯)}，Oxidiazoles，(如Oxidiazon，3-〔2，4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯基〕-5-(1，1-二甲基乙基-1，3，4-Oxadiazol-2-(3H)-one)，環亞胺(如S-23142，N-(4-氯-2-氟)-5-炔丙基苯)-3，4，5，6-四氫鄰苯二醯胺；Chlorophthalim，N-(4-氯苯)-3，4，5，6-四氫鄰苯二醯胺)，苯吡唑(如TNPP-乙基，乙基2-〔1-(2，3，4-三氯苯)-4-硝基吡唑-5-氧〕丙酸；MB 39279)，吡啶衍生物(如LS 82-556)，和phenopylate和它的O-苯吡咯烷一和呱啶氨基甲酸酯類似物。這個方法可以用於任何被編碼改變了的原卟啉原氧化酶基因轉化的植物細胞，可使用任何感興趣的轉移基因。轉移基因和原卟啉原氧化酶基因的表達可使用在植物細胞中起作用的同一啟動子或分開的啟動子。
本發明通過參考以下詳細的實施例進一步描述。這些實施例只是用於舉例目的，而不是用於限制，除非另有。
保存以下的載體分子保存在Agricultural Research Service，PatentCulture Collection(NRRL)，Northern Regional Research Center，1815 North University Street.Peoria，Illinas 61604，U.S.A，日期如下原卟啉原氧化酶-1 採用pBluescript SK載體，1994，4，5以pWDC-2(#B-21238)保存。
原卟啉原氧化酶-2 採用pFL61載體，1994，4，5作為pWDC-1(NRRL#B-21237)保存。
M2Protox-1，以pBluescript SK為載體，1994，5，20以pWDC-4(NRRL#B-21260)保存，在SEQ ID No5中表示。
MZProtox-1，以pBluescript SK為載體，1994，7，11作為SEQID NO5表示的pWDC-4以NRRL(#B-21260N)保存。
MZProtox-2，以pBluescript SK為載體，1994，5，20作為SEQID NO7表示的pWDC-3以NRRL(#B-21259)保存。
原卟啉原氧化酶-3 以pFL61為載體，1994.6.10.以pWDC-5(NRRL#B-21280)保存。
pMzC-1Val，以pBluescript SK為載體，1994.9.30以命名為pWDC-8的形式以給定的保藏號NRRL#21340保存。
pAraC-2Cys，以pFL61為載體，1994.11.14以pWDC-7形式以給定的保藏號NRRL#21339N保存。
實施例這兒使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域所熟知的，並在以下文獻T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，「分子克隆實驗室手冊」，冷泉港實驗室，紐約冷泉港(1982)和T.J.Sil-hary.M.L.Berman和L.W.Enquist.「基因融合試驗」冷泉港實驗室，紐約冷泉港(1984)中進行了描述。
實施例1通過一個大腸桿菌突變體的功能互補分離擬南芥編碼原卟啉原氧化酶基因的cDNA。
一個以pFL61為質粒載體(Minet等人，植物雜誌J.2417-422(1992))的擬南芥菜(Landsberg)cDNA文庫已獲得並擴增。購買了第二個以Unizapλ為載體的擬南芥(Columbia)cDNA文庫，並通過體內噬菌體外切以pBluescript質粒擴增。獲得大腸桿菌hemG突變體SAS×38(Sasarman等人.遺傳微生物雜誌113279(1979))並在含20g/ml正鐵血紅素(美國生化物質)的L培養基上保存。質粒文庫通過電穿孔採用Bio-Rad Gene Pulser和製造者建議的條件轉化到SAS×38中。這些細胞以大約500,000個轉化子/10cm平皿的密度平板接種到包含100mg/ml的氨苄青黴素的L瓊脂上。這些細胞在低亮度下37℃培養40小時，選擇其在無外源血紅素下生長能力。血紅素原養微生物的恢復頻率在pFL61文庫約400/107，在pBluescriprt文庫約2/107。從24個克隆中分離的質粒DNA進行了序列分析，24個中的每一個都再轉化到SAS×38以證實其互補能力。
序列分析顯示出兩類推定的原卟啉原氧化酶克隆。9個命名為「Protox-1」型。每一個都來自同一基因，兩個為全長克隆。此cD-NA為17196bp長，編碼蛋白分子量為57.7KDa。N-末端肽序列約60個胺基酸具葉綠體轉移肽的特徵。用GAP程序(Deveraux等人，核酸研究12387-395(1984))搜尋的資料庫顯示出與枯草芽孢桿菌hemY(protox)蛋白有同源性(Hansson和Hederstedt 1992，Dailey等人，生物化學雜誌269813(1994))。這兩種蛋白有53％相似，31％與高同源區相同，包括hemY蛋白可能的二核苷酸結合域(Dai-ley等人，J.Biol.Chem.269813(1994))。
其它15個命名為」Protox-2」型。這些也表現為由一個基因產生。大約全長的cDNA是1738bp，編碼的蛋白質分子量為55.6KD。氨基末端具有線粒體轉移肽的某種特徵。原卟啉原氧化酶-2(pro-tox-2)蛋白與protox-1(53％相似，28％相同)和枯草芽孢桿菌原卟啉原氧化酶(50％相似，27％相同)有有限的同源性。
原卟啉原氧化酶-1(protox-1)以pBluescript SK為載體，1994.4.5以pWDC-2保存(NRRL#B-21238)。
原卟啉原氧化酶-2(protox-2)以pFL61為載體，1994.4.5以pWDC-1保存(NRRL#B-21237)。
在pWDC-2中編碼原卟啉原氧化酶-1和在pWDC-1中編碼原卟啉原氧化酶-2的擬南芥cDNA分別在以下SEQ ID NOS1和3中表示。實施例2通過大腸桿菌突變體的功能互補作用分離玉米編碼原卟啉原氧化酶基因的cDNA從Stratagene購買了一個在λUnizap中的玉米(B73 inbred)cDNA文庫，並且通過群體外切轉到pBluescript文庫中。第二個商業製造Unizap玉米cDNA文庫購自Clontech，並類似地轉變到pBluescript質粒上。從玉米中選擇有功能的原卟啉原氧化酶基因的方法按上面實施例1.中描述的制擬南芥文庫方法進行。
兩個血紅素原養型從Stratagene文庫107個轉化子中分離出，並表現互補性，且測了序。這些cDNA是相同的並與擬南芥原卟啉原氧化酶-1有同源性。這個玉米克隆，命名為MZProtox-1是不完全的。此cDNA長度為1698bp，僅編碼可能的成熟原卟啉原氧化酶，沒有轉移肽序列，也沒有甲硫氨酸啟始密碼子。此基因在核苷酸水平與擬南芥protox-1有68％相同，在胺基酸水平有78％相同(87％相似)(在表1表示)。
從Clontech文庫107個轉化子中得到一個血紅素原養型，表現有互補作用，並測了序。此cDNA似乎是完整的，長2061bp，編碼59KDa的蛋白。此克隆是一個與擬南芥Protox-2同源的玉米克隆，命名為MZProtox-2。此基因在核酸水平有58％與擬南芥Pro-tox-2相同，在胺基酸水平有58％相同(76％相似)(表2中表示)。此玉米克隆只一個比擬南芥克隆長30個胺基酸的N-未端序列。與擬南芥克隆相比，兩個玉米原卟啉原氧化酶基因間同源性很低，兩個蛋白的序列之間僅31％相同。
MZProtox-1以pBluescript SK為載體，1994.5.20以在SEQID NO5中表示的pWDC-4以NRRL(#B-21260)保存。
MZProtox-1以pBluescript SK為載體，1994.7.11以在SEQID NO5中表示的pWDC-4在NRRL(#B-21260N)中再保存。
MZProtox-2以pBluescript SK為載體，1994.5.20以在SEQID NO7中表示的pWDC-3在NRRL(#B-21259)保存。實施例3以與已知原卟啉原氧化酶編碼序列的序列同源性為基礎分離另外的原卟啉原氧化酶基因一個噬菌體或質粒文庫以約10,000個噬菌斑每次10cm陪氏平皿的密度平板接種，在將植物在37℃生長過夜後製備噬菌斑的濾膜轉移。噬菌斑的轉移物以SEQ ID Nos1，3，5或7所述的cDNA為探針，以32P-dCTP標記，藉助於Prime Time試劑盒(國際生物技術公司，New Haren，CT)以隨機引物方法進行探針雜交。雜交條件為7％+＝烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M Na3sPO4pH7.0 1mM ED-TA，50℃。雜交過夜後，濾膜用1％SDS，2×SSC衝洗。陽性雜交噬菌斑通過放射自顯影檢測。在純化到單個噬菌斑後，分離cDNA插入序列，採用螢光染料標記的雙脫氧終止子以鏈終止法測定它們的序列(應用生物系統公司，Foster城，CA)。
上面描述的標準實驗方案可由本領域的技術人員使用以獲得來自其它真核生物，尤其高等植物種類與已知原卟啉原氧化酶編碼序列有高度同源性的原卟啉原氧化酶基因序列。
被SEQ ID Nos2和6中表示的序列編碼的各個蛋白質的推定的胺基酸序列的比較在表1中表示。被SEQ ID Nos4和8中表示的序列編碼的各個蛋白質的推定的胺基酸序列的比較在表2中表示。
表1擬南芥(SEQ ID No.2)和玉米(SEQ ID No.6)原卟啉原氧化酶胺基酸序列的比較相似百分比87.137相同百分比78.00851 GGTTITTDCVIVGGGISGLCIAQALATKHPDAAPNLIVTEAKDRVGGNII 100..|||:|||||||||.||||||:| :..:::||||:.|.||||.
1 ....NSADCVVVGGGISGLCTAQALATRH..GVGDVLVTEARARPGGNIT 44101 T..REENGFLWEEGPNSFQPSDPMLTMVVDSGLKDDLVLGDPTAPRFVLW 148| |.|:|:||||||||||||||:|||.||||||||||:|||.|||||||45 TVERPEEGYLWEEGPNSFQPSDPVLTMAVDSGLKDDLVFGDPNAPRFVLW 94149 NGKLRPVPSKLTDLPFFDLMSIGGKIRAGFGALGIRPSPPGREESVEEFV 198:||||||||| .||||||||||.||:|||:|||||||.||||||||||||95 EGKLRPVPSKPADLPFFDLMSIPGKLRAGLGALGIRPPPPGREESVEEFV 144199 RRNLGDEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWKLEQNGGSIIGG 248|||||.||||||||||||||||||||||||||||||||:||:.|||||||145 RRNLGAEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWRLEETGGSIIGG 194249 TFKAIQERKNAPKAERDPRLPKPQGQTVGSFRKGLRMLPEAISARLGSKV 298|:|.||||...||:.||:|||||.||||:|||||| |||:||...|||||195 TIKTIQERSKNPKPPRDARLPKPKGQTVASFRKGLAMLPNAITSSLGSKV 244299 KLSWKLSGITKLESGGYNLTYETPDGLVSVQSKSVVMTVPSHVASGLLRP 348||||||.:||| :. || |.||||:|:||||.|||:||:||.|||.:|||245 KLSWKLTSITKSDDKGYVLEYETPEGVVSVQAKSVIMTIPSYVASNILRP 294349 LSESAANALSKLYYPPVAAVSISYPKEAIRTECLIDGELKGFGQLHPRTQ 398||..||:|||::||||||||.:||||||||.||||||||.||||||||.|295 LSSDAADALSRFYYPPVAAVTVSYPKEAIRKECLIDGELQGFGQLHPRSQ 344399 GVETLGTIYSSSLFPNRAPPGRILLLNYIGGSTNTGILSKSEGELVEAVD 448|||||||||||||||||||.||:||||||||.|||||:||.|:|||||||345 GVETLGTIYSSSLFPNRAPDGRVLLLNYIGGATNTGIVSKTESELVEAVD 394449 RDLRKMLIKPNSTDPLKLGVRVWPQAIPQFLVGHFDILDTAKSSLTSSGY 498||||||||.....||| |||||||||||||||||:|:|:.||..|..:||395 RDLRKMLINSTAVDPLVLGVRVWPQAIPQFLVGHLDLLEAAKAALDRGGY 444499 EGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAYETAIEVNNFMSRYAYK*538:|||||||||||||||||||||||.| ::.:|:.:|||||445 DGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAYESASQISDFLTKYAYK*484
相同的殘基以兩序列間垂直杆表示。採用Deveraux等人，核酸研究12387-395(1984)中描述的GAP方法進行序列比較。
表2擬南芥(SEQ ID No.4)和玉米(SEQ ID No.8)原卟啉原氧化酶-2胺基酸序列的比較相似百分比75.889相同百分比57.9051 ............................MASGAVAD.HQIEAVSGKRVAV 21.| |:|: .: |..::.|||1 MLALTASASSASSHPYRHASAHTRRPRLRAVLAMAGSDDPRAAPARSVAV 5022 VGAGVSGLAAAYKLKSRGLNVTVFEADGRVGGKLRSVMQNGLIWDEGANT 71||||||||||||:|: .|:|||||||.:|.|||:|. :.|::|||||||51 VGAGVSGLAAAYRLRQSGVNVTVFEAADRAGGKIRTNSEGGFVWDEGANT 10072 MTEAEPEVGSLLDDLGLREKQQFPISQKKRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT 121|||:| |.:.|:|||||.:|||:| ||.|||||::|.|.::|.:||.|:.
101 MTEGEWEASRLIDDLGLQDKQQYPNSQHKRYIVKDGAPALIPSDPISLMK 150122 SSVLSTQSKFQILLEPFLWKK....KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE 167||||||.||:.:::||||:||.|:|||:. .|||:.| :||||.|151 SSVLSTKSKIALFFEPFLYKKANTRNSGKVSEEHLSESVGSFCERHFGRE 200168 VVDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDLWNVEKSFGSIIVGAIRTKFA 217||||::||||:||||:||:|||::|.||.|||:|:.:||:||||| .|:|201 VVDYFVDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPALWNLERKYGSVIVGAILSKLA 250218 AKGGKSRDTKSSPGTKKGSRGSFSFKGGMQILPDTLCKSLSHDEINLDSK 267|||:. :. ..|.|.::..|.||||.|||| | :.| ..::.|::.|:..
251 AKGDPVKTRHDSSGKRRNRRVSFSFHGGMQSLINALHNEVGDDNVKLGTE 300268 VLSLS..YNSGSRQENWSLSCVSHNETQRQ...NPHYDAVIMTAPLCNVK 312||||. :::.. :.||:|. |.:..::: |. :|||||||||:||:
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451 KQLVTSDLKKLLGVEGQPTFVKHVYWGNAFPLYGHDYSSVLEAIEKMEKN 500462 LPGFFYAGNHRGGLSVGKSIASGCKAADLVISYLESCSNDKKPNDSL*509||||||||| ::||.||. ||||:|||||.|||||| ......:
501 LPGFFYAGNSKDGLAVGSVIASGSKAADLAISYLESHTKHNNSH*... 545實施例4從擬南芥cDNA文庫分離汙染的酵母原卟啉原氧化酶克隆為了鑑定具有原卟啉原氧化酶活性的少數cDNA，對pFL61擬南芥文庫按以上方法進行了第二次篩選，再次產生數百個互補克隆。大約600個被各自接種到網格平皿，並在28℃培養18h.。複製的濾膜轉移物按製造商說明在菌落/噬菌斑篩選(NEN)膜上製備。分別用EcoRI/xhol和NotI消化，將Protox-1和Protox-2 cDNA從它們的載體上移出。插入序列在1.0％。Seaplaque GTP(FMC)瓊脂糖上凝膠電泳分離，切下並用隨機引物法以32P標記。每一份轉移物用一種探針雜交。雜交和衝洗條件按Church和Gilkert 1984所述進行。
不能顯示與Protox-1或Protox-2清晰雜交的克隆(約20個)在液體培養基中擴增，並製備質粒DNA。此DNA用Not1消化，重複的樣品走1.0％瓊脂糖膠，再Southern印跡到Gene Screen Plus(NEN)濾膜上[New England Nuclear]。這兩種已知原卟啉原氧化酶的探針按以前標記和雜交。有兩個不是Protox-1或Protox-2的相同克隆。此克隆表現出雖然生長很慢，但能與SAS×38突變體互補，命名為原卟啉原氧化酶-3(protox-3)。
Protox-3以pFL61為載體，1994.6.8以pWDC-5保存(NR-RL #B-21280)。這些編碼序列測定後是來自擬南芥cDNA文庫中少量汙染的酵母DNA。包含在pWDC-5中編碼原卟啉原氧化酶-3(Protox-3)的酵母DNA在下面SEQ ID No9中描述。實施例5在細菌系統中植物原卟啉原氧化酶克隆對原卟啉原氧化酶抑制型除草劑的敏感性的證實Protox-1/SASX38，Protox-2/SASX38和pBluescript/XL1-Blue的液體培養物在L amp100上生長，每種培養物分成100ml等分平板接種到含各種濃度(1.0nM-10mM的具結構式XVII原卟啉原氧化酶抑制型aryluracil除草劑的L amp100培養基。雙套平皿在37℃下培養18h.，要在弱光或完全黑暗中培養。
表現出對任何濃度除草劑都不敏感的protox+大腸桿菌菌株XL1-Blue包含對類似除草劑有抗性的自然細菌酶。Protox-1/SAS×38明顯是敏感的，它的菌膜在10nM低的濃度的抑制劑下就幾乎完全消失。Protox-2/SAS×38也是敏感的，但要在較高的除草劑濃度(10m下)。除草劑對兩個植物原卟啉原氧化酶株的作用在弱光下最有效，在黑暗的平皿也顯然也完全存在。除草劑的毒性可通過外加20mg/ml的正鐵血紅素到平皿中而完全消除。
這兩個植物原卟啉原氧化酶對除草劑的不同耐受性可能是這兩個質粒不同表達的結果，而非此兩種酶有內在差別。Protox-1/SAS×38在任何缺血紅素的培養基上都比Protox-2/SAS×38長得慢。另外，MZProtox-2/SAS×38株，與擬南芥Protox-1/SAS×38有相當的生長速率，也對較低濃度(10-100nM)的除草劑很敏感。酵母Protox-3克隆的初始特徵也表現對除草劑敏感。實施例6在大腸桿菌表達系統中選擇對原卟啉原氧化酶抑制型除草劑有抗性的植物原卟啉原氧化酶基因細菌系統中對植物原卟啉原氧化酶的抑制在大規模篩選植物基因中除草劑抗性突變是很有用的。在將液體培養物平板接種的初始劑量反應測試中，甚至在高濃度的除草劑中也產生高頻的抗性克隆。這種抗性不是以再轉化/除草劑敏感測試為基礎的質粒造成的。轉化原卟啉原氧化酶質粒到SAS×38突變株中並直接接種到含除草劑平皿可以幾乎完全減少此背景問題。
植物原卟啉原氧化酶質粒可通過各種方法誘變；採用已公開的化學物質方法，(如二硫化鈉(Shortle等人酶學方法.100457-468(1983)；甲氧胺(Kadonaga等人.核酸研究.131733-1745(1985)；寡聚核苷酸指導的飽和誘變(Hutchinson等人，美國自然科學研究彙編.83710-714(1986)；或各種聚合酶錯誤聯合方法(見如Shortle等人，美國自然科學研究彙編791588-1592(1982)；Shi-raishi等人，基因64313-319(1988)和Leung等人，技術111-15(1989)。在整個質粒誘變中的可能啟動子上升突變可通過將編碼序列再克隆到野生型載體並重新測試而消除。較高的表達可能導致在無除草劑條件下更好的生長，目測篩選編碼序列突變株也是可能的。
任何在細菌系統中表達除草劑抗性的植物原卟啉原氧化酶基因可採用此處描述的標準技術通過基因工程達到最適表達並轉化進入植物。得到的植物可用除草劑處理也證實和定量測定引入的原卟啉原氧化酶基因產生的抗生水平。實施例7在植物中除草劑抗性微生物原卟啉原氧化酶基因表達的構建編碼枯草芽孢桿菌原卟啉原氧化酶基因hemY的序列(Hansson和Hederstedt，細菌雜誌，1748081(1992)；Dailey等人，生化雜誌269813(1994)和編碼大腸桿菌原卟啉原氧化酶基因hemG的序列(Sasarman等人，加拿大微生物雜誌391155(1993))通過採用標準條件和按公開序列設計的側面引物的PCR擴增從實驗室菌株中分離。這些基因是已知編碼除草劑抗性形式的原卟啉原氧化酶的。
採用重疊PCR融合的標準技術(Ausubel等人.分子生物學的現行方案.John Wiley Sons.公司.(1994))，將兩細菌基因融入兩個不同擬南芥葉綠體轉移肽序列(CTPS)。首先是來自乙醯羥基酸合成酶的CTP(AHAS.Mazur等人，植物生理851110(1987))，此轉移肽容許進入葉綠體的基質。第二個來自擬南芥質體藍素基因(Vorst等人，基因6559(1988))，它具有一個二等分的轉移肽。CTP的氨基末端部分指導蛋白質進入葉綠體，而羧基末端指導它進入類囊體膜。所有四個融合基因克隆在2×355啟動子之後，而且是在為用土壤細菌轉化的轉基因植物產物設計的雙向表達載體中。
在擬南芥和玉米原卟啉原氧化酶cDNAs的分離之後，來自Pro-tox-1或MZProtox-1的葉綠體轉移肽也按上述方法融合到兩個細菌原卟啉原氧化酶蛋白中。
上述載體可轉化到需要的植物種類，所得的轉化子可測試其對除草抗性的提高。實施例8擬南芥/枯草芽孢桿菌基因間結構域的轉變以產生嵌合的，抗除草劑的原卟啉原氧化酶一個能用於產生具有在植物中對除草劑抗性和能提供有效的原卟啉原氧化酶活力的原卟啉原氧化酶基因的方法是將細菌和植物原卟啉原氧化酶基因部分融合。產生的嵌合基因可用於篩選那些在植物細胞中能提供除草劑抗性的原卟啉原氧化酶。如擬南芥和枯草芽孢桿菌(hemY)原卟啉原氧化酶肽序列在高同源區有合理的線性對應。hemY編碼序列克隆到pBluescript並測試了其在SAS×38中表達除草劑抗性原卟啉原氧化酶。Protox-1/hemY嵌合基因用融合PCR技術構建，接著接回pBluescript載體。初始交換約在蛋白質的中間。產生的融合蛋白用互補法測試其原卟啉原氧化酶功能，然後經過平板接種到含完整Protox-1和hemY對照的除草劑上測試其除草劑抗性。實施例9通過過度表達植物原卟啉原氧化酶基因產生除草劑耐受性植物為了在轉基因植物中表達擬南芥或玉米蛋白質，合適的全長cDNA插入到按以下方法以pCGN1761中來的表達載體pCGN1761ENX。pCGN1761在其唯一的EcoR1位點消化，再連接到包含以下兩寡聚核苷酸序列的雙鏈DNA片段中，5′AAT TATQAC GTA ACG，TAG，GAA，TTA，GCG，GCCC，GCT，CTC，GAG，T3′(SEQ ID NO.11)和5′AAT TAC TCG，AGA GCG GCC GCGAAT TCC TAC GTT ACG TCA T 3′(SEQ ID NO.12)。得到的質粒pCGN1761ENX包含在來自花椰菜花葉病毒重複35S啟動子(Kay等人，科學2361299-1302(1987))中的唯一EcoR1.Not1和Xhol位點及來自土壤細菌tml基因的3′非轉譯序列。此質粒酶切後與由一個具原卟啉原氧化酶cDNA的質粒限制酶切產生的片段連結，這樣它就帶有完整原卟啉原氧化酶cDNA。從此質粒可外切出一個包含擬南芥原卟啉原氧化酶cDNA，側面接重複35S啟動子和土壤細菌tml基因3′非轉譯序列的Xbal片段。此Xbal片段以位於T-DNA邊界序列之間唯一的Xbal位點插入到雙向載體pCIB200。產生的質粒，命名為pCIB200 protox，轉化到根瘤土壤細菌菌株CIB542中，見如UKnes等人，植物細胞5159-169(1993)。
菸草CV.Xanthi nc的葉子小園片用具pCIB2001GPD的根瘤土壤桿菌CIB542按Horsch等人.科學2271229(1985)描述的方法感染。來自15個獨立葉片的卡那黴素抗性芽轉移到生根培養基，進一步轉移到土壤並且得到的植物在溫室中長成熟。這些植物的種子收集後，在包含卡那黴素的MS瓊脂培養基上萌發。從各個單獨初始轉化物來的多個單獨對卡那黴素抗性的嫩芽在溫室中長至成熟，收集它們的種子。這些種子再含卡那黴素的MS瓊脂培養基上萌芽。具有額外卡那黴素抗性嫩芽的植物系純化後用於插入基因並用以進一步分析。用紙打孔器將15個單獨的轉基因植物系切小園葉片並放在含有各種不斷上升濃度的原卟啉原氧化酶抑制型除草劑的MS瓊脂培養基上。
在三周後，將每個株系的兩套中10個園片稱重記下結果。轉基因株系對抑制劑抗性比野生型高，非轉化植物選出進一步分析。
從各個株系葉片中提取RNA。來自各獨立純化系和來自非轉基因對照植物中總RNA用含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳分離。(Ausubel等人，分子生物學的現行方案，Wiley Sons，New York(1987)。此膠印跡到尼龍膜上(Ausubel等人，Supra)並用放射性標記的擬南芥原卟啉原氧化酶cDNA雜交。雜交和衝洗條件按Church和Gilbert，美國自然科學研究彙編811991-1995(1984)描述的條件進行。濾膜放射自顯影，密集的對應原卟啉原氧化酶轉移基因的RNA帶在所有除草劑耐受性轉基因植物系中觀測到。
為進一步提高原卟啉原氧化酶過表達性的抗性，植物種在溫室中，並用各種濃度的原卟啉原抑制型除草劑處理。實施例10菸草細胞懸浮培養物的生長培養基MX1此培養基包含Murashige和Skoog(」MS」，T.Murashige等人，植物生理15473-496，1962)主要鹽類，微量鹽類和Fe-ED-TA(Gibco #500-1117；4.3g/L)，100mg/L肌醇，1mg/L尼克酸，1mg/L吡哆醇-HCl，10mg/L VB1-HCl，2-3g/L蔗糖，0.4mg/L2，4-二氯苯氧乙酸，和0.04mg/L激動素，pH5.8。此培養基高壓滅菌。N6此培養基包含多量元素，微量元素和Fe-EDTA，這在C-C，Chu等人，中國科學18659(1975)中有描述，以及下列有機化合物吡哆醇-HCl(0.5mg/L)，VB1-HCl(0.1mg/L)，尼克酸(0.5mg/L)，甘氨酸(2.0mg/L)和蔗糖(30.0g/l)。溶液高壓滅菌，最終pH5.6。注多量元素以10X濃度貯備液製備，微量元素以1000X貯備液製備，維生素貯備液一般以100X濃度製備。
菸草的懸浮培養細胞系S3[Harms和Di Maio，植物生理雜誌137，513-519，1991]在液體培養基MX1上生長。含有25mlMX1培養基的錐形瓶接種10ml已生長10天的細胞培養物。細胞在25℃，黑暗下，在軌道搖床上以100rpm(2cm幅度)培養。每隔7天接種等分的樣品到新鮮培養基，傾倒或移出約90％細胞懸浮物，接著注入新鮮培養基到所需懸浮體積，這樣進行傳代培養。250-350mg細胞接種物生長10天能產生5-8g重新鮮細胞物質。實施例11通過將細胞平板接種固體選擇培養基生長對原卟啉原氧化酶除草劑型抑制劑有耐受性的菸草細胞培養物按實施例10生長的細胞通過允許細胞沉澱或在500xg短暫離心進行收穫，並除去已用過的培養基。細胞再用新鮮培養基稀釋至適合平板接種的細胞密度，每毫升約10,000集落形成單位。在接種時，在少量體積的培養基(約1ml)中的細胞平整地鋪到含所需濃度的抑制劑的固體培養基(MX1，0.8％瓊脂)上部。每10cm陪氏平皿約用20～30ml培養基。合適的抑制劑濃度由劑量反應曲線(實施例14)決定，且至少是敏感野生型細胞IC50的兩倍高。
包含擴散到選擇培養基細胞的培養平板在25～28℃黑暗中普通生長條件下培養，直至細胞克隆形成。出現的細胞克隆轉移至包含所需濃度抑制劑的新鮮培養基中。
上述方法的一個優選的改進是將生長好的懸浮培養細胞首先接種到固體培養基上部少量液體培養基中。將在40℃保持融化狀態的等量溫液液體瓊脂培養基(1.2-1.6％瓊脂)加到平皿中，在培養基融化之前，將平皿立刻溫和轉動使細胞平整擴散在培養基表面，並使細胞與瓊脂培養基混合。
作為選擇，細胞也可在擴散到選擇培養基表面之前與融化的瓊脂混和。此方法的優點是細胞鑲嵌和固定在選擇培養基上面固體培養基薄層中。與細胞鑲嵌在整個20-30ml體積中相比，它能提供更好的細胞透氣性。實施例12通過細胞在液體選擇培養基中生長產生對除草劑原卟啉原氧化酶抑制劑有耐受性的菸草細胞培養物按實施例10培養的細胞以合適的細胞密度接種到含所需濃度除草劑型原卟啉原氧化酶抑制劑的液體培養基MX1中，細胞按實施例10培養和生長，在7～10天周期後，依賴於生長速率，用包含所需濃度抑制劑的培養基，將細胞傳代培養。
取決於所用的抑制劑濃度，細胞生長會比無抑制劑慢。實施例13生產具增強水平的原卟啉原氧化酶的菸草細胞為了獲得具增強水平的原卟啉原氧化酶的細胞培養物或愈傷組織，懸浮培養物或愈傷組織以步驟合理的方式轉移到不斷增高濃度的除草劑型原卟啉原氧化酶抑制劑中。具體的說以下步驟表示為實施例11中平板接種細胞出現的細胞集落轉移到包含與根據實施例11中選擇使用的相同濃度的原卟啉原氧化酶抑制劑的MX1培養基中以製備懸浮培養物。另外，實施例12中選出的細胞懸浮培養物在包含與實施例12相同濃度原卟啉原氧化酶抑制劑的液體MX1培養基中傳代培養。
培養物以周為間隔傳代培養1～20次，然後傳代培養到包含下一個更高除草劑濃度的MX1培養基。此細胞在包含此較高濃度除草劑的培養基培養1～10個傳代培養物。然後，此細胞轉移到含有下一個更高濃度除草劑的MX1培養基中。
作為選擇，實施例11中選出的愈傷組織塊轉移到含所需濃度除草劑的固化MX1培養基上。按照前面段落列出的除使用固體培養基以外的步驟轉移到更高濃度的除草劑中。實施例14測定懸浮培養物中的細胞除草劑劑量依賴生長為了獲得劑量反應曲線，測定在不同除草劑濃度下細胞的生長。除草劑型原卟啉原氧化酶抑制敏感的野生型菸草細胞S3的懸浮培養細胞和選出的對除草劑耐受的或轉基因細胞S3和除草劑耐受的或轉基因細胞在實施例11中的液體培養基中以高密度預生長2～4天。這些細胞洗去用過的培養基，再加入無除草劑的新鮮培養基使之達到需要濃度(約150mgFW細胞每毫升懸液)。2.5ml懸液，包含約250～300mg FW細胞的樣品接種到裝有30ml具所需除草劑濃度的液體培養基的錐形瓶中。小心接種同樣量的細胞到各瓶中，每個錐形瓶包含相同體積培養基。每個除草劑濃度接種3～6個重複錐形瓶。除草劑濃度從O(＝對照)，0.1ppb，0.3ppb，1ppb，3ppb，10ppb，30ppb，100ppb，300ppb，1000ppb，3000ppb和10，000ppb。在接種以測定每個接種瓶中細胞量時，也要接種幾個樣品。
然後細胞接種在28℃，黑暗的對照條件下生長10天。細胞的收穫可將各個瓶子中物質傾入附在真空吸濾裝置的濾紙片上以除去所有液體，以獲得合理的幹新鮮細胞量。新鮮的細胞團進行稱重，樣品的乾重得在乾燥後獲得。
細胞的生長以10天內細胞增量來測定和表達，並按以下方程以與無除草劑細胞生長的百分比表示((最終加除草劑細胞生長質量—接種量)×100/(無除草劑細胞生長量-接種量))。IC50值從繪製數據圖表(相對細胞質量對除草劑濃度)上測定。IC50表示細胞生長為對照生長(細胞在無除草劑下生長)的50％的除草劑濃度。
此方法的改進中，除草劑抗性細胞培養物，正如在實施例11和13中得到的，其中的一些愈傷組織碎片轉移到包含不同除草劑濃度的固體愈傷組織培養基中，相對生長在培養周期2～6周後測定，稱量愈傷組織塊並與在無除草劑培養基的對照培養相比較。然而，優選懸浮方法因其更精確。實施例15交叉耐受的測定為了測定細胞表現對類似物或其他除草劑的耐受程度，通過在不斷上升的選定除草劑濃度上生長細胞來重複實施例14。對每種除草劑測定細胞的相對生長和它們的IC50值並比較。實施例16測定除草劑耐受性表型在時間上的穩定性為了測定一個細胞培養物的除草劑耐受性表型是否能長時間維持，細胞被從有除草劑培養基轉移到無除草劑培養基。按實施例10描述，細胞在無除草劑下生長3個月，並有規律地以合適間隔進行傳代培養(7～10天懸浮培養，而對於愈傷組織培養要3～6周)。已知量的細胞轉移回含除草劑培養基中，並培養10天(懸浮培養)，或4周(愈傷組織培養)。相對生長按實施例14測定。實施例17誘導和培養來自玉米盾片組織的胚原性愈傷組織谷穗在自花傳粉玉米的純培養系Funk 2717授粉後12-14天收穫。谷穗移去外殼，然後在加了幾滴除汙劑以更好溼潤的20％商業Chlorox漂白液中搖15分鐘以滅菌。谷穗再用無菌水洗幾次，以後步驟在滅菌空氣流動框中無菌操作。1.5-2.5mm長的胚從具匙突的核中移出並胚軸向下放置在包含2mg/l2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和3％蔗糖的培養基上，培養基用0.24％GelriteR固化。
胚原性愈傷組織在將胚的盾片組織在28℃黑暗中培養2-4周形成。此愈傷組織從外植體中移出並轉移到包含2mg/l 2，4-D的新鮮固體MS培養基中。胚原性愈傷組織的傳代培養以因為間隔重複。只有具胚原性形態的愈傷組織部分傳代培養。實施例18選擇對除草劑型原卟啉原氧化酶耐受的玉米細胞培養a)使用胚原性愈傷組織的選擇來自實施例17的胚原性愈傷組織轉移到包含含有2mg/l 2，4-D，3％蔗糖的N6培養基和足以阻滯生長但不影響培養的胚原性的濃度的原卟啉原氧化酶抑制劑；並以0.24％GelriteR固化的愈傷組織維持培養基上。為提高除草劑耐受性突變的頻率，培養物在選擇前可用化學誘變劑如乙醯甲烷硫酸或物理誘變劑，如UV光預處理，並在僅比實施14中測定的抑制生長濃度低的濃度上生長。培養物在28℃，黑暗中培養。在14天生長後，愈傷組織轉移到相同組分的新鮮培養基上。只有具所需胚發生形態的即已知為可改變胚發生愈傷組織II型形態的培養物進行傳代培養。通過以周為間隔的傳代培養，在新鮮培養基上繁殖2～10個傳代培養物，只有那些生長最快的培養物進行傳代培養。最快生長的愈傷組織轉移到包含實施例11設定的合適的原卟啉原氧化酶抑制劑的愈傷組織維持培養基上。一般在約5～10周的傳代亞培養後，愈傷組織在此除草劑濃度生長很好，此愈傷組織再轉移到含有三倍高濃度的抑制劑的愈傷組織維持培養基上，並傳代培養至獲得生長好的培養物。此過程採用包含濃度10倍高於原始合適濃度的原卟啉原氧化酶抑制劑的培養基重複操作，然後再用包含20和40倍高濃度的培養基。
當足夠的愈傷組織產生後，將其轉移到適合胚胎成熟和植物再生的再生培養基上。在各個除草劑濃度上生長的胚發生愈傷組織轉移到再生培養基上。
b)使用胚發生性懸浮培養的選擇玉米Funk純系2717的胚發生性懸浮培養按實施例24建立並通過以周為間隔在新鮮包含2mg/L 2，4-D的液體N6培養基上保持。為提高除草劑耐受性突變的頻率，此時，培養物可用化學誘變劑，如乙醯甲烷硫酸處理，並且按實施例14中測定的，僅低於可觀測到生長抑制濃度的濃度。為了選擇，培養物轉移到包含2mg/l 2，4-D和足以使生長停滯但不影響培養胚胎發生的抑制劑濃度的液體N6培養基中。培養物在28℃，黑暗中，120rpm搖床上生長。以周為間隔，培養基移去後加入新鮮培養基。培養物按照它們的生長用培養基稀釋以維持在每50ml培養基中含10ml聚集的細胞體積。對於每個傳代培養，培養物要進行觀測，只有具所需可變胚發生形態的快速生長培養物保留以進一步傳代培養。在含N6培養基中經過2～10，傳代培養後，對於每周傳代培養，培養物生長速率上升至少2～3倍。此培養物再轉移到包含2mg/L 2，4-D和比原始所用高3倍劑量的抑制劑的N6培養基。生長的培養物按上述重複地在此培養基上傳代培養2～10個傳代培養物。具有需要的可變胚發生形態的快速生長培養物選出進一步傳代培養。快速生長培養物轉移到包含2mg 2，4-D和比原始所用抑制劑濃度高10倍的N6培養基，具所需可變胚發生形態的傳代培養生長培養物的過程重複2～10次傳代培養直至獲得快速生長培養物。此培養物再轉移至包含2mg/l 2，4-D和30倍初始濃度的抑制劑的N6培養基。
為了使所提到除草劑濃度水平選出的胚發生懸浮培養物再生植物，此培養物首先轉移至用0.24％GelriteR固化並包含2mg/l 2，4-D和可選擇的培養物曾生長的濃度抑制劑的N6培養基上以產生胚發生愈傷組織。此胚發生愈傷組織傳代培養到新鮮愈傷組織維持培養基中直至獲得足夠再生的愈傷組織。只有具所需胚發生形態的培養物進行傳代培養。實施例19從選出的愈傷組織和懸浮培養物中再生玉米植株從實施例13中選出的胚發生性愈傷組織培養物通過轉移到新鮮的再生培養基上再生出植株。使用的再生培養基有由缺少2，4-3的N6培養基組成的ON6培養基，或由含有0.25mg/l 2，4-D和10mg/l激動素(6-呋喃甲基腺嘌呤)的N6培養基組成的N61培養基，或由含有0.1mg/l 2，4-D和1mg/l激動素的N6培養基組成的N62培養基，全都以0.24％GelriteR固化。培養物在28℃光照下生長(16h每天，10-100 Einsteins/m2sec，採用白色螢光燈)，此培養物每隔兩周在新鮮培養基上傳代培養。3～8周出現小植物。小植物至少2cm高后從粘附的愈傷組織轉移到根促生培養基中。有不同的根促生培養基可採用。這些培養基包括缺乏維生素，具普通量的鹽或鹽減半，蔗糖減至1g/l，並缺少生長調節物或包含0.1mg/lα-萘乙酸的N6或MS培養基。一旦根長得足夠了，小植物移植到包含殺蠕蟲劑，泥炭蘚和花園土的盆栽混合物中。在移植時所有愈傷組織都除去，所有瓊脂都洗淨，葉子剪除一半。小植物在溫室中生長，開始用倒置透明塑料杯蓋幾天以保持溫度和在陰處生長。在適應氣候後，植株再移栽並生長至成熟。肥料peters 20-20-20(Grace Sierra)用於確保植株健康成長。開花植物要授粉，優選自花授粉。實施例20構建植物轉化載體有許多轉化載體可用於植物轉化，本發明的基因可用於與任何這樣的載體相聯。所用載體的選擇依賴於優選的轉化技術和轉化的目標種類。對於某些目標種類，優選不同的抗生素或除草劑選擇性標記。在轉化中使用的常規性選擇標記包括能提供卡那黴素或其它相關抗生素抗性的nptll基因(Messing Vierra，基因19259-268(1982)；Beran等人，自然304184-187(1983))，能提供除草劑phosphinothricin抗性的bar基因(White等人.，核酸研究.181062(1990)，Spencer等人，理論應用遺傳學79625-631(1990)，能提供對抗生素潮黴素抗性的hph基因(Blochinger Digqelmann，分子細胞生物學42929-2931)，和能提供對Methotrexate抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO雜誌 2(7)1099-1104(1983))(1)構建適合土壤桿菌轉化的載體許多載體可用於對根瘤土壤桿菌進行轉化。這樣典型的組合至少包括一個T-DNA邊界序列並包括如pBIN19等的載體。(Be-van.核酸研究(1984)).下面描述了兩種典型載體的構建。
pCIB200和pCIB2001的構建用於構建土壤桿菌中重組載體的雙功能載體pCIB200和pCIB201按以下方式構建。pTJS75Kan的構建是通過允許外切四環素抗性基因條件下用Narl消化pTJS75(Schmidhauser和Helinski，細菌雜誌164446-455(1985))，接著插入帶NPT11的pUC4K中的Accl片段(Messing Vierra基因19259-268(1982)；Bevan等人，自然304184-187(1983)；McBrida等人，植物分子生物學14266-276(1990))。Xhol接頭(linker)接到含有T-DNA左右邊界，一個植物可選擇的nos/nptll嵌合基因和puc多向接頭(polylinker)的pCIBT的EcoRV片段上(Rothstein等人，基因53153-161(1987))，Xhol-消化片段克隆到Sall消化的pTJS75kan中以構建pCIB200(見EP0332104，實施例19(13387)。p CIB200含以下單一的多向接頭限制位點CcoR1，Sstl，Kpnl，Bgll，Xbal，和Sall。p CIB2001是通過插入其它限制性位點的多向接頭而產生的p CIB200的衍生物。p CIB2001的多向接頭的單一限制位點有EcoR1，Sstl，Kpnl，Bglll，Xbal，Sall，Mlul，Bcll，Arrll，Apal，Hpal，和stul。除了含有這些單一限制性位點外，p CIB2001也有植物和細菌卡納黴素選擇。用於土壤桿菌介導的轉化的T-DNA左右邊界，RK2衍生的trfA的在大腸桿菌和其他受體間運動的功能，也來自RK2的OriT和OriV的功能。此p CIB2001多向接頭適合於克隆含其自身調控信號的植物表達框。
p CIB10和其潮黴素選擇衍生物的構建雙向載體p CIB10包括一個編碼用於在植物中選擇的卡那黴素抗性的基因，T-DNA左右邊界序列和來自廣泛受體範圍的質粒pRK252並允許其在大腸桿菌和土壤桿菌中複製的非聯合序列。它的構建在Rothstein等人，基因53153-161(1987)中描述。Gritz等人.基因25179-188(183))中描述了插入了潮黴素B磷酸轉移酶基因的各種p CIB10衍生物的構建。這些衍生物能夠在只有潮黴素(p CIB743)或潮黴素和卡那黴素(p CIB715；p CIB717)上挑選轉基因植物細胞〔Rothstein等人，基因53153-161(1987)〕。(2)構建適合非土壤桿菌轉化的載體不使用土壤桿菌的轉化可迥避在選擇轉化載體時對T-DNA序列的需要，因而除了如上描述的含T-DNA序列的載體外，可以使用缺乏這些序列的載體。不依賴土壤桿菌的轉化技術包括通過粒子轟擊，原生質體提高(如PEG和電穿孔)和顯微注射變化。載體的選擇主要依賴於較優選的轉化物種。下面是對構建一些典型載體的描述。p CIB3064的構建p CIB3064是p UC衍生的並適合於與採用除草劑basta(或phos-phinothricin)選擇的直接基因轉移技術結合。質粒p CIB246包括與大腸桿菌GUS基因有效融合的CaMV 35S啟動子和CaMV 35S轉錄終止子並在PCT公開申請WO 93/07278中有描述。此載體的35S啟動子有兩個啟始位點5′的ATG序列。這些位點可採用標準PCR技術突變，通過此法可除去ATGs並產生Sspl和Pvull限制性位點。新的限制位點離Sall單一位點96和37bp，離準確啟始位點101和42bp。所得的p CIB246衍生物命名為p CIB3025。然後GUS基因通過Sall和Sacl消化從p CIB3025上切下，末端變成平頭並重連接以產生質粒p CIB3060。質粒pJIT82從John Innes Centre，Norwich獲得，包含來自鏈黴菌的bar基因的400bp Smal片段切下並插入到p CIB3060的Hpal位點(Thompson等人，EMBO雜誌.62519-2523(1987))。這樣產生的p CIB3064包含用於除草劑選擇的在CaMV 35S啟動子和終止子控制下的bar基因，一個氨苄青黴素抗性基因(用於在E.coli中選擇)和具有Sph1，Pst1，Hind111和BamH1單一位點的多向接頭。此載體適合克隆包括其自身調節信號的植物表達框。
p SOG19和p SOG35的構建p SOG35是利用大腸桿菌二氫葉酸脫氫酶(DHFR)基因為提供對Methotrexate抗性的選擇性標記的轉化載體。採用PCR擴增pSOG10中的35S啟動子(～800bp)，來自玉米Adh1基因的內含子6(～550bp)〔Lou等人，Plant J.3393-403 1993；Dennis等人，核酸研究123983-4000，1984〕和Gus的18pb非轉譯引導序列。一個編碼大腸桿菌二氫葉酸脫氫酶II型基因的250bp片段也通過PCR擴增，這兩個PCR片段與包含pUC19載體主鏈和nopaline合成酶終止子的p B1221(Clonteeh)的Sacl-Pstl片段組裝。這樣的組裝就產生了包含與內含子6序列融合的35S啟動子，GUS引導序列，DHFR基因和nopaline合成酶終止子的pSOG19。將p SOG19中GUS引導序列以玉米褪綠病花葉病毒(MCMV)的引導序列代替產生載體p SOG35。p SOG19和p SOG35帶有氨其青黴素抗性的pUC基質和共克隆外源基因的Hindlll，Sph1，Pst1和EcoRI位點。p SOG10此β-葡糖苷酸酶(GUS)表達載體是從買自Cloneteds實驗室，Palo Alto，California的質粒p B1121衍生的。玉米Adh1基因的內含子6用PCR從質粒p B428中擴增，採用了寡聚核苷酸引物SON0003和SON004；如Bennetzen等人，美國自然科學研究彙編814125-4128(1987)中所述。
SON00035′-CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG-3′SON004.5′-ACGGGATCCAACrTCCTAGCTGAAAAATGGG-3′此PCR反應產物用限制性核酸內切酶BamH1消化，在每個PCR引物5′末端的BamH1位點切開。產生的DNA片段在瓊脂糖凝膠上純化並與在p B1121 CaMV 35S啟動子和GUS基因之間的BamH1位點連接。連接的DNA轉化到E.coli並克隆與限制酶切鑑定的GUS基因相同方向的Adh1內含子6。p SOG19此二氫葉酸還原酶(DHFR)表達載體是將35S啟動子p SOG19中Adh1內含子6與質粒pHCO的DHFR基因按Bourouis和Jarry，EMBO雜誌21099-1104(1983)描述方法融合產生。35S啟動子和Adh1內含子6是p SOG10中的片段，以SON0031和SON0010為引物PCR擴增而得到。
SON00315′-CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC-3′SON00105′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′所得的片段用限制性核酸內切酶Pst1和BspH1消化，並用瓊脂糖純化。
DHFR編碼區通過以SON0016和SON0017為引物將pHCO用PCR擴增而產生。
SON00165′-GCTACCATGGCCACATAGAACACC-3′SON00175′-CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG-3′得到的片段用限制酶Nsol和Sac1消化並在瓊脂糖凝膠上純化。
上述兩個片段連接到通過用限制性內切酶Pst1和Sac1消化並在瓊脂糖上純化含Nos終止子區和p BI121和p UC19區的3kb片段從p BI121製備的載體片段。此三向連接物35S啟動子-Adh1內含子6-DHFR基因-Nos終止子以正確順序和方向融合以便在植物中功能性表達。p SOG30此GUS表達載體是從pSOG10通過按lommel等人，病毒學181382-385(1991)以三向聯接將玉米褪綠花葉病素(MCMV)引導序列插入到35S-GUS基因非轉譯引導序列中而產生。
17bp MCMV外殼蛋白引導序列加上合理限制性內切酶信號的雙鏈可合成並退火。產生的雙鏈片段可用BamH1和Ncol消化並在聚丙烯醯胺凝膠上純化。
此GUS基因編碼區以SON0039和SON0041為引物，以pBI121為模板用PCR擴增。
SON00395′-CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA-3′SON00415′-ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC-3′這些引物可在GUS5′末端加一個Ncol位點，在GUS 3′末端加一個Sacl位點。得到的片段用限制性內切核酸酶Ncol和Sacl消化，並在瓊脂糖凝膠上純化。
GUS基因從質粒p SOG10上通過限制性內切酶Sacl酶切和限制性內切酶BamHI部分酶切而移去，產生的有可在35S啟動子-Adh1內含子6後插入編碼序列的BamHI和Sac1位點的載體在瓊脂糖凝膠上純化。
上述三個片段以三向連接物形式連接產生具以下結構的基因融合物35S啟動子-Adh1內含子6-MCMV引導序列-GUS-NOS終止子，所有的都以pUC19載體為主鏈。p SOG35DHFR選擇性標記載體除MCMV引導序列插入在DHFR基因非轉譯引導序列中以增強轉移外與p SOG19相同。以兩步進行構建首先一個除含有不是35S的修飾的Adh啟動子外與p SOG30相同的載體p SOG32中的GUS編碼序列被p SOG19中的DHFR編碼序列經過用Ncol和Sacl切下GUS，並以Ncol-Sacl片段聯接進DHFR而代替。這樣產生的載體p SOG33具Adh啟動子-Adh1內含子6-MCMV引導序列-DHFR編碼區-Nos終止子，在啟動子和內含子之間的Bg111位點及編碼區和終止子之間的Sacl位點的基因結構。Bg111-Sacl片段通過限制性內切酶消化和瓊脂糖凝膠純化而分離，並聯入p SOG30的BamHI和Sacl位點；用p SOG33的Adh1內含子6-MCMV引導序列-DHFR編碼區代替p SOG30的Adh1內含子Z6-MCMV引導序列-GUS編碼區。實施例21構建植物表達框想要在轉基因植物中表達的基因序列首先組裝在一個合適的啟動子之後和一個合適轉錄終止子的上遊的表達框中，這些表達框就能容易地轉移到上面實施例19描述的植物轉化載體中。啟動子的選擇在表達框中啟動子的選擇將決定轉移基因在轉基因植物中表達的空間和時間形式。選定的啟動子會在特定細胞類型(如葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮細胞)或特定組織或器官(如根、葉或花)中表達轉移基因而且此選擇將反映轉移基因要表達的位置。並且，選定的啟動子可使基因在先誘導或其他時間調控啟動子下表達。進一步選定的啟動子可被化學物質調控。這樣使轉移基因只有在需要時和用化學物質處理時才會使誘導表達成為可能。轉錄終止子多種轉錄終止子可在表達框中使用。這將導致超過轉移基因轉錄的終止及它的正確多聚腺苷的產生。合適的轉錄終止子並已知在植物中作用的包括CaMV 35S終止子，tml終止子，nopaline合成酶終止子，豌豆rbcs E9終止子。這些都可在單子葉或雙子葉植物中應用。增強或調控表達的序列許多序列發現能在轉錄單元內增強基因表達，並且這些序列能與本發明的基因聯合使用以提高它們在轉移植物中的表達。
多種內含子序列能表現出增強表達，尤其在單子葉細胞。例如玉米Adh1基因的內含子已發現在導入細胞後能很強地促進在它同源啟動子下野生型基因的表達。內含子1發現特別有效地促進與氯黴素乙醯轉移黴基因融合的結構的表達(Callis等人，基因開發11183-1200(1987))。在相同表達系統中，玉米bronzel基因內含子具相似增強表達作用(Callis等人，同上)。內含子序列已常規性聯入到植物轉化載體，尤其是在非轉譯引導序列中。
許多來自病毒的非轉譯序列也已知能促進表達，而且在雙子葉植物細胞中特別有效。特別是菸草花葉病毒(TMV，「W-序列」)引導序列，玉米褪綠斑病毒(MCMV)和苜蓿花葉病毒(AMV)的引導序列已表現出很有效地增強表達(如Gallie等人，核酸研究158693-8711(1987)；(Kuzeski等人，植物分子生物學1565-79(1990))。細胞內基因產物的導向多種引導基因產物的機制已知存在於植物中，並且控制和使機制運行的序列已有一些較詳細的鑑定。如葉綠體基因產物的導向就由在各種蛋白質氨基末端在葉綠體產生成熟蛋白時要切除的信號序列控制(如Comai等人，生化雜誌26315104-15109(1988))。這些信號序列可與異源基因產物融合影響異源產物進入葉綠體(Van den Broeck等人，自然313358-363(1985))。編碼適合信號序列的DNA可從編碼RUBISCO蛋白，CAB蛋白，EPSP合成酶，GS2蛋白等其它已知位於葉綠體的蛋白的cDNAs 5′末端分離。
其它基因產物位於其它細胞器如線粒體和過氧化物酶體(如Unger等人，植物分子生物學13411-418(1989))。這些產物的編碼CDNA也可用於影響異源基因產物對這些細胞器的導向。這些序列的例子是線粒體核編碼ATP酶，特異的天冬氨酸轉移酶同功酶。細胞蛋白體的導向在Rogers等人，美國自然科學研究彙編826512-6516(1985))中有描述。
使基因產物導向到其它細胞空間的另外序列已有描述。氨基末端序列負責導向ER，非原質體和糊粉層細胞的細胞外分泌(Koehler HO，植物細胞2769-783(1990))。另外，氨基末端序列與羧基末端序列結合負責基因產物的液泡導向(Shinshi等人.植物分子生物學.14357-368(1990))。
將上述的合適引導序列與感興趣的轉移基因序列融合，可以引導基因產物到任何細胞器和細胞空間。對於葉綠體導向，如RU-BISCO基因，CAB基因，EPsP合成酶基因或GS2基因信號序列在轉移基因氨基末端ATG框中融合。選定的信號序列要包含已知切割位點並且構建的融合物要考慮要求切割的切割位點後所有胺基酸。許多時候這個要求可通過在切割位點和轉移基因間加入少量胺基酸或進一步在轉移基因序列內替換一些胺基酸來滿足。用於葉綠體進入的融合物能夠通過體外對體外轉錄產物的轉譯，接著採用下面描述的技術測定葉綠體體外吸收來測定葉綠體的吸收效率C Bartlett等人.在Edelnann等人(Eds)葉綠體分子生物學方法，Elsevier.pp1081-1091(1982)；Wasmann等人，分子基因遺傳學205446-453(1986))。這些構建技術在本發明中是眾所周知的並且也可用在線粒體和過氧化物體。轉移基因的表達可能要求的導向的選擇依賴於前體的細胞位置要求作為給定路線的起點。這通常為胞質的或葉綠體的，儘管有些情況是線粒體和過氧化物體。轉移基因的產物一般不需導向ER，非原質體或液泡。
上述細胞導向機制可不僅用於與它們同源啟動子聯合，也可與異源啟動子聯合，這樣可去影響在此轉錄啟動子調控下特異的細胞導向，因而具有與引導信號來源的啟動子不同的表達形式。實施例22雙子葉植物的轉化雙子葉植物的轉化技術是本領域已知的，包括土壤桿菌的基礎的技術和無需土壤桿菌的技術非土壤桿菌技術包括原生質體和細胞對外源基因材料的直接吸收。這些可通過PEG或電穿孔介導的吸收，粒子轟擊介導的輸送，或顯微注射來獲得。這些技術的實例在Paskowski等人EMBO J 32717-2722(1984)，Potrykus等人，分子基因遺傳學199169-177(1985)，Reich等人，生物技術41001-1004(1986)和Klein等人，自然32770-73(1987)中描述。在各例中轉化細胞採用本領域已知的標準技術再生成完整的植株。
土壤桿菌介導的轉化是一個優選的轉化雙子葉植物的技術，因為它有高的轉化效率和在許多種類中有廣泛使用。一些土壤桿菌常規轉化的作物種類包括菸草，西紅柿，向日葵，棉花，油菜，土豆，大豆，苜蓿和楊樹(EP 0317511(棉花)，EP 0249432(西紅柿，Calgene)，WO 87/07299(芸苔，Calgene)，US 4,795,855(楊樹))。土壤桿菌轉化典型地包括將帶有感興趣外源DNA的雙向載體(如p BI121(pCIB200或p CIB2001)轉移到合適的土壤桿菌菌株，這依靠受體土壤桿菌共生質粒T；或染色體上帶的Vir基因的互補(如p CIB200和pCIB2001的CIB542菌株(Uknes等人，植物細胞5159-169(1993))。轉移重組雙向載體到土壤桿菌通過使用帶有重組雙向載體的大腸桿菌的三素本雜交過程而獲得，它是一種輔助大腸桿菌菌株具有諸如p RK2013的質粒，能夠移動重組雙向載體到目標土壤桿菌菌株。作為選擇，重組雙向載體也可通過DNA轉化轉移至土壤桿菌(HOfgen Willmitzer，核酸研究169877(1988))。用重組土壤桿菌轉化目標植物種類常包括土壤桿菌與植物外植體共同培養並按本領域已知的方法進行。在雙向質粒下DNA邊界序列間有抗生素或除草劑抗性標記的轉化組織在選擇性培養基上再生。實施例23單子葉植物的轉化大多數單子葉植物的轉化現已變成常規性的。優選的技術包括用PEG或電穿孔技術直接轉移基因到原生質體，粒子轟擊使之進入愈傷組織。轉化可在單DNA種類或多DNA種類(即共同轉化)中進行，而且這些技術在本發明中適用。共同轉化具有可避免複雜載體構建和產生具有感興趣的基因與選擇性標記不相聯的基因座的轉基因植物，且可在以後世代中除去選擇性標記等優點。這些都可認為是需要的。但是，使用共同轉化有一缺點為整合到基因組中分開的DNA種類頻率少於100％(Schocher等人.生物技術41093-1096(1986))。
專利申請EP 0292435(Ciba-Geigy)，EP 0392225(Ciba-Geigy)和WO 93/07278(Ciba-Geigy)描述了一個玉米精華純培養系列製備愈傷組織和原生質體，使用PEG或電穿孔轉化原生質體，以轉化原生質體再生玉米植株的技術。Gorden-Kamm等人，PlantCell 2605-618(1990)和Fromm等人，生物技術8833-839(1990))已出版了用粒子轟擊轉化A188-衍生玉米系的技術。而且申請WO 93/07278(to Ciba-Geigy)和Koziel等人，Biotechnology11194-200(1993)描述了用粒子轟擊轉化玉米純培養系的技術。此技術採用從授粉14-15天後玉米穗上切下長1.5-2.5mm長的未成熟玉米胚及PDS-100He Biolistis轟擊裝置。
水稻的轉化可通過採用原生質體和粒子轟擊的直接基因轉移技術操作。原生質體介導的轉化對Japonica-型和Indica-型有描述(Zhang等人，Plant Cell Rep.7379-384(1988)；Shimamoto等人，自然338274-277(1989)；Dafta等人.生物技術8736-740(1990))。兩種類型也都可用粒子轟擊常規轉化(Christou等人，生物技術9957-962(1991))。
專利申請EP 0332581(Ciba-Geigy)描述了產生、轉化和再生Pooideae原生質體的技術。這些技術可用於鴨芽和小麥的轉化。另外，小麥轉化可用Vasil等人，生物技術10667-674(1992))描述的粒子轟擊進入C型長期可再生愈傷組織細胞中，也可用Vasil等人，生物技術111553-1558(1993))和Weeks等人，植物生理1021077-1084(1993)描述的粒子轟擊未成熟胚和未成熟胚來源愈傷組織。一個較優的小麥轉化技術包括通過粒子轟擊未成熟胚的小麥轉化和包括在基因輸送前的高蔗糖或高麥芽糖步驟。在轟擊前，許多胚(0.75-1mm長)平板接種至含3％蔗糖(Murashige Skoog，植物生理15473-497(1962))和用於在黑暗中誘導體細胞胚的2，4-D 3mg/l的培養基上。在選定的轟擊日子，將胚從誘導培養基移至滲壓劑上(即有蔗糖和麥芽糖加到需要濃度，典型的為15％的誘導培養基)。這些胚允許質壁分離2-3h再轟擊。典型的是每平皿20個胚，儘管這不是關鍵的。使用標準方法將合適的基因攜帶質粒(如p CIB3064或p SG35沉積到毫米大小的金粒上。每個平皿的胚用DuPont Biolistics射擊，氦氣裝置為標準80目篩，約1000Psi爆發壓力。在轟擊後，胚放回黑暗中恢復約24h(仍在滲壓劑中)。24小時後，胚從滲壓劑移至誘導培養基並在上面保持約一個月直至再生前。約一個月後，構建胚形成愈傷組織的胚外植物轉移到進一步包含合適選擇劑(如在p CIB3064情況下為10mg/l basta，在p SOG35情況下為2mg/l methotrexate)的再生培養基(MS+1mg/l NAA，5mg/lGA)。又在約一個月後，產生的芽轉移到稱為「GATS」並裝有半強度MS，2％蔗糖，和相同濃度選擇劑的無菌容器中。專利申請08/147,161中描述了小麥轉化方法，本文引用作為參考。實施例24在大腸桿菌表達系統中選擇對原卟啉原氧化酶抑制型除草劑有抗性的植物原卟啉原氧化酶基因。
將玉米葉綠體原卟啉原氧化酶編碼質粒p WDC-4轉化到隨機誘變株XL1-Red(Stratagene.la Jolla，CA)中。轉化物接種到含50g/ml氨苄青黴素的L培養基上在37℃培養48h。轉化細胞層從平板上刮下並用Wizard Megaprep試劑盒promega，Madison WI)提取質粒DNA。從此突變株分離的質粒DNA約含有2000個核苷酸一個鹼基改變(見Greener等人，策略T(2)32-34(1994))。
突變質粒DNA轉化到hemG突變株SAS×38(Sasarman等人，遺傳微生物學雜誌113297(1979)並平板接種含100g/ml氨苄青黴素的L培養基和包含各種濃度原卟啉原氧化酶抑制型除草劑的相同培養基上。這些平板在37℃培養2-3天。質粒DNA從所有在含有能有效殺死野生型菌株的除草劑濃度上生長的克隆中分離出。分離到的DNA再轉化到SAS×38，再平板接種到除草劑上確定抗性是質粒攜帶的。
突變的p WDC-4質粒DNA再從抗性克隆中分離，並用EcoR1和Xhol將原卟啉原氧化酶編碼序列切下，切下的原卟啉原氧化酶編碼序列再克隆到未突變的p Bluscript載體上並按上述同樣方法測試其對原卟啉原抑制型除草劑的抗性。
該方法消除了提供抗性的非編碼序列突變如啟動子上升突變(即突變體的抗性是突變導致未修飾原卟啉原氧化酶表達上升)而僅留下抗性是由於原卟啉原氧化酶編碼序列突變造成的突變體。對所有用此法測定為純的除草劑抗性原卟啉原氧化酶基因DNA序列進行測定，並通過與野生型p WDC-4原卟啉原氧化酶序列比較鑑定突變。
通過上述過程，鑑定了一個在p WDC-4序列(SEQ ID NO 5)中498位核苷酸由C變為T的抗性突變。帶有此突變的質粒命名為p MzC-1Val。這個在166胺基酸(SEQ ID NO.6)由丙氨酸密碼子GCT變為纈氨酸密碼子GTT的轉變導致了在細菌測試中原卟啉原氧化酶對原卟啉原氧化酶抑制性除草劑抗性至少高10倍。在p Bluscript SK載體中的p MiC-1Val於1994年9月30以pWDC-8命稱保存在農業研究培養物收集中心並給定保存號NRRL#21340。
同樣的方法用於在各種載體中篩選擬南芥原卟啉原氧化酶-1基因的除草劑抗性形成。鑑定到一個在p WDC-2序列(SEQ IDNO.1)689核苷酸由C變為T的抗性突變。此質粒定為pAraC-1Val。這個改變與上面p MzC-1Val突變體相同，將在擬南芥protox蛋白序列相應位置的220胺基酸(SEQ ID NO.2)處丙氨酸密碼子GCT變為纈氨酸密碼子GTT。
第二個抗性基因包括在p WDC-2序列(SEQ ID NO.1)的1307核苷酸的A變為G，此質粒定為p AraC-2Cys。這個改變為在426胺基酸(SEQ ID NO.2)酪氨酸密碼子TAC轉變成胱氨酸密碼子TGC。這個在玉米protox-1序列在核苷酸順序1115-1117(SEQID NO.5，胺基酸位置372，SEQ ID NO.6)對應的酪氨酸密碼子相似突變後會產生此酶的除草劑抗性形式。
第三抗性突變在p WDC-2序列(SEQ ID NO.1)691核苷酸由G變為A。此質粒命名為p Arac-3Ser。這個突變體在與p Arac-1突變體鄰近的密碼子位置221胺基酸(SEQ ID NO.2)甘氨酸密碼子GGT變為Ser密碼子AGT。在玉米protox-1序列497-499核苷酸位置(SEQ ID NO.5，胺基酸位置167 SEQ ID NO.6)對應的甘氨酸密碼子可相似突變產生此酶的除草劑抑制形式。
上述突變產生的原卟啉原氧化酶在細菌測試中至少有10倍的原卟啉原氧化酶抑制型除草劑抗性。
在p Fl61載體中的p Arac-2cys於1994年11月14日定為pWDC-7，保存在農業研究培養物收集中心，並給定保存號NRRL#21339N。實施例25在隨機篩選鑑定的位置額外的除草劑抗性密碼子替換在隨機篩選中鑑定為除草劑抗性位點的胺基酸被其他胺基酸替代並在細菌系統中測定其功能和除草劑抗性。擬南芥Protox-1序列的寡聚核苷酸指導的突變通過Trahsformer Site-Directed Mu-tagonesis試劑盒(Clotech.Palo Alto，CA)實施。在胺基酸的改變通過序列分析證實後，突變的質粒轉化到SAS×38並平板接種到L-amp100培養基上以測試其功能，在各種濃度原卟啉原氧化酶抑制型除草劑上測試其耐受性。
該方法用於擬南芥原卟啉原氧化酶序列(SEQ ID NO.1)在688-690核苷酸的丙氨酸密碼子和1306～1308核苷酸的酪氨酸密碼子。結果表明在688-690核苷酸的丙氨酸密碼子能改變為纈氨酸，蘇氨酸，亮氨酸或胱氨酸密碼子都可產生有功能並對除草劑抗性的原卟啉原氧化酶。結果進一步表明在1306～1308核苷酸的酪氨酸密碼子可改變為胱氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，纈氨酸或蘇氨酸密碼子而產生有功能並對除草劑有抗性的原卟啉原氧化酶。實施例26抗性突變對各種原卟啉原氧化酶抑制化合物的交叉耐受性選出對單一除草劑抗性的抗性突變質粒進行對其他原卟啉原氧化酶抑制化合物抗性譜的測試，包含野生型質粒的SAS×38株接種到有一個濃度範圍的各種化合物上以測定各化合物的致死濃度。接種SAS×38的抗性突變質粒，並在含有至少10倍包含野生型質粒SAS×38株致死濃度的各種化合物上存活。
交叉耐受測試結果表明鑑定的突變體對各種原卟啉原氧化酶抑制型化合物有抗性。具體的說，結果表明1)AraC1-Val突變提供的原卟啉原氧化酶抗性包括但不限於此具有結構式IV，XI，XIII，XIV和XVII的化合物。2)AraC-2Cys突變提供對原卟啉原氧化酶抑制劑抗性包括，但不僅限於對具結構式XI，XIII，XV和XVII的化合物有抗性。3)MzC-1Val突變體提供對原卟啉原氧化酶抑制劑抗性包括，但不僅限於對具結構式XI，XII，XIII，XIV，XV，XVI和XVII的化合物有抗性。4)AraC-3Ser突變提供對原卟啉原氧化酶抑制劑抗性包括但不僅限於對具結構式IV，XII，XIII，XIV，XV和XVII的化合物有抗性。實施例27通過過度表達植物原卟啉原氧化酶基因產生除草劑耐受性植物來自野生型和抗性突變AraC-1Val基因的擬南芥Protox-1編碼序列用EcoR1和Xhol部分消化而切出並克隆到植物表達質粒p CGN1761ENX上，這個包含兩份35S-原卟啉原氧化酶基因融合區域的表達框用Xbal酶切出後克隆到雙向載體p CIB200中。這個雙向原卟啉原氧化酶質粒用電穿孔轉化到土壤桿菌，再用真空過濾法(Bechtold等人，1993)轉化入擬南芥。轉化物在卡那黴素上選擇，T2種子從一些獨立株系上產生。這些種子接種到含有各種濃度原卟啉原氧化酶抑制型除草劑的GM培養基上並測定發芽和存活。過表達野生型或抗性突變原卟啉原氧化酶多轉基因系在對空載體對照是致死的除草劑濃度下產生大量綠色幼苗。
本文描述的本發明的多種修改對本領域的技術人員而言是顯而易見的。這些修改應在所附權利要求的範圍內。
序列描述(1)一般信息(i)申請人(A)姓名CIBA-GEIGY AG(B)街道Klybeckstr.141(C)城市Basel(E)國家瑞士(F)郵政編碼(ZIP)4002(G)電話+41 61 69 11 11(H)傳真+41 61 696 79 76(I)電報962，991(ii)發明的題目真核生物中原卟啉原氧化酶活力的操作。(iii)序列的數目20(iv)計算計可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體Patent In Release #1.0，Version #1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度1719鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iv)反義無(ix)特徵(A)名稱/鍵CDS(B)位置31..1644
(D)其他信息/注＝「擬南芥的原卟啉原氧化酶-1 cDNA；序列來自pWDC-2」(xi)序列描述SEQ ID NO1TGACAAAATT CCGAATTCTC TGCGATTTCC ATG GAG TTA TCT CTT CTC CGT CCG54Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro1 5ACG ACT CAA TCG CTT CTT CCG TCG TTT TCG AAG CCC AAT CTC CGA TTA102Thr Thr Gln Ser Leu Leu Pro Ser Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu10 15 20AAT GTT TAT AAG CCT CTT AGA CTC CGT TGT TCA GTG GCC GGT GGA CCA150Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro25 30 35 40ACC GTC GGA TCT TCA AAA ATC GAA GGC GGA GGA GGC ACC ACC ATC ACG198Thr Val Gly Ser Ser Lys Ile Glu Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ile Thr45 50 55ACG GAT TGT GTG ATT GTC GGC GGA GGT ATT AGT GGT CTT TGC ATC GCT246Thr Asp Cys Val Ile Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala60 65 70CAG GCG CTT GCT ACT AAG CAT CCT GAT GCT GCT CCG AAT TTA ATT GTG294Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Pro Asp Ala Ala Pro Asn Leu Ile Val75 80 85ACC GAG GCT AAG GAT CGT GTT GGA GGC AAC ATT ATC ACT CGT GAA GAG342Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu90 95 100AAT GGT TTT CTC 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CCA TCT CAT GTT GCA AGT GGT1062Gln Ser Lys Ser Val Val Met Thr Val Pro Ser His Val Ala Ser Gly330 335 340CTC TTG CGC CCT CTT TCT GAA TCT GCT GCA AAT GCA CTC TCA AAA CTA1110Leu Leu Arg Pro Leu Ser Glu Ser Ala Ala Asn Ala Leu Ser Lys Leu345 350 355 360TAT TAC CCA CCA GTT GCA GCA GTA TCT ATC TCG TAC CCG AAA GAA GCA1158Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala365 370 375ATC CGA ACA GAA TGT TTG ATA GAT GGT GAA CTA AAG GGT TTT GGG CAA1206Ile Arg Thr Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln380 385 390TTG CAT CCA CGC ACG CAA GGA GTT GAA ACA TTA GGA ACT ATC TAC AGC1254Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser395 400 405TCC TCA CTC TTT CCA AAT CGC GCA CCG CCC GGA AGA ATT TTG CTG TTG 1302Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Ile Leu Leu Leu410 415 420AAC TAC ATT GGC GGG TCT ACA AAC ACC GGA ATT CTG TCC AAG TCT GAA 1350Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Ser Glu425 430 435 440GGT GAG TTA GTG GAA GCA GTT GAC AGA GAT 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cDNA；序列來自pWDC-3」(xi)序列描述SEQ ID NO7CTCTCCTACC TCCACCTCCA CGACAACAAG CAAATCCCCA TCCAGTTCCA AACCCTAACT 60CAA ATG CTC GCT TTG ACT GCC TCA GCC TCA TCC GCT TCG TCC CAT CCT108Met Leu Ala Leu Thr Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Ser His Pro1 5 10 15TAT CGC CAC GCC TCC GCG CAC ACT CGT CGC CCC CGC CTA CGT GCG GTC156Tyr Arg His Ala Ser Ala His Thr Arg Arg Pro Arg Leu Arg Ala Val20 25 30CTC GCG ATG GCG GGC TCC GAC GAC CCC CGT GCA GCG CCC GCC AGA TCG204Leu Ala Met Ala Gly Ser Asp Asp Pro Arg Ala Ala Pro Ala Arg Ser35 40 45GTC GCC GTC GTC GGC GCC GGG GTC AGC GGG CTC GCG GCG GCG TAC AGG252Val Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Arg50 55 60CTC AGA CAG AGC GGC GTG AAC GTA ACG GTG TTC GAA GCG GCC GAC AGG300Leu Arg Gln Ser Gly Val Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Ala Asp Arg65 70 75GCG GGA GGA AAG ATA CGG ACC AAT TCC GAG GGC GGG TTT GTC TGG GAT348Ala Gly Gly Lys Ile Arg Thr Asn Ser Glu Gly Gly Phe Val Trp Asp80 85 90 95GAA GGA GCT AAC ACC ATG ACA GAA GGT GAA TGG GAG GCC AGT AGA CTG396Glu Gly 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Ser Ala Gly Asp Pro Glu Ser Leu Ser Ile210 215 220CGT CAT GCA TTC CCA GCA TTG TGG AAT TTG GAA AGA AAG TAT GGT TCA780Arg His Ala Phe Pro Ala Leu Trp Asn Leu Glu Arg Lys Tyr Gly Ser225 230 235GTT ATT GTT GGT GCC ATC TTG TCT AAG CTA GCA GCT AAA GGT GAT CCA828Val Ile Val Gly Ala Ile Leu Ser Lys Leu Ala Ala Lys Gly Asp Pro240 245 250 255GTA AAG ACA AGA CAT GAT TCA TCA GGG AAA AGA AGG AAT AGA CGA GTG876Val Lys Thr Arg His Asp Ser Ser Gly Lys Arg Arg Asn Arg Arg Val260 265 270TCG TTT TCA TTT CAT GGT GGA ATG CAG TCA CTA ATA AAT GCA CTT CAC924Ser Phe Ser Phe His Gly Gly Met Gln Ser Leu Ile Asn Ala Leu His275 280 285AAT GAA GTT GGA GAT GAT AAT GTG AAG CTT GGT ACA GAA GTG TTG TCA972Asn Glu Val Gly Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly Thr Glu Val Leu Ser290 295 300TTG GCA TGT ACA TTT GAT GGA GTT CCT GCA CTA GGC AGG TGG TCA ATT 1020Leu Ala Cys Thr Phe Asp Gly Val Pro Ala Leu Gly Arg Trp Ser Ile305 310 315TCT GTT GAT TCG AAG GAT AGC GGT GAC AAG GAC CTT GCT AGT AAC CAA 1068Ser Val Asp Ser Lys Asp Ser Gly Asp Lys Asp Leu Ala Ser Asn Gln320 325 330 335ACC TTT GAT GCT GTT ATA ATG ACA GCT CCA TTG TCA AAT GTC CGG AGG 1116Thr Phe Asp Ala Val Ile Met Thr Ala Pro Leu Ser Asn Val Arg Arg340 345 350ATG AAG TTC ACC AAA GGT GGA GCT CCG GTT GTT CTT GAC TTT CTT CCT 1164Met Lys Phe Thr Lys Gly Gly Ala Pro Val Val Leu Asp Phe Leu Pro355 360 365AAG ATG GAT TAT CTA CCA CTA TCT CTC ATG GTG ACT GCT TTT AAG AAG 1212Lys Met Asp Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Ala Phe Lys Lys370 375 380GAT GAT GTC AAG AAA CCT CTG GAA GGA TTT GGG GTC TTA ATA CCT TAC 1260Asp Asp Val Lys Lys Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu Ile Pro Tyr385 390 395AAG GAA CAG CAA AAA CAT GGT CTG AAA ACC CTT GGG ACT CTC TTT TCC 1308Lys Glu Gln Gln Lys His Gly Leu Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser400 405 410 415TCA ATG ATG TTC CCA GAT CGA GCT CCT GAT GAC CAA TAT TTA TAT ACA 1356Ser Met Met Phe Pro Asp Arg Ala Pro Asp Asp Gln Tyr Leu Tyr Thr420 425 430ACA TTT GTT GGG GGT AGC CAC AAT AGA GAT CTT GCT GGA GCT CCA ACG 1404Thr Phe Val Gly Gly Ser His Asn Arg Asp Leu Ala Gly Ala Pro Thr435 440 445TCT ATT CTG AAA CAA CTT GTG ACC TCT GAC CTT AAA AAA CTC TTG GGC 1452Ser Ile Leu Lys Gln Leu Val Thr Ser Asp Leu Lys Lys Leu Leu Gly450 455 460GTA GAG GGG CAA CCA ACT TTT GTC AAG CAT GTA TAC TGG GGA AAT GCT 1500Val Glu Gly Gln Pro Thr Phe Val Lys His Val Tyr Trp Gly Asn Ala465 470 475TTT CCT TTG TAT GGC CAT GAT TAT AGT TCT GTA TTG GAA GCT ATA GAA 1548Phe Pro Leu Tyr Gly His Asp Tyr Ser Ser Val Leu Glu Ala Ile Glu480 485 490 495AAG ATG GAG AAA AAC CTT CCA GGG TTC TTC TAC GCA GGA AAT AGC AAG 1596Lys Met Glu Lys Asn Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn Ser Lys500 505 510GAT GGG CTT GCT GTT GGA AGT GTT ATA GCT TCA GGA AGC AAG GCT GCT 1644Asp Gly Leu Ala Val Gly Ser Val Ile Ala Ser Gly Ser Lys Ala Ala515 520 525GAC CTT GCA ATC TCA TAT CTT GAA TCT CAC ACC AAG CAT AAT AAT TCA 1692Asp Leu Ala Ile Ser Tyr Leu Glu Ser His Thr Lys His Asn Asn Ser530 535 540CAT TGAAAGTGTC TGACCTATCC TCTAGCAGTT GTCGACAAAT TTCTCCAGTT 1745His545CATGTACAGT AGAAACCGAT GCGTTGCAGT TTCAGAACAT CTTCACTTCT TCAGATATTA1805ACCCTTCGTT GAACATCCAC CAGAAAGGTA GTCACATGTG TAAGTGGGAA AATGAGGTTA1865AAAACTATTA TGGCGGCCGA AATGTTCCTT TTTGTTTTCC TCACAAGTGG CCTACGACAC1925TTGATGTTGG AAATACATTT AAATTTGTTG AATTGTTTGA GAACACATGC GTGACGTGTA1985ATATTTGCCT ATTGTGATTT TAGCAGTAGT CTTGGCCAGA TTATGCTTTA CGCCTTTAAA2045AAAAAAAAAA AAAAAA(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特徵(A)長度544個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Leu Ala Leu Thr Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Ser His Pro Tyr1 5 10 15Arg His Ala Ser Ala His Thr Arg Arg Pro Arg Leu Arg Ala Val Leu20 25 30Ala Met Ala Gly Ser Asp Asp Pro Arg Ala Ala Pro Ala Arg Ser Val35 40 45Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Arg Leu50 55 60Arg Gln Ser Gly Val Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Ala Asp Arg Ala65 70 75 80Gly Gly Lys Ile Arg Thr Asn Ser Glu Gly Gly Phe Val Trp Asp Glu85 90 95Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Gly Glu Trp Glu Ala Ser Arg Leu Ile100 105 110Asp Asp Leu Gly Leu Gln Asp Lys Gln Gln Tyr Pro Asn Ser Gln His115 120 125Lys Arg Tyr Ile Val Lys Asp Gly Ala Pro Ala Leu Ile Pro Ser Asp130 135 140Pro Ile Ser Leu Met Lys Ser Ser Val Leu Ser Thr Lys Ser Lys Ile145 150 155 160Ala Leu Phe Phe Glu Pro Phe Leu Tyr Lys Lys Ala Asn Thr Arg Asn165 170 175Ser Gly Lys Val Ser Glu Glu His Leu Ser Glu Ser Val Gly Ser Phe180 185 190Cys Glu Arg His Phe Gly Arg Glu Val Val Asp Tyr Phe Val Asp Pro195 200 205Phe Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Asp Pro Glu Ser Leu Ser Ile Arg210 215 220His Ala Phe Pro Ala Leu Trp Asn Leu Glu Arg Lys Tyr Gly Ser Val225 230 235 240Val Asp Ser Lys Asp Ser Gly Asp Lys Asp Leu Ala Ser Asn Gln Thr325 330 335Phe Asp Ala Val Ile Met Thr Ala Pro Leu Ser Asn Val Arg Arg Met340 345 350Lys Phe Thr Lys Gly Gly Ala Pro Val Val Leu Asp Phe Leu Pro Lys355 360 365Met Asp Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Ala Phe Lys Lys Asp370 375 380Asp Val Lys Lys Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu Ile Pro Tyr Lys385 390 395 400Glu Gln Gln Lys His Gly Leu Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser Ser405 410 415Met Met Phe Pro Asp Arg Ala Pro Asp 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NO9的信息(i)序列特徵(A)長度1697個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(iv)反義無(ix)特點(A)名稱/鍵CDS(B)位置29..1501(D)其他信息/注＝「酵母原卟啉原氧化酶-3 cDNA；序列來自pWDC-5」(xi)序列描述SEQ ID NO9TTGGCATTTG CCTTGAACCA ACAATTCT ATG TCA ATT GCA ATT TGT GGA GGA 52Met Ser Ile Ala Ile Cys Gly Gly1 5GGT ATA GCT GGT CTT AGT ACA GCA TTT TAT CTT GCT AGA TTG ATT CCA100Gly Ile Ala Gly Leu Ser Thr Ala Phe Tyr Leu Ala Arg Leu Ile Pro10 15 20AAA TGT ACT ATT GAT TTG TAC GAA AAA GGT CCT CGT TTA GGT GGA TGG148Lys Cys Thr Ile Asp Leu Tyr Glu Lys Gly Pro Arg Leu Gly Gly Trp25 30 35 40CTT CAG TCG GTC AAA ATC CCG TGT GCA GAT TCT CCA ACA GGA ACG GTT196Leu Gln Ser Val Lys Ile Pro Cys Ala Asp Ser Pro Thr Gly Thr Val45 50 55TTG TTT GAG CAA GGT CCT AGA ACT CTT CGT CCT GCT GGG GTT GCT GGC244Leu Phe Glu Gln Gly Pro Arg Thr Leu Arg Pro Ala Gly Val Ala Gly60 65 70TTA GCA AAC TTA GAT TTA ATT AGC AAG TTG GGC ATC GAA GAC AAG TTG292Leu Ala Asn Leu Asp Leu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Glu Asp Lys Leu75 80 85TTA AGG ATT TCG AGC AAT TCT CCC AGC GCA AAA AAC CGA TAT ATT TAT340Leu Arg Ile Ser Ser Asn Ser Pro Ser Ala Lys Asn Arg Tyr Ile Tyr90 95 100TAC CCA GAT CGC TTA AAT GAA ATT CCT TCA AGC ATT TTA GGG AGT ATA388Tyr Pro Asp Arg Leu Asn Glu Ile Pro Ser Ser Ile Leu Gly Ser Ile105 110 115 120AAG TCG ATT ATG CAG CCT GCT TTG CGT CCG ATG CCT TTG GCT ATG ATG436Lys Ser Ile Met Gln Pro Ala Leu Arg Pro Met Pro Leu Ala Met Met125 130 135CTT GAG CCC TTT CGT AAA AGT AAG CGA GAT TCG ACA GAT GAA AGC GTG 484Leu Glu Pro Phe Arg Lys Ser Lys Arg Asp Ser Thr Asp Glu Ser Val140 145 150GGT TCA TTT ATG AGA AGA AGA TTT GGT AAAA AC GTT ACG GAT AGA GTT 532Gly Ser Phe Met Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asn Val Thr Asp Arg Val155 160 165ATG AGT GCA ATG ATA AAT GGT ATT TAT GCT GGT GAT TTG AAT GAT TTG 580Met Ser Ala Met Ile Asn Gly Ile Tyr Ala Gly Asp Leu Asn Asp Leu170 175 180TCT ATG CAT TCT AGC ATG TTT GGA TTT TTA GCG AAG ATT GAA AAA AAG 628Ser Met His Ser Ser Met Phe Gly Phe Leu Ala Lys Ile Glu Lys Lys185 190 195 200TAT GGA AAC ATT ACT TTG GGA TTA ATT AGA GCT CTT CTT GCA CGT 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1012Leu Ile Ser Cys Pro Lys Met Glu Thr Pro Thr Ser Ser Val Tyr Val315 320 325GTC AAC GTT TAT TAT AAG GAC CCT AAT GTT CTT CCA ATC CGT GGT TTT 1060Val Asn Val Tyr Tyr Lys Asp Pro Asn Val Leu Pro Ile Arg Gly Phe
330 335 340GGG CTT TTG ATT CCA TCA TGC ACT CCA AAT AAT CCG AAT CAT GTT CTT 1108Gly Leu Leu Ile Pro Ser Cys Thr Pro Asn Asn Pro Asn His Val Leu345 350 355 360GGT ATC GTT TTT GAT AGT GAG CAA AAC AAC CCT GAA AAT GGA AGC AAG 1156Gly Ile Val Phe Asp Ser Glu Gln Asn Asn Pro Glu Asn Gly Ser Lys365 370 375GTC ACT GTC ATG ATG GGA GGG TCT GCT TAT ACA AAA AAT ACT TCT TTG 1204Val Thr Val Met Met Gly Gly Ser Ala Tyr Thr Lys Asn Thr Ser Leu380 385 390ATT CCA ACC AAC CCC GAA GAA GCC GTT AAC AAT GCT CTC AAA GCT TTG 1252Ile Pro Thr Asn Pro Glu Glu Ala Val Asn Asn Ala Leu Lys Ala Leu395 400 405CAG CAT ACT TTA AAA ATA TCC AGT AAG CCA ACA CTC ACG AAT GCA ACA 1300Gln His Thr Leu Lys Ile Ser Ser Lys Pro Thr Leu Thr Asn Ala Thr410 415 420TTA CAA CCA AAT TGC ATC CCT CAA TAT CGT GTT GGG CAT CAA GAT AAT 1348Leu Gln Pro Asn Cys Ile Pro Gln Tyr Arg Val Gly His Gln Asp Asn425 430 435 440CTT AAT TCT TTG AAA TCT TGG ATT GAG AAA AAT ATG GGA GGG CGA ATT 1396Leu Asn Ser Leu Lys Ser Trp Ile Glu Lys Asn Met Gly Gly Arg Ile445 450 455CTT CTA ACT GGA AGT TGG TAT AAT GGT GTT AGT ATT GGG GAT TGT ATT 1444Leu Leu Thr Gly Ser Trp Tyr Asn Gly Val Ser Ile Gly Asp Cys Ile460 465 470ATG AAT GGA CAT TCA ACA GCT CGA AAA CTA GCA TCA TTG ATG AAT TCT 1492Met Asn Gly His Ser Thr Ala Arg Lys Leu Ala Ser Leu Met Asn Ser475 480 485TCT TCT TGAGCGTTTA TAAATGTTGA TATAAAATTA GTATATAGTT CCTTTGATTA1548Ser Ser490TTTTATGAGT TGAAAATGCC ACTTGTGAAA TAATTTTGCA CAAGCCCTTT TATTACAGAC 1608GTATATGCGA GGACATTCGA CAAACGTTTG AAATTAAAAA TCATATGCCT TTTAGCTTAA 1668GACATCAAGG TCATGAATAA TAAAATTTT 1697(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特徵(A)長度490胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Ser Ile Ala Ile Cys Gly Gly Gly Ile Ala Gly Leu Ser Thr Ala1 5 10 15Phe Tyr Leu Ala Arg Leu Ile Pro Lys Cys Thr Ile Asp Leu Tyr Glu20 25 30Lys Gly Pro Arg Leu Gly Gly Trp Leu Gln Ser Val Lys Ile Pro Cys35 40 45Ala Asp Ser Pro Thr Gly Thr Val Leu Phe Glu Gln Gly Pro Arg Thr50 55 60Leu Arg Pro Ala Gly Val Ala Gly Leu Ala Asn Leu Asp Leu Ile Ser65 70 75 80Lys Leu Gly Ile Glu Asp Lys Leu Leu Arg Ile Ser Ser Asn Ser Pro85 90 95Ser Ala Lys Asn Arg Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Arg Leu Asn Glu Ile100 105 110Pro Ser Ser Ile Leu Gly Ser Ile Lys Ser Ile Met Gln Pro Ala Leu115 120 125Arg Pro Met Pro Leu Ala Met Met Leu Glu Pro Phe Arg Lys Ser Lys130 135 140Arg Asp Ser Thr Asp Glu Ser Val Gly Ser Phe Met Arg Arg Arg Phe145 150 155 160Gly Lys Asn Val Thr Asp Arg Val Met Ser Ala Met Ile Asn Gly Ile165 170 175Tyr Ala Gly Asp Leu Asn Asp Leu Ser Met His Ser Ser Met Phe Gly180 185 190Phe Leu Ala Lys Ile Glu Lys Lys Tyr Gly Asn Ile Thr Leu Gly Leu195 200 205Ile Arg Ala Leu Leu Ala Arg Glu Ile Leu Ser Pro Ala Glu Lys Ala210 215 220Leu Glu Ser Ser Thr Thr Arg Arg Ala Lys Asn Ser Arg Ala Val Lys225 230 235 240Gln Tyr Glu Ile Asp Lys Tyr Val Ala Phe Lys Glu Gly Ile Glu Thr245 250 255Ile Thr Leu Ser Ile Ala Asp Glu Leu Lys Lys Met Pro Asn Val Lys260 265 270Ile His Leu Asn Lys Pro Ala Gln Thr Leu Val Pro His Lys Thr Gln275 280 285Ser Leu Val Asp Val Asn Gly Gln Ala Tyr Glu Tyr Val Val Phe Ala290 295 300Asn Ser Ser Arg Asn Leu Glu Asn Leu Ile Ser Cys Pro Lys Met Glu305 310 315 320Thr Pro Thr Ser Ser Val Tyr Val Val Asn Val Tyr Tyr Lys Asp Pro325 330 335Asn Val Leu Pro Ile Arg Gly Phe Gly Leu Leu Ile Pro Ser Cys Thr340 345 350Pro Asn Asn Pro Asn His Val Leu Gly Ile Val Phe Asp Ser Glu Gln355 360 365Asn Asn Pro Glu Asn Gly Ser Lys Val Thr Val Met Met Gly Gly Ser370 375 380Ala Tyr Thr Lys Asn Thr Ser Leu Ile Pro Thr Asn Pro Glu Glu Ala385 390 395 400Val Asn Asn Ala Leu Lys Ala Leu Gln His Thr Leu Lys Ile Ser Ser405 410 415Lys Pro Thr Leu Thr Asn Ala Thr Leu Gln Pro Asn Cys Ile Pro Gln420 425 430Tyr Arg Val Gly His Gln Asp Asn Leu Asn Ser Leu Lys Ser Trp Ile435 440 445Glu Lys Asn Met Gly Gly Arg Ile Leu Leu Thr Gly Ser Trp Tyr Asn450 455 460Gly Val Ser Ile Gly Asp Cys Ile Met Asn Gly His Ser Thr Ala Arg465 470 475 480Lys Leu Ala Ser Leu Met Asn Ser Ser Ser485 490(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特徵(A)長度41鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用於構建pCGN1761ENX的寡聚核苷酸(iii)假設無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO11AATTATGACG TAACGTAGGA ATTAGCGGCC CGCTCTCGAG T 41(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特徵(A)長度40個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用於構建pCGN1761ENX的寡聚核苷酸(iii)假設無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO12AATTACTCGA GAGCGGCCGC GAATTCCTAC GTTACGTCAT40(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明用於構建pSOG10的引物SON003(iii)假設無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO13CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG31(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用於構建pSOG10的引物SON0004(iii)假設無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO14ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG31(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特徵(A)長度26鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用於構建pSOG19的引物SON0031(iii)假設無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO15CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC 26(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用於構建pSOG19的引物SON0010(iii)假設無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO16AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 24(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用於構建pSOG19的引物SON0016(iii)假設無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO17GCTACCATGGCCACATAGAACACC 24(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用於構建pSOG19的引物SON0017(iii)假設無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO18CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG23(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特徵(A)長度28個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用於構建pSOG30的引物SON0039(iii)假設無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO19CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA 28(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用於構建pSOG30的引物SON0041(iii)假設無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO20ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC 2權利要求
1.一種控制不需要的植被生長的方法，該方法包括給包括其子代的植物種群施用有效量的原卟啉原氧化酶抑制型除草劑，所說的植物包含一種編碼修飾的原卟啉原氧化酶，包括具有至少一個胺基酸修飾的真核原卟啉原氧化酶的DNA分子，其中所說的修飾的原卟啉原氧化酶能耐受抑制所說的真核原卟啉原氧化酶量的除草劑，其中所說的真核原卟啉原氧化酶包括(a)SEQ ID No.2中所示的胺基酸序列並且其中所說的至少一個胺基酸修飾是選自SEQ ID No.2的220位丙氨酸，221位甘氨酸和426位酪氨酸的胺基酸取代；或(b)SEQ ID No.6中所示的胺基酸序列並且其中所說的至少一個胺基酸修飾是選自SEQ ID No.6的166位丙氨酸，167位甘氨酸和372位酪氨酸的胺基酸取代；其中所說的DNA分子在所說的植物中被表達並使所說的植物能耐受抑制所說的真核原卟啉原氧化酶量的除草劑。
2.權利要求1的方法，其中所說的220位丙氨酸被選自纈氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，胱氨酸和酪氨酸的胺基酸替代。
3.權利要求1的方法，其中所說的221位甘氨酸被絲氨酸替代。
4.權利要求1的方法，其中所說的426位酪氨酸被選自胱氨酸，異亮氨酸，亮氨酸和蘇氨酸的胺基酸取代。
5.權利要求1的方法，其中所說的166位丙氨酸被選自纈氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，胱氨酸和酪氨酸的胺基酸取代。
6.權利要求1的方法，其中所說的167位甘氨酸被絲氨酸替代。
7.權利要求1的方法，其中所說的372位酪氨酸可被選自胱氨酸，異亮氨酸，亮氨酸和蘇氨酸的胺基酸取代。
8.權利要求1的方法，其中所說的DNA分子，它是植物基因組的一部分。
9.權利要求1的方法，其中所說的DNA分子與在植物中有活性的啟動子可操作地連接。
10.權利要求9的方法，其中所說的DNA分子與信號序列可操作地連接，其中所說的信號序列能夠將所說的DNA分子所編碼的蛋白質導入葉綠體。
11.權利要求9的方法，其中所說的DNA分子與信號序列可操作地連接，其中所說的信號序列能夠將所說的DNA分子所編碼的蛋白質導入線粒體。
12.權利要求1的方法，其中所說的植物選自大豆，棉花，菸草，甜菜，油菜，玉米，小麥，高粱，黑麥，燕麥，苔草(turf grass)和水稻。
13.權利要求1的方法，其中所說的原卟啉原氧化酶抑制型除草劑選自芳基尿嘧啶，二苯基醚，噁二唑(oxidiazole)，亞胺，苯基吡唑，吡啶衍生物，3-取代-2-芳基-4，5，6，7-四氫吲哚，吡落草(phenopylate)和鄰-苯基吡咯烷-與哌啶子基氨基甲酸酯的吡落草類似物。
14.權利要求1的方法，其中所說的原卟啉原氧化酶抑制型除草劑是具以下結構式的二醯亞胺類 (結構式V)其中Q等於 (結構式VI) (結構式VII)(結構式VIII) (結構式IX) (結構式IXa) (結構式IXb)其中R1代表H，Cl或F，R2代表Cl，R3為可被選擇性取代的醚，硫醚，酯，氨基或烷基，並且其中R2和R3可一起形成5或6元雜環。
15.權利要求14的方法，其中所說的二醯亞胺類選自 (結構式X) (結構式XI) (結構式XII) (結構式XIII) (結構式XIV) (結構式XV) (結構式XVI)；和 (結構式XVII)其中R表示(C2-6-鏈烯氧基)羰基-C1-4-烷基。
16.權利要求1的方法，其中所說的原卟啉原氧化酶抑制型除草劑具有從以下選出的結構式 (結構式XVIII) (結構式XIX) (結構式XX)，和 (結構式XXI)
17.一種鑑定對存在於細胞群體中的原卟啉原氧化酶抑制劑有抗性的修飾的原卟啉原氧化酶的方法，所說的細胞包含一種編碼來自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的DNA分子，所說的方法包括步驟(a)將所說的群體在能抑制該酶未修飾形式的量的所說的原卟啉原氧化酶抑制劑存在的條件下培養；(b)從步驟(a)中選出生長未受抑制的細胞；和(c)分離和鑑定存在於選自步驟(b)的細胞中的原卟啉原氧化酶，其中所說的真核生物是擬南芥種，所說的蛋白質包括選自SEQID Nos.2和4的胺基酸序列，或所說的真核生物是玉米，所說的蛋白質包括選自SEQ ID Nos.6和8的胺基酸序列，包括與所說的DNA分子同源並選擇性雜交的DNA分子。
18.權利要求17的方法，其中所說的蛋白質包括選自SEQ ID Nos.2和4的胺基酸序列，包括與其同源的胺基酸序列。
19.權利要求18的方法，其中所說的DNA分子包括選自SEQ IDNos.1和3的核苷酸序列。
20.權利要求17的DNA分子，其中所說的蛋白質包括選自SEQID Nos.6和8的胺基酸序列，包括與其同源的胺基酸序列。
21.權利要求20的DNA分子，其中所說的DNA分子包括選自SEQ ID Nos.5和7的核苷酸序列。
22.一種從非轉化的植物中選擇用感興趣的轉移基因轉化的植物，植物組織或植物細胞的方法，該方法包括步驟(a)用能被植物表達的感興趣的轉移基因和一種編碼修飾的原卟啉原氧化酶，包括具有至少一個胺基酸修飾的真核原卟啉原氧化酶的DNA分子轉化植物，植物組織或植物細胞，其中所說的修飾的原卟啉原氧化酶能耐受抑制所說的真核原卟啉原氧化酶量的除草劑，其中所說的真核原卟啉原氧化酶包括(i)SEQ ID No.2中所示的胺基酸序列並且其中所說的至少一個胺基酸修飾是選自SEQ ID No.2的220位丙氨酸，221位甘氨酸和426位酪氨酸的胺基酸取代；或(ii)SEQ ID No.6中所示的胺基酸序列並且其中所說的至少一個胺基酸修飾是選自SEQ ID No.6的166位丙氨酸，167位甘氨酸和372位酪氨酸的胺基酸取代；(b)將如此轉化的植物或植物細胞轉移到含有原卟啉原氧化酶抑制劑的培養基中；和(c)選擇在此培養基中存活的植物或植物細胞。
23.一種產生包含編碼來自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的DNA分子的宿主細胞的方法，包括用下述DNA分子轉化所述宿主的細胞(a)一種編碼來自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的DNA分子，其中所說的真核生物是擬南芥種，所說的蛋白質包括選自SEQ ID Nos.2和4的胺基酸序列，或所說的真核生物是玉米，所說的蛋白質包括選自SEQ ID Nos.6和8的胺基酸序列，包括與所說的DNA分子同源並選擇性雜交的DNA分子；或(b)一種編碼修飾的原卟啉原氧化酶，包括具有至少一個胺基酸修飾的真核原卟啉原氧化酶的DNA分子，其中所說的修飾的原卟啉原氧化酶能耐受所說的真核原卟啉原氧化酶量的除草劑，其中所說的真核原卟啉原氧化酶包括(i)SEQ ID No.2中所示的胺基酸序列並且其中所說的至少一個胺基酸修飾是選自SEQ ID No.2的220位丙氨酸，221位甘氨酸和426位酪氨酸的胺基酸取代；或(ii)SEQ ID No.6中所示的胺基酸序列並且其中所說的至少一個胺基酸修飾是選自SEQ ID No.6的166位丙氨酸，167位甘氨酸和372位酪氨酸的胺基酸取代。
24.一種產生包含編碼來自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的DNA分子的植物細胞的方法，包括用下述DNA分子轉化所述的植物細胞(a)一種編碼來自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的DNA分子，其中所說的真核生物是擬南芥種，所說的蛋白質包括選自SEQ ID Nos.2和4的胺基酸序列，或所說的真核生物是玉米，所說的蛋白質包括選自SEQ ID Nos.6和8的胺基酸序列，包括與所說的DNA分子同源並選擇性雜交的DNA分子；或(b)一種編碼修飾的原卟啉原氧化酶，包括具有至少一個胺基酸修飾的真核原卟啉原氧化酶的DNA分子，其中所說的修飾的原卟啉原氧化酶能耐受所說的真核原卟啉原氧化酶量的除草劑，其中所說的真核原卟啉原氧化酶包括(i)SEQ ID No.2中所示的胺基酸序列並且其中所說的至少一個胺基酸修飾是選自SEQ ID No.2的220位丙氨酸，221位甘氨酸和426位酪氨酸的胺基酸取代；或(ii)SEQ ID No.6中所示的胺基酸序列並且其中所說的至少一個胺基酸修飾是選自SEQ ID No.6的166位丙氨酸，167位甘氨酸和372位酪氨酸的胺基酸取代。
25.一種產生包含編碼來自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的DNA分子的轉基因親本植物的轉基因後代的方法，包括用下述DNA分子轉化所說的親本植物(a)一種編碼來自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的DNA分子，其中所說的真核生物是擬南芥種，所說的蛋白質包括選自SEQ ID Nos.2和4的胺基酸序列，或所說的真核生物是玉米，所說的蛋白質包括選自SEQ ID Nos.6和8的胺基酸序列，包括與所說的DNA分子同源並選擇性雜交的DNA分子；或(b)一種編碼修飾的原卟啉原氧化酶，包括具有至少一個胺基酸修飾的真核原卟啉原氧化酶的DNA分子，其中所說的修飾的原卟啉原氧化酶能耐受所說的真核原卟啉原氧化酶量的除草劑，其中所說的真核原卟啉原氧化酶包括(i)SEQ ID No.2中所示的胺基酸序列並且其中所說的至少一個胺基酸修飾是選自SEQ ID No.2的220位丙氨酸，221位甘氨酸和426位酪氨酸的胺基酸取代；或(ii)SEQ ID No.6中所示的胺基酸序列並且其中所說的至少一個胺基酸修飾是選自SEQ ID No.6的166位丙氨酸，167位甘氨酸和372位酪氨酸的胺基酸取代；和用已知植物育種技術將除草劑耐受性特徵轉移到所說轉基因親本植物的後代中去。
26.一種產生編碼來自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的DNA分子的方法，包括(a)建立合適真核生物來源的基因組或cDNA文庫；(b)用一種能與編碼來自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白質的DNA分子或其mRNA特異性雜交的探針分子探測所說的文庫，其中所說的真核生物是擬南芥種，所說的蛋白質包括選自SEQID Nos.2和4的胺基酸序列，或所說的真核生物是玉米，所說的蛋白質包括選自SEQ ID Nos.6和8的胺基酸序列，其中所說的探針包括與所說的DNA分子鄰接的部分，並至少有10個核苷酸的長度。
27.一種編碼修飾的原卟啉原氧化酶，包括具有至少一個胺基酸修飾的真核原卟啉原氧化酶的DNA分子在將對抑制自然產生的原卟啉原氧化酶活性的量的除草劑的耐受性從親本植物傳遞給其子代上的應用，包括首先通過將所述的DNA分子穩定摻入所說親本植物基因組中而用所述DNA分子穩定地轉化親本植物，隨後採用已知植物育種技術將除草劑耐受性特徵轉移到所述轉基因親本植物的子代中去，其中所述的修飾的原卟啉原氧化酶能耐受抑制所說的真核原卟啉原氧化酶量的除草劑，其中所說的真核原卟啉原氧化酶包括(a)SEQ ID No.2中所示的胺基酸序列並且其中所說的至少一個胺基酸修飾是選自SEQ ID No.2的220位丙氨酸，221位甘氨酸和426位酪氨酸的胺基酸取代；或(b)SEQ ID No.6中所示的胺基酸序列並且其中所說的至少一個胺基酸修飾是選自SEQ ID No.6的166位丙氨酸，167位甘氨酸和372位酪氨酸的胺基酸取代；其中所說的DNA分子在所說的植物中被表達並使所說的植物能耐受抑制所說的真核原卟啉原氧化酶量的除草劑。
全文摘要
本發明提供編碼自然原卟啉原氧化酶(protox)及其除草劑耐受性的修飾形式的新的真核DNA序列。也提供了具有改變的原卟啉原氧化酶活力,並對除草劑有耐受性的植物。這些植物可以是培養或基因工程處理後而對原卟啉原氧化酶抑制劑有抗性,這通過將自然原卟啉原氧化酶基因突變成抗性形式或通過提高自然原卟啉原氧化酶基因表達水平,或用修飾的真核或原核原卟啉原氧化酶編碼序列或除草劑耐受性野生型原核原卟啉原氧化酶序列轉化實現。還描述了新的真核原卟啉原氧化酶序列在診斷及其他方面的用途。還公開了編碼野生型和改變了的原卟啉原氧化酶的植物基因,純化的植物原卟啉原氧化酶,從植物中分離原卟啉原氧化酶的方法,使用原卟啉原氧化酶編編基因的方法。
文檔編號A01N43/54GK1382377SQ0111183
公開日2002年12月4日 申請日期2001年3月21日 優先權日1994年6月16日
發明者E·R·瓦德, S·沃勒拉茨 申請人:諾瓦提斯公司