一種抑制白色念珠菌的藥物組合物及其製備方法和應用的製作方法

2023-10-10 15:39:49 3

一種抑制白色念珠菌的藥物組合物及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種抑制白色念珠菌的藥物組合物及其製備方法和應用。具體提供了一種白鮮皮水提物及其用途，還提供了一種藥物組合物及其製備方法和用途，所述的藥物組合物是由白鮮皮水提物、苦參水提物、苦參醇提物按照以下體積比組成：（2-3）:（2-3）:（2-3）。本發明證實了白鮮皮水提物對白色念珠菌具有抑制作用，由白鮮皮水提物、苦參水提物以及苦參醇提物組成的藥物組合物當三種成分在特定配比下時，可顯著抑制白色念珠菌生長，以上研究結果為製備純中藥來源、無毒副作用的抑制白色念珠菌藥物奠定了基礎。
【專利說明】-種抑制白色念珠菌的藥物組合物及其製備方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種藥物組合物，具體地說，涉及一種抑制白色念珠菌的水提物及其 應用，還涉及一種藥物組合物及其製備方法和應用。

【背景技術】
[0002] 白色念珠菌（Monilia a化ican或Canidia A化icans),是一種常見的條件致病菌， 通常存在於正常人口腔、上呼吸道、腸道及陰道，一般在正常機體中數量少，不引起疾病，當 機體免疫功能或一般防禦力下降或正常菌群相互制約作用失調，則本菌大量繁殖並改變生 長形式(芽生菌絲相）侵入細胞引起疾病。
[0003] 口腔念珠菌病是真菌一念珠菌屬感染所引起的口腔黏膜疾病。據報導，此種菌 屬於隱球菌科的念珠菌、高裡念珠菌、假熱帶念珠菌，其中白色念珠菌是最主要的病原菌。 中醫上，口腔念珠菌病稱為唇風，W唇紅部黏膜紅腫、糜爛、結麻、脫屑、瘦癢、疼痛為特徵， 嚴重影響患者日常生活和工作，甚至還有癌變的潛在危險。目前西醫對唇風的治療方法甚 少，治療W局部注射和內服皮質激素為主。雖有一定療效，但局部注射時極為疼痛，反覆注 射易引起藥物沉積和局部組織變硬，尤其是會造成育齡期婦女月經失調等不良反應，使患 者的依從性大大下降。開展口腔念珠菌病的中醫治療可顯著降低毒副作用。
[0004] 白鮮皮為芸香科植物白鮮（Dictamnus dasyca巧US "TurcZ)和狹葉白鮮 (Dictamnus angustifolius G. Don)的乾燥根皮，具有清熱燥溼、巧風解毒的功效，主治 皮膚瘦癢，風疹，溼疹，巧癖，黃痘，風溼瘍痛，筋骨瘦弱，小兒梅厥。苦參為豆科植物苦參 (So地ora flavescens Ait.)的根，具有清熱燥溼，利水退黃，巧風殺蟲的功效，主治溼熱發 狂，熱毒結胸，消渴，溼熱瀉痴，腸風便血，帶下陰癢，黃痘，小便赤澀，風疹瘦癢，巧癖，麻風， 溼毒瘡瘍。
[0005] 目前關於白鮮皮、苦參的提取物在抑制白色念珠菌方面的作用還未見報導。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種抑制白色念珠菌的白鮮皮水提 物。
[0007] 本發明的再一的目的是，提供所述的白鮮皮水提物的用途。
[0008] 本發明的另一的目的是，提供一種抑制白色念珠菌的藥物組合物。
[0009] 本發明的第四個目的是，提供所述的藥物組合物的用途。
[0010] 本發明的第五個目的是，提供所述的藥物組合物的製備方法。
[0011] 為實現上述第一個目的，本發明採取的技術方案是： 一種白鮮皮水提物，所述的白鮮皮水提物的製備方法包括W下步驟：取白鮮皮加蒸觸 水浸泡20-40min，回流提取1-3次，每次20-40min，合併濾液。
[0012] 優選地，所述的白鮮皮與蒸觸水的比例為；1: (1-10) g/mL。
[0013] 優選地，所述的浸泡時間為30min ;回流提取2次，每次30min。
[0014] 為實現上述第二個目的，本發明採取的技術方案是： 如上任一所述的白鮮皮水提物在製備抑制白色念珠菌的藥物中的應用。
[0015] 為實現上述第H個目的，本發明採取的技術方案是： 一種抑制白色念珠菌的藥物組合物，所述的藥物組合物是由白鮮皮水提物、苦參水提 物、苦參醇提物按照W下體積比組成：（2-3): (2-3): (2-3)，其中所述的鮮皮水提物、苦參 水提物、苦參醇提物的生藥濃度相同； 所述的白鮮皮水提物的製備方法包括W下步驟：取白鮮皮加蒸觸水浸泡20-40min，回 流提取1-3次，每次20-40min，合併濾液； 所述的苦參水提物的製備方法包括W下步驟；取苦參加蒸觸水浸泡20-40min，回流提 取1-3次，每次20-40min，合併濾液； 所述的苦參醇提物的製備方法包括W下步驟；取苦參加蒸觸水浸泡20-40min，煎 煮1-3次，每次0.5-1. 5小時，合併煎液，濃縮，冷卻至室溫，加己醇使己醇體積分數達 60% -80%，靜置18-30小時後濾過，濾液回收己醇。
[0016] 優選地，所述的白鮮皮水提物、苦參水提物、苦參醇提物體積比為：（2.4-2.6): (2. 4-2. 6) : (2. 4-2. 6)。
[0017] 更優選地，所述的白鮮皮水提物、苦參水提物、苦參醇提物體積比為；1:1:1。
[0018] 優選地，所述的白鮮皮水提物的製備方法中，所述的浸泡時間為30min，回流提取 2次，每次30min ;所述的苦參水提物的製備方法中，所述的浸泡時間為30min，回流提取2 次，每次30min ;所述的苦參醇提物的製備方法中，所述的浸泡時間為30min，煎煮2次，每次 1小時，靜置時間為24小時。
[0019] 為實現上述第四個目的，本發明採取的技術方案是： 如上任一所述的藥物組合物在製備抑制白色念珠菌的藥物中的應用。
[0020] 為實現上述第五個目的，本發明採取的技術方案是： 如上所述的藥物組合物的製備方法，它包括W下步驟： a) 提取白鮮皮水提物；取白鮮皮加蒸觸水浸泡20-40min，回流提取1-3次，每次 20-40min，合併濾液； b) 提取苦參水提物；取苦參加蒸觸水浸泡20-40min，回流提取1-3次，每次20-40min， 合併濾液； C)提取苦參醇提物；取苦參加蒸觸水浸泡20-40min，煎煮1-3次，每次0. 5-1. 5小時， 合併煎液，濃縮，冷卻至室溫，加己醇使己醇體積分數達60% -80%，靜置18-30小時後濾 過，濾液回收己醇； d)將所述的白鮮皮水提物、提取苦參水提物和苦參醇提物按W下體積比混合： (2. 4-2. 6) : (2. 4-2. 6) : (2. 4-2. 6)，其中所述的白鮮皮水提物、提取苦參水提物和苦參醇 提物的生藥濃度相同。
[0021] 本發明優點在於： 本發明採用煎煮法W及水提醇沉澱法製備了中草藥的水提物和醇提物，分別檢測了白 鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參水提物W及白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參、白立、白及醇提物對白色 念珠菌的體外抑制作用，結果顯示白鮮皮水提物、苦參水提物W及苦參醇提物對白色念珠 菌均有抑制作用。
[0022] 本發明還提供了一種由白鮮皮水提物、苦參水提物W及苦參醇提物組成的藥物組 合物，H種成分在特定配比下，可獲得顯著的抑制白色念珠菌生長的效果。
[0023] 本發明為製備純中藥來源、無毒副作用的抑制白色念珠菌的藥物奠定了基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 附圖1是96孔微量藥敏板。

【具體實施方式】
[0025] 下面結合附圖對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0026] 實施例1白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參水提物的製備(一） 分別取白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參各50g，加250ml蒸觸水浸泡30分鐘，回流提取二次， 每次30min，合併兩次濾液，濃縮至25ml，高壓滅菌，置4°C冰箱保存，生藥濃度為2g/ml。
[0027] 實施例2白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參水提物的製備(二） 分別取白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參各50g，加300ml蒸觸水浸泡20分鐘，回流提取H次， 每次20min，合併H次濾液，濃縮至25ml，高壓滅菌，置4°C冰箱保存，生藥濃度為2g/ml。
[0028] 實施例3白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參水提物的製備(H) 分別取白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參各50g，加200ml蒸觸水浸泡40分鐘，回流提取一次， 回流時間為40min，濾液濃縮至25ml，高壓滅菌，置4°C冰箱保存，生藥濃度為2g/ml。
[0029] 實施例4白鮮皮、苦參、僵蠶、白花藤、白立、白及醇提物的製備(一） 分別取白鮮皮、苦參、僵蠶、白花藤、白立、白及各50g，加250ml蒸觸水浸泡30分鐘，煎 煮2次，每次1小時，合併煎液，濃縮至含藥量約2g/ml，冷卻至室溫，加無水己醇，使含己醇 體積分數達70%，4C冰箱保存，靜置24小時後濾過，濾液回收己醇，加蒸觸水至25ml，高壓 滅菌，置4C冰箱保存，生藥濃度為2g/ml。
[0030] 實施例5白鮮皮、苦參、僵蠶、白花藤、白立、白及醇提物的製備(二） 分別取白鮮皮、苦參、僵蠶、白花藤、白立、白及各50g，加200ml蒸觸水浸泡40分鐘，煎 煮3次，每次0. 5小時，合併煎液，濃縮至含藥量約2g/ml，冷卻至室溫，加無水己醇，使含己 醇體積分數達60%，4°C冰箱保存，靜置30小時後濾過，濾液回收己醇，加蒸觸水至25ml，高 壓滅菌，置4C冰箱保存，生藥濃度為2g/ml。
[0031] 實施例6白鮮皮、苦參、僵蠶、白花藤、白立、白及醇提物的製備(H) 分別取白鮮皮、苦參、僵蠶、白花藤、白立、白及各50g，加300ml蒸觸水浸泡20分鐘，煎 煮1次，時間為1. 5小時，合併煎液，濃縮至含藥量約2g/ml，冷卻至室溫，加無水己醇，使含 己醇體積分數達80%，4C冰箱保存，靜置18小時後濾過，濾液回收己醇，加蒸觸水至25ml， 高壓滅菌，置4°C冰箱保存，生藥濃度為2g/ml。
[0032] 實施例7各提取物對白色念珠菌的體外抑制作用 1材料與方法 1.1材料 1.1.1藥物及試劑 白鮮皮、苦參、僵蠶、白花藤、白立、白及中草藥原料均由上海萬仕誠國藥製品有限公 司提供，產地及批號如下：白鮮皮（黑龍江080625)、僵蠶(浙江081101)、白花藤(湖北 080918)、苦參（山西081016)、白立(安徽080929)、白及（四川081119)。
[0033] 氣康哇購自中國藥品生物製品檢定所，批號100314-200503。
[0034] 1. 1. 2試驗菌株 國際標準菌株ATCC76615,由上海市口腔醫學研究所口腔微生物實驗室提供，經酵母菌 生化卡（Vitek, E23K)鑑定為白色念珠菌（Bionumber 555017411)。
[00；35] 1. 1. 3 培養基 ①沙保勞氏瓊脂(上海伊華醫學科技有限公司，20080303) 63g，加氯黴素50mg，蒸觸水 IOOOml,高壓滅菌。
[0036] ②RPMI1640液體培養基；RPMI1640粉劑（GIBC0 1381654)(含穀氨醜胺，不含碳 酸氨軸）10. 4g，H氮嗎啡晰丙賴酸 34. 53g (SIGMA 018K0724)，蒸觸水 900ml，W lmol/1 的 化OH調節抑至7. 0,加蒸觸水定容至1000ml，用Millipore濾過滅菌（濾膜0. 22 y m)，置 4 C冰箱備用。
[0037] 1. 1. 4主要儀器 超淨工作檯（蘇州YJ-875DA)、麥氏比濁管（biomerieux 806814701)、無菌96孔板 (Greiner 08230135)、Millipore (MILLEX R8BM7645)。
[0038] 1. 2 方法 參照 N(XLS M27-A2 (N(XLS, Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts ；Approved standard. NCCLS document M27-A2. N(XLS，Wayne[S].化nnsylvania. 2002,17(9) :1-29.)推薦的肉湯微量稀釋法酵母菌藥敏 性試驗進行。
[0039] 1.2. 1藥物及標準品的製備 參照實施例1和4的方法，分別製備各中草藥原料藥的水提物W及醇提物。
[0040] 氣康哇用無菌蒸觸水配製成1280 y g/ml的膽存液，用Millipore濾過滅菌(濾膜 0. 22 y m)，分裝後置-80°C冰箱膽存備用。
[0041] 1.2. 2微量藥敏板製備 配製好的藥液4C冰箱靜置24小時W上，取上清液進行抑菌實驗。將藥液及標準品膽 存液用RPMI1640液體培養基為稀釋液進行倍比稀釋，使前述四味中草藥水提物及六味中 草藥醇提物的起始質量濃度為500mg/ml，終末質量濃度為0. 976563mg/ml，使氣康哇的起 始質量濃度為128 y g/ml，終末質量濃度為0. 25 y g/ml，W上各藥物及標準品質量濃度均 為2倍應測試藥物質量濃度。將稀釋好的藥液對應加在無菌96孔板中，從第1孔至第10 孔濃度由高到低，每孔IOOy 1。第11、12孔加不含藥液的RPMI1640液體培養基，其中第11 孔為生長對照，第12孔為空白對照。加畢，藥敏板用鉛鉛紙密封后放置-8(TC保藏備用。
[0042] 1. 2. 3菌息液製備及接種 將白色念珠菌接種在沙堡氏瓊脂培養基上，置35C，傳代培養。挑取生長24小時的菌 落，用0. 85 %的無菌氯化軸水溶液製成菌息液，經麥氏比濁管調整其濁度達到0. 5麥氏標 準，相當於每毫升含1?5Xl〇6菌落形成單位（CFU/ml)，用RPMI1640液體培養基1:50稀 釋後再1:20稀釋(共稀釋1000倍）至菌含量為1?5X 1〇3 CFU/ml (2倍於終濃度)。將冷 藏的藥敏板按-2(TC、4°C、室溫各Ih的融化程序融化後置超淨工作檯上。用微量移液器W 從第11孔至第1孔的順序每孔加100 U L菌息液(此時各孔藥液和菌息液均分別達到應測 試的濃度)，第12孔不加，見圖1。
[0043] 1. 2. 4培養及結果判定 接種後96孔藥敏板置35C培養48小時，觀察受試菌生長情況，讀取結果。結果判斷 的前提是生長對照良好，空白對照無菌生長清晰，其它孔隨藥物濃度梯度升高而菌的生長 受到抑制。判讀標準如下；與生長對照孔比較，將測試孔菌株生長抑制情況進行對比，0分 為肉眼觀察清晰；1分為輕度模糊；2分為濁度顯著降低(約抑制50%受試菌生長);3分為濁 度輕度降低；4分為濁度不減低。氣康哇組W濁度顯著降低(約抑制50%受試菌生長）孔（2 分）為MIC判斷終點。每次試驗W氣康哇作為陽性對照藥物，其MIC值位於M27-A2規定的 範圍，則認為該次試驗結果有效。將每孔內生長情況與生長對照孔內情況比較，參照氣康哇 的藥物敏感性實驗臨界點，W生長被抑制50%判定為MIC值，並規定受試藥物的MIC值低於 或等於62. 5mg/ml為具有抗白色念珠菌活性。每種藥物每次實驗同時做4排，每種藥物重 復3次試驗，取平均值作為該藥物的MIC值。
[0044] 2 結果 生長對照孔均生長良好，空白對照孔無菌落生長清晰，且陽性對照藥物氣康哇MIC值 位於M27-A2規定的範圍。對4種中藥水提物（白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參）W及6種中藥 醇提物（白鮮皮、僵蠶、白花藤、苦參、白立、白及）藥敏測定的MIC值表明，白鮮皮水提物、苦 參水提物、苦參醇提物具有抗白色念珠菌活性，其MIC值見表1，分別為；62.5、15. 625 W及 62. 5mg/ml。
[0045] 表1各中草藥提取物對白色念珠菌的MIC值

【權利要求】
1. 一種白鮮皮水提物，其特徵在於，所述的白鮮皮水提物的製備方法包括以下步驟： 取白鮮皮加蒸餾水浸泡20-40min，回流提取1-3次，每次20-40min，合併濾液。
2. 根據權利要求1所述的白鮮皮水提物，其特徵在於，所述的白鮮皮與蒸餾水的比例 為：1: (1-10) g/mL。
3. 根據權利要求1所述的白鮮皮水提物，其特徵在於，所述的浸泡時間為30min ;回流 提取2次，每次30min。
4. 權利要求1-3任一所述的白鮮皮水提物在製備抑制白色念珠菌的藥物中的應用。
5. -種抑制白色念珠菌的藥物組合物，其特徵在於，所述的藥物組合物是由白鮮皮水 提物、苦參水提物、苦參醇提物按照以下體積比組成：（2-3): (2-3): (2-3)，其中所述的鮮 皮水提物、苦參水提物、苦參醇提物的生藥濃度相同； 所述的白鮮皮水提物的製備方法包括以下步驟：取白鮮皮加蒸餾水浸泡20-40min，回 流提取1-3次，每次20-40min，合併濾液； 所述的苦參水提物的製備方法包括以下步驟：取苦參加蒸餾水浸泡20-40min，回流提 取1-3次，每次20-40min，合併濾液； 所述的苦參醇提物的製備方法包括以下步驟：取苦參加蒸餾水浸泡20-40min，煎 煮1-3次，每次0. 5-1. 5小時，合併煎液，濃縮，冷卻至室溫，加乙醇使乙醇體積分數達 60% -80%，靜置18-30小時後濾過，濾液回收乙醇。
6. 根據權利要求5所述的藥物組合物，其特徵在於，所述的白鮮皮水提物、苦參水提 物、苦參醇提物體積比為：（2. 4-2. 6) : (2. 4-2. 6) : (2. 4-2. 6)。
7. 根據權利要求6所述的藥物組合物，其特徵在於，所述的白鮮皮水提物、苦參水提 物、苦參醇提物體積比為：1:1:1。
8. 根據權利要求5所述的藥物組合物，其特徵在於，所述的白鮮皮水提物的製備方法 中，所述的浸泡時間為30min，回流提取2次，每次30min ;所述的苦參水提物的製備方法中， 所述的浸泡時間為30min，回流提取2次，每次30min ;所述的苦參醇提物的製備方法中，所 述的浸泡時間為30min，煎煮2次，每次1小時，靜置時間為24小時。
9. 權利要求5-9任一所述的藥物組合物在製備抑制白色念珠菌的藥物中的應用。
10. 權利要求5所述的藥物組合物的製備方法，其特徵在於，它包括以下步驟： a) 提取白鮮皮水提物：取白鮮皮加蒸餾水浸泡20-40min，回流提取1-3次，每次 20-40min，合併濾液； b) 提取苦參水提物：取苦參加蒸餾水浸泡20-40min，回流提取1-3次，每次20-40min， 合併濾液； c) 提取苦參醇提物：取苦參加蒸餾水浸泡20-40min，煎煮1-3次，每次0. 5-1. 5小時， 合併煎液，濃縮，冷卻至室溫，加乙醇使乙醇體積分數達60% -80%，靜置18-30小時後濾 過，濾液回收乙醇； d) 將所述的白鮮皮水提物、提取苦參水提物和苦參醇提物按以下體積比混合： (2. 4-2. 6) : (2. 4-2. 6) : (2. 4-2. 6)，其中所述的白鮮皮水提物、提取苦參水提物和苦參醇 提物的生藥濃度相同。
【文檔編號】A61K36/75GK104224996SQ201410489534
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月23日 優先權日:2014年9月23日
【發明者】周曾同, 沈雪敏 申請人:上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院