一種以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法
2023-10-10 04:48:19 1
一種以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法
【專利摘要】本發明公開了一種以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法，包括以下步驟：1）降解菌的富集；2）降解菌的馴化培養；3）降解菌平板培養；4）降解菌平板劃線分離單菌落；5）降解菌透明圈篩選。應用該方法得到的降解菌可以利用乙醯甲胺磷為唯一碳源，並有效降解乙醯甲胺磷農藥。本發明提供的以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法可以用於其它有機磷類殺蟲劑降解菌株的篩選，在農藥殘留降解菌株的篩選方面提供了一定的理論指導。
【專利說明】一種以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法
【技術領域】[0001]本發明涉及生物降解農藥殘留【技術領域】，具體地說是一種以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法。
【背景技術】
[0002]乙醯甲胺磷(Ac印hate)又名高滅磷，化學名稱為0，S- 二甲基乙醯基硫代磷醯胺酯。乙醯甲胺磷屬低毒殺蟲劑，具有胃毒和觸殺作用，可殺卵並有一定的燻蒸作用，原藥大鼠經口 LD50值為945mg/kg。自2007年I月I日起我國全面禁用甲胺磷等5種高毒農藥後，乙醯甲胺磷作為多種高毒有機磷農藥的替代品被廣泛推廣。
[0003]乙醯甲胺磷的藥效和甲胺磷相當，但毒性是甲胺磷的1/30，主要用於蔬菜、茶葉等經濟作物上。但乙醯甲胺磷只有不到0.1%的量到達靶生物，高達99.9%的農藥則散布到環境中，對微生物、植物及生態環境產生潛在危害。因此，由乙醯甲胺磷帶來的危害環境安全以及食品安全問題迫切需要解決，而利用微生物去除農藥殘留是一種十分有效的方法。
[0004]利用生態系統中微生物代謝類型的多樣性、生化適應能力的極強性以及能迅速產生相應酶系的應急性來降解各類人工合成的農藥，使其完全降解成無機物是目前最有潛力的有效方法之一。乙醯甲胺磷的微生物降解研究起步較晚、成果也較少，迄今為止，國內外僅有幾篇報導。因此，分離、篩選具有高效降解乙醯甲胺磷農藥的微生物對消除農藥汙染、淨化環境和社會的可持續發展具有重要的現實意義。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題在於提供一種以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法，通過尋找高效降解乙醯甲胺磷的菌株，以期能夠有效控制農藥造成的環境汙染與危害。
[0006]為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案:
[0007]—種以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法，包括以下步驟:
[0008]I)降解菌的富集培養:稱取長期受農藥汙染的活性汙泥或土樣於富集培養基中，培養條件為25-37°C，搖床培養5-9天，共轉接4次，以培養液5_25wt%的接種量轉接入含有乙醯甲胺磷濃度梯度遞增的富集培養基中；
[0009]所述富集培養基的組份包括=MgSO4.7Η200.1-0.5g/L，K2HPO40.05-0.2g/L，(NH4)2SO40.05-0.2g/L, CaSO40.01-0.lg/L, FeSO4.7Η200.001-0.005g/L，葡萄糖 5_20g/L，蛋白腖 l-10g/L，pH 為 6.0-8.0 ；
[0010]2)降解菌的馴化培養:取步驟I)中培養的最終富集菌液，以5_25wt%的接種量轉接到基礎培養基中，添加乙醯甲胺磷進行馴化培養，培養條件為25-37°C，搖床培養5-9天，如此重複進行3次馴化；
[0011]所述基礎培養基的組成包括=MgSO4.7Η200.1-0.5g/L，K2HPO40.1-0.5g/L，(NH4)2SO40.1-0.5g/L, CaSO40.05-0.lg/L, FeSO4.7H200.001-0.005g/L，酵母膏 0.01-0.lg/L, pH 為 6.0-8.0 ；
[0012]3)降解菌平板培養:取步驟2)中培養的最終馴化菌液稀釋IO4-1O5後，塗布於牛肉膏蛋白腖固體培養基平板上，25-37°C恆溫倒置培養3-7天，獲得降解菌的菌落；
[0013]所述牛肉膏蛋白腖固體培養基的組成包括:牛肉膏l-10g/L，胰蛋白腖5_20g/L，NaC15-20g/L, pH 為 6.0-8.0 ；
[0014]4)降解菌平板劃線分離單菌落:取步驟3)中塗布培養的菌落，劃線培養於所述牛肉膏蛋白腖固體培養基平板上，25-37°C恆溫倒置培養3-7天，獲得降解菌的單菌落；
[0015]5)降解菌篩選:取步驟4)分離獲得的單菌落，點塗於添加有乙醯甲胺磷的篩選培養基中，25-37°C恆溫倒置培養3-7天，挑選能夠生長並有明顯透明圈的菌株，作為篩選的以乙醯甲胺磷為唯一碳源的降解菌株；
[0016]所述篩選培養基的組成包括:葡萄糖5_20g/L，MgSO4.7H200.1-0.5g/L，KC10.1-0.5g/L, MnSO4.H2O0.01-0.05g/L, (NH4)2.SO40.1-lg/L, NaCl0.1-0.5g/L,FeSO4.7H200.01-0.05g/L, CaC03l_10g/L,瓊脂 1.8%-2.0%, pH 為 6.0-8.0。
[0017]優選地，所述步驟I)中的富集培養基中，降解菌首次培養時乙醯甲胺磷的濃度為100mg/L，在之後的轉接過程中，富集培養基中的乙醯甲胺磷濃度以100mg/L的梯度遞增。
[0018]優選地，所述步驟2)中基礎培養基中添加的乙醯甲胺磷濃度為500mg/L。
[0019]優選地，所述步驟5)中篩選培養基中添加的乙醯甲胺磷濃度為50_500mg/L。
[0020]優選地，所述步驟5)中篩選培養基中添加的乙醯甲胺磷濃度為100mg。
[0021 ] 優選地，所述步驟I)中所述富集培養基的組成包括=MgSO4.7H200.2g/L，K2HPO40.lg/L, (NH4)2SO40.lg/L, CaSO40.04g/L, FeSO4.7Η200.001g/L，葡萄糖 10.0g/L，蛋白腖 5.0g/L，pH 為 7.0。
[0022]優選地，所述步驟2 )中所述基礎培養基的組成包括=MgSO4.7H200.4g/L，K2HPO40.2g/L, (NH4) 2S040.2g/L, CaSO40.08g/L, FeSO4.7H200.002g/L,酵母膏 0.05g/L, pH 為
7.0。
[0023]優選地，所述牛肉膏蛋白腖固體培養基的組成包括:牛肉膏5g/L，胰蛋白腖IOg/L, NaC110g/L, pH 為 7.0。
[0024]優選地，所述步驟5)中所述篩選培養基的組成包括:葡萄糖10g/L，MgSO4.7Η200.3g/L, KC10.3g/L, MnSO4.H2O0.03g/L, (NH4)2.SO40.5g/L, NaCl0.3g/L,FeSO4.7H200.03g/L, CaC035g/L,瓊脂 2.0%, pH 為 7.0。
[0025]本發明具有以下有益效果:
[0026]I)本發明釆用的篩選方法中通過設計菌體篩選的各種培養基的組成配方，從田間土壤中獲得能夠有效降解有機磷農藥的菌株。所篩選的菌株對於乙醯甲胺磷、對硫磷、甲基對硫磷、甲胺磷、氧化樂果、敵敵畏和毒死蜱均具有良好的消解效果。其中，所篩選的菌株對於乙醯甲胺磷的消解效果最好，消解率達到87%以上，在優選的培養基組成配方的情況下所篩選的菌株，則能夠將乙醯甲胺磷完全消解。所述的篩選方法簡單易行、經濟廉價，所得菌株可以用來製備乙醯甲胺磷的降解菌劑，在實踐中有很好的應用潛力。
[0027]2)本發明利用長期受乙醯甲胺磷汙染的田間土壤為處理對象，所得的降解菌是田間土壤中的土著菌，製成菌劑後田間應用不易被排斥，效果會更好。
[0028]3)本發明提供的以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法可以用於其它有機磷類殺蟲劑降解菌株的篩選，在農藥殘留降解菌株的篩選方面提供了一定的理論指導。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1為本發明實施例中降解菌降解乙醯甲胺磷水解圈。
【具體實施方式】
[0030]以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案。
[0031]實施例1
[0032]1、以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選
[0033]I)降解菌的富集培養:稱取5g長期受農藥汙染的活性汙泥或土樣於50ml富集培養基中，所述富集培養基中乙醯甲胺磷的濃度為100mg/L，培養條件為25°C，120r/min搖床培養5天。然後以培養液5wt%的接種量轉接入新鮮富集培養基中，即轉接量按質量百分比為新鮮富集培養液的5%，轉接的富集培養基中的乙醯甲胺磷的濃度提高為200mg/L，以後每培養5天轉接一次,每次轉接的富集培養基中的乙醯甲胺磷的濃度以100mg/L的梯度遞增，直至乙醯甲胺磷在培養液中的濃度達到500mg/L，每次轉接後的菌體培養條件相同。
[0034]所述富集培養基的製備方法為:稱取MgSO4.7H200.lg, K2HPO40.05g,(NH4)2SO40.05g, CaS040.01g，FeSO4.7Η200.0Olg,葡萄糖 5g，蛋白腖 lg，加去離子水至lOOOmL，調pH為6.0，於0.lMPa、121°C滅菌20min ;待培養基冷卻到50°C時，添加乙醯甲胺磷分別為100mg、200mg、300mg、400mg、500mg ;獲得乙醯甲胺磷濃度分別為100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、50`0mg/L 的富集培養基。
[0035]2)降解菌的馴化培養:取步驟I)中培養的最終富集菌液，以5wt%的接種量轉接到基礎培養基中，培養條件為25°C，120r/min搖床培養5天。以上述相同培養條件，反覆培養3次進行馴化。
[0036]所述基礎培養基的製備方法為:稱取MgSO4.7H200.lg, K2HPO40.1g,(NH4) 2S040.lg, CaSO40.05g, FeSO4.7Η200.001g，酵母膏 0.01g，加去離子水 1L，調 pH 為 6.0,於0.lMPa、121°C滅菌20min ;待培養基冷卻到50°C時，添加乙醯甲胺磷，使乙醯甲胺磷的濃度為 500mg/L。
[0037]3)降解菌平板培養:取步驟2)中培養的最終馴化菌液稀釋IO4-1O5後，塗布於牛肉膏蛋白腖固體培養基平板上，25°C恆溫倒置培養3天，獲得降解菌的菌落。
[0038]所述牛肉膏蛋白腖固體培養基的製備方法為:稱取牛肉膏lg，胰蛋白腖5g，NaC15g,加去離子水溶解後調pH為6.0,定容至1L,於0.1MPa、121°C滅菌20min。
[0039]4)降解菌平板劃線分離單菌落:將步驟3)中塗布培養的菌落，劃線培養於牛肉膏蛋白腖固體培養基平板上，25°C恆溫倒置培養3天，獲得降解菌的單菌落(菌株)。
[0040]5)降解菌透明圈篩選:將步驟4)分離獲得的單菌落(菌株)，一部分劃線培養於牛肉膏蛋白腖固體培養基平板上以備保存菌株，另一部分點塗於透明圈篩選培養基，25°C恆溫倒置培養3天，能夠生長並有明顯透明圈的菌株即為篩選的以乙醯甲胺磷為唯一碳源的降解菌株，命名為SWS-10003。
[0041]所述篩選培養基的製備方法為:稱取葡萄糖5g，MgSO4.7H200.lg, KC10.lg,MnSO4.H2O0.01g, (NH4)2.SO40.1，NaCl0.lg, FeSO4.7Η200.01g, CaCO3Ig,加去離子水至1000mL, il pH為6.0 ;加瓊脂1.8%，包裝好；於0.lMPa、121°C滅菌20min ;乙醯甲胺磷添加量為50mg。
[0042]2、篩選菌株SWS-10003對有機磷農藥降解能力的鑑定
[0043]將保存於斜面上的篩選菌株SWS-10003接種於含有0.5mg/mL乙醯甲胺磷的液體基礎培養基中活化，將活化好的菌轉接於50mL LB培養基中大量培養，將生長至對數生長期的菌離心收集菌體，去除培養基，並將菌用Burk無機鹽培養基洗兩次以徹底去除細菌表面上粘的LB完全培養基。用50mLBurk無機鹽培養基將菌體懸起，取2%接種於5mL Burk液體無機鹽培養基中，在此培養基中分別加有乙醯甲胺磷、對硫磷、甲基對硫磷、甲胺磷、氧化樂果、敵敵畏和毒死蜱，同時做對照，空白對照中的有機磷農藥量與實驗管相同，但未接種菌液，而是用Burk培養基代替。在32°C搖床上震蕩培養36小時後，分別用氯仿萃取培養液，氣相色譜測定培養基中各種農藥的含量，結果列於表1中。空白對照中的有機磷農藥均未消解，數據未列於表中。
[0044]從表所列的結果可以看出，此菌對於乙醯甲胺磷的消解效果最好，經過培養後乙醯甲胺磷已被消解87%。
[0045]表1不同農藥與篩選菌株培養36小時後的農藥殘留量
【權利要求】
1.一種以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法，包括以下步驟: 1)降解菌的富集培養:稱取長期受農藥汙染的活性汙泥或土樣於富集培養基中，培養條件為25-37°C，搖床培養5-9天，共轉接4次，以培養液5_25wt%的接種量轉接入含有乙醯甲胺磷濃度梯度遞增的富集培養基中； 所述富集培養基的組份包括=MgSO4.7H200.1-0.5g/L，K2HPO40.05-0.2g/L，(NH4)2SO40.05-0.2g/L, CaSO40.01-0.lg/L, FeSO4.7Η200.001-0.005g/L，葡萄糖 5_20g/L，蛋白腖 l-10g/L，pH 為 6.0-8.0 ； 2)降解菌的馴化培養:取步驟I)中培養的最終富集菌液，以5-25wt%的接種量轉接到基礎培養基中，添加乙醯甲胺磷進行馴化培養，培養條件為25-37°C，搖床培養5-9天，如此重複進行3次馴化； 所述基礎培養基的組成包括=MgSO4.7Η200.1-0.5g/L，K2HPO40.1-0.5g/L，(NH4)2SO40.1-0.5g/L, CaSO40.05-0.lg/L, FeSO4.7H200.001-0.005g/L，酵母膏 0.01-0.lg/L, pH 為 6.0-8.0 ； 3)降解菌平板培養:取步驟2)中培養的最終馴化菌液稀釋IO4-1O5後，塗布於牛肉膏蛋白腖固體培養基平板上，25-37°C恆溫倒置培養3-7天，獲得降解菌的菌落； 所述牛肉膏蛋白腖固體培養基的組成包括:牛肉膏l-10g/L，胰蛋白腖5-20g/L，NaC15-20g/L, pH 為 6.0-8.0 ； 4)降解菌平板劃線分離單菌落:取步驟3)中塗布培養的菌落，劃線培養於所述牛肉膏蛋白腖固體培養基平板上，25-37°C恆溫倒置培養3-7天，獲得降解菌的單菌落； 5)降解菌篩選:取步驟4)分 離獲得的單菌落，點塗於添加有乙醯甲胺磷的篩選培養基中，25-37°C恆溫倒置培養3-7天，挑選能夠生長並有明顯透明圈的菌株，作為篩選的以乙醯甲胺磷為唯一碳源的降解菌株； 所述篩選培養基的組成包括:葡萄糖5-20g/L，MgSO4.7H200.1-0.5g/L，KC10.1-0.5g/LjMnSO4.Η200.01-0.05g/L, (NH4)2.SO40.1-lg/L,NaCl0.1-0.5g/L,FeSO4 *7H200.01-0.05g/L, CaC03l-10g/L,瓊脂 1.8%-2.0%, pH 為 6.0-8.0。
2.根據權利要求1所述的以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法，其特徵在於:所述步驟I)中的富集培養基中，降解菌首次培養時乙醯甲胺磷的濃度為100mg/L，在之後的轉接過程中，富集培養基中的乙醯甲胺磷濃度以100mg/L的梯度遞增。
3.根據權利要求1所述的以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法，其特徵在於:所述步驟2)中基礎培養基中添加的乙醯甲胺磷濃度為500mg/L。
4.根據權利要求1所述的以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法，其特徵在於:所述步驟5)中篩選培養基中添加的乙醯甲胺磷濃度為50-500mg/L。
5.根據權利要求1所述的以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法，其特徵在於:所述步驟5)中篩選培養基中添加的乙醯甲胺磷濃度為100mg。
6.根據權利要求1所述的以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法，其特徵在於，所述步驟I)中所述富集培養基的組成包括=MgSO4.7H200.2g/L，K2HPO40.lg/L,(NH4)2SO40.lg/L, CaSO40.04g/L，FeSO4.7H200.001g/L，葡萄糖 10.0g/L，蛋白腖 5.0g/L，pH為 7.0。
7.根據權利要求1所述的以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法，其特徵在於，所述步驟2)中所述基礎培養基的組成包括=MgSO4.7Η200.4g/L，K2HPO40.2g/L，(NH4)2SO40.2g/L, CaSO40.08g/L, FeSO4.7H200.002g/L，酵母膏 0.05g/L, pH 為 7.0。
8.根據權利要求1所述的以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法，其特徵在於，所述牛肉膏蛋白腖固體培養基的組成包括:牛肉膏5g/L，胰蛋白腖10g/L，NaC110g/L，pH為7.0。
9.根據權利要求1所述的以乙醯甲胺磷為底物的降解菌株的篩選方法，其特徵在於，所述步驟5)中所述篩選培養基的組成包括:葡萄糖10g/L，MgSO4.7Η200.3g/L，KC10.3g/L，MnSO4.H2O0.03g/L, (NH4)2.SO40.5g/L, NaCl0.3g/L, FeSO4.7H200.03g/L, CaC035g/L，瓊脂`2.0%, pH 為 7.0。`
【文檔編號】C12N1/00GK103525703SQ201310472888
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月11日 優先權日:2013年10月11日
【發明者】唐雪明, 王金斌, 李文, 蔣瑋, 何建華, 吳瀟, 宿學峰, 任芳芳 申請人:上海市農業科學院