一種快速積累微藻胞內油脂的方法

2023-10-10 06:23:59 3

專利名稱：一種快速積累微藻胞內油脂的方法
一種快速積累微藻胞內油脂的方法技術領域
本發明屬於生物能源領域和/或微藻生物技術領域，涉及一種快速積累微藻胞 內油脂的方法。
背景技術：
微藻能源發展前景廣闊、優勢獨特已獲國內外公認。迄今，世界各國在該領域 的研發工作還停留在實驗研究和中試論證的起步階段(李元廣、譚天偉、黃英明，微藻 生物柴油產業化技術中的若干科學問題及其分析，中國基礎科學，2009，5，64 70)， 但均遇到技術不成熟而導致成本高這一瓶頸，因而微藻能源在全球尚未實現規模化製備。
掌握能源微藻的高效培養模式是實現微藻能源規模化製備的基礎。現有生長 快的藻種一般油脂含量較低，而含油量高的藻種生長大多比較緩慢。這一矛盾是能源 微藻高效培養模式開發的現實障礙。微藻培養包括自養、異養和混合營養三種模式 (Yanna Liang, Nicolas Sarkany, Yi Cui.Biomass and lipid productivities of Chlorella vulgaris under autotrophic, heterotrophic and mixotrophic growth conditions.Biotechnology Letters, 2009，31 : 1043 1049)。異養培養模式(Han Xu，Xiaoling Miao，Qingyu Wu.High quality biodiesel production from a microalga Chlorella protothecoides by heterotrophic growth in fermenters. Journal of Biotechnology, 2006，126 499 507)存在「不能直接利用太 陽能、不能固定C02、能耗大」等問題，因而難以用於能源微藻的大規模培養。美國 1998年的ASP計劃工作總結報告指出相對低成本的開放式光自養培養是最有前景的 培養模式(Sheehan J, Dunahay T, Benemann J, et al.A Look Back at the U.S.Departmentof Energy' s Aquatic Species Program---Biodieselfrom Algae.National Renewable EnergyLaboratory, 1998)。但是，開放式光自養存在的「培養密度低、易被汙染、水分蒸發、 受環境因素影響大」等問題，也使其難以滿足能源生產的規模需求。
針對開放式光自養培養存在的問題，人們試圖採用封閉式光生物反應器進行微 藻的光自養培養。封閉式光生物反應器包括管道式、平板式、柱式等(Ogbonna J C， Tanaka H.Industrial-size photobioreactors.Chemical technology, 1997, 27(7) 43 49), 雖然具有細胞密度高、生長快等優點，但由於成本高、放大技術不成熟等原因，目前尚 未應用於微藻的大規模培養。
此外，近年來人們試圖採用封閉式光生物反應器和開放池組合進行微藻的光自 養培養即先利用密閉式光生物反應器實現微藻的高密度培養，再利用開放池降低生產 成本。該模式基本具備「可利用太陽能、高密度、固定co2、低成本、高效」的特徵， 但如何實現全過程的有效控制和系統工程優化，還有待深入研究。
學者公認能源微藻培養模式應具備「可利用太陽能、高密度、固定C02、低成 本、高效」的特徵，為實現這一目標，研究者先後又探索推出了 「混合營養」、「先自 養，後異養」等培養模式
(1)混合營養模式是指藻細胞利用光和有機物作為能源、再利用有機物和 無機物作為碳源的培養方式(Lee YK，Ding SY, Hoe CH，Low CS.Mixotrophic growth of Chlorella sorokiniana in outdoor enclosed photobioreactor. Journal of applied phycology, 1996，8 163 169)。在微藻的混合營養培養過程中，微藻的光合自養和化能異養可以 同時進行。該模式可以通過與富含碳、氮等有機物廢水處理結合而降低生產成本，但其 最大問題是大規模培養過程中容易滋生大量雜菌，難以實現微藻的高密度培養。
(2) 「先自養，後異養」模式是先利用密閉式光生物反應器自養以固 定 CO2,後進行異養培養(Xiong W, Gao C, Yan D，et al.Double CO2 fixation in photosynthesis-fermentation model enhances algal lipid synthesis for biodiesel production. Bioresource Technology, 2010，101 2287 2293)。該模式存在的最大問題是光誘導培 養過程放大後無法做到無菌培養(Scott SA, Davey MP, Dennis JS, et al.Biodiesel from algae challenges and prospects.Current Opinion inBiotechnology, 2010, 21: 1-10),由於 微藻的異養培養要求藻種必須不帶任何雜菌，因此該模式無法放大，不具有規模化應用 價值。
綜合上述幾種微藻培養模式的優缺點，本發明設計了一種「異養-稀釋-光誘導 串聯培養」模式，該模式滿足了 「可利用太陽能、高密度、固定co2、低成本、高效」 的要求。以小球藻為例，其流程如下首先利用生物反應器異養培養小球藻以獲得高 密度細胞，待培養液中有機碳源消耗完畢後，用不含有機碳源的培養基稀釋藻液，經短 時間內(8 Mh)的光照誘導，使藻細胞內的油脂快速大量積累。該模式中的異養階段 是在搖瓶、機械攪拌式、氣升式、鼓泡式等可異養培養的生物反應器中進行，目的是為 了在短時間內獲得較高密度的細胞；光誘導階段可在任何可用於微藻光自養培養的系統 中進行，目的是通過光誘導作用提高胞內油脂的含量；異養階段與光誘導階段分開獨立 進行，異養階段放出的藻液先用光誘導培養基進行稀釋後再轉入光誘導培養階段。過程 中需確保進入光誘導階段的藻液中不含有機碳源，這樣可避免光誘導階段滋生過多的雜 菌；而通過稀釋作用可以確保光誘導階段的藻細胞能獲得充足的光照，實現胞內油脂含 量的快速提高。該模式和上述其他模式相比，具有生產效率高、不存在因不同系統的組 合而造成的異養培養過程染菌問題(光自養培養過程有雜菌並不影響生長)、所用培養系 統的組合方式靈活和生產成本低等優點，可充分發揮小球藻在光誘導階段油脂快速積累 的優勢，為解決生物柴油規模化製備過程中由於原料不足而導致的成本過高問題提供重 要的技術手段。發明內容
本發明提供了一種快速積累微藻胞內油脂的方法，該方法包括微藻異養培養的 步驟，將異養培養所獲得的微藻培養液稀釋後進行光誘導培養的步驟，以及任選的藻細 胞採收、油脂分離提取的步驟。
本發明提供一種微藻油脂的生產方法，該方法包括微藻異養的步驟，將微藻的 異養培養液稀釋後進行光誘導培養的步驟，以及藻細胞採收、油脂分離提取的步驟。該 方法能夠實現胞內油脂的快速積累，具有佔地面積少、面積產率高、相對微藻光自養而 言因細胞密度高而帶來的採收成本低(光誘導時的細胞密度較高，一般為2 @/L)，因5而大大提高了生產效率，降低了生產成本。
在一個具體實施方式
中，所述的微藻選自綠藻門小球藻屬中的蛋白核小 球藻(Chlorella pyrenoidosa)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)，橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)，Chlorellaemersonii, Chlorella sorokiniana, Chlorella saccharophila, Chlorella regularis，Chlorella minutissima，Chlorella protothecoides, Chlorella zofingiensis， 以 及綠藻門中的 Brachiomonas submarina，Chlamydobonas reinhardtii，Chlamydomonas acidophila, Haematococcus pluvialis, Haematococcus lacustris, Scenedesmus obliquus， Spongiococcum exetriccium, Tetraselmis suecica，Tetraselmis chuii，Tetraselmis tetrathele， Tetraselmis verrucosa, Micractinium pusillum ；
娃藻門的 Cylindrotheca fusiformis，Nitzschia laevis, Nitzschia alba, Nitzschia fonticola，Navicula incerta，Navicula pelliculosa ；
藍藻門的 Anabaena variabilis ；
金藻門的 Poterioochromonas malhamensis ；
甲藻門的 Amphidinium carterae，Crypthecodinium cohnii ；
裸藻門的Euglena gricilis ；
紅藻門的 Galdieria sulphuraria。
在一個具體實施方式
中，所述微藻選自綠藻門小球藻屬的藻類。尤其是， 所述微藻選自綠藻門小球藻屬中的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)，普通小球藻 (Chlorella vulgaris)，橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)，Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana, Chlorella saccharophila, Chlorella regularis, Chlorella minutissima, Chlorella protothecoides 禾口 Chlorella zofingiensis。
在一個具體實施方式
中，所述微藻選自蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)， 普通小球藻(Chlorella vulgaris)和橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)。
在一個具體實施方式
中，所述微藻異養的步驟包括在生物反應器中加入pH為 4.0 10.0的培養基，按工作體積的0.1 30%接入微藻藻種進行分批培養、補料分批培 養、連續培養或半連續培養，培養溫度為10 50°C，控制pH小於10.0，控制溶氧在 以上。
在一個具體實施方式
中，所述藻液稀釋包括用培養基將異養獲得的藻液稀釋至 細胞密度為0.1 50克/升，所述培養基不含有機碳源，其pH為4.0 10.0。
在一個具體實施方式
中，所述光誘導培養包括將稀釋後的藻液轉入光誘導裝置 中進行光誘導，連續光照或間歇光照，培養溫度為5 50°C，光照強度為0.1 150klx， 光誘導培養周期為1 150小時。
在一個具體實施方式
中，異養培養基由氮源、有機碳源以及少量無機鹽、微量 元素和水組成；光誘導培養基由氮源、無機鹽和水組成。
在一個具體實施方式
中，所述異養步驟在搖瓶、機械攪拌式、氣升式或鼓泡式 可異養培養的生物反應器中進行，所述光誘導培養步驟在搖瓶或選自敞開式的跑道池或 圓池、封閉式的平板式光生物反應器或管道式光生物反應器或柱式光生物反應器或薄膜 立袋與吊袋光生物反應器等任何可用於微藻光自養培養的裝置中進行，光照條件為自然 光或人工光照射。
在一個具體實施方式
中，當小球藻為普通小球藻時，異養所使用的培養基基本 上由以下成分組成KN035 15克/升、葡萄糖10 60克/升、KH2PO4 0.3 0.9克/ 升、N^HPO4 · 12H20 1.0 10.0 克 / 升、MgSO4 · 7H20 0.2 1.0 克 / 升、CaCl20.05 0.3克/升、FeSO4 · 7H20 0.01 0.05克/升；微量元素0.5 4ml，其中微量元素的 組成為 H3BO3 5 15 克 / 升，ZnSO4 · 7H20 5.0 10.0 克 / 升，MnCl2 · H2O 1.0 2.0 克 / 升，(NH4)6Mo7Om · 4H20 0.5 1.5 克 / 升，CuSO4 · 5H20 1.0 2.0 克 / 升， Co(NO3)2 · BH2O 0.1 0.9克/升；水。在一個具體實施方式
中，當小球藻為蛋白核小 球藻時，異養所使用的培養基基本上由以下成分組成葡萄糖10 60克/升，尿素2 8 克 / 升，KH2PO4 1 2 克 / 升，N^HPO4 · 12H20 1.0 10.0 克 / 升，MgSO4 · 7H20 1 2克/升，CaCl2 0.05 0.1克/升，梓檬酸三鈉0.1 2.0克/升，Fe—EDTA溶液 0.5 lmL，A5溶液1 5mL ；其中Fe-EDTA溶液配方為FeSO4 · 7H20 20 30克/升 和EDTA 20 40克/升；A5溶液配方為H3BO3 2.5 4.0克/升，MnCl2 · 4H20 1.0 2.0 克 / 升，ZnSO4 · 7H20 0.1 0.6 克 / 升，CuSO4 · 5H20 5 10 克 / 升，N^MoO4 0.01 0.05 克 / 升；7jC。
在一個具體的實施方式中，所述油脂分離提取方法採用有機溶劑提取法。
在另一具體實施例中，所述微藻培養方法還包括提取微藻油脂的步驟。
本申請還提供一種油脂生產方法，該方法包括異養培養微藻的步驟，將異養培 養的微藻藻液稀釋後進行光誘導培養的步驟，以及藻細胞採收、油脂分離提取的步驟。
本申請的油脂生產方法中使用到的微藻、培養基以及培養條件等如本文上文以 及下文具體實施方式
部分所詳述。
用本發明公開的異養-稀釋-光誘導串聯技術培養小球藻，首先在密閉式生物反 應器中高密度異養培養小球藻，待培養液中有機碳源消耗完畢後，用不含有機碳源的培 養基稀釋藻液，經短時間內(8 Mh)的光照誘導，可使藻細胞內的油脂含量快速大量積 累，油脂含量在短時間內(例如8 M小時)比異養階段的藻細胞提高約一倍(異養階 段胞內油脂含量一般不超過10%，經光誘導後可達20 30% )。
附圖簡述


圖1顯示在50L生物反應器/3L平板式光生物反應器串聯繫統中採用異養-稀 釋-光誘導串聯培養蛋白核小球藻快速積累油脂的結果(同時測定了細胞內其他主要生化 成分)。
圖2顯示5T發酵罐串聯至戶外30L平板和60L大盆連續培養普通小球藻光誘導 階段戶外自然光強和自然溫度的變化曲線。
圖3顯示5T發酵罐串聯至戶外30L平板培養普通小球藻快速積累油脂的過程曲 線(同時測定了細胞內其他主要生化成分)。
圖4顯示5T發酵罐串聯至戶外60L大盆培養普通小球藻快速積累油脂的過程曲 線(同時測定了細胞內其他主要生化成分)。
圖5顯示5T發酵罐串聯至戶外20m2跑道池和3.14m2圓池連續培養普通小球藻 光誘導階段戶外自然光強和自然溫度的變化曲線。
圖6顯示5T發酵罐串聯至戶外20m2跑道池培養普通小球藻快速積累油脂的過程 曲線(同時測定了細胞內其他主要生化成分)。
圖7顯示5T發酵罐串聯至戶外3.14m2圓池培養普通小球藻快速積累油脂的過程 曲線(同時測定了細胞內其他主要生化成分)。
圖8顯示500mL搖瓶/3L圓柱式光反應器串聯培養橢圓小球藻胞內主要生化成 分的變化曲線。具體實施方案
適用於本申請的微藻包括但不限於綠藻門小球藻屬中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)，橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)， Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana，Chlorella saccharophila, Chlorella regularis， Chlorella minutissima，Chlorella protothecoides, Chlorella zofingiensis，以及綠藻門中 的 Brachiomonas submarina，Chlamydobonas reinhardtii，Chlamydomonas acidophila, Haematococcus pluvialis, Haematococcus lacustris，Scenedesmus obliquus，Spongiococcum exetriccium, Tetraselmis suecica， Tetraselmis chuii， Tetraselmis tetrathele, Tetraselmis verrucosa, Micractinium pusillum ；
娃藻門的 Cylindrotheca fusiformis，Nitzschia laevis，Nitzschia alba, Nitzschia fonticola，Navicula incerta, Navicula pelliculosa ；
藍藻門的 Anabaena variabilis ；
金藻門的 Poterioochromonas malhamensis ；
甲藻門的 Amphidinium carterae，Crypthecodinium cohnii ；
裸藻門的Euglena gricilis ；
紅藻門的 Galdieria sulphuraria。
在優選的實施方式中，本發明採用綠藻門小球藻屬的藻類來生產油脂。在更優 選的實施方式中，本發明採用蛋白核小球藻、普通小球藻或橢圓小球藻來生產油脂。
1.微藻在生物反應器中的高密度異養培養
此步驟的目的是為了快速獲得大量藻細胞，以供光誘導階段快速合成積累各種 活性成分，尤其包括油脂、色素、蛋白質、多糖等。
可採用本領域熟知的各種培養基來進行微藻異養培養。通常，異養培養基含有 氮源、有機碳源、少量無機鹽、微量元素和水。適用於微藻培養的氮源、有機碳源、無 機鹽、微量元素等是本領域周知的。例如，作為氮源，可使用的有尿素或各種硝酸鹽， 如KNO3等；作為有機碳源，可使用的有例如葡萄糖等。
這類培養基包括HA-SK培養基(中國專利ZL 200610024004.9)、Endo培養基 (Ogbonna J.C., Masui.H., Tanaka.H.Sequential heterotrophic autotrophic cultivation—an efficient method of producing Chlorella biomass for health foodand animal feed. J. Appl. Phycol.1997, 9，359 366)等。
本發明所用的HA-SK培養基是基本上由KN03、葡萄糖以及少量無機鹽、微 量元素和水組成。在所述技術方案中，所述微量元素宜選自H3BO3, ZnSO4 · 7H20， MnCl2 · H2O, (NH4)6Mo7O24 · 4H20, CuSO4 · 5H20, Co(NO3)2 · 6H20 中的一種或多種或全部。
本文所用的術語「基本上由……組成」表示本發明的組合物中除了含有主要組分ΚΝ03、葡萄糖以及少量無機鹽、微量元素和水外，還可包含一些對於組合物的基本特 性或新的特性(即可維持微藻在較短的培養周期內細胞密度達到較高的水平，同時活性 物質含量與常規異養培養相比有較大幅度提高)沒有實質上影響的組分。本文所用的術 語「由……組成」表示本發明的組合物由所指出的具體組分組成，沒有其他組分，但是 可以帶有含量在通常範圍內的雜質。
在該培養基中，培養基的各組分可在一定範圍內變化而不會對微藻細胞密度和 品質有很大的實質影響。因此，這些組分的用量不應受實施例的嚴格限制。如本領域技 術人員所熟知的，培養基中還可加入少量無機鹽，例如硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵和磷 酸鹽等，以及少量微量元素如Mn、Zn、B、I、M、Cu、Co等。
在本發明中，較佳的微量元素組分宜選自H3BO3, ZnSO4 · 7H20， MnCl2 · H2O, (NH4)6Mo7O24 · 4H20, CuSO4 · 5H20, Co(NO3)2 · 6H20 中的一種或 多種。無機鹽和微量元素的用量可根據常規知識確定。
本發明所採用的HA-SK培養基基本上由以下成分組成KN03 5 15克/升、 葡萄糖 10 60 克 / 升、KH2PO4 0.3 0.9 克 / 升、Ν%ΗΡ04 · 12H20 1.0 10.0 克 / 升、 MgSO4 · 7H20 0.2 1.0 克 / 升、CaCl2 0.05 0.3 克 / 升、FeSO4 · 7H20 0.01 0.05 克 /升；微量元素0.5 4ml，其中微量元素的組成*H3B035 15克/升，ZnSO4 · 7H20 5.0 10.0 克 / 升，MnCl2 · H2O 1.0 2.0 克 / 升，(NH4)6Mo7O24 · 4H200.5 1.5 克 / 升，CuSO4 · 5H20 1.0 2.0 克 / 升，Co(NO3)2 · 6H20 0.1 0.9 克 / 升;水。
在一個較佳的實施方案中，本發明的HA-SK培養基組合物宜由以下成分組成 KN03 7 克/ 升、葡萄糖 40 克 / 升、KH2PO4 0.6 克 / 升、Ν ΗΡ04 · 12H20 2.0 克 / 升、 MgSO4 · 7H20 0.8 克 / 升、CaCl2 0.2 克 / 升、FeSO4 · 7H20 0.03 克 / 升；微量元素 1.5mL,其中微量元素的組成為H3BO3 11 12克/升，ZnSO4 · 7H20 8.5 9.5克/升， MnCl2 · H2O 1.4 1.5 克 / 升，(NH4)6Mo7O24 · 4H20 0.8 0.9 克 / 升，CuSO4 · 5H20 1.5 1.6 克 / 升，Co(NO3)2 · 6H20 0.45 0.55 克 / 升；水 lOOOmL。
本發明所用的Endo培養基基本上由以下成分組成葡萄糖10 60克/升， 尿素2 8 克/升，KH2PO4 1 2 克 / 升，NiHPO4 · 12H20 1.0 10.0 克 / 升， MgSO4 · 7H201 2克/升，CaCl2 0.05 0.1克/升，檸檬酸三鈉0.1 2.0克/升， Fe-EDTA溶液0.5 lmL，A5溶液1 5mL ；其中Fe-EDTA溶液配方為FeSO4 · 7H20 20 30克/升和EDTA 20 40克/升；A5溶液配方為H3BO3 2.5 4.0克/升， MnCl2 · 4H20 1.0 2.0 克 / 升，ZnSO4 · 7H20 0.1 0.6 克 / 升，CuSO4 · 5H20 5 10 克 / 升，N^MoO4 0.01 0.05 克 / 升；水。
在一個較佳的實施方案中，所述Endo培養基由以下成分組成葡萄糖40克/ 升，尿素 6.0 克 /升，KH2PO4 1.5 克/ 升，Na2HPO4 · 12H20 5.0 克 / 升，MgSO4 · 7H201.8 克/升，CaCl2 0.05克/升，檸檬酸三鈉0.4克/升，Fe-EDTA溶液0.8mL，A5溶液 2.0mL,其中Fe-EDTA溶液配方為FeSO4 · 7H20 25克/升和EDTA 33.5克/升，A5溶 液配方為 H3BO3 2.86 克 / 升，MnCl2 · 4H20 1.81 克 / 升，ZnSO4 · 7H200.222 克 / 升， CuSO4 · 5H20 0.07 克 / 升，N^MoO4 0.021 克 / 升;水。
在根據上述配方配製培養基後，可用常規手段如酸或鹼將所述培養基的pH調為 4.0 9.0，並在115 120°C下高壓滅菌15 20分鐘。可採用分批培養、補料分批培9養、半連續培養(帶放)或連續培養等四種方式實施異養培養。
當進行異養培養時，將相應配製好的培養基加入到生物反應器中，補加水至工 作體積，通常裝料係數為0.6 0.8，然後蒸汽滅菌(121°C，維持約20分鐘)，當溫度降 至30 35°C時，按工作體積的1 15%接入微藻開始異養培養。
無論採用何種培養方式，在培養過程中，須控制適合的培養條件使微藻正常生 長。通常，控制溫度為20 35°C，例如^ 30°C，溶氧不低於5%的空氣飽和濃度， pH不高於9.0。在優選的實施例中，溶氧不低於10%的空氣飽和濃度，pH不高於8.5。 在其它優選的實施例中，溶氧不低於15%的空氣飽和濃度，pH不高於8。
在培養過程中，pH不宜過高或過低，一般隨著培養的進行，pH會慢慢上升(對 於普通小球藻此現象特別明顯)，pH過高會對藻細胞生長產生不利影響，所以應用酸(例 如10%的硫酸)進行調節，使pH不高於9.0，較佳的pH應為6.5 7.5。
無論採用何種異養培養方式，轉入光誘導的藻液，在更佳的方案中應使藻液中 有機碳源例如葡萄糖含量為零或接近於零。
異養可以在搖瓶、機械攪拌式、氣升式、鼓泡式等可異養培養的生物反應器中 進行。
2.高濃度藻液的稀釋
此步驟的目的是為了使轉入光誘導培養的小球藻高效地吸收光能，提高光能利 用效率，同時降低藻細胞的死亡率。因為光強在藻液中呈「時、空、非線性」衰減，所 以在高細胞密度下，反應器中藻細胞大部分處於暗區，幾乎接受不到光照，這樣藻細胞 很容易死亡而且會影響光誘導的效率。
異養培養獲得的高密度藻液應進行稀釋操作，用水和不含有機碳源的培養基對 高密度的藻液進行稀釋，使細胞密度維持在0.1 10克/升，調節pH至5.0 8.0。在 其它實施例中，稀釋藻液，使細胞密度維持在1 8克/升。在優選的實施例中，使細 胞密度維持在1.0 5.0克/升。在其它實施例中，使細胞密度維持在2 5克/升或者 2 4克/升。稀釋的藻液的pH可以調節為5.5 7.5，例如6.0 7.5等。
可採用各種已知的稀釋培養基來稀釋藻液。通常，可使用光誘導培養基進行稀 釋。光誘導培養基通常含有氮源、無機鹽和水，相對於異養培養基不含有有機碳源。在 優選的實施方案中，所述培養基的氮源濃度為0.1 10克/升，較佳為0.3 6克/升， 更佳為0.5 5克/升。所述氮源可以與異養培養步驟中所用的氮源相同或不同。
在一個優選的具體方案中，異養培養獲得的高密度藻細胞宜用氮源濃度為0.1 10克/升而不含有機碳源的初始培養基(例如，培養普通小球藻時採用不含葡萄糖的 HA-SK培養基，培養蛋白核小球藻時採用不含葡萄糖的Endo培養基)進行適當稀釋。
稀釋採用的培養基無需高壓滅菌，配製好後調節pH至5.0 8.0即可使用。
在具體實施方式
中，對普通小球藻，稀釋培養基(光誘導培養基)由以下成分組 成KNO3 0.1 5 克 / 升、MgSO4 · 7H20、0.5 5.0 克 / 升、CaCl2 0.01 0.06 克 / 升、FeSO4 · 7H20 0.01 0.06 克 / 升、EDTA0.020 0.052 克 / 升。
對蛋白核小球藻，稀釋培養基(光誘導培養基)由以下成分組成尿素 0.1 5.0 克 / 升、MgSO4 · 7H20、0.5 5.0 克 / 升、CaCl2 0.01 0.06 克 / 升、 FeSO4 · 7H200.01 0.06、EDTA0.020 0.052 克 / 升、檸檬酸鈉 0.02 0.5 克 / 升。
3.光誘導培養
該步驟的目的是讓微藻接受光照，通過光誘導使藻細胞快速大量合成積累各種 活性成分。
如上所述高密度微藻培養液經稀釋後，將所得稀釋液轉入光誘導裝置中進行 光誘導培養。添加的光誘導培養基如上文所述，溫度控制在5 50°C，光照強度為 0.11 150klx，連續光照或間歇光照，光誘導培養周期為1 150小時，通氣量為0.1 2.0VVm。其中所述的光生物反應器包括所有的封閉式光生物反應器(搖瓶、管道式、平 板式、柱式、薄膜立袋與吊袋等)和所有的開放式光生物反應器(跑道池、圓池和鼓泡式 大盆等)。
通常，培養溫度可控制在15 ;35°C的範圍內，例如18 ;35°C、20 !35°C、 20 30°C等。通常，光照強度為1 70klx，例如，1 60、1 50、1 40、1 30、 1 20、1 IOklx等，可視具體生產情況而定。通常，通氣量可控制為0.15 2.0vvm， 例如，0.2 1.8、0.5 1.5、0.8 1.5、1.0 1.5vvm等。在其它實施方式中，培養溫 度控制在10 50°C，光照強度為1 lOklx，通氣量為0.05 2.0vvm。
在其它實施例中，光誘導培養周期為8 100小時，例如，根據實際的天氣情 況，光誘導培養周期可以為8 90小時、8 80小時、8 60小時、8 48小時、8 M小時不等；或者，光誘導培養周期可以為12 72小時、12 60小時、12 48小 時、12 36小時、12 M小時不等或M 60小時、M 48小時不等。
在本申請中，「光誘導培養周期」包括了整個光誘導培養過程，例如，戶外培 養時光誘導培養周期包括夜晚沒有光照的時間。
在本申請中，「光照時間」指使用本申請所述光照強度對微藻實施光誘導培養 的時間，即該時間不包括夜晚沒有光照的時間。在一些實施例中，光誘導培養步驟的光 照時間為8 48小時，例如8 36小時、8 M小時、8 18小時、8 12小時、 12 36小時、12 M小時不等，以及上述範圍內的任意時長。
因此，本申請的光誘導培養步驟也包括光照時間為8 48小時範圍內的光誘導 培養步驟。可採用人工光照的方式進行光誘導培養，也可在戶外利用自然光照的方式進 行光誘導培養。
在光誘導過程中，當油脂含量達到最高值(不同微藻油脂含量達到的最大值不 一樣，可通過測定光誘導過程中胞內油脂含量曲線判斷，小球藻一般為20 30%左右) 時可結束光誘導培養，收穫藻細胞進行後續的油脂的分離提取。
4.藻細胞採收、油脂的提取及藻體綜合利用
光誘導培養結束後，對小球藻進行離心採收，獲得溼藻體。藻細胞的採收方法 包括但不限於高速離心、絮凝，氣浮或過濾等技術；藻細胞破壁方法包括但不限於藻體 自溶、高壓勻漿、酶水解、水相熱解等溼法破壁方法。
胞內油脂的提取測定方法包括但不限於有機溶劑萃取法，即將藻體於80 105°C下乾燥至恆重，研磨藻粉後採用氯仿甲醇標準萃取溶劑從幹藻粉中提取油脂，萃取 溶劑反覆提取直至藻粉顏色變為白色，旋轉蒸發去除溶劑。
上清液中的其他成分可逐步分離提取獲得脂肪酸、葉綠素等，或直接將上清液 中的所有成分與藻體沉澱混合噴霧乾燥獲得小球藻粉。
本發明中，可對培養所得的微藻進行綜合利用，提取其中的色素、蛋白質、多 糖等各種活性成分。活性成分的提取順序並無特殊限制，但通常要滿足先提取的步驟不 能導致後提取的成分損失這一前提。
本文中涉及到藻細胞乾重、油脂含量及胞內生化成分的測定方法如下
藻細胞乾重測定在微藻(如小球藻)培養過程中取培養液V毫升，SOOOrpm離 心10分鐘，將離心後的藻體用去離子水洗滌3次，轉移至稱量瓶(W1 (克))中，在105°C 烘箱中烘乾至恆重W2 (克)。藻體乾重Cx可根據下式計算Cx (克/升)=(W2-W1) / V/1000。
油脂測定取一定量各培養階段烘乾至恆重的藻細胞，在研缽中研磨至粉末 狀，稱取適量藻粉(0.2 0.5g)小心轉移至離心管中，加入適量萃取溶劑(氯仿甲醇= 2 1)於超聲振蕩器中超聲振蕩30min，8000rpm離心lOmin，將上清轉移至已知重量的 乾燥旋轉蒸發瓶中，重複上述步驟直至上清無色。合併上清後旋轉蒸乾，稱重並計算油 脂含量。
油脂含量(％ )按下式計算
油脂(％) = (W2-W0) /W1XlOO
式中Wi——為藻粉重量，——為烘乾至恆重的旋轉蒸發瓶重量，g; W2—為油脂萃取液蒸乾後蒸發瓶的重量，g。
碳水化合物的測定參照藥典2005版，選擇蒽酮-硫酸顯色反應，採用無水葡 萄糖作為對照品，用比色法在625nm處測定。
蛋白質含量測定微藻(如小球藻)細胞中總蛋白質含量的測定採用凱氏定氮法 (寧正祥.食品成分分析手冊.北京中國輕工業出版社，1998，76-78)。
葉綠體色素含量測定微藻(如小球藻)葉綠體色素含量測定採用Lichtenthaler 等對 Arnon 法進行 了 修正後的方法(Lichtenthaler HK，Wellburn AR.Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts indifferent sovents.Biochemical Society Transactions, 1983，11 : 591 592)。
灰分測定微藻(如小球藻)灰分採用550 °C灼燒至恆重測量，即國標 GB6438-86 法。
與現有的能源微藻培養積累油脂的方法相比，本發明的方法具有以下優點可 在短時間內獲得高密度的微藻細胞，同時可在短時間內使微藻細胞內的油脂含量快速提 高。本發明將微藻培養合成油脂分成藻細胞生長和油脂合成積累兩個階段，即異養培養 和光誘導培養階段。異養培養微藻的目的是為了快速獲得大量的藻細胞，而光誘導培養 的目的是為了誘導微藻細胞快速合成積累大量的油脂，採用異養-稀釋-光誘導串聯培養 方式培養微藻提高了油脂的產率，一定程度上解決了能源微藻細胞生長和油脂合成不同 時進行的矛盾，大大降低了成本，為解決生物燃料規模化製備過程中由於原料不足而導 致的成本過高問題提供新的技術手段。
此外，本申請之前，本領域的普遍認識是只有通過光自養的模式才能夠利用微 藻來大規模生產油脂。然而，光自養培養與本發明的光誘導培養完全不同。光自養培養 中，培養基不含有有機碳源，微藻利用大氣中的co2、水、光、和少量無機營養鹽進行 光合自養，維持自身的生長，一般接種密度較低(0.1g/L左右)，生長慢(有時候為了促進生長，還需要在培養過程中人工通入CO2),培養周期長(一般要一周以上，戶外光自 養培養細胞密度難以達到較高水平)，尤其在大規模培養的時候，為了提供大規模培養所 需的接種藻液，種子擴培需要的時間很長(一般需要1-2個月)，生產效率很低。而本申 請的光誘導所用的培養基和光自養的培養基不一樣，由於異養階段藻液中含有豐富的無 機鹽和微量元素等營養成分，所以經過稀釋後，所需的光誘導培養基比光自養培養基要 簡單很多，例如和文獻上常見的微藻光自養培養基BG-Il相比，稀釋用的光誘導培養基 中不需要添加磷酸鹽、碳酸鈉、檸檬酸鐵銨以及微量元素，同時添加的硝酸鹽用量也比 光自養培養基用量要少很多。通過異養階段的培養，可以在短時間內積累大量藻細胞， 規模化培養時，通過稀釋後，進入光誘導的藻細胞密度(以小球藻為例，密度範圍在2 相/L左右)比光自養培養方式的接種密度要高20倍以上，很好的解決了光自養培養方 式接種密度低，種子擴培周期長等缺點，同時在較短時間的光照誘導周期內(一般8 M小時)，藻細胞密度幾乎維持不變(即它已經不再生長)，胞內油脂含量卻能夠快速積 累，含量成倍增長(由10%增加到20 30%左右)，這樣相對光自養而言，佔地面積大 大縮小，面積產率大幅提高，整個培養周期明顯縮短，採收成本降低，生產效率大大提 尚ο
以下將通過實施例對本發明的有關內容作進一步的說明。除非另有所述，本發 明採用的培養基中各組分含量均用克/升^/L)表示。應理解，本申請中「含有」、「包 含」也包括「由……組成」、「由……構成」的含義。
實施例1
在50L生物反應器中加入下述異養培養基和自來水至25L後滅菌，當溫度降至 30°C時按工作體積的12%接入蛋白核小球藻，開始異養培養。
異養培養條件溫度為30°C，初始轉速為150r/min，空氣流量為lvvm，pH小於8.0，培養過程中通過調節轉速控制溶氧15%以上。
將異養培養過程中葡萄糖耗完的高密度藻液稀釋到2.70g/L左右，並加入下述光 誘導培養基，轉入3L平板式光反應器中進行光誘導培養，溫度30°C，光強80001x，空氣 流量為lvvm。光誘導培養12h，細胞密度從2.70g/L降低到2.65g/L，油脂含量從9.70% 上升至19.70% (見圖1)。
異養培養基
葡萄糖60.0 克 尿素 8.0 克MgSO4 · 7H20 2.0 克
KH2PO4 1.1 克 N^HPO4 · 12H20 9.0 克 CaCl2 0.02 克
檸檬酸三鈉1.8克
Fe-EDTA 溶液 1.0ml 微量元素溶液 4.5ml 水 1000ml
其中Fe-EDTA溶液配方為FeSO4 · 7H20 15克/升和EDTA1.4克/升，微量元 素溶液配方為 H3BO3 2.11 克 / 升，MnCl2 · 4H20 0.81 克 / 升，ZnSO4 · 7H20 0.11 克 / 升，CuSO4 · 5H20 10.0 克 / 升，NaMoO4 0.05 克 / 升。
光誘導培養基
尿素0.5克 MgSO4 · 7H20 1.0克 檸檬酸三鈉0.05克
CaCl2 0.01 克 Fe-EDTA 溶液 0.4ml 水 IOOOml
其中Fe-EDTA溶液配方為15克/升和EDTA1.4克/升。13
實施例2
在5T發酵罐中加入異養培養基和自來水至2.5T後滅菌，當溫度降至30°C時， 以500L發酵罐作為種子罐培養的普通小球藻，培養過程中根據細胞生長情況、發酵液中 溶氧水平來調節罐壓、通氣量和攪拌轉速，維持培養液中充足的氧含量，確保藻細胞的 快速生長。
將前期補料分批異養培養過程中葡萄糖耗完的高密度藻液經光誘導培養基稀釋 後，轉至30L平板式光反應器及60L鼓泡式大盆中在戶外進行光誘導培養。光誘導培養 條件自然溫度，溫度在13 30°C，自然光照，光強在0 36klx(見圖2)，空氣流量 為lvvm。光誘導培養《ι後，30L平板式反應器中藻細胞密度從1.60g/L降低到1.46g/ L,油脂含量從7.87%上升至13.27%，後進入夜晚，整個晚上藻細胞密度從1.46g/L降低 至1.16g/L，降幅較白天明顯，油脂含量也有小幅下降，從13.27%下降至12.93%，第二 天白天經過4h的短暫光誘導後，藻細胞密度略有上升，從1.16g/L上升至1.18g/L，同時 油脂含量迅速上升，從12.93%升高至18.58% (見圖幻，圖4為60L鼓泡式大盆中光誘 導情況，數據顯示變化規律與30L平板式光反應器的規律相類似。
將半連續異養培養結束後的高密度普通小球藻藻液，經光誘導培養基稀釋後， 轉入3T跑道池及3.14m2斜葉攪拌式圓池在戶外進行光誘導培養。光誘導培養條件 較低自然溫度，溫度在5 18°C，自然光照，光強在0 34klx(見圖5)，空氣流量為 lvvm。因該批次5T發酵罐半連續培養結束時間在傍晚，所以藻細胞轉入光誘導後即進 入夜晚，光誘導階段共進行了 90h，前2天天氣晴好，但是氣溫較低，放入藻液的當晚， 最低氣溫只有5°C，後面兩天最高氣溫為14°C，第三天開始天氣轉陰有小雨，氣溫開始 小幅回升，第三天傍晚開始悶熱潮溼，整個晚上伴有雷陣雨，第四天上午陰有小雨，午 後雨停，結束培養並採收藻細胞。
由圖6、7可以看出，一方面由於氣溫較低，不利於藻細胞的生長代謝；另一方 面由於第三天開始陸續下雨，雨水稀釋了藻液，造成了大池內細胞內濃度下降，所以整 個光誘導過程藻細胞密度下降明顯。
由於接種後的前12小時，正好是晚上，光合作用不能進行，所以色素和碳水化 合物均大幅下降，油脂含量卻顯著升高，從12%升至18%左右，當晚戶外溫度較低， 低溫脅迫可能誘導藻細胞內油脂的合成積累，這也是藻細胞油脂代謝對外界環境變化的 一種響應機制。後面兩天溫度都較低，最高氣溫不超過14°C，藻細胞胞內成分沒有明 顯變化，第三天開始，雖然有雨水，但是氣溫顯著回升，並且悶熱潮溼，從實驗數據來 看，這種戶外實際氣候情況反而有利於光誘導過程藻體品質的提升，但是上升速度比較 緩慢。在整個90h的戶外光誘導過程中，儘管出現低溫、陰雨及雷雨天氣，但通過延長 光誘導時間，藻體的品質也能得到大幅提升，最終油脂含量均大幅提升至20%左右。
異養培養基
葡萄糖60.0克 硝酸鉀10.0克 MgSO4 · 7H20 0.2克
KH2PO4 0.3 克 Na2HPO4 · 12H20 8.8 克 CaC12 0.02 克
Fe-EDTA 溶液 1.0ml 微量元素溶液 3.5ml 水 1000ml
其中Fe-EDTA溶液配方為FeSO4 · 7H20 15克/升和EDTA 1.4克/升，微量元 素溶液配方為 H3BO3 2.86 克 / 升，MnCl2 · 4H20 0.11 克 / 升，ZnSO4 · 7H209.22 克 /升，CuSO4 · 5H20 1.00 克 / 升，(NH4)6Mo7O24 · 4H20 0.1 克 / 升，Co(NO3)2 · 6H200.9克/升。
光誘導培養基
硝酸鉀0.5 克 MgSO4 · 7H20 0.6 克
CaCl2 0.03 克 Fe-EDTA 溶液 1.5ml 水 IOOOml
其中Fe-EDTA溶液配方為8克/升和EDTA10.4克/升。
實施例3 異養-稀釋-光誘導串聯培養過程中橢圓小球藻主要生化成分變化規 律的研究
本實施例在500mL搖瓶/3L圓柱式光生物反應器水平測定橢圓小球藻異養_稀 釋-光誘導串聯培養過程中主要生化成分的變化。
採用與實施例1和2類似的方式以異養-稀釋-光誘導串聯培養技術培養橢圓 小球藻，500mL搖瓶，裝液量200mL，28°C, 150rpm,待藻細胞密度達到10g/L以上且 葡萄糖耗盡時，轉入3L圓柱式光生物反應器進行光誘導培養，藻細胞密度約2g/L，溫度 30°C,光強lOl^lx。異養和光誘導所採用的培養基和蛋白核小球藻的相應培養基一致。 異養結束時藻細胞內油脂含量為13.94%，轉入光誘導後12h，藻細胞油脂含量快速增加 到 23.91% (見圖 8)。
儘管上面已經描述了本發明的具體例子，但是有一點對於本領域技術人員來說 是明顯的，即在不脫離本發明的精神和範圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因 此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明範圍內的變動。
權利要求
1.一種快速積累微藻胞內油脂的方法，其特徵在於，該方法包括微藻的異養培養步 驟，將異養培養的微藻藻液稀釋後進行光誘導培養的步驟，以及任選的藻細胞採收、油 脂分離提取的步驟。
2.如權利要求1所述方法，其特徵在於，所述的微藻選自綠藻門小球藻屬中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，普通小球藻(Chlorella vulgaris), 橢 圓 小 球 藻(Chlorella ellipsoidea)，Chlorellaemersonii, Chlorella sorokiniana，Chlorella saccharophila, Chlorella regularis，Chlorella minutissima，Chlorella protothecoides, Chlorella zofingiensis, 以及綠藻門中的 Brachiomonas submarina， Chlamydobonas reinhardtii， Chlamydomonas acidophila, Haematococcus pluvialis, Haematococcus lacustris， Scenedesmus obliquus， Spongiococcum exetriccium, Tetraselmis suecica， Tetraselmis chuii， Tetraselmis tetrathele， Tetraselmis verrucosa, Micractinium pusillum ；娃藻 門 的 Cylindrotheca fusiformis, Nitzschia laevis，Nitzschia alba, Nitzschia fonticola，Navicula incerta，Navicula pelliculosa ；藍藻門的 Anabaena variabilis ；金藻門的 Poterioochromonas malhamensis ；甲藻門的 Amphidinium carterae, Crypthecodinium cohnii ；裸藻門的 Euglenagricilis;和紅藻門的 Galdieria sulphuraria。
3.如權利要求1-2中任一項所述的方法，其特徵在於，所述異養微藻的步驟包括在生 物反應器中進行異養培養在生物反應器中加入pH為4.0 10.0的培養基，按工作體積 的0.1 30%接入微藻藻種進行分批培養、補料分批培養、半連續培養或連續培養，培養 溫度為10 50°C，控制pH小於10.0，控制溶氧在以上。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於，所述藻液稀釋包括用培養基將 異養培養獲得的藻液稀釋至細胞密度為0.1 50克/升，所述培養基不含有機碳源，其 pH 為 4.0 10.0。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其特徵在於，所述光誘導培養包括將稀釋後 的藻液轉入光誘導裝置中進行光誘導，培養溫度為5 50°C，連續光照或間歇光照，光 照強度為0.1 150klx，光誘導培養周期為1 150小時。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其特徵在於，異養培養基由氮源、有機碳源 以及少量無機鹽、微量元素和水組成；光誘導培養基由氮源、無機鹽和水組成。
7.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其特徵在於，所述異養步驟在搖瓶、機械攪 拌式、氣升式或鼓泡式可異養培養的生物反應器中進行，所述光誘導培養步驟在搖瓶或 選自敞開式的跑道池或圓池、封閉式的平板式光生物反應器或管道式光生物反應器或柱 式光生物反應器或薄膜立袋與吊袋用於微藻光自養培養的裝置中進行，光源為自然光或 各種人工光。
8.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，當小球藻為普通小球藻時，異養所使用的 培養基基本上由以下成分組成KNO3 5 15克/升、葡萄糖10 60克/升、KH2PO4 0.3 0.9 克 / 升、Na2HPO4 · 12H20 1.0 10.0 克 / 升、MgSO4 · 7H200.2 1.0 克 / 升、CaCl2 0.05 0.3克/升、FeSO4 · 7H20 0.01 0.05克/升；微量元素0.5 4ml，其中微 量元素的組成為H3BO3 5 15克/升，ZnSO4 · 7H20 5.0 10.0克/升，MnCl2 · H2O 1.0 2.0 克 / 升，(NH4)6Mo7O24 · 4H20 0.5 1.5 克 / 升，CuSO4 · 5H201.0 2.0 克 / 升，Co(NO3)2 · 6H20 0.1 0.9 克 /升；/K。
9.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，當小球藻為蛋白核小球藻時，異養所使用 的培養基基本上由以下成分組成葡萄糖10 60克/升，尿素2 8克/升，KH2PO4 1 2 克 / 升，Na2HPO4 · 12H20 1.0 10.0 克 / 升，MgSO4 · 7H20 1 2 克 / 升， CaCl2 0.05 0.1克/升，檸檬酸三鈉0.1 2.0克/升，Fe-EDTA溶液0.5 lmL，A5 溶液1 5mL ；其中Fe-EDTA溶液配方為FeSO4 · 7H20 20 30克/升和EDTA20 40克/升；A5溶液配方為H3BO3 2.5 4.0克/升，MnCl2 · 4H20 1.0 2.0克/升， ZnSO4 · 7H20 0.1 0.6 克 / 升，CuSO4 · 5H20 5 10 克 / 升，Na2MoO4 0.01 0.05 克/升；水。
10.—種油脂生產方法，其特徵在於，所述方法包括異養培養微藻的步驟，將異養培 養的微藻藻液稀釋後進行光誘導培養的步驟，以及藻細胞採收、油脂分離提取的步驟。
全文摘要
本發明涉及一種快速積累微藻胞內油脂的方法，該方法包括異養培養、稀釋、光誘導培養、微藻採收以及油脂提取等步驟。採用本發明方法可充分發揮微藻在光誘導階段油脂快速積累的優勢，為解決生物燃料(如柴油、航空煤油等)規模化製備過程中由於原料不足而導致的成本過高問題提供重要的技術手段。
文檔編號C12R1/89GK102021208SQ20101054587
公開日2011年4月20日 申請日期2010年11月16日 優先權日2010年11月16日
發明者李元廣, 李淑蘭, 李際軍, 沈國敏, 王偉良, 範建華, 魏鴻剛, 黃建科 申請人:上海澤元海洋生物技術有限公司, 華東理工大學