一種誘導製備egcg酯酶及用該酶生產egc和沒食子酸的方法
2023-10-10 13:53:49 2
專利名稱：一種誘導製備egcg酯酶及用該酶生產egc和沒食子酸的方法
技術領域：
本發明屬酶的製備及酶的催化轉化領域，特別是涉及一種EGCG酯酶的誘導製備及用 該酶生產EGC和沒食子酸的方法。
技術背景茶兒茶素是茶葉中主要的生理活性成分，茶兒茶素由表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (epi-gallocatechin-3-gallate， EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(印icatechin-3-gallate， ECG)、 沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin-3-gallate， GCG)、表兒茶素(epicatechin，又名 cis-catechin， EC)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,又名cis-gallocatechin, EGC)等組成。兒茶素單體在抗氧化、清除自由基、抗腫瘤、抗突變、抗衰老、抗病毒、抗過敏、 抗菌消炎、增強免疫功能、抗輻射、降血壓、降血脂等方面均具有很高的活性，對預防和 治療惡性腫瘤、高血脂症、動脈硬化、腦血栓、糖尿病、肥胖病等均有良好作用。不同的茶兒茶素單體的生理活性有一定的差異，分離製備各種單體能充分利用各種兒 茶素具優勢的生理活性。另外，開發茶兒茶素新藥也要求單體的茶兒茶素。因而，分離純 化或者定向合成兒茶素單體，對擴大兒茶素的應用途徑和方式，為兒茶素在醫藥、保健、 食品、化妝品等工業上開拓新市場具有十分重要的意義。目前已有的獲得兒茶素單體的方法一般通過分離純化的技術方法。而就EGC而言， 在茶葉中含量較低，即使分離純化收率較高，產量仍然很低，導致異常短缺而價格昂貴。 因此，尋找一種能從那些量大且易得的原料生產EGC的方法就顯得十分迫切和必要。EGCG 是兒茶素中含量最高的組分，是EGC和沒食子酸形成的酯，因此如能通過水解反應將 EGCG水解成EGC和沒食子酸就可以達到上述目的，具有現實意義。但常規的酸或鹼水解 等化學方法，存在水解率極低，水解產物極不穩定或反應過程中極易被氧化等缺點。另外， 據文獻報導，豬肝酯酶不能水解EGCG，也未發現其它市售酯酶或脂肪酶能水解EGCG。 只有單寧酶(Tannase)可水解EGCG成非酯型兒茶素EGC，但是該酶產量少且價格高。黑麴黴C4印wg///^ m'gw)是一種好氣性、易培養、產多種複合酶的真菌，屬於半知 菌亞門、麴黴屬。黑麴黴能分泌多種水解酶，如蛋白酶、澱粉酶和酯酶等。黑麴黴生產的 酶製劑具有用量大、應用範圍廣、安全性好的特點，己愈來愈受到人們的重視，在工業上 具有重要作用。1987年，聯合國糧食及農業組織(FAO) /世界衛生組織(WHO) /食 品添加劑與汙染物聯合專家委員會(JECFA)批准黑麴黴可用於食品工業用酶製劑的生產
發明內容
本發明的目的是提供一種用於將茶葉中含量豐富的EGCG轉化成含量較少且價格昂貴 的EGC的酶水解方法，該方法操作簡單、轉化率高、產物穩定、環保，可以為工業化大 規模生產EGC單體和沒食子酸提供新的思路和途徑。本發明的一種誘導製備EGCG酯酶方法，包括下列步驟(1) 將黑麴黴種子培養基在25—30。C， 100—250 r/min條件下培養36小時；(2) 以4一10。/。接種量轉接至含EGCG的發酵培養基中，在25—30'C， 100—250 r/min 條件下培養72小時，過濾，離心得酶液。所述的黑麴黴是世界公認的食品工業用安全菌種； 所述的EGCG原料可以採用不同的純度； 所述的培養產酶過程是間歇式的、分批補料式或連續培養式。 本發明的一種利用EGCG酯酶生產EGC和沒食子酸的方法，包括下列步驟(1) 構建EGCG酶水解反應體系、酶液空白體系和底物空白體系；(2) 反應體系和空白體系在25—60'C,反應0—48小時或直至水解反應基本結束才停止；(3) 利用高效液相色譜(HPLC)和薄層層析(TLC)分析底物和產物。所述的EGCG酶水解反應體系是指EGCG底物、EGCG水解酶和pH3—7緩衝液體系； 所述的酶液空白體系是指EGCG水解酶和pH3—7緩衝液體系； 所述的底物空白體系是指EGCG底物和pH3 — 7緩衝液體系； 所述的TLC分析是正相矽膠板分析或反相矽膠板分析。本發明的有益效果-(1) 利用食品工業常用的黑麴黴(美國FDA認可的工業用安全菌種)發酵產酶，具有安全環保的優點；(2) 本方法操作簡單、產物穩定、轉化率高且可控性強；(3) 利用EGCG酯酶，可以為工業化大規模生產EGC單體這一醫藥中間體和具有廣泛工 業用途的沒食子酸提供新的思路和途徑。附圖加以說明
圖1是EGCG酶水解反應式；圖2是EGCG和EGC標準品的HPLC譜圖，圖中顯示EGC和EGCG的保留時間分別為 1.770 min禾口 2.211 min;圖3是酶解反應12 h後經稀釋的酶解液的HPLC譜圖，圖中顯示第2個峰(保留時間1.773 min)是EGC，第3個峰(保留時間2.216 min)是EGCG;圖4是酶解反應24 h後經稀釋的酶解液的HPLC譜圖，圖中顯示第2個峰為EGC，而EGCG 幾乎被完全水解。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而 不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定 的範圍。實施例11. 黑麴黴ATCC468卯的種子培養黑麴黴種子培養基1%葡萄糖，0.1%蛋白腖，0.05%擰檬酸，0.015% Tween 80， 2% Vogel'smediumN;以黑麴黴j^7^g,7/^ w/gw ATCC 468卯為生產菌種，在pH5.0， 30°C， 200 r/min條件下培養36小時。2. 黑麴黴發酵產酶黑麴黴產酶培養基1%葡萄糖，0.1%蛋白腖，0.05%檸檬酸，0.015% Tween 80， 2% Vogel's medium N，添加EGCG至終濃度2.5 g/L， pH5.0;以4%接種量，在30°C， 160 r/min 條件下培養72 h誘導產酶。過濾或離心收集的發酵清液就是EGCG水解酶液。實驗中以未 加EGCG的發酵培養為對照。3. EGCG的酶水解反應體系10g/LEGCG的底物2mL， EGCG水解酶液2mL， pH5.2的醋酸緩衝液2 mL; EGCG水解酶液空白體系pH5.2的醋酸緩衝液2 mL， EGCG水解酶液2mL， pH5.2 的醋酸緩衝液2mL;底物空白體系10g/LEGCG底物2mL，去離子水2mL， pH5.2的 醋酸緩衝液2mL。 40°C，振蕩反應24h，每6—12h取1次樣進行分析。4. 採用薄層層析和高效液相色譜分析方法來定性和定量分析EGCG、 EGC和沒食子酸的 濃度。薄層層析條件用乙酸乙酯以l:l (v/v)的比例萃取酶水解液3次；將乙酸乙酯萃取 液經旋蒸濃縮至幹後再用甲醇溶解；層析液U0mL)採用80%二氯甲烷+20%甲醇+2滴水 +1滴冰醋酸；樣品展開後用硫酸鈰顯色劑顯色。高效液相色譜條件在配備色譜柱Phenomenex Luna C18 (150 mmX4.60 mm， 5 pm) 或C8柱的液相色譜儀上進行分析，分析條件流動相為乙腈-水-磷酸緩衝液(pH3.5) (30:70:0.5， v/v),檢測波長為270nm，流速為1.0 mL/min。實施例21. 黑麴黴MC57的種子培養黑麴黴種子培養基1%葡萄糖，0.1%蛋白腖，0.05%檸檬酸，0.015% Tween 80， 2% Vogel's medium N;以黑麴黴爿jp^g/〃w "&er MC 57為生產菌種，pH5.0, 30°C， 200 rpm 培養36小時。2. 黑麴黴發酵產酶黑麴黴產酶培養基1%葡萄糖，0.1%蛋白腖，0.05%擰檬酸，0.015% Tween 80， 2% Vogel，s mediumN，添加EGCG至終濃度5.0 g/L， pH5.0;以8%接種量，在30°C ， 160 r/min 條件下培養72 h誘導產酶。過濾或離心收集的發酵清液就是EGCG水解酶液。實驗中以未 加EGCG的發酵培養為對照。3. EGCG的酶水解反應體系15 g/L EGCG底物2 mL， EGCG水解酶液2 mL， pH5.2的醋酸緩衝液2 mL; EGCG水解酶液空白體系pH5.2的醋酸緩衝液2 mL， EGCG水解酶液2 mL， pH5.2的醋 酸緩衝液2mL;底物空白體系15g/LEGCG底物2mL，去離子水2 mL， pH5.2的醋酸 緩衝液2mL。 40°C，振蕩反應24h，每6—12h取1次樣進行分析。4. 採用薄層層析和高效液相色譜分析方法來定性和定量分析EGCG、 EGC和沒食子酸的 濃度，分析條件詳見實施例l。實施例31. 黑麴黴ATCC 46890的種子培養黑麴黴種子培養基1%葡萄糖，0.1%蛋白腖，0.05%檸檬酸，0.015% Tween 80， 2% Vogd's medium N;以黑麴黴^f/^《/〃附"&w ATCC 46890為生產菌種，在pH5.0， 30°C, 200 r/min條件下培養36小時。2. 黑麴黴發酵產酶黑麴黴產酶培養基1%葡萄糖，0.1%蛋白腖，0.05%擰檬酸，0.015% Tween 80， 2% Vogel's medium N，添加EGCG至終濃度10.0 g/L， pH5.0;以8%接種量，在30°C， 130 r/min
條件下培養72 h誘導產酶。過濾或離心收集的發酵清液就是EGCG水解酶液。實驗中以未 加EGCG的發酵培養為對照。3. EGCG的酶水解 —反應體系30 g/L EGCG底物2 mL， EGCG水解酶液2 mL， pH5.2的醋酸緩衝液2 mL; EGCG水解酶液空白體系pH5.2的醋酸緩衝液2 mL， EGCG水解酶液2mL， pH5.2的醋 酸緩衝液2mL;底物空白體系30 g/L EGCG底物2 mL，去離子水2 mL, pH5.2的醋酸 緩衝液2mL。 40°C，振蕩反應24h,每6 12h取l次樣進行分析。4. 採用薄層層析和高效液相色譜分析方法來定性和定量分析EGCG、 EGC和沒食子酸的 濃度，分析條件詳見實施例l。實施例41. 黑麴黴MC.57的種子培養黑麴黴種子培養基1%葡萄糖，0.1%蛋白腖，0.05%檸檬酸，0.015% Tween 80， 2% Vogel，s medium N;以黑麴黴^perg/〃w;y "/ger MC 57為生產菌種，pH5.0， 30°C， 200 rpm 培養36小時。2. 黑麴黴發酵產酶黑麴黴產酶培養基1%葡萄糖，0.1%蛋白腖，0.05%檸檬酸，0.015% Tween 80， 2% Vogel，s mediumN，添加EGCG至終濃度12.0 g/L， pH5.0;以8%接種量，在30°C， 130r/min 條件下培養72h誘導產酶。過濾或離心收集的發酵清液就是EGCG水解酶液。實驗中以未 加EGCG的發酵培養為對照。3. EGCG的酶水解反應體系20 g/L EGCG底物2 mL， EGCG水解酶液2 mL， pH5.2的醋酸緩衝液2 mL; EGCG水解酶液空白體系pH5.2的醋酸緩衝液2 mL， EGCG水解酶液2mL， pH5.2的醋 酸緩衝液2mL;底物空白體系20g/LEGCG底物2mL，去離子水2mL， pH5.2的醋酸 緩衝液2 mL。 40°C ，振蕩反應24 h,每6--12 h取1次樣進行分析。4. 釆用薄層層析和高效液相色譜分析方法來定性和定量分析EGCG、 EGC和沒食子酸的 濃度，分析條件詳見實施例l。根據實施例1至實施例4的高效液相色譜和薄層層析分析結果比較可知，黑麴黴可通 過在培養基中添加EGCG誘導產生酯酶，將EGCG轉化為EGC和沒食子酸;而未加EGCG 誘導劑的發酵液卻沒有水解EGCG的酯酶活力。
權利要求
1.一種誘導製備EGCG酯酶方法，包括下列步驟(1)將黑麴黴種子培養基在25-30℃，100-250r/min條件下培養36小時；(2)以4-10％接種量轉接至含EGCG的發酵培養基中，在25-30℃，100-250r/min條件下培養72小時，過濾，離心得酶液。
2. 根據權利要求1所述的一種誘導製備EGCG酯酶方法，其特徵在於所述的黑麴黴是 食品工業用安全菌種。
3. 根據權利要求1所述的一種誘導製備EGCG酯酶方法，其特徵在於所述的EGCG原 料採用不同的純度。
4. 根據權利要求1所述的一種誘導製備EGCG酯酶方法，其特徵在於所述的培養產酶 過程是間歇式的、分批補料式或連續培養式。
5. —種利用EGCG酯酶生產EGC和沒食子酸的方法，包括下列步驟(1) 構建EGCG酶水解反應體系、酶液空白體系和底物空白體系；(2) 反應體系和空白體系在25—6(TC，反應0—48小時或直至水解反應結束才停止；(3) 利用高效液相色譜和薄層層析分析底物和產物。
6. 根據權利要求5所述的一種利用EGCG酯酶生產EGC和沒食子酸的方法，其特徵在於 所述的EGCG酶水解反應體系是EGCG底物、EGCG水解酶和pH3—7緩衝液體系，酶液 空白體系是EGCG水解酶和pH3—7緩衝液體系，底物空白體系是EGCG底物和pH3 —7 緩衝液體系。
7. 根據權利要求5所述的一種利用EGCG酯酶生產EGC和沒食子酸的方法，其特徵在於-所述的薄層層析分析是正相矽膠板分析或反相矽膠板分析。
全文摘要
本發明涉及一種用表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)誘導黑麴黴產EGCG酯酶，包括(1)將黑麴黴種子培養基在25-30℃，100-250r/min條件下培養36小時；(2)以4-10％接種量轉接至含EGCG的發酵培養基中，在25-30℃，100-250r/min條件下培養72小時，過濾，離心得酶液；用該酶將EGCG水解轉化為表沒食子兒茶素(EGC)和沒食子酸，包括(1)構建EGCG酶水解反應體系、酶液空白體系和底物空白體系；(2)反應體系和空白體系在25-60℃，反應0-48小時或直至水解反應基本結束才停止；(3)利用高效液相色譜和薄層層析分析底物和產物。本發明EGC轉化率和得率高，產物穩定易分離，且安全環保，操作簡單，可控性強，適合工業化大規模生產。
文檔編號C12R1/685GK101113411SQ200710042829
公開日2008年1月30日 申請日期2007年6月27日 優先權日2007年6月27日
發明者楓 洪, 坤 鍾 申請人:東華大學