一種肺炎支原體的滾環恆溫擴增快速檢測引物及試劑盒的製作方法

2023-10-10 13:34:44 1

本發明屬於微生物檢測領域，尤其涉及一種肺炎支原體的滾環恆溫擴增快速檢測引物及試劑盒。

背景技術：

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是呼吸道感染最常見的致病菌之一。我國流行病學調查顯示，Mp已成為我國成人社區獲得性肺炎的首要致病菌。Mp感染不但可引起呼吸道疾病，還可引起全身多器官病變，如腦炎、心肌炎、肝炎、腎炎、免疫溶血性貧血等，而且近些年來Mp引起的危重病例不斷增多。由於Mp缺乏細胞壁，對常用抗生素如β-內醯胺類等藥物的治療，效果不明顯。

現有醫學領域對Mp的檢測手段為：肺炎支原體培養、肺炎支原體核酸PCR擴增和血清學檢測（lgM和lgG），這些方法耗時長、需要特殊的儀器、並且成本高。因此，亟需研究一種可以快速、準確的判斷出Mp感染的方法，然後合理並具有針對性的選擇抗生素進行臨床治療，及時控制感染。

技術實現要素：

為了解決現有技術存在的問題，本發明提供一種肺炎支原體滾環恆溫擴增快速檢測引物及試劑盒，利用滾環恆溫擴增（RCA）技術可進行菌樣的快速、高準確度檢測。

為了實現上述目的，本發明提供一種用於檢測肺炎支原體的引物，是根據肺炎支原體P1基因的特異性保守靶序列設計的，所述引物由四條引物組成，包括前端內引物SIP，後端內引物ASIP，外引物S和AS；其中S引物位於SIP上遊，AS引物位於ASIP下遊；在帶有鏈置換功能的Bst DNA聚合酶作用下，四條引物以肺炎支原體基因組DNA為模板，擴增出一條單鏈DNA目標模板。單鏈DNA目標模板在橋引物BP的幫助下，被DNA連接酶連接環化，通過與環化DNA目標模板互補的橋引物BP，啟動肺炎支原體基因組DNA滾環複製，每一輪滾環複製的產物又可以被DNA連接酶連接環化，產生級聯放大的循環擴增。

所述的肺炎支原體的滾環恆溫擴增快速檢測引物的核苷酸序列如下。

外引物S：SEQ ID NO：2： CGC TGC GCC ACA CCA ATG。

外引物AS：SEQ ID NO：3：AGC GGC TTT GAC CGC ATC。

內引物SIP：SEQ ID NO：4： TGA ATC CGT TAG TTT TTC TCC CGC TCT CCC AAC CCG CGC TTA ACC CCG TG。

內引物ASIP：SEQ ID NO：5： AAT AAG GAG GCG GCT GCT GGT CGG GTG GGA TCA TAC GTG GT。

橋式引物BP：SEQ ID NO：6：CTAACGGATTCAAATAAGGAGG。

為實現上述目的，本發明還提供一種肺炎支原體的滾環恆溫擴增快速檢測試劑盒，包括如下組分：10×Bst DNA聚合酶緩衝液（NEB）；MgSO4 (100 mM)；10× DNA連接酶緩衝液（Thermo）；dNTP(10mM each)；外引物S（10 µM）；外引物AS（10µM）；內引物SIP（10µM）；內引物ASIP（10µM）；橋式引物BP（10µM）；肺炎支原體基因組DNA（10 ng/µl）；Bst DNA聚合酶大片段(NEB，1600 U/mL)；DNA連接酶(Thermo，1000 U/mL)；25×鈣黃綠素指示劑（鈣黃綠素625µM、MnCl2 10 mM）和水。

上述試劑盒應用於臨床樣品肺炎支原體檢測，其使用方法依次包括如下步驟。

1、提取肺炎支原體的基因組 DNA。

2、按試劑盒配方，製作肺炎支原體滾環擴增檢測反應體系。

3、反應結束後進行結果判定：在反應液中加入鈣黃綠素指示劑（終濃度25µM 鈣黃綠素和400µM MnCl2），顏色變為綠色，表示待測樣品中存在肺炎支原體（結果陽性），顏色不變，表示待測樣品中不存在肺炎支原體（結果陰性）。

所述的提取肺炎支原體的基因組DNA 的OD260/OD280 在1.6-2.0範圍內，濃度在10ng/μL-100ng/μL 範圍內。

所述的提取肺炎支原體的基因組DNA 的OD260/OD280優選1.8。

本發明的有益效果。

滾環擴增（rolling circle amplification，RCA）是最新發展起來的一種恆溫核酸擴增方法。以環狀DNA為模板，通過一個短的DNA引物，在酶催化下將dNTPs轉變成單鏈DNA，此單鏈DNA包含成百上千個重複的模板互補片段。這種方法不僅可以直接擴增DNA和RNA，還可以實現對靶核酸的信號放大，靈敏度達到一個拷貝的核酸分子，因此在核酸檢測中具有很大的應用價值和潛力。因此，本發明所提供的檢測試劑盒針對肺炎支原體，採用了用於滾環恆溫擴增反應的特異性引物，該試劑盒檢測Mp的方法具有以下優勢：（1）通過4條引物的6個特異性區域，對檢測靶序列進行特異性識別，實現很好的檢測特異性；（2）通過橋引物使檢測靶序列環化，與AIP/ASIP引物共同實現靶序列級聯擴增的信號放大效果，靈敏度高；（3）反應過程只需要65攝氏度的恆溫進行即可，簡單易用，操作方便。

本發明檢測試劑盒中的序列是通過大量的實驗設計出來的新基因序列，在現有的基因庫中並未公開。同時，橋式引物BP可以將AIP/ASIP引物合成的產物連接環化，對形成級聯擴增具有重要作用。

本發明可以用於肺炎支原體肺炎的快速檢測，為臨床的早期診斷和治療提供保證，實現了快速、準確、便捷及低成本檢測的重要價值。目前，國內未見有用於檢測肺炎支原體的滾環擴增檢測試劑盒及其專用引物。

具體實施方式

下列結合具體實施例對本發明做進一步說明。

實施例1。

對肺炎支原體標準菌株（ATCC 15531）的檢測從 NCBI 的核酸資料庫 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 檢索獲得肺炎支原體 P1 基因 (GenBank 號 ：CP002077.1)，通過 BLAST 軟體進行同源性分析，獲得肺炎支原體P1基因的特異性保守靶序列SEQ ID NO：1：TCG CGC TGC GCC ACA CCA ATG CCA TCA ACC CGC GCT TAA CCC CGT GAA CGT ATC GTA ACA CGA GCT TTT CCT CCC TCC CCC TCA CGG GTG AAA ATC CCG GGG CGT GGG CCT TAG TGC GCG ACA ACA GCG CTA AGG GCA TCA CTG CCG GCA GTG GCA GTC AAC AAA CCA CGT ATG ATC CCA CCC GAA CCG AAG CGG CTT TGA CCG CAT CAA。

根據該保守靶序列設計（可以找到對應的序列，通過與靶序列比對設計）滾環擴增引物：外引物S：SEQ ID NO:2：CGC TGC GCC ACA CCA ATG；外引物AS: SEQ ID NO:3：AGC GGC TTT GAC CGC ATC；內引物SIP：SEQ ID NO:4: TGA ATC CGT TAG TTT TTC TCC CGC TCT CCC AAC CCG CGC TTA ACC CCG TG；內引物ASIP：SEQ ID NO:5: AAT AAG GAG GCG GCT GCT GGT CGG GTG GGA TCA TAC GTG GT。；橋式引物BP：SEQ ID NO:6: CTA ACG GAT TCA AAT AAG GAG G。

上述肺炎支原體的滾環恆溫擴增快速檢測試劑盒，包括如下組分：10×Bst DNA 聚合酶緩衝液(200 mM Tris-HCl、100 mM (NH4)2SO4、100 mM KCl、20 mM MgSO4、1% Triton® X -100)；MgSO4(100 mM)；10×DNA連接酶緩衝液（400 mM Tris-HCl、100 mM MgCl2、100mM DTT、 5mM ATP）；dNTP(10mM each)；外引物S（10 µM）；外引物AS（10µM）；內引物SIP（10µM）；內引物ASIP（10µM）；橋式引物BP（10µM）；肺炎支原體基因組DNA（10 ng/µl，每次用量1µl）；Bst DNA聚合酶大片段(NEB 1600 U/mL)；DNA連接酶(Thermo 1000 U/mL)；25×鈣黃綠素指示劑（鈣黃綠素625µM、MnCl2 10 mM）和水。

檢測方法包括以下步驟。

1、待檢測樣品DNA模板的提取：採用的支原體DNA提取試劑盒，提取待檢樣品DNA：OD260/OD280 在1.6～2.0範圍內（1.8為最佳值）， 濃度在10ng/μL～100ng/μL 範圍內。

2、將待檢測樣品DNA模板按配方將各組分加到同一個PCR管中，用移液器輕輕吹打3次混勻，在恆溫水浴鍋或者恆溫器中，溫度控制在65℃條件下，擴增1小時，反應體系中各成分用量如下。

10× Bst DNA聚合酶緩衝液 2µl、10×DNA連接酶緩衝液2µl、MgSO4（100 mM）2µl、dNTP(10mM each) 1µl、外引物S（10µM）1µl、外引物AS（10µM）1µl、內引物SIP （10µM）2µl、內引物ASIP（10µM）2µl、橋式引物BP（10µM）2µl、肺炎支原體基因組DNA 1µl、Bst 聚合酶大片段 (NEB 1.6 U/ul) 1µl、DNA連接酶(1 U/ul) 0.5µl、H2O 2.5µl。

3、反應結果判定：滾環恆溫擴增反應產物通過鈣黃綠素指示劑進行檢測（核酸擴增過程會形成大量焦磷酸根離子，螢光燃料中的錳離子與鈣黃綠素結合導致螢光猝滅，同時燃料顏色為橙色，當擴增反應形成焦磷酸根離子時，錳離子與焦磷酸根離子結合形成焦磷酸錳，引起螢光信號的產生，同時染料顏色變為黃綠色），反應結束後加入鈣黃綠素指示劑（終濃度25µM 鈣黃綠素和400 µM 氯化錳溶液）。顏色變為綠色，表示待測樣品中肺炎支原體陽性，顏色不變，表示待測樣品中肺炎支原體陰性。

1.對實施例1中肺炎支原體檢測方法的靈敏度檢測。

將總量為106拷貝的肺炎支原體基因組DNA進行1：10梯度稀釋，獲得含1個至105個基因組DNA拷貝的獨立樣品，用本試劑盒按實例1中方法進行檢測。陰性對照不含肺炎支原體基因組DNA。檢測結果：從含10個拷貝的樣品起，可觀察到綠色的產生，該綠色隨樣品中基因組DNA拷貝數的增加而增加，表明本發明方法可以實現10個拷貝肺炎支原體基因組DNA的檢測靈敏度。

2.對實施例1中肺炎支原體檢測方法的準確性檢測。

通過對比實施例1與已有商品化DNA檢測試劑盒對肺炎支原體的檢測，進行實施例1的準確性檢測。作為對照使用的商品化DNA檢測試劑盒從北京藍譜公司採購，為LAMP DNA擴增試劑盒，肺炎支原體檢測擴增引物參考中國專利「用於檢測肺炎支原體的LAM P試劑盒及其專用引物」（專利號CN201510666616.7）獲得。通過對8個臨床樣品的檢測發現，本發明方法與已商品化的檢測試劑盒獲得一致的檢測結果，表明本方法的檢測結果準確性高。

本發明的引物和試劑盒還可以對痰液、咽試紙等其它的樣品進行肺炎支原體的檢測。

序列表

＜110＞瀋陽優寧生物科技有限公司

＜120＞一種肺炎支原體的滾環恆溫擴增快速檢測引物及試劑盒

＜160＞6

＜210＞1

＜211＞210

＜212＞DNA

＜213＞肺炎支原體P1基因的特異性保守靶序列

＜400＞1

tcgcgctgcg ccacaccaat gccatcaacc cgcgcttaac cccgtgaacg tatcgtaaca 60

cgagcttttc ctccctcccc ctcacgggtg aaaatcccgg ggcgtgggcc ttagtgcgcg 120

acaacagcgc taagggcatc actgccggca gtggcagtca acaaaccacg tatgatccca 180

cccgaaccga agcggctttg accgcatcaa 210

＜210＞2

＜211＞18

＜212＞DNA

＜213＞外引物S

＜220＞

＜223＞

＜400＞2

cgctgcgcca caccaatg 18

＜210＞3

＜211＞18

＜212＞DNA

＜213＞外引物AS

＜220＞

＜223＞

＜400＞3

agcggctttg accgcatc 18

＜210＞4

＜211＞50

＜212＞DNA

＜213＞內引物SIP

＜220＞

＜223＞

＜400＞4

tgaatccgtt agtttttctc ccgctctccc aacccgcgct taaccccgtg 50

＜210＞5

＜211＞35

＜212＞DNA

＜213＞內引物ASIP

＜220＞

＜223＞

＜400＞5

aataaggagg cggctgctgg tcgggtggga tcatacgtgg t 41

＜210＞6

＜211＞22

＜212＞DNA

＜213＞橋式引物BP

＜220＞

＜223＞

＜400＞6

ctaacggatt caaataagga gg 22