一種快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗的螢光定量pcr試劑盒及應用的製作方法
2023-10-10 11:55:44
專利名稱：一種快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗的螢光定量pcr試劑盒及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒苗的螢光定量PCR試劑盒，適用於豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒苗的定量檢測以及疫苗質量時實監控，還涉及在檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒苗中的用途。
背景技術：
豬瘟是豬的一種高度接觸性傳染病，常給養豬業造成嚴重的經濟損失。目前，疫病的早期特異性診斷、染疫動物的撲殺和疫苗接種是有效預防控制豬瘟的重要手段。
傳統的豬瘟檢測方法主要包括病毒的分離和生物學試驗、電鏡技術、免疫螢光技術、補體結合試驗、核酸雜交、聚丙烯醯胺凝膠電泳等，這些方法在病毒病診斷和進出口檢驗檢疫中起了重要作用，但普遍存在著明顯的不足，諸如周期長，操作繁瑣，特異性和敏感性差，不規範，不適用於大批量檢測，給豬瘟的檢測帶來巨大困難。
中國豬瘟兔化弱毒疫苗(Hog Cholera Lapinized Virus，HCLV)以其具有誘生免疫反應快，對種豬、乳豬無殘餘毒力，免疫豬可抵抗豬瘟強毒株的攻擊等特點，成為國際上公認的最安全有效的弱毒疫苗。多年來，在國內外被廣泛應用，對豬瘟的控制起到了重要的作用(王家富，張楚瑜，傅烈振，等.中國豬瘟兔化弱毒NS2-3基因的序列分析[J]。病毒學報，2000，16150-154.)。
疫苗效價的高低是疫苗合格與否的關鍵指標。HCLV在細胞中的增殖力較弱，不產生致細胞病變，對其效價的測定一直沿用兔體定型熱反應法(中華人民共和國農業部，中華人民共和國獸用生物製品規程[S].2000年版.)。但該法存在的突出不足是不能準確定量；測毒結果易受兔體個體差異和天氣條件影響；實驗周期長、費時費力。因此，如何快速、準確測定疫苗效價是豬瘟疫苗生產中面臨的主要難題之一。據報導，採用微量細胞培養ELISA(杜念興，豬瘟的回顧與展望[J].中國畜禽傳染病，1998，20317-319)和反向間接血凝實驗(李寶臣，郭興福，韓正博，等.運用反向間接血凝方法對豬瘟細胞毒原液效檢試驗[J].黑龍江畜牧獸，1999，546-46.)測定HCLV效價，可相應縮短檢測時間，降低生產成本，但仍不能對毒價準確定量，而且目前也沒有在生產實踐中普遍應用。
近年來發展起來的螢光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，FQ-PCR)技術以其靈敏度高、速度快、特異性強等優點在基因表達水平分析(Nellemann C，Vinggaard AM，Dalgaard M，et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determinedby LightCycler Technology[J].Toxicology，2001，16329-38)、病原體的定性(McGoldrick A，Lowings JP，Ibata G，et al.A Novel Approach to the Detection ofClassical Swine Fever Virus by RT-PCR with a Fluorogenic Probe(TaqMan)[J].J.Virol.Methods，1998，72125-135.；Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCRassay(TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J]Vet.Microbiol.，2001，831-10.)和定量檢測(Desire N，Dehee A，Schneider V，et al.Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral Load by a TaqManReal-Time PCR Assay[J].J.Clin.Microbiol，2001，391303-1310.；Martell M，Gomez J，Esteban JI，et al.High-Throughput Real-Time Reverse Transcription-PCRQuantitation of Hepatitis C Virus RNA[J].J.Clin.Microbiol，1999，37327-332.；Keams AM，Turner AJL，Eltringham GJA，et al.Rapid Detection and Quantificationof CMV DNA in Urine using Lightcycler-based Real-time PCR[J].J.Clin.Virol，2002，24131-134；Florence KP，Glaucia PB，Mireille S，et al.Quantitation of HCVRNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods，2001，95111-119.)等方面得到廣泛應用，並且已經成為當前病毒核酸定量主要方法以，國內目前也已有關於C肝、B肝、支原體、愛滋病、結核定量檢測的試劑盒上市。
發明內容
本發明的目的在於提供一種快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗的螢光定量PCR試劑盒，該PCR試劑盒不僅可使用目前存在市場上的所有類型螢光定量儀器，更重要的是能快速地對豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗進行定量檢測。
本發明的另一個目的是提供一種螢光定量PCR試劑盒在對豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗進行定量檢測中的應用。
為了實現上述目的，本發明要用以下技術措施一種快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗的螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括a)RNA裂解液，b)逆轉錄酶，c)RNA酶抑制劑，d)Taq DNA聚合酶，e)標準陽性模板，f)逆轉錄反應液和g)螢光定量反應液，其特徵是f)逆轉錄反應液含有正向引物PF為5』-TAGCCATGCCCATAGTAGG-3』(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列，g)螢光定量反應液含有引物和螢光探針，引物為正向引物和反向引物，分別為5』-TAGCCATGCCCATAGTAGG-3』(SEQ ID NO1)和5』-ATCAGGTCGTACTCCCATCAC-3』(SEQ ID NO2)所示的核苷酸序列，螢光探針為5』-TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGA-3』( SEQID NO3)所示的核苷酸序列，螢光探針5』端標記的螢光報告基團是FAM，3』端標記的螢光受體基團為ROX，e)標準陽性模板pGS是含有豬瘟兔化弱毒株5』端400個核苷酸片段構成的pGEM-T載體，且該載體可在大腸桿菌DH5α中增殖。
在本發明的一個優選方案中，逆轉錄反應液是由正向引物(SEQ ID NO1)，RT5×buffer溶液，dNTPs溶液和無菌雙蒸水組成，在本發明的一個具體方案中，逆轉錄反應液是10μmol/L正向引物(SEQ ID NO1)3μl，RT5×buffer 10μl，10mmol/LdNTPs 5μl，逆轉錄酶1μl，RNA酶抑制劑1μl，滅菌雙蒸水10μl。
在本發明的一個優選方案中，螢光定量反應液是由正向引物(SEQ ID NO1)和反向引物(SEQ ID NO2)，螢光探針FP，PCR 10×buffer溶液，MgCl2溶液，dNTPs溶液，Taq DNA聚合酶和無菌雙蒸水組成；在本發明的一個具體方案中，螢光定量反應液由PCR 10×buffer 2μl，10μmol/L正向引物(SEQ ID NO1)和反向的引物(SEQ ID NO2)各0.5μl，lμmol/L螢光探針1μl，25mmol/L MgCl23.6μl，10mmol/L dNTPs 0.4μl，3U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，無菌雙蒸水9.5μl組成。其中螢光探針為SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，螢光探針5』端標記的螢光報告基團是FAM，3』端標記的螢光受體基團為ROX。
在本發明的一個優選方案中，標準陽性模板是含有豬瘟兔化弱毒株5』端400個核苷酸片段構成的pGEM-T載體，且該載體可在大腸桿菌DH5α中增殖。貯存濃度為5×1010拷貝/μl，使用前系列稀釋。實驗所用的標準品為含有目的擴增片段的質粒pGS，該質粒轉化大腸桿菌DH5α增殖後用鹼裂解法提取，經DNA純化試劑盒純化，用分光光度計測A260定量並稀釋至5×1010拷貝/μl，-20℃保存。
在本發明提供檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗的螢光定量PCR試劑盒中，有一條兩端標記有螢光基團的特異性螢光探針，在探針完整時，兩基團在空間結構上距離相互靠近，5』端報告基團產生的螢光因為螢光共振能量轉移(FRET)而被3』端淬滅基團淬滅，故體系中沒有螢光信號的變化。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結合，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5』-3』外切活性對探針進行切割釋放出報告基團，這樣破壞了兩基團之間的FRET，報告基團所釋放的螢光可以被內置在定量檢測儀內的螢光計檢測，螢光量的增加與PCR產物的積累量呈比例關係。對HCLV的定量可通過與標準品的循環域值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，螢光量的積累超過基底螢光量的循環圈數，Ct值與起始模數呈一定比例關係，Ct值越小，起始模板數越多，相反，Ct值越大，起始模板數越少。利用陽性梯度標準模板的Ct值製成標準曲線，再根據待測樣品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數。
在本發明提供檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗的螢光定量PCR試劑盒中，針對豬瘟兔化弱毒疫苗檢測中的特殊性，對不同的靶片段進行反應體系，如引物和探針濃度、Mg2+濃度、退火溫度等的優化，並將FQ-PCR技術和定量檢測系統(包括LigthCycler系統，Roche；ABI Prism系統，PE Applied Bioasystems；)相結合，將其用於豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗的定量檢測。通過優化方案，反覆實驗，以及與傳統兔體定型熱反應法進行比較，建立了定量檢測HCV和HCLV方法，並研製出豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒苗定量檢測的試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個反應體系中檢出200Copies，完全可以滿足豬瘟病毒的快速特異性檢測和檢測豬瘟兔化弱毒疫苗是否合格的要求。
在本發明的另外一個方面，還提供了使用本發明的試劑盒對豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗進行檢測的方法，該方法包括下列步驟A)用e)標準陽性模板製備陽性標準品，並用紫外分光光度計定量；B)用a)RNA裂解液從待測標本中提取RNA，然後加b)逆轉錄酶，c)RNA酶抑制劑和f)逆轉錄反應液逆轉錄成cDNA；C)分別取B)步中的cDNA和同樣量的系列稀釋的A)步中的陽性標準品加入到含d)Taq DNA聚合酶和g)螢光定量反應液的PCR反應體系中用螢光定量檢測儀進行PCR檢測；
D)通過比較待測樣品和標準品的循環域值而對待測樣品的起始拷貝數進行定量。
在本發明中提供的檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗的螢光定量PCR試劑盒可對豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗進行定量檢測以及疫苗質量的時實監控，並可替代一直沿用的豬瘟病毒傳統檢測方法和豬瘟兔化弱毒疫苗檢測的兔體定型熱反應法。
本發明與現有技術相比具有以下優點和效果1、定量準確；2、檢測速度快，僅1小時，加上核酸的提取和cDNA的製備，共僅需3-4小時；3、步驟簡單；4、可同時進行高通量的樣品檢測；具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明要求保護的範圍，下列實施例中未註明具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，1992，分子克隆實驗指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學出版社，200l，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學出版社，1982，或接照製造廠商所建議的條件。
實施例1 豬瘟弱毒疫苗的螢光定量PCR試劑盒組成與配製A).試劑組成TRIZOL RNA提取試劑盒為GIBCOL公司產品。dNTPs(10mM)、Taq DNA聚合酶(3U/μl)、RNA酶抑制劑(40U/μl)、MgCl2(25mM)均購自華美公司。MMLV逆轉錄酶(200U/μl)購自Promega公司。
B).MMLV 5×Buffer組成50mM Tris-HCl(PH8.3 25℃)、3mM MgCl2、75mM KCl、10mM DDT；C).螢光PCR 10×Buffer組成500mM KCl、100mM Tris-HCl(PH9.0 25℃)、1.0％Triton X-100；
D).逆轉錄反應液正向引物PF(SEQ ID NO1)3μl(10μmol/L)，RT5×buffer 10μl，dNTPs 5μl(10mmol/L)，無菌雙蒸水10μl。
E).螢光定量反應液PCR 10×buffer 2μl，正向引物PF(SEQ ID NO1)和反向引物PR(SEQ ID NO2)各0.5μl(10μmol/L)，螢光探針1μl(1μmol/L)，MgCl23.6μl(25mmol/L)，dNTPs 0.4μl(10mmol/L)，Taq DNA聚合酶0.5μl(3U/μl)，無菌雙蒸水9.5μl。螢光探針FP序列為SEQ ID NO3，其5』端標記的螢光報告基團是FAM，3』端標記的螢光受體基團為ROX。使用濃度為1μmol/L。
F).自備試劑氯仿、異丙醇、DEPC處理的滅菌雙蒸水、用DEPC處理的滅菌雙蒸水配製的75％乙醇。
實施例2用豬瘟兔化弱毒苗的螢光定量PCR試劑盒檢測豬瘟兔化弱毒苗A).取三種不同類型(兔子都產生定型熱反應；一個兔子有定型熱，一個不產生定型熱；兩隻兔子都不產生定型熱反應)的經兔體定型熱反應重複檢測驗證的疫苗液(由武漢中博生化有限公司生產)各100μl，分別加RNA裂解液1ml混勻，室溫靜置10分鐘，加0.2ml氯仿，室溫靜置3分鐘，於4℃12000g/min離心15分鐘，上清液轉移到另一個離心管，加0.5ml異丙醇，室溫沉澱10分鐘，4℃12000g/min離心10分鐘，輕輕倒出上清，加1ml 75％乙醇於4℃7500g/min離心5分鐘，棄上清，RNA沉澱在室溫下自然晾乾，加DEPC處理過的20ul。
B).取A)步所提RNA 20μl，85℃孵育5min，迅速置冰上5min，然後加逆轉錄反應液28μl，RNA酶抑制劑1μl，MMLV逆轉錄酶1μl。42℃ 60min，95℃5min滅活MMLV。
C).將陽性標準模板系列稀釋為5×105拷貝數/μl、5×104拷貝數/μl、5×103拷貝數/μl。
D).分別取螢光定量PCR反應液各18μl，取第B)步所得cDNA和第C)步稀釋的陽性標準模板各2μl，分別加入不同的PCR反應管，在螢光定量檢測儀上平行做PCR檢測。循環條件為95℃預變性2min；95℃15s，65℃40s，擴增40個循環。把螢光檢測的程序設置在每個循環的第二步結束時進行，檢測波長為530nm。
循環結束後，運用儀器自帶軟體，讀取待檢樣品拷貝數。結果為
標準陽性模板5×105拷貝數/μl、5×104拷貝數/μl、5×103拷貝數/μl的Ct值分別為21.20、24.77和28.62；使兩個兔子都產生定型熱反應疫苗樣品的Ct值為26.96，換算後每ml疫苗樣品拷貝數為7.13×106拷貝數/ml；一個兔子有定型熱，一個不產生定型熱疫苗樣品的Ct值為28.63，換算後每ml疫苗樣品拷貝數為3.35×106拷貝數/ml；兩隻兔子都不產生定型熱反應的疫苗樣品的Ct值為31.86，換算後每ml疫苗樣品拷貝數為4.70×105拷貝數/ml。
實施例3豬瘟兔化弱毒苗的螢光定量PCR試劑盒與傳統兔體定型熱反應法檢測豬瘟兔化弱毒苗的比較1.取15份不同批次收穫的疫苗液(由武漢中博生化有限公司生產)，經兔體定型熱反應法檢測為5份為兩個兔子都產生定型熱反應；5份為一個兔子有定型熱，一個不產生定型熱；5份為兩隻兔子都不產生定型熱反應。分別編號為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。1-5為兩個兔子都產生定型熱反應疫苗液；6-10為一個兔子有定型熱，一個不產生定型熱疫苗液；12-15為兩隻兔子都不產生定型熱反應疫苗液。經用本試劑盒檢測，結果如下表疫苗樣品兔體定型熱反應螢光定量 PCR法FQ-PCR病 毒 量(copies/ml)1 ++4.63×1062 ++1.42×1073 ++5.63×1064 ++6.28×1065 ++1.36×1076 +-2.19×1067 +-1.47×1068 +-6.50×1069 +-1.99×106
10 +-3.44×10611 --5.52×10512 --4.34×10613 --9.25×10414 --1.22×10415 --8.21×105++兩個兔子都產生定型熱反應疫苗樣品+-一個兔子有定型熱，一個不產生定型熱疫苗樣品--兩隻兔子都不產生定型熱反應第8號樣品兔體定型熱反應法檢測為+-，而螢光定量PCR檢測為6.50×106病毒粒子/ml，病毒粒子量已經達到使兔體產生定型熱反應的量；12號樣品兔體定型熱反應法檢測為--，而螢光定量PCR檢測4.34×106病毒粒子/ml，病毒粒子量已經達到使兔體產生一個產生定型熱反應，一個不產生定型熱反應的量；我們對這兩份樣品重新用兩種方法檢測，結果是8號樣品兔體定型熱反應法檢測為++，螢光定量PCR檢測為6.94×106病毒粒子/ml；12號樣品兔體定型熱反應法檢測為+-，而螢光定量PCR檢測3.95×106病毒粒子/ml。
2.取15份不同批次收穫的疫苗液，先用螢光定量PCR檢測試劑盒測定病毒粒子數，然後再經兔體定型熱反應法檢測。編號分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。結果如下表疫苗樣品兔體定型熱反應 螢光定量 PCR法 FQ-PCR病毒量(copies/ml)1 ++ 5.17×1062 +- 7.42×1063 -- 7.53×1054 ++ 6.55×1065 ++ 3.27×1076 ++ 2.55×107
7 +-1.48×1068 +-3.17×1069 +-6.36×10610 ++1.17×10711 --5.33×10512 --4.70×10613 ++9.55×10614 +-1.98×10415 ++8.33×106++兩個兔子都產生定型熱反應疫苗樣品+-一個兔子有定型熱，一個不產生定型熱疫苗樣品--兩隻兔子都不產生定型熱反應第2號樣品兔體定型熱反應法檢測為+-，而螢光定量PCR檢測為7.42×106病毒粒子/ml，病毒粒子量已經達到使兩個兔體產生定型熱反應的量；9號樣品兔體定型熱反應法檢測為+-，螢光定量PCR檢測為6.36×106病毒粒子/ml，病毒的量已經能夠使兩個兔體產生定型熱反應；12號樣品兔體定型熱反應法檢測為--，而螢光定量PCR檢測4.70×106病毒粒子/ml，病毒粒子量已經達使一個兔子產生定型熱反應，一個不產生定型熱反應；14號樣品兔體定型熱反應法檢測為+-，而螢光定量PCR檢測1.98×104病毒粒子/ml，病毒粒子量不足以使任何兔體產生定型熱反應；我們對上述4個樣品重新用兩種方法進行檢測，結果是2號、9號樣品兔體定型熱反應法檢測為++，螢光定量PCR檢測分別為6.78×106病毒粒子/ml和7.11×106病毒粒子/ml；12號樣品兔體定型熱反應法檢測為+-，螢光定量PCR檢測為3.55×106病毒粒子/ml；14號樣品兔體定型熱反應法檢測仍為+-，螢光定量PCR檢測為5.32×104病毒粒子/ml。
從上述實驗對比可以說明，螢光定量PCR方法定量重複性好，定量準確，而兔體定型熱反應法會因兔子個體反應性差異而導致測毒不準。而且，螢光定量PCR檢測試劑盒對疫苗的檢測僅需4個小時就能完成，而傳統的兔體定型熱反應法約需1周左右才能完成，因此，使用該試劑盒可以大大縮短檢測時間。
用螢光定量PCR試劑盒檢測豬瘟病毒的實施方法與檢測豬瘟兔化弱毒疫苗相同。不進行兔體定型熱反應。
該試劑盒的操作只需1人即可完成整個定量操作過程，一次可檢測32-384個(由定量檢測儀的型號決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費。
SEQUENCE LISTING110武漢大學120一種快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗的螢光定量PCR試劑盒及應用130一種快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗的螢光定量PCR試劑盒及應用1604170PatentIn version 3.1210121119212DNA213人工合成4001tagccatgcc catagtagg 19210221121212DNA213人工合成4002atcaggtcgt actcccatca c21210321130212DNA213人工合成4003tacaggacag tcgtcagtag ttcgacgtga 302104211400212DNA213豬瘟病毒石門株，豬瘟兔化弱毒株4004gtatacgagg ttagttcatt ctcgtataca cgattggaca aatcaaaatt ataatttggt 60tcagggcctc cctccagcga cggccgaact gggctagcca tgcccatagt aggactagca 120aaacggaggg actagccata gtggcgagct ccctgggtgg tctaagtcct gagtacagga 180cagtcgtcag tagttcgacg tgagcagaag cccacctcga gatgctacgt ggacgagggc 240atgcccaaga cacaccttaa ccctagcggg ggtcgctagg gtgaaatcac gccacgtgat 300gggagtacga cctgataggg cgccgcagag gcccactatt aggctagtat aaaaatctct 360gctgtacatg gcacatggag ttgaatcgct ttgaactttt 400
權利要求
1.一種快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟弱毒疫苗的螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括a)RNA裂解液，b)逆轉錄酶，c)RNA酶抑制劑，d)Taq DNA聚合酶，e)標準陽性模板，f)逆轉錄反應液和g)螢光定量反應液，其特徵是逆轉錄反應液含有正向引物，其序列為5』-TAGCCATGCCCATAGTAGG-3』，螢光定量反應液含有引物和螢光探針，引物為正向引物和反向引物，其序列為5』-ATCAGGTCGTACTCCCATCAC-3』，螢光探針序列為5』-TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGA-3』，螢光探針5』端標記的螢光報告基團是FAM，3』端標記的螢光受體基團為ROX，標準陽性模板pGS是含有豬瘟兔化弱毒株5』端400個核苷酸片段構成的pGEM-T載體，且該載體可在大腸桿菌DH5α中增殖。
2.根據權利要求1所述的一種快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟弱毒疫苗螢光定量PCR試劑盒，其特徵是逆轉錄緩衝液，dNTPs溶液和無菌雙蒸水。
3.根據權利要求1所述的一種快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟弱毒疫苗螢光定量PCR試劑盒，其特徵是螢光定量反應液是正向引物和反向引物，螢光探針，PCR緩衝液，MgCl2溶液，dNTPs溶液，Taq DNA聚合酶和無菌雙蒸水。
4.根據權利要求1所述的一種快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟弱毒疫苗螢光定量PCR試劑盒，其特徵是標準陽性模板pGS的核苷酸序列為gtatacgagg ttagttcatt ctcgtataca cgattggaca aatcaaaatt ataatttggt 60tcagggcctc cctccagcga cggccgaact gggctagcca tgcccatagt aggactagca 120aaacggaggg actagccata gtggcgagct ccctgggtgg tctaagtcct gagtacagga 180cagtcgtcag tagttcgacg tgagcagaag cccacctcga gatgctacgt ggacgagggc 240atgcccaaga cacaccttaa ccctagcggg ggtcgctagg gtgaaatcac gccacgtgat 300gggagtacga cctgataggg cgccgcagag gcccactatt aggctagtat aaaaatctct 360gctgtacatg gcacatggag ttgaatcgct ttgaactttt 400
5.權利要求1所述的螢光定量PCR試劑盒在快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗的螢光定量PCR試劑盒，利用該試劑盒快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗的方法以及該試劑盒在快速定量檢測豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗中的應用。該試劑盒及方法克服了傳統和現代方法中存在的不足，可有效方便地對豬瘟病毒和豬瘟兔化弱毒疫苗進行定量檢測以及對豬瘟兔化弱毒疫苗生產進行質量監控。
文檔編號C12Q1/68GK1405328SQ0213925
公開日2003年3月26日 申請日期2002年11月8日 優先權日2002年11月8日
發明者張楚瑜, 潘茲書, 陳玉棟 申請人:武漢大學