來自酵母提取物的食用香料的製作方法

2023-10-17 20:40:14 3

專利名稱：來自酵母提取物的食用香料的製作方法
技術領域：
本發明涉及食用香料。
採用水解後的酵母提取物作為食用香料是眾所周知的事。酵母對人體無毒，並通常在高密度(高的幹細胞重量/升)下進行培養。
通過使絲狀真菌(filamentous fungi)與水在高溫下進行接觸並將其從水中分離出來可以降低其核酸含量，這種用於鐮孢屬(Fusarium)的方法見述於PCT專利申請WO 95/23843中。我們發現，真菌從中分離出來的水含有可用作或可轉化為用於食物的食用香料，如果該真菌為鐮孢屬，例如鐮孢屬IMI 145，425時尤其如此。
本發明包括一種方法，籍此經熱處理後從絲狀真菌細胞中喪失的各種可溶性組分可被分離並用作或轉化為用於食物的香料物質。
本發明包括一種加工絲狀真菌以改進其作為食物適合性的方法，它包括在水的存在下使之在足以降低其核酸含量的溫度下進行處理，其基本特徵在於直接採用從所述方法的真菌中除去的材料或經化學反應後做成調味食物。
本發明也包括一種用於食物的含水溶液的食用香料(flavouringmaterial)，它包括通過使絲狀真菌在高溫下與水接觸而從中除去的核酸，其中所溶解固體的濃度足夠的高以便使該物質在20℃的溫度下穩定貯存一個月，或者是包括這種核酸的固體，或者是包括這種核酸與含硫胺基酸、硫化氫或硫化銨的反應產物的食用香料。
當此食用香料為含水溶液的形式時優選包括至少30％(重量)、更優選為45-60％(重量)的固體。
雖然在食用香料中味道是一個重要的因素，但食用香料的氣味也同樣重要。
優選在核酸減少步驟中通過例如蒸發、蒸餾(優選在減壓下進行)、反滲透、冷凍乾燥或將水作為冰的形式冷凍出來得到含水濃縮物的方式除去水而將各種可溶性組分從核酸減少步驟中產生的含水溶液中濃縮出來。可適宜地在減壓及例如40-70℃的溫度下通過蒸發將其除去。
可將溶解的固體分離成或作為濃縮溶液的形式，其中將Aw(水的活度)減少至在貯存溫度的範圍內足以確保生物停滯(biostasis)的程度。
如果通過提高絲狀真菌生長培養基的溫度來減少其核酸的含量，則所回收的水將含有各種鹽和其他營養物如葡萄糖和/或除了核酸之外還有複合氮營養物以及其他衍生自真菌的物質。如果需要通過這些物質來賦予香味則可將它們保留在這些物質中，但如果不是這樣的話，則可例如通過滲透或超濾將其除去，或在降低真菌核酸含量之前可對其進行洗滌以便避免其存在。在WO 95/23843中描述了將核酸從生長態的絲狀真菌中除去；這樣的方法是對例如在純水中處理靜止態的真菌的一種改進。然而，我們發現生物體只花很短的時間便從其生長態調整至靜止態，並且若核酸從生長培養基中分離出來後能很快將其除去，則根據WO 95/23843的方法便可令人滿意地除去核酸。
我們發現，在如上述般將水部分或全部除去後，濃縮物可用作作為食物添加劑的水解植物蛋白、酵母自溶物或酵母提取物的替代物。從真菌中除去的各種物質可用於美味香料製品和加工香料的生產中。由於香料的風味特性，它可直接用於各種小吃、餅乾、原料、湯、燉過的食物、醬汁和肉汁中，其含量優選為0.1-15％、如1-10％(乾重)。
我們也發現，通過將其加熱可產生一種誘人的烘烤型的香味。如需要可在加熱前進行部分水解，例如通過採用乙酸進行水解以便得到改良的烘烤香料。
也可以任選在進行至少部分水解後使其與含硫的胺基酸(優選為半胱氨酸)或任選與H2S和/或(NH4)2S進行反應以製備美味可口的香料。
可通過化學反應改變材料的香味性質以便提供肉/烘烤香料風味得以增加的不同香料香形(flavour profile)。這種「反應調味劑」可用於各種風味肉製品(牛肉、雞肉、羊肉、豬肉等)、肉類替代物(如基於大豆、小麥、豌豆蛋白、黴茵蛋白等)、精製麥片、小吃和飲料，其含量優選為0.1-10％、例如為1-8％(乾重)。
可通過使如上述般從真菌中去除的各種物質與半胱氨酸進行反應來生產香料。如需要可在水的存在下進行；例如，可使這些物質的1.5-75％(重量)、優選為5-50％(重量)的溶液與基於這些物質的量計量高達10％(重量)、如1-5％(重量)的半胱氨酸進行反應。反應可在例如110-140℃的溫度、pH為5.5-9的條件下進行。反應適宜連續進行0.5-7.5小時。
我們相信，水解增加了濃縮物游離核糖的含量，而如果需要某些香料，這樣做可能是恰當的。由於規章制度方面的原因(可能產生氯代丙醇衍生物)而需要避免採用鹽酸進行處理，但可能需要採用例如乙酸進行水解。
在以下說明書中，術語「centrate」用來指在分離出細胞物質後鐮孢屬的懸浮液在約70℃下以及在其生長培養基的存在下通過熱激處理所回收的胞外液。術語FDC意指「冷凍乾燥的centrate」。試驗方法材料製備對液體centrate進行冷凍乾燥以便-降低水的含量因而抑制微生物生長；-在高濃度的centrate下進行研究；-便利於產品的處理。
在本報告中所述的所有其它分析都與冷凍乾燥的centrate(縮寫為FDC)有關。方法-成分分析水分通過放置於100℃的烘箱中測量FDC的重量減少直至恆重為止來確定水分含量。灰分通過將FDC放置於600℃的烘箱中直至得到恆重為止來確定灰分含量。有機氮進行凱氏定氮法；蔗糖作為空白而甘氨酸作為標準物。結果示於表1中。
表1FDC的水分、灰分和有機氮含量
胺基酸採用6300 Beckman自動分析儀進行胺基酸測定。採用0.06％的FDC溶液分析存在於FDC中的游離胺基酸。可以通過FDC的預先水解(HCl 6N，24小時，110℃烘箱)來測量總的胺基酸含量。但是已知該酸只水解色氨酸和含硫胺基酸。通過預先將半胱氨酸氧化為磺基丙氨酸和將甲硫氨酸氧化為甲硫氨酸碸可以避免含硫胺基酸發生水解。這可通過採用甲酸/過氧化氫/甲醇(48.5/1/0.5)的溶液在0℃和暗處處理FDC4小時來完成。結果示於表1a中。
表1aFDC的胺基酸含量(平均結果以克/100克FDC表示)
總碳水化合物通過苯酚-硫酸測定法評估FDC的碳水化合物含量(碳水化合物分析實用方法，ed.Chaplin，Kennedy，IRL出版社)。使FDC與葡萄糖(校準標準物)的溶液與苯酚在水中的溶液(5％w/v)進行混合。快速並直接將濃硫酸(1毫升)加入到溶液表面，避免接觸到試管的側面。使溶液保持穩流10分鐘，然後進行劇烈搖動。30分鐘後在490納米處讀取吸光度。糖採用高壓液相色譜法(HPLC)的Dionex系統進行糖分析，其中使用HPLC分段水(grade water)的洗脫液(1毫升/分)和陰離子交換柱(Dionex PA-1柱)以及脈衝安培檢測器。純化合物用作停留時間測定及定量的標準物。採用經0.45微米Minisart 25膜濾過的0.15％FDC溶液分析游離糖。在FDC進行初步酸水解(在HCl 1N的0.15％溶液中，2小時，110℃烘箱)後並首先經Ag過濾器(AgCl沉澱物)過濾，其次再經0.45微米Minisart 25過濾器進行過濾後評估總糖。結果示於表2中。
表2FDC糖含量的HPLC分析(克糖/100克FDC)
核酸衍生物採用裝有Spectroflow 757 ABI Analytical Kratos Division的PerkinElmer Binary HPLC泵250。標準物和試樣均通過Acrodisc 0.45微米Gelman Sciences膜過濾器進行過濾，並通過裝有20微升注射環(loop)的注射閥注射進由μBondapack C18保護柱所保護的反相μBondapack C18(3.9×300毫米)Waters分析柱。採用254納米的波長。採用具有兩個流動相的梯度程序流動溶劑A為60/40甲醇/水混合物，流動溶劑B為0.02M KH2PO4(pH5.5)，通過將正磷酸二氫鉀溶解於蒸餾水中並採用1M的KOH調節pH進行製備。使用前將所有流動溶劑過濾(Nylaflo 0.2微米Gelman Sciences膜過濾器)並採用氦脫氣。總的運轉時間為51分鐘，流速為1毫升/分，由以下各部分組成5分鐘內為100％的溶劑B、接著在36分鐘內為0-36％梯度的溶劑A、在5分鐘內為36％的溶劑A。然後在5分鐘內設置36-0％的反向梯度A，經過15分鐘的平衡後準備進一步注射HPLC。
通過比較在相同的HPLC條件下分析標準物所得的停留時間對各種化合物進行鑑定。分別分析各種標準物以便知道其各自的停留時間，然後一起檢查在試樣中可能出現的洗脫重疊(elution over lap)的情況。這些標準物示於表3中。
表3核酸標準物的HPLC停留時間
續表
FDC的水解由於游離核糖在美拉德(Maillard)反應中具有高度的反應性，因此我們研究溫和的水解條件對於FDC的影響及隨後對香料生產的影響。採用0.01M的乙酸鈉，用乙酸調節至pH4進行酸性水解。製備一式兩份的4000μM的各種標準物(次黃苷、5』一磷酸腺苷-AMP5』、鳥苷和5』一磷酸鳥苷-GMP5』)並取出每種溶液的一個等份，在適宜於分析以上核酸衍生物的相同HPLC條件下運轉。然後使各種溶液在100℃的烘箱(GC烘箱Carlo Erba)中水解7.5小時。通過將各試管放置於冰浴中使反應停止，並保存在冷藏箱中直到進行分析為止。
使2％(w/v)的FDC經受類似的水解條件。香料混合物調合如上所述，我們認為FDC本身具有作為香料或在反應(產物為香料)中作為前體的潛力。因此製備一系列反應混合物並示於表4中。
表4通過嗅覺專門小組(sniffing panel)分析的香料混合物選擇進行GS-MS分析的混合物在其下劃線；C=半胱氨酸
通過在玻璃試管中混合適量的儲液製備反應混合物(2毫升)，然後轉移到在熱火焰中密封的20毫升Kimble安瓿中。然後將安瓿放置於金屬蓋中並在Carlo Erba 4200氣相色譜烘箱中加熱。
分析前將反應混合物貯存於-20的冷藏箱內。在使反應混合物達到室溫後將安瓿打破以便進行分析。香味揮發物的感覺評定招募在香料評定方面具有經驗的非正式6人(3位女性，3位男性)專門小組。
為感覺評定，將1毫升調查中的等份試樣轉移到棕色螺絲帽的瓶中並稀釋10倍(其中不實行稀釋的濃度研究除外)。每一次在室溫下將編了號的試樣呈現給一個評味員並請各評味員以其自己的語言描述該香味(aromas)。香味揮發物確定的儀器評定採用動態液面上氣體(headspace collection)的方法。將每一個試樣(1.7毫升反應混合物使其等量於0.4克FDC)放置於裝有Drechsel蓋的250毫升錐形瓶中。加入蒸餾水使最終體積為10毫升，並輕搖該混合物。將不含氧的氮氣以40毫升/分的速率流過試樣1小時。將揮發物收集於預先準備好的裝有85毫克Tenax GC(CHIS系統，SGELimited)的搪瓷不鏽鋼阱(105毫米×3毫米i.d.)中。在整個收集過程中採用水浴將試樣保持在37℃。內標為在醚中的1，2-二氯苯(130微升/毫升)，收集結束後將1微升注射進阱上，然後用氮氣吹洗阱10分鐘。
採用0.5微米膜厚的Hewlett-Packard(HP)5890/5972氣相色譜-質譜(GC-MS，裝有50米×0.32毫米內徑熔凝矽石毛細管柱，用BPX-5(SGE Limited)塗漬)來分析所收集的揮發物。它們在250℃下在CHIS注射口(SGE Limited)中進行熱解吸，並直接低溫聚集於GC柱的前部，而將烘箱在0℃下保持5分鐘。然後在1分鐘內將烘箱的溫度提高到40℃並保持5分鐘，其後以4℃/分的速率將溫度提高至250℃並保持10分鐘。氦載體的氣體流速為1.5毫升/分。以電子碰撞的模式在70eV的電離電壓和200℃的源溫度下記錄質譜。採用29-400 m/z的掃描範圍和0.69秒的掃描時間。控制日期並通過HP G1034CChemstation數據系統貯存。
通過將揮發物的質譜與來自Reading Laboratory或NIST/EPA/MSDC質譜資料庫中的可信化合物的質譜或其他公布的質譜進行比較來鑑定。對於每一種組分採用C6-C22正烷同系列(homologous senes)的停留時間計算線性保留指數(LRI)。核酸衍生物從3次重複中確定centrate的核酸組成並示於表5中。它解釋了大多數的HPLC洗脫峰。雖然許多化合物被共洗脫，但由於不可能研究替代的分析條件，因此對於共洗脫化合物而言，不能確定對在centrate分析中所得的峰有作用的化合物。
正如我們所預料的那樣，與核糖核酸衍生的化合物(它們更多存在於自然界中)相比極少有脫氧核糖核酸衍生的化合物。主要的核酸組分為5』一磷酸胞嘧啶(總核酸含量的26％)、3』一磷酸尿苷和/或5』一磷酸鳥苷(18％)、5』一磷酸腺苷和/或5』一磷酸脫氧核糖鳥苷(16％)。它們都是核糖及磷酸核糖的潛在來源，是美拉德反應的良好反應前體。除了鹼之外，核糖或磷酸核糖的潛在來源佔96％的centrate核酸含量，等於202ppm centrate含量。
表5centrate核酸HPLC分析結果
Hypox=次黃嘌呤；I=肌苷；C=胞苷；U=尿苷；G=鳥苷；A=腺苷；MO=一磷酸；D=脫氧核糖酸性水解對核酸衍生物的影響表6代表肌苷、鳥苷及其各自的5』磷酸核糖核苷酸溶液的水解結果。此方法基於Matoba等人所用的方法(J.Food Science，53卷，第4期，1988年，1156頁)。最後一欄給出了定量回收的情況，可以看出鳥苷的水解結果顯示大量的損失，這意味著鳥嘌呤分子是不穩定的。
最令人感興趣的模型系統是核糖核苷酸，因它們是centrate的主要組分。其水解不超過一半，得到各自的核苷，再進一步水解成鹼。雖然可以將核糖核苷酸水解為其鹼並隨後得到核糖和/或磷酸核糖，但所得的鹼的收率較低，因而該方法必須進行最優化。
表6模型系統的酸性水解結果
結論我們對FDC的核酸組成進行了鑑定。它主要包括核糖核苷酸以及少量的脫氧核糖核苷酸。在pH4的乙酸鹽緩衝液中核苷酸的水解釋放出核糖或磷酸核糖只發生較小的程度。結果香味揮發物的感覺評定我們決定介紹每一位評味員的各自結果，並且由於所描述的術語具有太大的多樣性而不將它們歸類為具體常用述詞。
表7和8表示在投加和不加半胱氨酸時加熱的效果及水解的影響。
表7香味專門小組對centrate的評議結果-烹調效果的研究
表8香味專門小組對加熱後緩衝centrate的評議結果關於水解及投加半胱氨酸效果的研究
研究centrate的濃度在接近工業實踐濃度範圍，即固體為12％-30％的範圍內的效果。將其與未稀釋的冷凍乾燥centrate粉末相比較(87％固體)。其他的製備條件保持恆定，即pH 5.5並在140℃加熱30分鐘。將結果示於表9中。氣味相當地強烈，並且對於每一個評味員而言在2個同樣的樣品中結果的可再現性相當地差。然而，濃度從低至高(12％)排列的樣品中具有值得注意的趨勢，氣味主要為甜味、蔬菜和糖蜜。在20％和30％固體下這些特徵變得與燒焦和辛辣以及美味可口有關。在50％下試樣具有燒烤及顏料的氣味，在75％下這些氣味是主要的氣味。對於87％的試樣檢測到一些超金屬(extrametallic)的、燒焦的橡膠和硫的特徵。20％和30％固體的試樣由於其肉的風味氣味而似乎是最令人感興趣的，因此選擇它們做進一步的分析。我們也決定在進一步嗅覺(sniffing)測定反應混合物之前稀釋原始風味的反應混合物。
表9香味專門小組對加熱後centrate(pH 5.5)的評議結果-濃度影響的研究
將加熱條件保持在140℃下30分鐘，研究三種不同的5.5、7.5和9的pH值對centrate的影響。結果示於表10中。在20％與30％固體試樣之間的結果沒有太大的區別。在pH 7.5時的結果類似於pH5.5的結果，氣味主要為用高壓鍋蒸煮的味和焦糖味。pH為9時氣味開始變得燒焦。因此我們決定通過選用兩個極端的pH並只保持一個濃度(20％固體)來進行嗅覺測定實驗。
表10香味專門小組對加熱後的centrate pH效果研究的評議結果
研究投加半胱氨酸對20％固體在pH為5.5和9的centrate溶液的影響。試驗三種濃度的半胱氨酸半胱氨酸(克)/centrate固體(克)比例為1/20、1/10和1/5。如前述般保持相同的加熱條件(在140℃下30分鐘)。結果示於表11中。在pH 5.5的試樣系列中，低濃度的半胱氨酸得到一些程度令人愉悅的氣味甜味、油膩的、肉醬，隨著半胱氨酸濃度的增加，逐漸代之以烤過和橡膠的香型。pH為9時，低濃度的半胱氨酸又出現在先前實驗所提及的燒烤穀類的香型。當半胱氨酸含量增加時，氣味變得濃烈和更加有堅果味，最後成為美味可口的肉材料。因此我們決定選擇半胱氨酸為1/20、pH為5.5的試樣和半胱氨酸為1/5、pH為9的試樣進行下一組的試驗。
表11香味專門小組對加熱後centrate(pH 5.5和pH 9)的評議結果-投加半胱氨酸的作用的研究
將溫度/持續時間加熱條件研究的結果示於表12中。包括兩個先前所述的所選試樣在較低的溫度及較長的時間(100℃下60分鐘和90分鐘)，和在較高的溫度但較短的時間(175℃下5分鐘)進行烹調。與原加熱條件相比，對pH 5.5半胱氨酸1/20試樣通過在100℃加熱60分鐘可獲得相似的結果。在100℃加熱更長的時間得到更加烤焦的香型，在175℃下加熱5分鐘後也得到類似的氣味。關於pH 9半胱氨酸1/5試樣，通過在140℃加熱30分鐘所得到的肉香型可通過在175℃處理5分鐘獲得。以下描述了在100℃下一些很強烈的尿和煮熟的蛋的氣味。
表12香味專門小組對加熱後centrate pH 5.5和pH 9+半胱氨酸的評議結果對烹調用的溫度及持續時間的影響的研究
結果-通過GC/MS進行CF香味揮發物的儀器分析通過前述的方法採用GC-MS分析液面上氣體揮發物來進一步研究選擇上述各種反應混合物。將這些混合物在表2中加下劃線。為了比較各種揮發物，在相同的條件下分析自溶酵母的試樣。將研究的結果詳細示於表13中。
表13通過液面上氣體濃度分析的揮發性化合物
吡嗪、噻唑和噻吩的含量很受反應條件的影響。在pH 9處發現最高水平的吡嗪，這是因為在美拉德反應中，pH值越高則越易形成N-雜環化合物。除了一些例外，含硫化合物僅在半胱氨酸的存在下生成，證實了含硫胺基酸在冷凍乾燥的centrate中的含量相當低。
酵母自溶產物香味揮發物受萜的控制，並且其組成與從centrate中獲得的揮發物很不相同。結論各種香味由centrate生成，顯示其作為調味成分或作為反應產物香料前體源的潛力。在本研究施用的各種變量為centrate濃度、pH、所投加的半胱氨酸的存在以及加熱條件的溫度/持久時間。需要投加半胱氨酸以便產生衍生自含硫揮發物的肉香味。
權利要求
1．一種用於食物的含水溶液的食用香料，它包括通過在足以減少絲狀真菌(filamentous fungus)的核酸含量的高溫下使之與水接觸而從絲狀真菌中除去的材料，其中溶解固體的濃度足夠地高以便使得該溶液可在20℃的溫度下穩定貯存一個月的時間，或者是一種包括從絲狀真菌中這樣除去的物質的固體，或者是一種包括這些材料與含硫胺基酸、硫化氫或硫化銨的反應產物的食用香料。
2．根據權利要求1的食用香料，它是一種包括至少30％(重量)固體的含水溶液。
3．根據權利要求1或2的食用香料材料，它包括這些材料與半胱氨酸的反應產物。
4．一種生產用於食物的食用香料的方法，它包括改進絲狀真菌用於食物適應性的步驟，在水的存在下將它置於足以減少其核酸含量的溫度下，由此產生一種含水溶液，並將此含水溶液進行濃縮。
5．權利要求4的方法，其中通過蒸發、蒸餾、反滲透、冷凍乾燥將水從含水溶液中除去，或將水作為冰從含水濃縮液中冷凍出來。
6．權利要求4或5的方法，其中通過在減壓及40-70℃的溫度下將水除去來濃縮可溶性的各種組分。
7．根據權利要求4-6中任一項生產用於食物的食用香料的方法，其中核酸從生長狀態中的絲狀真菌中除去。
8．權利要求7的方法，其中對正處於其生長狀態下的絲狀真菌進行洗滌以除去生長培養基，其後在水的存在下立即加熱以除去核酸。
9．權利要求4-8中任一項的方法，其中使從絲狀真菌中回收的物質與含硫胺基酸、硫化氫或硫化銨反應由此生產美味可口的香料。
10．權利要求9的方法，其中含硫胺基酸為半胱氨酸。
11．權利要求9或10的方法，其中所述反應在水的存在下進行。
12．權利要求11的方法，其中使從真菌中除去的物質在水中的1.5-75％的溶液與基於所述物質計高達10％(重量)的半胱氨酸在pH為5.5-9下進行反應。
13．權利要求12的方法，其中所述反應溫度為110-140℃。
14．一種包括0.1-15％(重量)的權利要求1、2或3中所要求保護的食用香料(基於固體含量計)的食物，或它通過如在要求保護4-13中任一項要求保護的方法生產得到。
15．根據權利要求14的食物，它是小吃、餅乾、原料(stock)、湯、燉品(stew)、醬、肉汁或飲料。
16．一種生產食用香料的方法，它包括改進絲狀真菌作為食物適應性的步驟，在水的存在下將其置於足以減少其主要核酸含量的溫度下，並在所述步驟中直接採用或在化學反應後採用從真菌中除去的物質作為食物調味。
全文摘要
通過使絲狀真菌與水在足以減少其核酸含量的溫度下進行接觸並進行濃縮或從所得含水溶液中分離出固體可從中生產出食用香料。這些物質可進一步與例如含硫胺基酸進行化學反應。
文檔編號A23L1/229GK1285717SQ98812088
公開日2001年2月28日 申請日期1998年12月11日 優先權日1997年12月16日
發明者G·W·羅傑爾, G·B·科德爾, D·S·莫特拉姆 申請人:瑪爾露食品有限公司