一種新穎的耐酸耐膽鹽、抗腸道致病菌和抗氧化能力鼠李糖乳桿菌株的製作方法

2023-10-17 20:20:39 1

專利名稱：一種新穎的耐酸耐膽鹽、抗腸道致病菌和抗氧化能力鼠李糖乳桿菌株的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物學領域，更具體的，本發明涉及一種新穎的耐酸耐膽鹽、抗腸道致病菌和抗氧化能力鼠李糖乳桿菌株。
背景技術：
乳酸菌是一類可發酵碳水合物、且主要生成乳酸的細菌的總稱。目前，國際上已對乳酸菌進行大量的研究，並在實踐上將乳酸菌應用於許多領域中。
通常，乳酸菌對含有大量外源凝集素的消化器官的上皮細胞具有親和力。因而，從外環境獲得的乳酸菌在體內傾向於結合到該區域上，並在其上增殖。並且，日常存在於體內的乳酸菌在這種附屬表面上形成集落。
存在於上皮細胞上的乳桿菌屬，與這些上皮細胞互相生存，這一特性給宿主帶來健康功能性作用。不同種的乳酸菌可起到不同的作用，例如，(1)在細胞表面形成優勢菌群，對病原微生物產生抑制作用；(2)菌株分泌抗細菌物質；(3)菌株有助於消化活性；(4)產生抗癌活性物質等。
近來的研究發現，用於人的益生菌最好來源於人體內。但是現在獲得的許多的功能性乳酸菌菌株大多是從其它動物腸、糞便、食物、環境、土壤等獲得。因此，雖然乳酸菌菌株對小腸和大腸具有黏附能力，但是當將它們作為食物攝取時，許多乳酸菌不能耐受胃酸和膽汁，因而不能通過胃、到達腸道。它們幾乎都被胃酸殺滅。
因此，現有技術中迫切需要解決乳酸菌的應用和功效等問題。因此在人體內尋找出優勢乳酸菌加以利用，對於維持人體健康、促進機體正常功能、延緩衰老等，將較其它來源的乳酸菌具有更強大的功能。

發明內容
本發明的目的在於提供一種來源於人體的新的鼠李糖乳桿菌菌株，該菌株可很好地粘附到胃和腸黏膜上，並可抵抗酸、膽汁，對病原性微生物(如幽門螺旋桿菌和大腸桿菌)具有抗性，同時具有抗氧化功能。
本發明的另一目的是提供含有所述鼠李糖乳桿菌和/或其代謝產物的用途。
在本發明的第一方面，提供一種鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)，所述鼠李糖乳桿菌在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.1531。
在本發明的第二方面，提供所述的鼠李糖乳桿菌和/或其代謝產物的用途，用於製備抑制幽門螺旋桿菌、大腸桿菌或其它腸道致病性菌的食物和/或藥物。
在本發明的第三方面，提供所述的鼠李糖乳桿菌或其代謝產物的用途，用於製備預防和/或治療細菌性消化道疾病的食物和/或藥物。
在本發明的一個優選例中，所述的細菌性消化道疾病包括胃炎、胃潰瘍、十二指腸炎、腸炎、結腸炎或直腸炎。
在本發明的第四方面，提供所述的鼠李糖乳桿菌和/或其代謝產物的用途，用於製備抗氧化的食物和/或藥物。
在本發明的第五方面，提供一種食物組合物，其中含有有效量的(如102-1012cfu/mL或102-1012cfu/g，優選的如105-1010cfu/g或105-1010cfu/ml，更優選的如106-109cfu/g或106-109cfu/ml)所述的鼠李糖乳桿菌和/或其代謝產物，以及餘量的食品上可接受的載體。
在本發明的一個優選例中，所述的食物組合物選自固體、乳品、溶液製品、粉末製品、或懸浮液製品。
在本發明的第六方面，提供一種藥物組合物，其中含有有效量的(如102-1012cfu/mL或102-1012cfu/g，優選的如105-1010cfu/g或105-1010cfu/ml，更優選的如106-109cfu/g或106-109cfu/ml)鼠李糖乳桿菌和/或其代謝產物，以及藥學上可接受的載體。
在本發明的一個優選例中，所述的藥物組合物劑型選自顆粒劑、膠囊、片劑、粉末劑、口服液、混懸液、或乳劑。
在本發明的另一優選例中，所述的藥物或食物組合物的配方如下含有102-1012cfu/mL(或g)的鼠李糖乳桿菌和/或其代謝產物；以及餘量為食品上或藥學上可接受的載體。
本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1a和1b描述本發明的鼠李糖乳桿菌經革蘭氏染色後的情況。
圖2描述本發明的鼠李糖乳桿菌中使用API KIT 50 CHL進行的碳水化合物反應分析，50個小管(1-49號)中，0表示對照小管，黃色管表示其內碳水化合物因鼠李糖乳桿菌發酵而從紫變黃，七葉靈測定(25號管)則從紫變黑。
圖3描述本發明乳桿菌中的16S rRNA的核苷酸序列測定結果。
圖4描述本發明乳桿菌中的16S rRNA的核苷酸序列。
圖5描述使用鼠李糖乳桿菌的特異性引物(L73R和LC4F)對所述乳桿菌進行PCR後的電泳結果。泳道1為DNA分子量markerλ-EcoT14 I消化物；泳道2為陰性對照；泳道3為本發明菌株，泳道4，5，6分別為鼠李糖乳桿菌6012、鼠李糖乳桿菌6013、鼠李糖乳桿菌grx05。
圖6描述本發明鼠李糖乳桿菌引物Rha1和Rha2的PCR鑑定結果；泳道M為DL2000，泳道1為空白，泳道2為陰性對照，泳道3為本發明的鼠李糖乳桿菌的鑑定結果。
圖7描述使用引物OPG4擴增鼠李糖乳桿菌RAPD-PCR結果，泳道M為DL2000，泳道1為鼠李糖乳杆6012，泳道2為鼠李糖乳桿菌grx01，泳道3為鼠李糖乳桿菌grx02；泳道4為鼠李糖乳桿菌grx03，泳道5為本發明菌株，泳道6為鼠李糖乳桿菌grx05，泳道7為鼠李糖乳桿菌grx07，泳道8為鼠李糖乳桿菌grx09。
圖8描述可粘附到人結腸腺癌細胞系Caco-2細胞的體外粘附性試驗特性。
圖9描述所述乳桿菌對幽門螺旋桿菌的抑制效果。
圖10描述所述乳桿菌對大腸桿菌的抑制效果。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究和實驗，最終找到了一種具有優異的抗細菌特性的鼠李糖乳桿菌菌株(保藏號為CGMCC No.1531)，本發明人將該菌株命名為「鼠李糖乳桿菌LV108」。多種試驗表明，所述的鼠李糖乳桿菌LV108具有抗幽門螺旋桿菌和大腸桿菌等有害菌的能力以及抗氧化能力，具有耐受低pH值和膽汁酸鹽的能力，並具有很強的消化道黏附能力。基於此完成了本發明。
如本文所用，術語「本發明的鼠李糖乳桿菌」，「鼠李糖乳桿菌菌株LV108」可互換使用，都指保藏號為CGMCC No.1531的鼠李糖乳桿菌菌株LV108。
本發明所述的鼠李糖乳桿菌菌株LV108是通過以下方法、經過長期的分析和篩選而獲得(1)從廣西巴馬瑤族自治縣和新疆和田地區長壽老人糞便中分離的乳酸菌；(2)對分離獲得的1000多株乳酸菌、選用特異性培養基、結合生長特性等，初步確定乳酸菌類群；(3)分析共性優勢乳酸菌，確定3種優勢乳酸菌；(4)從初步確定的優勢乳酸菌中，比較它們的加工和生長特性，篩選出具有優異的抗細菌特性、耐酸和膽汁酸鹽能力、優良抗氧化能力的安全乳酸菌，從而可廣泛用於乳品加工、功能食品生產、增進健康的添加劑、新藥開發等。
本發明採用以下途徑對所述乳桿菌菌株進行鑑定(1)利用生理、生化特徵進行分析；(2)使用API KIT 50 CHL進行糖發酵分析；(3)通過進行16SrRNA序列分析，將本發明的乳桿菌菌株與標準的菌株進行比較，以便確切證實所述細菌菌株。(4)進行RAPD聚合酶鏈式反應(PCR)，以對所得結果與常規菌株進行比較。結果，鑑別出所述乳桿菌就是鼠李糖乳桿菌。
具體而言，使用API KIT 50 CHL糖發酵，分析使用特定程序，證實99％的精確度屬於鼠李糖乳桿菌。通過使用16S rRNA測序和核苷酸序列BLAST分析，所述菌株以95％以上的精確度被證實屬於鼠李糖乳桿菌。此外，當使用對鼠李糖乳桿菌特異性的引物進行PCR時，在本發明的菌株和經驗證的鼠李糖乳桿菌中都發現了大約300bp的類似片段，這證明了本發明該菌株屬於鼠李糖乳桿菌。
另一方面，當比較16SrDNA測序的結果時，本發明的菌株顯示與鼠李糖乳桿菌MCRF-412和MCRF-271株存在一些不同。
當使用對鼠李糖乳桿菌特異的L73R和LC4F引物進行聚合酶鏈式反應時，在730bp和448bp的片段在試驗株和其它已經驗證的鼠李糖乳桿菌中是共有的，而其它條帶則互不相同。然而，當使用對鼠李糖乳桿菌特異的Rha1和Rha2引物進行PCR時，在該菌株中發現約150bp和448bp的片段，而用OPG4引物進行PCR時，在850bp處與其它菌株具有明顯差異。因此利用Rha1和Rha2，以及OPG4引物可以用於篩選鑑定出本發明菌株，從而可證明該菌株具有其自己的特異特徵。
為了證實所述細菌菌株的安全性，選擇使用ICR小鼠作為實驗動物。在本發明第一個實施例中，將菌株接種到10％脫脂乳中培養24小時(約5×109cfu/mL)，取健康小鼠20隻，雌雄各半，體重20±2g，飼養觀察一日，活動正常，進食狀況良好，實驗前禁食12小時後稱重，分別按0.4mL/10g灌服樣品，2次/天，給藥後即對動物的精神狀態、毛色、自主活動、呼吸、飲食、二便、口鼻分泌物等一般狀況及死亡情況進行觀察，連續餵養7天，2個月後檢測其安全性，發現器官維持正常的外觀，包括胃黏膜和小腸黏膜在內的消化器官與對照組的消化器官類似。
另一方面，本發明的鼠李糖乳桿菌還具有抵抗酸和膽鹽能力。為了研究菌株的抗酸、膽汁能力，本發明人用混合酸將MRS培養基分別調節成pH2.0 MRS培養基、pH3.0 MRS培養基、pH4.0 MRS培養基，在pH2.0 MRS培養基、pH3.0MRS培養基中各加入2.0％、3.0％、4.0％、5.0％的膽汁酸鹽。結果表明，本發明菌株可以在pH2、3.0％膽汁酸中放置5小時而仍有活菌檢出，說明可具有較強抵抗酸和膽鹽雙重能力。
另一方面，本發明的鼠李糖乳桿菌菌株具有較強的粘附能力。為了檢測菌株的粘附能力，本發明人進行了人結腸腺癌細胞系Caco-2細胞的體外粘附性試驗。分別測定了菌株的粘附能力及對致病性大腸桿菌粘附的競爭性黏附抑制作用，並與其它鼠李糖乳桿菌菌株作了比較。通過實驗證實菌株具有腸道粘附能力。
另一方面，本發明的鼠李糖乳桿菌菌株具有抑制幽門螺旋桿菌作用。將凍融後的幽門螺旋桿菌吸取少量於Skirrow氏培養基表面，稍推開後，置於密封罐中37℃培養，密封罐內創造微氧環境，抽成真空，充填CO2氣體和N2氣體。用生理鹽水將培養皿表面的菌落洗脫下來，同麥氏標準比濁管進行比濁，確定菌數，使其濃度控制在105cfu/mL。吸取菌液0.5mL於相應固體培養基平板上，用無菌塗抹棒，於超淨工作檯內通無菌空氣，放置1h待表面的菌液固定在平板的表面後打孔，孔的直徑4mm，孔深3mm。將調整好濃度的乳酸菌菌液注至滿孔，不可溢出孔外，於合適生長環境培養48h觀察結果並測量抑菌圈直徑；同時用與其它鼠李糖乳桿菌株做對照。證實了該菌株對幽門螺旋桿菌較強的抑制作用。
另一方面，本發明的鼠李糖乳桿菌菌株具有抑制大腸桿菌的作用。採用單層營養瓊脂平板擴散法(AWDA法)進行定性試驗，結果發現所分離的乳酸菌菌株對大腸桿菌有抑制作用。
另一方面，本發明的鼠李糖乳桿菌菌株具有抗氧化的能力。利用ICR小鼠，雌雄各半，體重20g±2.0g，灌胃菌株培養物(約1×109cfu/g)和陽性對照品VE，連續8天，末次灌胃後1h，摘眼球取血，分離血清測試SOD活力和MDA含量，結果該菌株培養物具有顯著提高小鼠抗氧化能力，減少體內脂質過氧化物的生成。
本發明還提供了含有作為有效成分的本發明的鼠李糖乳桿菌或其代謝產物或所述抗細菌物質的食物組合物。該菌株或含有菌株的食物組合物可起到預防和/或治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸炎以及由大腸桿菌和其它腸道致病性細菌引起的腸炎、結腸炎和直腸炎等的作用。
此外，本發明還提供了可作為活性成分的鼠李糖乳桿菌或其代謝產物或所述抗細菌物質的功能食品或藥品。所述的食品或藥品可起到預防和/或治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸炎以及由大腸桿菌和其它腸道致病菌引起的腸炎、結腸炎和直腸炎等的作用。
更具體的，所述食品可以是含有所述鼠李糖乳桿菌的發酵牛奶或其它食物，比如由活的鼠李糖乳桿菌和/或由鼠李糖乳桿菌培養獲得的產物製備成的各種粉末狀產品，加入活的鼠李糖乳桿菌或其代謝產物的各種冷凍產品，經鼠李糖乳桿菌發酵的各種發酵乳產品，添加活性鼠李糖乳桿菌製成的各種飲料，加了鼠李糖乳桿菌的提取物的各種飲料和冷凍產品等等。
此外，本發明還提供含有活的鼠李糖乳桿菌或失活的鼠李糖乳桿菌的各種培養物或代謝產物製成的液體、固體粉末等以及含有所述乳酸菌提取物和純化的抗細菌物質的各種各樣的食用的製劑形式。
本發明中，術語「含有」表示各種成分可一起應用於本發明的混合物或組合物中。因此，術語「主要由...組成」和「由...組成」包含在術語「含有」中。
本發明中，「藥學上可接受的」或「食品上可接受的」的成分是適用於人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即有合理的效益/風險比的物質。
本發明中，「藥學上可接受的載體」或「食品上可接受的載體」是用於將本發明的鼠李糖乳桿菌或其代謝產物傳送給動物或人的藥學上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體，較佳的是能夠較高程度保持鼠李糖乳桿菌或其代謝產物活性的載體。
本發明還包括藥物和/或食物組合物，它包括給哺乳動物施用藥物或食物上有效量的鼠李糖乳桿菌或其代謝產物。本發明的組合物可用於預防和/或治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸炎，由大腸桿菌和其它腸道致病菌引起的腸炎、結腸炎和直腸炎等；以及可用於抗氧化。
當本發明的鼠李糖乳桿菌或其代謝產物用於上述用途時，它們可與一種或多種食品上或藥學上可接受的載體或賦形劑混合，如溶劑、稀釋劑等，而且可以用如下形式口服施用片劑、膠囊、可分散的粉末、顆粒或懸浮液(含有如約0.05％-5％懸浮劑)、糖漿(含有如約10％-50％糖)。例如，這些製劑可含有102-1012cfu/g或102-1012cfu/ml(特別的，可含有105-1010cfu/g或105-1010cfu/ml，更特別地，可含有106-109cfu/g或106-109cfu/ml)的活性鼠李糖乳杆和/或發酵產生的活性成分。
在本發明中，「有效量」是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。比如，在本發明中，可製備含有102-1012cfu/g或102-1012cfu/ml(特別的，可含有105-1010cfu/g或105-1010cfu/ml，更特別地，可含有106-109cfu/g或106-109cfu/ml)的鼠李糖乳杆和/或其代謝產物的製劑。
當用於製備藥物組合物時，所用的鼠李糖乳桿菌或其代謝產物的有效劑量可隨施用的模式和待治療的疾病的嚴重程度而變化。適用於內服的劑量形式，包含與固態或液態藥學上可接受的載體密切混合的約102-1012cfu/g或102-1012cfu/ml(特別的，可含有105-1010cfu/g或105-1010cfu/ml，更特別地，可含有106-109cfu/g或106-109cfu/ml)的活性鼠李糖乳杆或發酵產生的活性成分。可調節此劑量方案以提供最佳治療應答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按比例地減少。
所述的鼠李糖乳桿菌或其代謝產物可通過口服等途徑給予。固態載體包括澱粉、乳糖、磷酸二鈣、微晶纖維素、蔗糖和白陶土，而液態載體包括培養基、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要適合鼠李糖乳桿菌或其代謝產物特性和所需的特定給藥方式。在製備藥物組合物中通常使用的佐劑也可有利地被包括，例如調味劑、色素、防腐劑和抗氧化劑如維生素E、維生素C、BHT和BHA。
從易於製備和給藥的立場看，優選的藥物組合物是固態組合物，尤其是片劑和固體填充或液體填充的膠囊。口服給藥是優選的。
本發明的主要優點在於(a)本發明的鼠李糖乳桿菌具有優異的抗細菌特性、具有優異的耐酸和膽汁酸鹽能力、以及具有優異的抗氧化能力。
(b)本發明的鼠李糖乳桿菌具有預防和治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸炎以及由大腸桿菌和其它腸道致病性細菌引起的腸炎、結腸炎和直腸炎的功能。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照《微生物實驗手冊》(James Cappuccino和Natalie Sherman編，Pearson Education出版社)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1樣品的來源和採集本發明菌株來源於中國的2個長壽村，也是世界第4和第5個長壽村——廣西巴馬瑤族自治縣和新疆和田地區長壽老人糞便。
巴馬縣位於廣西的西北部，屬於山地丘陵地帶。平均海拔在400-600米，負氧離子多，空氣清新。當地人多分散居住在山區、河谷、林區，無噪音。巴馬地處亞熱帶，植物生長茂盛，四季常青，有利於保護視力。植物種類多達2000種以上，降水量和水利資源豐富。飲水都是相當程度的硬水，含有大量多種微量元素。雨熱同季，春涼秋爽，夏天無酷暑，冬暖無嚴寒。得天獨厚的自然環境為巴馬人長壽提供了良好的自然條件。
和田位於新疆最南端，古稱于闐，藏話意思為「產玉石的地方」。是絲綢之路南道上的重鎮。和田地區總面積為24.8萬平方公裡，人口150萬。其中維吾爾族佔總人口的97％以上。早在商周時期，古于闐就和中原有過物質交流。公元前68年，漢宣帝「遣衛司護鄯以西之諸國」，于闐正式納入漢朝中央政府的統轄之下。古于闐是西域最早的佛教中心，有豐厚的佛文化遺產；許多著名高僧如晉時法顯、唐時玄奘都曾涉足和田。而濃鬱、獨特的民俗風情，更使人耳目一新，飽領異域風採。和田氣候溫暖，特產豐富，民風淳樸，素以「金玉之邦、糧棉之倉、絲綢之路、瓜果之鄉著稱於世。並以玉石、地毯、絲綢等傳統物產享譽海內外。這裡有世界第二大沙漠的勝景，兩千年歷史的絲綢古蹟，以及人與大自然搏鬥創造的沙漠綠洲、千裡葡萄長廊等人文景觀。
本發明樣品採集分3次，其中廣西2次，新疆1次。廣西採取兩個典型長壽家族不同世代的糞便及當地長壽典型村落巴馬瑤族自治縣甲篆鄉平安村巴盤屯長壽老人的糞便，對象包括巴馬90歲以上的健康長壽老人23位，其中百歲以上的長壽老人6位。
新疆採取主要針對和田地區周邊50公裡範圍內，分布在3個區的18位90歲以上的長壽老人。
實施例2從長壽老人糞便中分離出乳酸菌菌種篩選共進行了5年(2000-2005)，從廣西巴馬及新疆和田長壽老人(90歲以上)54個糞便樣品浸入MRS肉湯培養物中，在37℃厭氧培養24小時。將該培養物塗布在MRS瓊脂平板上，然後在37℃培養3天。培養後，收集在瓊脂培養基上出現的菌落，並進一步純化，利用菌落形態篩選共獲得1000多株產酸菌，通過對其產物測定獲得乳酸菌，根據生長特點、代謝特徵，並選用特異性培養基，獲得優勢乳酸菌。從3種優勢乳酸菌中，根據其特性，獲得優良特性乳酸菌一株。所述的鼠李糖乳桿菌已經保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No.1531，保藏日為2005年11月10日。
用其檢測細菌特徵，包括生理生化反應，以及如下文所述的革蘭氏染色、糖發酵能力等(特性鑑定方法如下文所述)。
分離菌株添加10％脫脂乳的肉湯培養物，培養、凍幹、保存在-18℃，然後用於檢測細菌各種特徵試驗。
實施例3乳酸菌菌株革蘭氏染色採用革蘭氏染色法檢測菌株的特徵。結果如圖1所示，本發明的菌株呈革蘭氏陽性菌，為無芽孢，棒狀，大小為1.0-1.5μm，這是乳桿菌屬的典型特徵。
然後，研究該乳酸菌，以闡明其培養特徵。結果是，該菌種在MRS瓊脂平板上長成直徑為2-3mm的灰色菌落，最佳培養溫度在37℃。
實施例4使用API KIT 50 CHL對菌株進行分析在37℃，在厭氧條件下將該菌株在MRS瓊脂平板上培養48小時，然後用懸浮培養基將所得培養物懸浮，懸浮液的濁度與McFarland 2的相同。然後，將該培養細胞接種到API 50 CHL試劑條(購自法國生物梅裡埃公司)中，在其上層覆蓋一層無菌石蠟，以便檢測對49種碳水化合物的發酵能力。
使用API識別軟體程序(法國生物梅裡埃公司)分析了碳水化合物發酵能力。結果見圖2和表1。表1中，0表示對照小管，GLY-5KG(共49種)表示各種供本發明的鼠李糖乳桿菌發酵的碳水化合物，分別對應於圖2中各個小管(陽性結果如果發酵碳水化合物，由於培養物中所含溴甲酚紫指示劑產酸作用從紫變黃，七葉靈測定(25號管)則從紫變黑)，軟體分析結果顯示本發明的菌株的糖發酵能力與其它經驗證的鼠李糖乳桿菌相似，相似度99％以上。表1中所用碳水化合物GLY-5KG各縮寫的意義可參見法國生物梅裡埃中國有限公司提供的操作手冊——《API細菌鑑定金標準》，122-125頁。
表1

實施例5總基因組DNA的抽提將本發明菌種接種到脫脂乳培養基活化，平板劃線分離(MRS瓊脂培養基)，挑取單菌落接種液體培養基，置於CO2恆溫箱深層厭氧培養(溫度37℃ 濃度10％)，48小時後收集試管底部的乳酸菌細胞，用於基因組DNA的抽提。取1.5mL細胞培養液於離心管，6000g離心5min棄上清；沉澱用3mL生理鹽水(85％NaCl)洗滌菌體細胞3-5次；沉澱細胞加1200μL抽提緩衝液，並使之懸浮，250μL10％SDS和750μL氯化苄。振蕩混勻，60℃振蕩水浴保溫40min，其間隔10min顛倒混勻數次，可適當延長時間至1h，效果更好；超聲波處理10min；加入750μL3M的NaOAc(pH5.0)，冰浴20min；8000g離心10min收集上清，加0.8倍體積的異丙醇10000g離心10min沉澱；得到的DNA用70％的乙醇洗滌，溶於150μL的TE緩衝液，加入RNase在37℃消化1h進一步去除RNA。
將提取的乳酸菌基因組DNA樣品，各取10uL用1％的瓊脂糖進行凝膠電泳，EB染色後，在凝膠成像系統上觀測，分析純度和基因組DNA的完整性。然後將提取的乳酸菌基因組DNA樣品在紫外分光光度計上測量OD260nm和OD280nm，對DNA濃度進行定量。
實施例616S rRNA測序分析由於對於細菌來說，16s rRNA是比較穩定的，因此16s rRNA的序列分析是細菌鑑定的很好方法。
將提取的實驗菌株的基因組DNA作為模板用於聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴增16S-rDNA序列。
用於本發明乳酸菌的16S-rDNA測序分析的引物為上遊引物(SEQID NO2)5』-AGAGT TTGAT YMTGG CTCAG-3』(其中，Y、M代表兼併引物，Y代表(CT)，M代表(AC))下遊引物(SEQ ID NO3)5』-ACGGT TACCT TGTTA CGACTT-3』PCR反應體系組成為PCR反應的總體積50μL，其中含10×PCR緩衝液5μL，2.5mmol/L dNTPs 4.0μL，5U/μL Tag酶2.0μL， 50pmol/μL上遊引物4.0μL，50pmol/μL下遊引物4.0μL，20ng/μL模板DNA 5.0μL，ddH2026μL。
反應程序為95℃預變性5min，95℃變性1min 55℃退火50s，72℃延伸2min30次循環；95℃變性1min 55℃退火50s，72℃延伸2min 1次循環；72℃後延伸10min 1次循環。
擴增產物在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳分離，用0.5μg/mL的溴化乙錠染色，在凝膠成像系統上觀察分析後用凝膠抽提試劑盒(購自上海博彩生物工程公司)回收1500bp大小的DNA片段，並克隆到pEGM-T載體(購自申能博彩公司)中，按分子克隆手冊上提供的方法轉化大腸桿菌，在含有氨苄青黴素的IPTG/X-galLB平板上進行篩選，挑取陽性克隆經鑑定後，測定16S-rDNA序列。測序結果見圖3，16S-rDNA序列見圖4(即SEQ ID NO1)。
實施例7使用BLAST分析核苷酸序列數據將上述測定的16S-rRNA序列使用BLAST程序(美國生物信息中心網站，NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov)同已知的多種鼠李糖乳桿菌進行同源性比較，根據獲得的距離值，建立系統樹。
結果發現，本發明的鼠李糖乳桿菌的16S-rRNA序列與目前已知的其它所有鼠李糖乳桿菌的相應序列皆不同，與鼠李糖乳桿菌的同源性最高(達95％以上)。
實施例8特異性引物鑑定鼠李糖乳桿菌本發明人根據鼠李糖乳桿菌16S rRNA和23S rRNA設計了一種屬特異性引物，如表2。
表2引物

本發明人採用20μl PCR反應體系(PCR條件同上)，結果發現L73R和LC4F引物進行聚合酶鏈式反應時，在730bp和448bp的片段在試驗株(泳道3)和其它鼠李糖乳桿菌(泳道4，5，6分別為鼠李糖乳桿菌6012、鼠李糖乳桿菌6013、鼠李糖乳桿菌grx05，均購自揚州大學)中是共有的，而其它條帶則互不相同。結果見圖5。
實施例9多重RAPD PCR分析對本發明中的鼠李糖乳桿菌菌株以及已知的鼠李糖乳桿菌菌株的基因組DNA進行隨機多態性擴增(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)分析，以比較該菌株與其它鼠李糖乳桿菌菌株在基因組DNA的差異。本實施例中其它鼠李糖乳桿菌菌株包括泳道1為鼠李糖乳桿菌6012，泳道2為鼠李糖乳桿菌grx01，泳道3為鼠李糖乳桿菌grx02；泳道4為鼠李糖乳桿菌grx03，泳道5為本發明菌株，泳道6為鼠李糖乳桿菌grx05，泳道7為鼠李糖乳桿菌grx07，泳道8為鼠李糖乳桿菌grx09。(鼠李糖乳桿菌6012，鼠李糖乳桿菌grx02；鼠李糖乳桿菌grx03，鼠李糖乳桿菌grx05，鼠李糖乳桿菌grx07，鼠李糖乳桿菌grx09均購自揚州大學)。
根據前面所述方法進行乳酸菌基因組DNA的提取，完整性和濃度分析後取100ng基因組DNA樣品按如下方法進行RAPD分析。合成的隨機引物的序列如表1所示。採用經過優化的RAPD擴增反應體系反應的總體積25μL，其中含10×PCR緩衝液2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2.0μL，5U/μL Tag 酶1.0μL，50pmol/μL隨機引物2.0μL， 20ng/μL模板DNA 5.0μL，ddH20 12.5μL。反應程序為93℃2min，36℃1min，72℃2min 1次循環；93℃1min，36℃1min，72℃2min，40次循環；93℃1min，36℃1min，72℃10min 1次循環(在進行隨機引物的篩選中，針對不同的引物，需要對退火溫度進行適當的調整)。擴增完畢，在1.4％瓊脂糖凝膠上，加含EB0.5μg/mL電泳分離，在凝膠成像系統上拍片分析。本實驗從30條隨機引物(序列見表3所示)中篩選到1條在種和菌株水平具有良好鑑別力的的引物OPG4。
結果如圖7所示，表明在850bp處與其他菌株具有明顯差異，OPG4引物可以用於篩選鑑定出本發明的菌株。
表3RAPD分析中所使用的隨機引物


注*表示經篩選具有菌株水平特異性的隨機引物在前面的試驗中，本發明人通過採用多重RAPD-PCR技術來篩選隨機引物從而產生菌株特異性的標記。通過對30條隨機引物不同的組合，產物片斷介於0.6-2.2kb。在引物5′-ACGAGGCAC-3′和5′-ACGCGCCCT-3′組合的PCR產物分析中發現，在613bp處存在一菌株特異性標記，可以用以鑑定鼠李糖乳桿菌。將此產物回收克隆測序，並在克隆片斷的序列末端設計引物(表4)表4引物

結果見圖6，在該菌株中發現約150bp和448bp的片段，與其他鼠李糖乳桿菌不同，證實該菌株有其特有的特性。
實施例10對本發明菌株和鼠李糖乳桿菌DNA進行核苷酸序列比較測定本發明菌株和鼠李糖乳桿菌MCRF-412、鼠李糖乳桿菌MCRF-271的16s-rDNA核苷酸序列比較，本發明菌株在第545位的核苷酸為G，而鼠李糖乳桿菌MCRF-412、鼠李糖乳桿菌MCRF-271中為C。
實施例11本發明菌株LV108對ICR小鼠的安全性為了檢測LV108的安全性，選擇使用ICR小鼠。具體是，將LV108菌株接種到11％脫脂乳中培養24h(約5×109cfu/mL)，取健康小鼠20隻，雌雄各半，體重20±2g，飼養觀察一日，活動正常，進食狀況良好，實驗前禁食12小時後稱重，分別按0.4mL/10g灌服樣品，2次/天，給藥後即對動物的精神狀態、毛色、自主活動、呼吸、飲食、二便、口鼻分泌物等一般狀況及死亡情況進行觀察，連續餵養7天，2個月後檢測其安全性，結果如表5所示。
表5本發明的乳酸菌的安全性

由表5可見，小鼠對該菌發酵液的最大耐受量為80mL/kg。給藥後小鼠未出現不適症狀，小鼠活動有所減少，餘基本正常，在整個觀察期間精神狀態良好、毛色光潔、活動自如、呼吸均勻、口鼻內無異常分泌物，動物飲食量正常，便軟，小便無異常。觀察一周後，稱體重，周體重增長率為25.1％。於2個月後脫頸椎處死動物，並對所有動物進行屍檢，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等內臟器官均未見任何異常。
將給藥小鼠的胃、小腸和大腸中的粘液塗布到MRS瓊脂平板上，於37℃培養48小時，從給藥組中分離出大量的乳酸菌LV108株，但是在對照組中未檢測到。
實施例12本發明菌株LV108的抗酸及抗膽鹽能力研究了鼠李糖乳桿菌LV108的抗酸和抗膽鹽能力，在MRS培養基上，用混合酸將MRS培養基分別調節成pH2.0 MRS培養基、pH3.0 MRS培養基、pH4.0 MRS培養基，在pH2.0 MRS培養基、pH3.0 MRS培養基中各加入2.0％、3.0％、4.0％、5.0％的膽汁酸鹽。
在不同的培養基中，按2％的接種量接種試驗菌的培養液，置37℃分別培養1h、2h、3h、4h、5h、6h、16h，以Oh為對照，檢測活性乳酸菌數。
結果表明，本發明菌株可以在pH2、3.0％膽汁酸中放置5小時，仍有活性乳酸菌數檢出。在pH3、3.0％中存活率高於pH2、3.0％中的存活率。證明本發明菌株具有較強的抗酸及抗膽鹽能力。
實施例13鼠李糖乳桿菌LV108對人結腸腺癌細胞系Caco-2細胞的體外粘附性試驗為了檢測本發明菌株的粘附能力，本發明人進行了人結腸腺癌細胞系Caco-2細胞(購自中科院上海生化所)的體外粘附性試驗(見圖8)，本試驗菌株在人結腸腺癌細胞系Caco-2細胞表面緊密粘附了大量本發明菌株，通過實驗發現本發明菌株平均達到18.7±5.92個/細胞，較其它乳酸菌多，平均較一般鼠李糖乳桿菌高出約6.0個/細胞。
同時測定了本發明菌株對致病性大腸桿菌粘附的競爭性抑制作用，並與鼠李糖乳桿菌6012、鼠李糖乳桿菌6013作了比較，本發明菌株競爭性粘附抑制作用強。
實施例14鼠李糖乳桿菌LV108的抗氧化能力本發明人研究了鼠李糖乳桿菌LV108對實驗小鼠(ICR小鼠，雌雄各半，體重20±2g，購自南京江寧湯山青龍實驗動物中心)抗氧化能力的影響。採用正常小鼠分別灌胃給予鼠李糖乳桿菌發酵乳(約1×109cfu/g)，設立(設高、低兩個劑量組)，另設對照組和陽性對照品(維生素E9mg/kg)，每組10隻小鼠，按40mL·kg-1·d-1等容量不等濃度灌胃給予受試品和陽性對照品維生素E，連續8天，對照組同時灌胃生理鹽水。末次灌胃後1小時摘眼球取血，分離血清測試SOD活力和MDA含量。按黃嘌呤氧化酶法(SOD試劑盒購自南京聚力生物製品公司)測定血清中的SOD含量；按硫代巴比妥酸法(MDA試劑盒購自南京聚力生物製品公司)測定血清中的MDA。
結果見表6。鼠李糖乳桿菌發酵乳與對陽性照品維生素E使SOD活力增高，MDA含量降低，與對照組比較差異非常顯著。說明鼠李糖乳桿菌LV108可不同程度增強小鼠的抗氧化能力，減少體內脂質過氧化產物的生成。
表6鼠李糖乳桿菌發酵乳抗氧化功能試驗測定結果

與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01實施例15鼠李糖乳桿菌LV108對大腸桿菌的抑制作用將大腸桿菌0157H7(購自揚州大學)接種於營養肉湯中，37℃培養18h後，平板計數法計活菌數。控制其活菌數約106cfu/mL，此濃度易致病。吸取菌液0.5mL於相應固體培養基平板上，用無菌塗抹棒，於超淨工作檯內通無菌空氣，放置1h待表面的菌液固定在平板的表面後打孔，孔的直徑4mm。孔深3mm，將調整好濃度的乳酸菌菌液注至滿孔，不可溢出孔外，於各自生長環境培養48h觀察結果、測量抑菌圈直徑；同時用鼠李糖乳桿菌6012(購自揚州大學)做對照。
本發明菌株對大腸桿菌0157H7的抑菌圈直徑為12.6mm(圖10)，而鼠李糖乳桿菌6012抑菌圈為12.0mm，顯示鼠李糖乳桿菌LV108有較強的抑制作用。
實施例16鼠李糖乳桿菌LV108對幽門螺旋桿菌的抑制作用將凍融後的幽門螺旋桿菌(購自中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所)。吸取少量於Skirrow氏培養基表面，稍推開後，置於密封罐中37℃培養，密封罐內創造微氧環境(85％N2，10％CO2，5％O2)，抽成真空，充填CO2氣體和N2氣體。用生理鹽水將培養皿表面的菌落洗脫下來，同麥氏標準比濁管進行比濁，確定菌數，使其濃度控制在105cfu/mL。吸取菌液0.5mL於相應固體培養基平板上，用無菌塗抹棒，於超淨工作檯內通無菌空氣，放置1h待表面的菌液固定在平板的表面後打孔，孔的直徑4mm。孔深3mm，將調整好濃度的乳酸菌菌液注至滿孔，不可溢出孔外，於適宜生長環境培養48h觀察結果並測量抑菌圈直徑；同時用鼠李糖乳桿菌6012(購自揚州大學)做對照。
本發明菌株對幽門螺旋桿菌抑菌圈直徑為12.7mm(圖9)，而鼠李糖乳桿菌6012僅為9.5mm，顯示鼠李糖乳桿菌LV108對幽門螺旋桿菌較強的抑制作用。
實施例17含鼠李糖乳桿菌的食物組合物原料配比如表7。
表7

按上述配方比例，將鮮奶加熱到50℃以上，加入白砂糖攪拌至完全，預熱到60-65℃，20Mpa壓力均質，90℃左右殺菌5-10分鐘，冷卻至40-43℃，接種。接種數量為每1g上述混合物接種嗜熱鏈球菌6035(購自揚州大學)1-100×106cfu、保加利亞乳桿菌6032(購自揚州大學)1-100×106cfu、鼠李糖乳桿菌LV108 1-50×106cfu。
40-42℃發酵至pH值為4.2-4.5，攪拌，充填，冷藏，即製成含活性鼠李糖乳桿菌的酸奶。
實施例18含鼠李糖乳桿菌的藥物組合物原料配比如表8。
表8


按照比例將脫脂奶粉、乳糖、酵母粉、蛋白腖以純淨水混合均勻，預熱到60-65℃，20Mpa壓力均質，90℃左右殺菌20-30分鐘，冷卻至36-38℃，接入鼠李糖乳桿菌活菌(1-50×106cfu/mL)，36-38℃發酵至pH值為4.2-4.5，離心，冷凍乾燥至水份含量小於3％，即製備成鼠李糖乳桿菌冷凍乾燥物。稱取0.5克鼠李糖乳桿菌冷凍乾燥物與麥芽糊精等量混合後裝入膠囊中，即製成含鼠李糖乳桿菌的藥物組合物。
菌種保藏本發明的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)LV108已經保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No.1531，保藏日為2005年11月10日。
應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110統一企業(中國)投資有限公司統一企業(中國)投資有限公司崑山研究開發中心120一種新穎的耐酸耐膽鹽、抗腸道致病菌和抗氧化能力鼠李糖乳桿菌株13005928116037170PatentIn version 3.321012111666212DNA213Lactobacillus rhamnosus4001tgcatgcctg caggtcgact ctagactcga gggatccaga tctccagtct tacggttacc 60ttgttacgac ttcaccctaa tcatttgtcc caccttagac ggctcgctcc ctaaaagggt 120tacgccaccg gcttcgggtg ttacaaactc tcatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc 180ccgggaacgt attcaccgcg gcgtgctgat ccgcgattac tagcgattcc gacttcgtgt 240aggcgagttg cagcctacag tccgaactga gaatggcttt aagagattag cttgacctcg 300cggtctcgca actcgttgta ccatccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg 360catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt cttactagag 420tgcccaacta aatgctggca actagtcata agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca 480acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gtcattttgc ccccgaaggg 540gaaagctgat ctctcaggtg atcaaaagat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc 600ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc 660aaccttgcgg tcgtactccc caggcggaat gcttaatgcg ttagctgcgg cactgaaggg 720cggaaaccct ccaacaccta gcattcatcg tttacggcat ggactaccag ggtatctaat 780cctgttcgct acccatgctt tcgagcctca gcgtcagtta cagaccagac agccgccttc 840gccactggtg ttcttccata tatctacgca tttcaccgct acacatggag ttccactgtc 900ctcttctgca ctcaagtttc ccagtttccg atgcacttcc tcggttaagc cgagggcttt 960cacatcagac ttaaaaaacc gcctgcgctc gctttacgcc caataaatcc ggataacgct1020tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt ctggttggat1080accgtcacgc cgacaacagt tactctgccg accattcttc tccaacaaca gagttttacg1140acccgaaagc cttcttcact cacgcggcgt tgctccatca gacttgcgtc cattgtggaa1200gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtt tgggccgtgt ctcagtccca atgtggccga1260tcaacctctc agttcggcta cgtatcattg ccttggtgag ccgttacctc accaactagc1320taatacgccg cgggtccatc caaaagcgat agcttacgcc atctttcagc caagaaccat1380gcggttcttg gatttatgcg gtattagcat ctgtttccaa atgttatccc ccacttaagg1440gcaggttacc cacgtgttac tcacccgtcc gccactcgtt caaaattaaa tcaagatgca1500agcacctttc aataatcaga actcgttcga cttgcatgta ttaggcacgc cgccagcgtt1560catcctgagc cagaatcaaa ctctagacct ggtctgcagg cggccgccca tgggatatca1620tcgatcatat gtcgccctat agtgagtcgt attacggtac cgagct 1666210221120212DNA
213引物4002agagtttgat ymtggctcag 20210321121212DNA213引物4003acggttacct tgttacgact t 21210421120212DNA213引物4004agggtgaagt cgtaacaagt 20210521125212DNA213引物4005gccaacaagc tatgtgttcg cttgc 25210621110212DNA213引物4006aatcaacttc 10210721110212DNA213引物4007ttctttaatt 10210821110212DNA
213引物4008tttaacaact 10210921110212DNA213引物4009ctgcgctgga 102101021110212DNA213引物40010acgtatctgc 102101121110212DNA213引物40011gcgatcccca 102101221110212DNA213引物40012gtagacccgt 102101321110212DNA213引物40013gtttccgccc 102101421110212DNA213引物
40014ctgctgggac 102101521110212DNA213引物40015tgccgagctg 102101621110212DNA213引物40016gggaacgtgt 102101721110212DNA213引物40017aggcgggaac 102101821110212DNA213引物40018cagcacccac 102101921110212DNA213引物40019aggttgcagg 102102021110212DNA213引物40020aggtgaccgt 10
2102121110212DNA213引物40021ccgcagccaa 102102221110212DNA213引物40022aacgcgcaac 102102321110212DNA213引物40023gtggatgcga 102102421110212DNA213引物40024gtgacgtagg 102102521110212DNA213引物40025caatcgccgt 102102621110212DNA213引物40026gggaggcaaa 102102721110212DNA
213引物40027ccaagaggct 102102821110212DNA213引物40028tccccaggag 102102921110212DNA213引物40029agtgcacacc 102103021110212DNA213引物40030aggcatcgtg 102103121110212DNA213引物40031acgcgacaga 102103221110212DNA213引物40032agtatggcgg 102103321110212DNA213引物
40033ggaagtcctg 102103421110212DNA213引物40034ccaggctgac 102103521110212DNA213引物40035ggtcgggtca 102103621122212DNA213引物40036ctatttagta atcacagaaa ac222103721120212DNA213引物40037taacagcagt ctccaaatgg 20
權利要求
1.一種鼠李糖乳桿菌，其特徵在於，所述鼠李糖乳桿菌在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.1531。
2.權利要求1所述的鼠李糖乳桿菌和/或其代謝產物的用途，其特徵在於，用於製備抑制幽門螺旋桿菌、大腸桿菌或其它腸道致病性菌的食物和/或藥物。
3.權利要求1所述的鼠李糖乳桿菌和/或其代謝產物的用途，其特徵在於，用於製備預防和/或治療細菌性消化道疾病的食物和/或藥物。
4.如權利要求3所述的用途，其特徵在於，所述的細菌性消化道疾病包括胃炎、胃潰瘍、十二指腸炎、腸炎、結腸炎或直腸炎。
5.權利要求1所述的鼠李糖乳桿菌和/或其代謝產物的用途，其特徵在於，用於製備抗氧化的食物和/或藥物。
6.一種食物組合物，其特徵在於，其中含有有效量的權利要求1所述的鼠李糖乳桿菌和/或其代謝產物，以及餘量的食品上可接受的載體。
7.如權利要求6所述的食物組合物，其特徵在於，所述的食物組合物選自固體、乳品、溶液製品、粉末製品、或懸浮液製品。
8.一種藥物組合物，其特徵在於，其中含有有效量的鼠李糖乳桿菌和/或其代謝產物，以及藥學上可接受的載體。
9.如權利要求8所述的藥物組合物，其特徵在於，所述的藥物組合物劑型選自顆粒劑、膠囊、片劑、粉末劑、口服液、混懸液、或乳劑。
10.如權利要求6或8所述的食物組合物或藥物組合物，其特徵在於，所述的組合物的配方如下102-1012cfu/mL或102-1012cfu/g的鼠李糖乳桿菌和/或其代謝產物；以及餘量為食品上或藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明公開了一種新的鼠李糖乳桿菌菌株(Lactobacillus rhamnosus)，該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo.1531。本發明還提供了所述鼠李糖乳桿菌和/或其代謝產物的用途。本發明的菌株從長壽老人的排洩物中篩選獲得，具有優異的抗菌特性，並具有耐酸和膽汁酸鹽能力以及優良的抗氧化能力，食用安全，從而可廣泛用於乳品加工、功能食品生產等領域。
文檔編號A61K35/74GK1982437SQ200510111588
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月16日 優先權日2005年12月16日
發明者陳順利, 顧瑞霞, 李正華, 席文博, 沈琴 申請人:統一企業(中國)投資有限公司, 統一企業(中國)投資有限公司崑山研究開發中心