用於促進神經細胞分化的含有環狀甘油磷酸酯及其類似物的藥物組合物的製作方法
2023-10-17 19:15:04
專利名稱：用於促進神經細胞分化的含有環狀甘油磷酸酯及其類似物的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及含有環狀甘油磷酸酯及其類似物的藥物組合物以及治療與神經有關的疾病和病症的方法。
在生物學上最為重要的6元環狀磷酸酯是環AMP。環AMP的環實際上1，3 cGP骨架的衍生物。在生物學系統中檢測到的其它環狀磷酸酯包括葡萄糖環狀磷酸二酯(Leloir，1951)、2』，3』-環狀磷酸二酯(Markham和Smith，1952)、核黃素-4』，5』-環狀磷酸二酯(Forrest和Todd，1950)、肌醇-1，2-環狀磷酸二酯(Dawson等，1971)和環狀溶血磷脂酸(Friedman等，1996)。
除了被廣泛研究的環AMP和環GMP外，到目前為止還沒有提出關於其它生物學環狀磷酸酯的具體的生物學活性。
有許多病症和疾病是由腦區域的退化和神經元的損失所引起的。所述疾病的一個例子是神經變性疾病如帕金森氏症(PD)。該疾病通常涉及產生多巴胺的神經元的變性。目前常用的治療方法主要是用藥物連續地刺激多巴胺受體，雖然該方法在開始時可以引起症狀的緩解，但會逐漸失去效力。此外，這些藥物也不能阻止這些疾病所特有的多巴胺神經元的進行性變性。
有許多生長因子例如神經生長因子(NGF)、基礎成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子、腦衍生的生長因子和神經膠質衍生的神經營養因子(Knusel B.等，1990；Knusel等，1991；Linn等，1993)可以在體外刺激多巴胺能神經元的存活和分化。在涉及誘導帕金森氏症的動物模型中，當用GDNF(Tomac，A.等，1995)和睫狀神經營養因子(CNTF)(Hagg，T.和Varon 1993)等因子進行治療時，誘導的動物顯示出行為的改善和酪氨酸羥化酶(TH)的增加，所述TH是多巴胺生成途徑免疫反應性的關鍵酶。化合物及其縮寫的列表在本說明書中，將下列化合物(其結構式如權利要求書之前的附錄A中所示)用如下縮寫表示1. 1，3環甘油磷酸酯-1，3 cGP2. 1，2環甘油磷酸酯-1，2 cGP3. 3-醯基1，2環甘油磷酸酯(環狀溶血磷脂酸)-c-lysoPA4. 苯基1，3 cGP-P-1，3 cGP5. 苯基1，2 cGP-P-1，2 cGP6. 1，3環狀丙二醇磷酸酯-1，3 cPP7. 1，2環狀丙二醇磷酸酯-1，2 cPP8. 苯基1，3cPP-P-1，3 cPP9. 苯基1，2，環狀丙二醇磷酸酯-P-1，2，cPP10. 環狀二羥基丙酮磷酸酯-cDHAP11. 苯基環狀二羥基丙酮磷酸酯-P-cDHAP術語表以下是上文中以及隨後的說明書和權利要求書中所用術語的解釋CG-本發明所用的環狀甘油磷酸酯及其類似物。促進神經細胞分化-該術語涉及本發明所用的CG在與細胞接觸後引起所述細胞成熟成為神經細胞的能力。該活性可以通過以下實施例中所述的體外和體內試驗之一進行評估。體外試驗的一個例子是使能夠分化成神經細胞的細胞(例如PC 12細胞)在試驗化合物的存在下生長並通過顯微鏡下評估來測定細胞內的神經分支。體內試驗可以涉及，例如，將存在受損的多巴胺能神經元的動物用試驗化合物治療並測試運動和肢體震顫參數以及就地測定與所治療動物的多巴胺能傳導有關的分子。靶細胞-能夠成熟成為神經細胞的任何細胞。該細胞的非限定性實例是PC 12和初級腦細胞。類似物-涉及從本發明的環狀甘油磷酸酯之一衍生的並且基本保持了衍生前的環狀磷酸酯的活性的任何化合物，包括，例如環狀甘油磷酸酯的脫氧類似物和苯酯類似物，優選脫氧類似物。基本保持-該術語涉及類似物將衍生前的環狀甘油磷酸酯所具有的活性實現到一定程度的能力。當活性為環狀甘油磷酸酯的活性水平的30％或以上，優選50％或以上，更優選70％或以上，首選90％或以上時，可以認為類似物的活性是基本保持了。有效量-當本發明的方法是用於預防不希望的病症時，術語「有效量」應理解為是指在給藥時可以防止所述病症出現的活性化合物的量。預防所述病症例如神經變性病症需要在疾病的任何症狀出現之前，例如在發生疾病的高危險性個體中進行，或者當組合物是用於治療神經損傷後所期望的神經拯救時。當組合物或方法是用於治療進行性的不希望的病症時，術語「有效量」應理解為是指可以有效改善或預防所治療的病症和相關症狀加強的活性化合物的量。神經促進活性-該術語包括當與本發明所用的CG接觸時可以在靶細胞內促進的各種與神經有關的活性。所述活性包括但不僅限於促進神經生長、在生病的大腦中提供多巴胺營養支持環境、防止神經變性和神經拯救。預防或治療-根據本發明，術語「病症和疾病的預防」應理解為是指在存在發生所述病症和疾病的高危險因素的個體中降低所述病症和疾病出現的可能性、降低在所述病症和疾病出現時與所述病症和疾病有關之症狀的程度或完全預防它的出現。
根據本發明，所述病症或疾病的治療是指改善與病症或疾病有關的症狀、降低所述症狀的程度或完全消除所述症狀。
因此，第一方面，本發明提供了用於促進靶細胞中的神經細胞分化的藥物組合物，該組合物含有可藥用載體以及作為活性成分的通式I的化合物 其中Y是-(CH2)m-、-CH(OH)-或-C(＝O)-，m是0-3；X是H、烷基、-CH2OH-、CH2O醯基或-CH2醯基；R是H、陽離子、烷基或選擇性取代的芳基。
本文所用的術語「烷基」是指含有約1至約24個碳原子，例如，優選約3個碳原子至約20個碳原子，首選約5個碳原子至約15個碳原子的烷基；術語「醯基」是指脂肪族的飽和或不飽和C1-C24醯基，優選含有偶數碳原子的醯基，首選從天然脂肪酸衍生的醯基，例如選自乙醯基、丁醯基、己醯基、辛醯基、癸醯基、月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基和硬脂醯基的飽和脂肪族醯基，或選自棕櫚油醯基、油醯基、亞油醯基和蓖麻油醯基的不飽和脂肪酸；術語「芳基」是指單或多個碳環的芳基，首選苯基，其選擇性地被C1-C4烷基、滷素和/或羥基所取代。R可以是任何生理上適宜的陽離子，優選Na+。
在一個實施方案中，Y是-CH(OH)-，X是H，R是H或苯基。根據該實施方案，組合物含有1，3環甘油磷酸酯(1，3 cGP)或苯基1，3環甘油磷酸酯(P-1，3 cGP)。
在另一個實施方案中，Y是-C(＝O)-，X是H，R是H或苯基。根據該實施方案，組合物含有環狀二羥基丙酮磷酸酯(cDHAP)或苯基環狀二羥基丙酮磷酸酯(P-cDHAP)。
在又一個實施方案中，Y是-(CH2)m-，m是0，X是-CH2OH，R是H或苯基。根據該實施方案，組合物含有1，2環甘油磷酸酯(1，2 cGP)或苯基1，2環甘油磷酸酯(P-1，2 cGP)。
在又一個實施方案中，Y是-(CH2)m-，m是0，X是C1-C24烷基、優選-CH3，R是陽離子或苯基。根據該實施方案，組合物含有1，2環狀丙二醇磷酸酯(1，2 cPP)或苯基1，2環狀丙二醇磷酸酯(P-1，2cPP)。
在又一個實施方案中，Y是-(CH2)m-，m是1，X是C1-C24烷基、優選-CH3，R是陽離子或苯基。根據該實施方案，組合物含有1，3環狀丙二醇磷酸酯(1，3 cPP)或苯基1，3環狀丙二醇磷酸酯(P-1，3cPP)。
在又一個實施方案中，Y是-(CH2)m-，m是0，X是-CH2(C1-C24)醯基、優選油醯基，R是陽離子。根據該實施方案，組合物含有3-醯基-1，2環甘油磷酸酯(環狀溶血磷脂酸-c-lyso PA)。
本發明所用的CG可以顯示多種神經促進活性中的一種，包括但不僅限於促進神經元分支、促進神經生長、在大腦的生病區域提供多巴胺營養支持環境、防止神經變性和神經拯救。所有這些活性均落在神經促進活性的範圍內。
因此，本發明還提供了用於促進神經活性的藥物組合物，該組合物含有可藥用載體和作為活性成分的上述通式I的化合物。
本發明的藥物組合物促進神經細胞分化的能力以及在一種或多種上述途徑中的神經元活性使得它們特別適用於治療各種疾病。因此，本發明還提供了含有可藥用載體和作為活性成分的上述通式I化合物的藥物組合物，該組合物可用於預防或治療可以通過促進神經細胞分化和/或神經活性進行預防或治療的疾病。
所述疾病可以是精神疾病例如精神分裂症或痴呆，或是導致學習能力缺失的疾病。
此外，本發明的藥物組合物還可用於治療涉及多巴胺能神經細胞損傷的神經變性疾病。所述病症的例子是早老性痴呆(AD)或帕金森氏症(PD)。
包括在本發明範圍內的其它神經變性疾病是，由於個體接觸有害的環境因素例如危險的化學物質所引起的疾病、由於機械損傷(例如由於眼睛接觸機械損傷性的外部因素所引起的眼神經的損傷)所引起的神經變性疾病等。
此外，已知在原發的神經變性後，存在於變性神經附近的其它神經會發生繼發性變性。對患有原發性神經變性疾病的個體進行治療可以預防或減少存在於變性神經附近的其它神經的繼發性變性的出現。該治療稱為「神經拯救」，也包括在本發明的範圍內。
又一方面，本發明提供了誘導促進靶細胞的神經細胞分化的方法，該方法包括，將所述靶細胞與有效量的上述通式I化合物接觸適當的時間。
適當的時間是指能夠使本發明的組合物產生其活性的時間。本領域技術人員很容易利用本文所述的方法確定對於各種組合物和靶細胞的適當的時間。通常，與某些已知的可以影響神經細胞的因子例如NGF相比，本發明所用的CG與靶細胞接觸以產生其作用所需的時間非常短(幾分鐘)。
根據本發明的又一方面，提供了在個體中促進神經活性的方法，該方法包括，向有需要的個體施用有效量的上述通式I的化合物。
本發明還提供了預防或治療可以通過促進神經細胞分化和/或神經活性進行預防或治療的疾病的方法，該方法包括，向有需要的人施用治療有效量的上述通式I的化合物。
本發明的方法可用於治療其中上述作用是有益的各種病症和疾病，即，其中CG的作用是改善或減少所治療病症或疾病的不希望的症狀。這些病症和疾病可以是，例如(但不僅限於)精神疾病例如精神分裂症或痴呆、導致學習能力缺乏的疾病、神經變性疾病例如早老性痴呆或帕金森氏症，以及預防或治療神經損傷後的神經拯救。
圖2顯示了在培養基中生長的(對照)(圖2A)、用直鏈的α和β甘油磷酸酯(分別為圖2B和2C)或環狀甘油磷酸酯和類似物1，3cGP、苯基-1，3 cGP、1，2 cGP、1，3 cPP和苯基-1，3 cPP(分別為圖2D-圖2H)或用NGF(圖2I)脈衝3小時的PC12細胞的照片。保溫後，將細胞洗滌然後在生長培養基中生長，照片顯示了在用各種因子處理7天後的細胞。僅在用上述環狀甘油磷酸酯和類似物處理的PC12細胞中觀察到了神經分支(圖D-H)。
圖3顯示了用對照培養基(圖3A)、αGP(圖3B)、βGP(圖3C)、濃度為0.5μM的各種CG1，3 cGP、苯基-1，3 cGP、1，2 cGP、1，3cPP和苯基-1，3 cPP(分別為圖2D-圖2H)和用NGF(圖3I)處理7天後PC 12細胞的照片。在與α或βGP(分別為圖3B和C)保溫後均沒有觀察到神經分支，而在與各種CG一起保溫的細胞中觀察到了不同程度的神經分支(圖3D-H)。在這些條件下，在與NGF一起保溫的細胞中觀察到了廣泛的神經分支(圖3I)。
圖4顯示了用對照培養基(4A)、50ng/ml NGF(4B)處理14天、用50ng/ml NGF處理7天然後洗滌並用不含NGF的生長培養基(4C)或2μM、4μM或6μM的1，3 cPP(分別為4D、4E和4F)處理7天的PC 12細胞的照片。
發明詳述環狀甘油磷酸酯可以通過酶降解磷脂來形成，該降解在大部分情況下會生成5或6元環的環狀甘油磷酸酯。含有通過酶降解磷脂和通過合成形成的環狀甘油磷酸酯的組合物均包括在本發明的範圍內。具有不到5個或6個以上碳原子的環的CG也包括在該範圍內。
本發明所用的環狀甘油磷酸酯及其類似物通常可以通過本領域已知的用於合成磷酸酯的任何一種方法來合成。以下具體描述了用於製備本發明環狀磷酸酯的具體方法(參見實施例)。
本發明的這些環狀甘油磷酸酯的類似物也包括在本發明的範圍內，這些類似物通常是1，3環狀磷酸酯的脫氧類似物以及苯酯。這些類似物也可以通過酶方法或本領域已知的合成方法來製備。
除活性成分外，藥物組合物還可含有本領域已知的各種載體。載體的性質取決於準備採用的給藥形式以及組合物所應用的適應症。組合物還可含有多種添加的成分，例如稀釋劑、潤滑劑、粘合劑、防腐劑等。
本發明的組合物可以通過任何適宜的方式給藥。優選的給藥方式是靜脈內、局部或口服，但有時也可以採用其它給藥方式。
通常，本發明的藥物組合物含有約1mg至約10mg活性成分/每公斤所治療個體的體重。
雖然本發明的組合物通常只含有單一的CG，但有時也可以在組合物中含有或者共同給藥兩種或多種CG，這些CG於是可以以協同或加合的方式發揮作用來預防或治療神經變性疾病。
本發明所用的CG可以以其異構體的形式使用(參見，例如構成附錄A中所述的合成1，3 cGP的四種立體異構體)。對於不同的目的，其中的一種異構體可能比其它異構體更為優選。
根據本發明，可將CG以單劑量給藥，或者在一段時間內反覆給藥。
還可以將本發明的組合物與其它治療藥物聯合向所治療的個體給藥，例如，當所治療的病症是神經變性疾病時，可將組合物與目前治療神經變性疾病所用的藥物例如多巴胺受體興奮劑、L-多巴一起或與生長因子例如NGF一起給藥。在所述聯合治療中，可將CG與其它治療藥物同時或以不同的時間給藥，以產生最大的預防或治療作用。
當原料化合物中含有一個或多個羥基時，即Y是-CH(OH)-和/或X是-CH2OH-時，必需對這些羥基進行保護，例如通過苄基化進行保護，然後在環化之後通過常規的催化氫化在適宜催化劑例如Pt或Pd的存在下將苄基除去。
反應在無水溶劑例如二氧六環或二氯甲烷中、在等量親核試劑例如吡啶或三乙胺的存在下進行。當R不是芳基時，終產物通常以鹽的形式得到。
以下將說明一系列已知的和新的5和6元環的環狀磷酸酯的合成。實施例11，3環甘油磷酸酯(1，3 cGP)的合成基本按照Buchnea(Buchnea，1973)所述的方法進行。簡單地講，將2-苄氧基-1，3-丙二醇(Aldrich)與等摩爾量的三氯氧磷(Aldrich)在二氯甲烷中反應。將形成的2-苄基-1，3 cGP在鈀黑的催化下用氫氣在甲醇中處理除去苄基殘基。以鋇鹽的形式分離得到1，3 cGP，其在紙色譜上是純淨的(正丙醇∶氨∶水6∶3∶1，Rf＝0.52)。
1，3 cGP還可以通過將磷脂醯甘油(PG)用磷脂酶C按照文獻中的描述(Shinitzky等，1993)裂解來製備。紙色譜表明該產物含有約10-20％的α-GP。實施例21，2環甘油磷酸酯(1，2 cGP)的合成該化合物按照文獻中的描述(Kugel，L.和Halmann，M.，J.Am.Chem. Soc.，894125-4128(1967)製備。將β-甘油磷酸酯的二鈉鹽(Sigma)先轉化成酸的形式，然後用二環己基碳二亞胺(A1drich)環化。以鋇鹽的形式分離得到產物，其在紙色譜上是純淨的。實施例3苯基1，3環狀甘油磷酸酯(P-1，3 cGP)的合成按照實施例1所述的製備1，3 cGP的方法，將2-苄氧基-1，3-丙二醇與苯基二氯代磷酸酯(Aldrich)反應。苄基化的中間體產物在薄層色譜(乙酸乙酯∶己烷3∶2 Rf＝0.58)上是純淨的，熔點136℃。將其按照實施例1所述進行氫化選擇性地除去苄基殘基。所得到的P-1，3 cGP(化合物III)在薄層色譜(同上)上是純淨的，Rf＝0.15，熔點為116℃。實施例41，3環狀丙二醇磷酸酯(1，3 cPP)的合成1，3 cPP通過將1，3-丙二醇(Aldrich)與等摩爾量的三氯氧磷反應然後按照Buwalda等，1997的描述進行純化製得。以游離酸的形式分離得到產物(熔點99-100℃)。
32P標記的1，3 cPP(1，3 cP32P)用32POCl3製得。後者通過將少量H332PO4(Amersham)引入到過量的冷的POCl3中製得(Neuhaus和Korkes，1958)。然後將反應在微量水平上進行，並通過與未標記的1，3 cPP一起共結晶分離出1，3 cP32P。實施例51，2環狀丙二醇磷酸酯(1，2 cPP)的合成1，2 cPP通過與實施例4相同的方法製備，但使用的是1，2-丙二醇(Aldrich)。該化合物以鋇鹽的形式分離得到，其在紙色譜上(正丙醇∶氨∶水6∶3∶1，Rf＝0.55)是純淨的。實施例6苯基1，3環狀丙二醇磷酸酯(P-1，3 cPP)的合成P-1，3 cPP按照與實施例4類似的方法，通過將1，3-丙二醇與等摩爾量的苯基二氯代磷酸酯在無水吡啶中反應進行製備。將產物用乙酸乙酯-己烷結晶兩次，熔點為72℃。實施例7苯基1，2環狀甘油磷酸酯(P-1，2 cGP)的合成該新化合物按照實施例3的方法通過將1-苄氧基-2，3-丙二醇與苯基-PO2Cl2反應然後通過選擇性地氫化除去苄基殘基製得。用乙醇-丙酮進行結晶，產物的熔點為95℃。實施例8苯基1，2環狀丙二醇磷酸酯(P-1，2 cPP)的合成該新化合物按照實施例6的方法通過將1，2-丙二醇與等摩爾量的苯基-PO2Cl2在乾燥吡啶反應製得。用乙酸乙酯-己烷進行結晶，產物的熔點為69℃。實施例9環狀二羥基丙酮磷酸酯(cDHAP)的合成該新化合物通過將POCl3與二羥基丙酮反應製得。
將1.8g(0.01M二聚體或0.02M單體)二羥基丙酮二聚體MW-180溶於20mL新蒸餾的二氯甲烷。
於室溫下向溶液中緩慢加入3.07g＝1.87mL(0.02M)磷醯氯(MW-153.5，d-1.645)的4mL MeCl2溶液。將溶液回流15小時(溶液為黑色)。蒸除二氯甲烷然後向溶液中加入100mL 90％丙酮/水。將反應混合物回流18小時。將黑色的溶液用活性碳在室溫下處理然後過濾。從得到的淺黃色溶液中蒸除丙酮和水，將非常細的結晶殘餘物溶於10mL丙酮。向溶液中加入0.01M BaJ2的80mL丙酮溶液，開始析出環狀二羥基丙酮磷酸酯鋇鹽的細的結晶。將沉澱用少量丙酮洗滌3次然後乾燥。將產物溶於少量水中然後用丙酮沉澱進行純化。得到的產物為白色結晶狀粉末，在紙色譜中(溶劑混合物∶正丙醇∶NH4H2O 6∶3∶1)Rf-0.50。實施例10苯基環狀二羥基丙酮磷酸酯(P-cDHAP)的合成該新化合物通過將苯基-PO2Cl2與二羥基丙酮在乾燥吡啶中反應製得。真空蒸除溶劑後，將殘餘物用乙酸乙酯萃取兩次。蒸除乙酸乙酯後得到油狀殘餘物。實施例11環狀油醯基溶血磷脂酸(c-lysoPA)的合成該新化合物通過將油醯基溶血磷脂酸(Avanti Polar Lipids)與過量的二環己基碳二亞胺(DCC)在二甲亞碸中反應製得。產物呈油狀。生物學部分材料和方法無限增殖PC 12細胞系是在神經元分化中研究得最多的一種細胞系。在神經生長因子的存在下，這些細胞可以分化成神經元細胞。使來源於大鼠嗜鉻細胞瘤的PC 12細胞以單層的形式在補充有10％胎牛血清、50μg/ml慶大黴素和5mM谷醯胺的Eagle’s培養基(EM)中在用5％CO2緩衝的潮溼恆溫箱中於37℃下生長。每隔4天更換一次培養基，細胞每隔8天傳代一次並形成融合的單層(在10cm的平皿中1.5×106個細胞，或在24孔板中每孔105個細胞)。PC 12細胞最初是圓形的細胞，在神經生長因子(NGF)的存在下經數天成為神經。在撤走NGF後，神經開始回縮並開始在細胞中發生細胞凋亡。在大鼠中誘導PD將Sprague-Dawley(SD)大鼠(重量230-250g)用氯胺酮加賽拉嗪腹膜內給藥進行麻醉，然後將它們的頭固定在立體定位架上。然後向中前腦束內注射6OH-DA(8mg/4mL)以單側地破壞多巴胺能末梢(Fitoussi，N.等神經科學(Neuroscience)，85(2)405-413)(1998))。疾病的症狀在2-3周內出現。
用旋轉計量試驗在行為上評估多巴胺能的切除，這是基於在受損傷一側多巴胺受體的向上調節。全身性給藥DA激動劑(阿樸嗎啡，0.25mg/kg，皮下)可以引起單側多巴胺能切除的大鼠的旋轉，旋轉方向朝向受損傷一側的對側。向大腦內給藥環狀甘油磷酸酯及其類似物用ALZET滲透泵(ALZET Corporation，Palo Alto，CA)將環狀磷酸酯給藥到大腦內。在評估了黑質紋狀體損傷(旋轉行為)後，用立體定位裝置將一個插管(30號)插入到大鼠SN內側0.5mm處。以1μl/小時的速率微量輸注環狀磷酸酯3或14天。大腦解剖和提取將大鼠斬首並迅速取出它們的大腦。然後將大腦置於放置在冰上的大鼠大腦模子中，切下0.5mm的連續部分然後置於冰冷的顯微鏡載物片上。迅速用內徑為1.1mm的不鏽鋼套管按照如下坐標進行組織鑽孔紋狀體，A1.5-2.0mm；SN，P5.5-5.0mm，包括大部分所需的區域。將組織樣品立即在液氮中冷凍並在-70℃下保存直到提取。提取通過將鑽出的組織融化然後將其在置於冰上的含有EDTA/乙醇(0.021％)的0.5mL高氯酸鹽溶液(0.1M)中進行探針超聲(80瓦，5秒，帶有Sonifier B-12；Branson，Danbury，CN)來完成。取樣(100μl)進行蛋白質分析，剩餘物進行離心(2000xg，10分鐘，4℃)，將得到的上清液(組織提取液)過濾(0.45μm Acrodisk，Gelman；Ann.Arbor. Ml)然後於-70℃下存放直至進行ELISA分析來測定ILS或GDNF或進行HPLC分析來測定5-HT和5-HIAA含量。GDNF的評估按照如下描述測定環狀甘油磷酸酯對於SVG細胞和腦組織提取液生成和釋放GDNF的影響。將細胞在含或不含環狀磷酸酯的條件下保溫12、24和48小時。離心後取出上清液並用ELISA試劑盒(ENDOGEN，MA，USA和PROMEGA，Madison，USA)分析GDNF。RNA的分離用Tri ReagentTM(Boehringer Mannheim，德國)從培養的細胞或組織提取液中分離總RNA。將細胞在試劑中溶解(106細胞/1mL試劑)。用玻璃聚四氟乙烯棒將冷凍的組織鑽取物用試劑勻化(50mg組織/1mL)。然後加入氯仿並通過離心將組織勻漿分成三相。小心地取出水相，防止破壞中間相或有機相，以避免基因組DNA汙染。通過加入異丙醇使RNA從水相中析出沉澱，用乙醇洗滌然後溶於用DEPC處理的水中。將RNA在260nm和280nm下進行分光光度檢測，在使用前於-80℃下存放。
在含有3μg總RNA、10mM引物dT(Boehringer Mannheim，德國)和1mM dNTP mix(Boehringer Mannheim，德國)的體積為20μl的反應中完成cDNA第一鏈的合成。於65℃加熱2分鐘並冷卻至4℃後，加入50單位M-MuLV逆轉錄酶和20單位RNAse抑制劑(Boehringer Mannheim，德國)引發反應。然後將混合物升溫至37℃60分鐘。在50μl的反應體積中完成cDNA的PCR。將cDNA第一鏈(2μl)加入到含有如下組分的PCR混合物中0.2mM dNTP mix(Boehringer Mannheim，德國)，1mM的各種寡核苷酸引物(引物按照公開的GDNF cDNA序列設計。5』-TCACCAGATAAACAAATGGC-3』{5』}和5』-TACATCCACACCTTTTAGCG-3』{3』}分別對應於鹼基81-101和460-480)(Biosource，CA，USA)和2.5U Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)。將反應液用礦物油覆蓋，然後於94℃變性2分鐘。用設定了40次循環的MJ Research熱循環控制裝置進行PCR，所述循環包括於94℃變性1分鐘，然後於55℃進行引物退火1分鐘和於72℃進行引物延伸1分鐘。在40次循環結束時，將反應混合物於72℃保持10分鐘。將PCR產物在2％瓊脂糖凝膠(含有溴化乙錠)上進行電泳分析。大腦中存活的細胞的免疫化學評估在實驗結束時，將動物用氯胺酮和賽拉嗪進行腹膜內麻醉，然後通過心臟穿刺用依次用PBS和4％低聚甲醛進行灌注。然後取出大腦並在4％低聚甲醛中後固定24小時，然後轉移到20％蔗糖中48小時。
用低溫恆溫器製得35μm的組織切片然後置於PBS中的24孔板中。將切片與抗酪氨酸羥化酶(TH)的初級兔多克隆抗體(Chemicon，CA，USA)或抗神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)的初級小鼠單克隆抗體(Chemicon，CA，USA)一起於4℃下保溫過夜。然後將切片用PBS洗滌，與HRP結合的次級抗體(綿羊抗兔或抗小鼠)(Chemicon，CA，USA)一起保溫然後用PBS洗滌。然後將切片與產色的二氨基聯苯胺(DAB)一起保溫，用蘇木精進行復染色，然後通過光學顯微鏡進行拍攝。對TH的陽性染色顯示了紋狀體和黑質中多巴胺能細胞的量，即多巴胺能細胞的存活率。對注射道內GFAP的陽性染色顯示了神經膠質瘤進程。微透析微透析技術需要在活大鼠的腦內植入小(500μm直徑)的探針。按照如下描述對大鼠進行植入。將大鼠用戊巴比妥麻醉，置於立體定位裝置中，按照立體定位的坐標用鑽孔器在其頭蓋骨上鑽孔，然後將市售的微透析探針(CMA/10探針，3mm長，20kD截止值；CarnegieMedicine，West lafayette，IN)插入到紋狀體內。通過探針緩慢地(1μl/分鐘)灌注人工腦脊液(CSF；145mM NaCl，1.2mM CaCl2，2.7mM KCl，1.0mM MgCl2，pH7.4)。小分子將在人工CSF和腦組織的細胞外液之間擴散。使大鼠恢復20-24小時，然後從微透析探針的流出物中收集透析液。在基線和通過探針給藥DA拮抗劑的過程中，將透析液(在30分鐘的間隔內收集30μl)收集在含有15μl EDTA-乙醇(0.02/1％)作為防腐劑的聚乙烯試管內。將收集的透析液於-70℃下存放直至進行HPLC分析。組織提取液和微透析液中單胺和代謝物的分析將冷凍的組織提取液和微透析液融化，然後直接注射到與氧化電位為0.70至0.78V的電化學檢測器(460型；Waters；Milford，MA)相連的HPLC儀(Altex Ion Pair Ultrasphere C18，4.6mm內徑250mm柱號235335)中。流動相由2升水、0.55g 1-庚烷磺酸、0.2g EDTA、16mL三乙胺、12mL 85％磷酸和80mL乙腈組成，流速為0.8ml/分鐘。將各樣品進行HPLC，通過該方法測定DA及其代謝物二羥基苯乙酸(DOPAC)和高香蘭酸(HVA)的水平。結果
B組-濃度為50ng/ml的神經生長因子(NGF)。
C組-濃度為1μM的1，3 cGP。
監測上述培養基中神經元的生長速率並通過顯微照片進行記錄。如
圖1所示，雖然在α甘油磷酸酯存在下的細胞生長不能促進細胞內的神經分支(圖1A)，但在NGF(圖1B)或1，3 cGP(圖1C)存在下生長的細胞中清楚地看到了神經分支。
如圖2所示，在上述條件下，僅在與上述CG一起保溫的細胞中觀察到了神經分支(圖2D-2H)。在與直鏈甘油磷酸酯一起保溫細胞中沒有發現神經分支(圖2B和C)，在上述條件下，NGF也不能促進任何神經再生(圖2I)。
如圖3所示，在與各種上述CG一起保溫的細胞(圖3B-3H)以及在NGF的存在下生長的細胞(圖3I)中觀察到了神經分支，但在與直鏈甘油磷酸酯一起生長的對照細胞中沒有觀察到神經分支(圖3A)。
然後通過局部、口服或按照以上描述用滲透泵直接注射到腦內進行給藥將大鼠用α和β直鏈GP或用CG進行治療。
通過用微透析技術和上述方法評估L-DOPA、多巴胺(DA)、多巴胺代謝物DOPAC和HVA以及生長因子GDNF的原位生成來評估直鏈GP和CG的作用。還在用上述各因子治療的大鼠中定量評估了運動和肢體震顫參數。
如圖4A所示，當PC 12細胞在不含添加劑的生長培養基中生長時，不能觀察到神經元的伸展(對照)。細胞在NGF(50ng/mL)的存在下生長整整14天可以觀察完整的神經元分化(參見圖4B)。如圖4C所示，當細胞先在NGF(50ng/mL)的存在下生長7天然後再在不含NGF的條件下生長7天時，觀察到了徹底的神經回縮，細胞的分化水平也回到了對照的水平。當PC 12細胞先在NGF(50ng/mL)的存在下生長7天然後再與2μM、4μM或6μM的1，3 cPP一起生長7天時(圖4D、4E和4F)，可以觀察到對回縮的神經元網絡(該神經元網絡是在與NGF一起保溫的最初7天內形成的)的部分至完全的拯救。附錄A
權利要求
1.用於在靶細胞中促進神經細胞分化的藥物組合物，該組合物含有可藥用載體和作為活性成分的通式I的化合物 其中Y是-(CH2)m-、-CH(OH)-或-C(＝O)-，m是0-3；X是H、烷基、-CH2OH-、CH2O醯基或-CH2醯基；R是H、陽離子、烷基或選擇性取代的芳基。
2.用於促進神經活性的藥物組合物，該組合物含有可藥用載體和作為活性成分的權利要求1的通式I化合物。
3.權利要求2的藥物組合物，其中所述的神經活性選自促進神經元分枝、促進神經生長、在大腦的發病部位提供多巴胺營養支持環境、防止神經變性和神經拯救。
4.用於預防或治療可以通過促進神經細胞分化和/或神經活性進行預防或治療的病症和疾病的藥物組合物，該組合物含有可藥用載體以及作為活性成分的權利要求1的通式I化合物。
5.權利要求4的藥物組合物，其中所述的病症和疾病是精神病。
6.權利要求5的藥物組合物，其中所述的精神病是精神分裂症或痴呆。
7.權利要求5的藥物組合物，其中所述的精神病是學習能力缺陷。
8.權利要求4的藥物組合物，用於治療涉及多巴胺能神經細胞損傷的神經變性疾病。
9.權利要求8的藥物組合物，其中所述的神經變性疾病是早老性痴呆。
10.權利要求8的藥物組合物，其中所述的神經變性疾病是帕金森氏病。
11.權利要求4的藥物組合物，其中所述的病症和疾病是由於接觸有害的環境因素或由於機械損傷所引起的。
12.權利要求4的藥物組合物，用於治療神經損傷後的神經拯救。
13.權利要求1-12中任意一項所述的藥物組合物，其中的活性成分是選自下列的式I化合物i.1，3環甘油磷酸酯-1，3cGP；ii.1，2環甘油磷酸酯-1，2cGP；iii.3-醯基1，2環甘油磷酸酯(環狀溶血磷脂酸)-c-lysoPA；iv.苯基1，3cGP-P-1，3cGP；v.苯基1，2cGP-P-1，2cGP；vi.1，3環狀丙二醇磷酸酯-1，3cPP；vii.1，2環狀丙二醇磷酸酯-1，2cPP；viii.苯基1，3cPP-P-1，3cPP；ix.苯基1，2，環狀丙二醇磷酸酯-P-1，2，cPP；x.環狀二羥基丙酮磷酸酯-cDHAP；和xi.苯基環狀二羥基丙酮磷酸酯-P-cDHAP。
14.誘導促進靶細胞的神經細胞分化的方法，該方法包括，將所述靶細胞與有效量的權利要求1的通式I化合物接觸適當的時間。
15.在個體中促進神經活性的方法，該方法包括，向有需要的個體施用有效量的權利要求1的通式I化合物。
16.權利要求15的方法，其中所述的神經活性選自促進神經元分支、促進神經生長、在大腦的生病區域提供多巴胺營養支持環境、防止神經變性和神經拯救。
17.預防或治療可以通過促進神經細胞分化和/或神經活性進行預防或治療的病症和疾病的方法，該方法包括，向有需要的人施用治療有效量的權利要求1的通式I化合物。
18.權利要求17的方法，其中所述的病症和疾病是精神上的障礙或疾病。
19.權利要求18的方法，其中所述的精神上的障礙或疾病是精神分裂症或痴呆。
20.權利要求18的方法，其中所述的精神障礙是學習能力缺失。
21.權利要求17的方法，其中所述的病症和疾病是神經變性病症或疾病。
22.權利要求21的方法，其中所述的神經變性病症或疾病是早老性痴呆或帕金森氏症。
23.權利要求17的方法，其中所述的病症或疾病是由於個體接觸有害的環境因素或由於機械損傷所引起的。
24.權利要求15的方法，用於治療神經損傷後的神經拯救。
25.通式I化合物在製備用於促進神經細胞分化的藥物組合物中的用途 其中Y是-(CH2)m-、-CH(OH)-或-C(＝O)-，m是0-3；X是H、烷基、-CH2OH-、CH2O醯基或-CH2醯基；R是H、陽離子、烷基或選擇性取代的芳基。
26.通式I化合物在製備用於促進神經活性的藥物組合物中的用途 其中Y是-(CH2)m-、-CH(OH)-或-C(＝O)-，m是0-3；X是H、烷基、-CH2OH-、CH2O醯基或-CH2醯基；R是H、陽離子、烷基或選擇性取代的芳基。
27.權利要求26的用途，其中所述的神經活性選自促進神經元分支、促進神經生長、在大腦的生病區域提供多巴胺營養支持環境、防止神經變性和神經拯救。
28.權利要求25的用途，用於預防或治療可以通過促進神經細胞分化和/或神經活性進行預防或治療的病症和疾病。
29.權利要求28的用途，其中所述的病症和疾病是精神上的障礙或疾病。
30.權利要求29的用途，其中所述的精神上的障礙或疾病是精神分裂症或痴呆。
31.權利要求29的用途，其中所述的精神障礙是學習能力缺失。
32.權利要求28的用途，其中所述的病症和疾病是神經變性病症或疾病。
33.權利要求32的用途，其中所述的神經變性病症或疾病是早老性痴呆或帕金森氏症。
34.權利要求28的用途，其中所述的病症或疾病是由於個體接觸有害的環境因素或由於機械損傷所引起的。
35.權利要求27的用途，用於神經損傷後的神經拯救。
全文摘要
證實了環狀甘油磷酸酯及其類似物(CG)可以在靶細胞中顯示神經促進活性。所述活性包括促進神經元分支、促進神經生長、在大腦的生病區域提供多巴胺營養支持環境、防止神經變性和神經拯救。CG的這些活性使得它們可用於治療各種病症,包括但不僅限於精神障礙,例如精神分裂症、痴呆或導致學習能力缺失的障礙。此外,這些CG還可用於治療神經變性疾病,例如早老性痴呆、帕金森氏症、由於接觸有害的環境因素或由於機械損傷所引起的病症。CG還可用於對患有原發性神經變性疾病的個體進行治療以預防或減少其它神經的繼發性變性的出現(「神經拯救」)。
文檔編號A61P25/28GK1348375SQ00806738
公開日2002年5月8日 申請日期2000年3月24日 優先權日1999年3月25日
發明者M·辛尼茨基 申請人:耶達研究與開發有限公司