植物鈉鈣交換蛋白基因(AtNCL)的應用的製作方法

2023-10-17 21:01:54 2

專利名稱：植物鈉鈣交換蛋白基因(AtNCL)的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地說涉及一種植物鈉鈣交換蛋白基因(AtNCL)及 其編碼蛋白的鈉鈣轉運活性在農作物耐鹽品種選育中的應用。
背景技術：
植物對外界環境變化甚至脅迫刺激有著一定的適應性和抵抗能力，這種適應性是 通過植物個體的生理生化機制來完成的。植物抗逆機理的闡明，不僅有著重要的理論意義， 而且有著重要的應用價值。其中植物耐鹽性的研究是其中的熱點之一。用傳統遺傳育種的 方式來選育耐鹽鹼作物難度大、周期長，很難滿足我國的顯示需求。隨著分子生物學的發 展，分子育種開始走進人們的視野。功能基因的發掘和利用也已經成為當今世界生物資源 競爭的重要方面。植物響應鹽脅迫的過程是十分複雜的，包括脅迫信號的感知以及下遊相應的生理 生化反應過程。鈣離子對於植物細胞的結構和生理功能有著重要的作用。鈣離子不僅可以 維持細胞壁、細胞膜的穩定性，而且參與細胞內的穩態調控和生長發育的調節過程，在細胞 內起著第二信使的作用。機械刺激、植物激素、病原侵染和脅迫刺激都可以引起胞內自由鈣 離子的水平發生變化，這種變化可以通過啟動胞內的生理生化過程，是植物對於外界刺激 準確的產生相應的反應。鹽脅迫等刺激可以引起植物細胞質中的自由鈣離子濃度升高，並持續幾分鐘。植 物鈣信號的產生主要是通過各種鈣通道的開放，使鈣庫中的鈣離子釋放到細胞質中，從而 造成鈣離子水平升高。在植物體內，持續高水平的鈣離子會造成細胞內的磷酸鹽等產生沉 澱，對植物細胞造成傷害，所以細胞質內的鈣離子濃度需要維持在較低的水平，這就依賴於 植物的鈣離子排除機制。在植物系統中主要有對鈣離子具有高親和力的直接依賴於腺苷三磷酸(ATP)的 鈣泵和對鈣離子具有低親和力的依賴於質子梯度的鈣氫離子(Ca2+Al+)反向轉運體。在動 物可興奮細胞中還廣泛存在著一種鈉鈣反向交換蛋白(sodium-calcium exchanger,NCX),可以利用鈉離子梯度轉運鈣離子，從而在心肌等細胞中發揮重要的調控作用。但 在植物中一直沒有克隆到具有此類鈉鈣交換活性蛋白的編碼基因。尋找植物中新的鈉鈣離 子轉運蛋白的編碼基因，利用不同類型的鈣離子轉運蛋白在植物對鹽脅迫反應的過程中協 同作用，維持脅迫下細胞內的鈣離子穩態，並將之應用於植物分子育種，這將有著重要的理 論和實踐意義。

發明內容
本發明的目的在於提供一種植物鈉鈣交換蛋白基因(AtNCL)的應用。本發明的構思如下本發明所涉及的模式植物擬南芥鈉鈣交換蛋白基因(AtNCL) 在擬南芥基因組資料庫(TAIR)中編號為Atlg53210，該基因開放閱讀框全長1758bp (附圖 1)，編碼585個胺基酸殘基組成的蛋白質(附圖2)。
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模式植物擬南芥鈉鈣交換蛋白基因(AtNCL)編碼框序列的獲得以擬南芥葉片為 材料，提取信使核糖核酸(mRNA)，反轉錄為cDNA，以其為模板，採用正向5 『 -GCTAGCGCCACC ATGAGATTCAGATCTCTCATCTCTC-3，和反向 5，-ACCGGTGGCGACCAGCCAAACCAGTAATC-3，為引物， 聚合酶鏈式反應擴增獲得約1758bp的特異產物(如附圖3)，經測序獲得鹼基序列組成如附 圖1。模式植物擬南芥鈉鈣交換蛋白基因的功能實驗首先採用體外培養的動物細胞系 CHO-Kl檢測AtNCL蛋白的鈉鈣轉運活性，將附圖3擴增獲得的1758bp目的條帶，用限制性 內切酶NheI和AgeI雙酶切連入pDsRedl-Nl載體，獲得AtNCL-DsReD融合基因，將其轉染 入CHO-Kl細胞，通過螢光顯微鏡檢測DsRed紅色螢光蛋白螢光，確定是否為轉染陽性細胞， 進而檢測在培養介質中存在不同濃度鹽條件下，鈣離子螢光探針Fluo3螢光指示的細胞內 鈣離子的濃度變化，確定轉染AtNCL-DsReD融合基因陽性細胞存在鈉鈣轉運活性，而空載 體對照細胞沒有檢出鈉鈣交換活性(如附圖4)。這一結果表明異源細胞表達的重組AtNCL 蛋白具有鈉鈣離子反向轉運活性。從來源於SAIL突變體庫的擬南芥T-DNA插入突變體中篩選鑑定得到AtNCL基因 的缺失突變體，轉基因獲得超表達株系(附圖5A) ,RT-PCR鑑定突變體中沒有AtNCL基因全 長轉錄本而超表達體中轉錄本增加(附圖5B)，在高鹽脅迫處理實驗中，可以觀察到AtNCL 缺失突變體atncl的幼苗與野生型對照相比，存活率和葉綠素含量都顯著偏高，而超表達 體略差於野生型(附圖5C-D)。這表明AtNCL對模式植物擬南芥幼苗鹽脅迫反應中發揮負 調節作用。利用原子吸收光譜法分析AtNCL缺失突變體植株和野生型植株的鈉、鈣元素含 量，發現在突變體植株中鈉含量比野生型低而鈣含量相對野生型偏高。在200mM NaCl脅迫 處理1小時後，再測定鈉鈣元素含量，發現突變體依然維持了較低的鈉元素含量(附圖6A)。 利用水母發光蛋白監測植株細胞內的鈣離子濃度，我們發現在鹽脅迫刺激後細胞內的鈣離 子濃度都表現出升高，但是AtNCL缺失突變體的鈣離子濃度升高的程度比野生型要顯著偏 高(附圖6B)。利用離子選擇性電極掃描技術(SIET)植株的根尖生長點處的鈣離子流動情 況，我們發現50mM NaCl刺激後，植株都表現出鈣離子外流增強，野生型在10分鐘內可以恢 復靜息狀態而突變體在將近30分鐘時才恢復到靜息狀態(附圖6C)。這些實驗結果證實了 AtNCL在植物響應鹽脅迫下的鈣離子的動態變化過程中發 揮著一定的作用，利用該性能，可以將其應用於農作物耐鹽品種選育。本發明取得的有益效果是擬南芥AtNCL是擬南芥中存在的一類具有NCX樣鈉鈣 轉運活性的蛋白，它參與到植株響應鹽脅迫的鈣信號消除過程，同時證實了植物中存在一 種新的離子轉運機制，通過農作物轉基因技術，調節植物鈉鈣交換蛋白基因的表達，有望獲 得耐鹽性提高的農作物新品種。


附圖1附圖2附圖3附圖4
植物鈉鈣交換蛋白編碼基因(AtNCL)的開放閱讀框序列圖。 植物鈉鈣交換蛋白(AtNCL)分析推測的胺基酸序列圖。 植物鈉鈣交換蛋白編碼基因(AtNCL)的開放閱讀框片段的擴增。 植物鈉鈣交換蛋白基因(AtNCL)轉化CHO-Kl細胞鈉鈣轉運活性測定。
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附圖5 植物鈉鈣交換蛋白(AtNCL)基因缺失或超表達擬南芥幼苗對鹽敏感性的 實驗。附圖6 植物鈉鈣交換蛋白基因缺失突變體(Atncl)對鈉鈣離子濃度及轉運的影 響。
具體實施例方式
以下實施例用於說明本發明。實施例1基因的獲得以野生型Col-O葉片為材料，小量提取RNA。實驗所用的玻璃器皿在180°C幹 烤7-10小時，水、塑料製品、溶液均用DEPC處理後高壓滅菌。參照上海華舜生物工程有 限工司的RNARose試劑盒說明書步驟進行。將約IOOmg組織加液氮研磨，置於離心管 中，加入Iml RNARose振蕩混勻，室溫靜止5_10min ；4°C 12000g離心IOmin ；取新EP管 加入200 μ L氯仿，小心將上清移入，用力顛倒離心管充分混勻，靜止5-lOmin，待分層後 40C 12000g離心15min ；將上層水相小心轉移至一新離心管中，加入等體積異丙醇輕輕混 勻，室溫放置5-10min，4°C 12000g離心IOmin ；小心去上清，加入Iml 75%乙醇震蕩片刻， 40C 7500g離心5min，小心去上清(盡力吸乾)；室溫靜止使RNA恰好乾燥，加入適量DEPC 水。用Nano-DroplOOO微量紫外分光光度計，以雙蒸水為對照，分別讀出260nm和280nm 的光密度，和RNA樣品的濃度。純度根據A260/A280確定，比值在1. 8-2. 0之間，純度較 好。用 TAKARA RT-PCR 試劑盒反轉錄並用引物 5，-ATGAGATTCAGATCTCTCATCTCTCTCCT-3，和 5，-CTACGACCAGCCAAACCAGTAATC-3，，進行 PCR 擴增，即可得到 AtNCL 的全長 CDS 序列。AtNCL的鈉鈣轉運活性用引物5-GCTAGCGCCACCATGAGATTCAGATCTCTCATCTCTC-3，和 5，-ACCGGTGGCGACCAG CCAAACCAGTAATC-3，PCR 擴增 AtNCL 基因，用 NheI 和 AgeI 酶切連入 pDsRedl-Nl 載體。轉 染CH0-K1細胞後，培養24小時。用螢光顯微鏡在543nm激發，可以觀察到DsRed的螢光， 則認為AtNCL已經表達。細胞用寡黴素和2-DG抑制能量代謝，並孵入Fluo-3後，以莫能星 導入鈉離子，同時以烏苯苷抑制鈉鉀泵的活性。此時，在細胞外加入含有2毫摩爾鈣離子的 緩衝液，利用ZEISS 510-META雷射共聚焦顯微鏡在488nm激發Fluo_3，在505_530nm監測 Fluo-3的螢光，可以得知細胞內的鈣離子濃度變化。實驗證實，表達AtNCL的細胞可以檢測 到細胞內的鈣離子濃度升高4-5倍，而空載對照細胞內鈣離子濃度幾乎沒有變化。T-DNA突變體鑑定從SAIL突變體庫索取SAIL_791_D12和SAIL_770_A10兩個突變體，分別命名 為 atncl-Ι 禾Π atncl-2 禾Ij 用 atncl_l_F 5 『 -AGAGAAGAAACGAAACCACGC-3 『，atncl_l_ R 5 『 -CAATTGATGCAAACAATGACG-3 『和 atncl_2_F 5 『 -TGCTTAATTCCACGGACAAAC-3 『， atncl-2_R 5' -CTTTTGGCTTTCAGTGTCTGG-3『以及 LB3:5, -TAGCATCTGAATTTCATAACCAATC TCGATACA-3 『弓丨物進行PCR鑑定。F和R引物可以擴增跨T-DNA插入位點兩側的DNA序列， 而R引物和LB3引物可以擴增T-DNA和基因組DNA的序列。如果F和R可以擴增出預期條 帶，則說明有未插入T-DNA的拷貝存在，如果R和LB3能夠擴增出預期條帶，則說明存在插 入T-DNA的拷貝，如果兩者都能擴增出目的條帶，則說明植株是雜合體。通過PCR鑑定出純和T-DNA插入的植株，小量提取RNA，並進行RT-PCR鑑定AtNCL的RNA水平表達。可以發現 兩個突變體植株都沒有AtNCL全長mRNA的表達。擬南芥幼苗對鹽敏感性的實驗野生型和兩個突變體的種子經75%乙醇表面消毒後，經4攝氏度72小時冷處理， 點種在1/2MS培養基上，16小時光照，8小時黑暗光周期下，22攝氏度，培養7天後，將幼苗 在無菌條件下移植到含有150mmol/L NaCl的1/2MS培養基上豎直培養，繼續培養7天後， 統計存活率並測定葉綠素含量。幼苗以真葉完全白化為標準，統計存活率。樣品量大於30 棵，重複3次以上。葉綠素含量測定參照Arnon的方法(Arnon，1949)。將擬南芥幼苗從胚軸部分剪 斷，取地上部分，用分析天平稱重。每個樣品取30株苗，浸泡於2-4mL 80%丙酮中，室溫避 光保存，24h後，植株完全失綠，溶有葉綠素的丙酮避光保存，用於葉綠素含量測定。預熱HITACHI-U2001分光光度計，設置為雙波長模式，兩個波長分別為645nm和 663nm。用80%丙酮調0後，逐一測定每個樣品的吸光度，按下述公式計算葉綠素含量Cchlor。phyll_a = 10-1*0· 1272*Α663-1(Γ2*0· 2585*A645 (g/L)Cchlor。phyll_b = -1(Γ2*0· 4671*A663+10_1*0. 2288*A645 (g/L)Ctotal 一 Cchlorophyll_a+Cchlorophyll_b (g/L)然後換算為每克鮮重所含葉綠素的量。統計顯示，突變體幼苗比野生型幼苗存活率和葉綠素含量都顯著偏高。說明在鹽 脅迫條件下，AtNCL的基因缺失可以緩解植株的鹽害。原子吸收光譜法測定植株鈉鈣元素含量取生長10天的擬南芥幼苗，迅速在純水中清洗3-5次以除去可能帶有的外源離 子；放入電熱鼓風乾燥箱中70度烘乾後稱重，加入一定體積的硝酸，室溫靜置過夜，然後按 照硝酸高氯酸=4 1的比例補加高氯酸。混勻後在電爐上緩慢加熱進行溼法消解，直到 溶液顏色完全變為無色澄清狀，再繼續加熱至酸溶液有大量白煙冒出，體積逐漸減少至0. 4 毫升左右為止，此時應保證溶液中已無大量煙霧冒出時停止加熱；待溶液冷卻後加入純水 按比例稀釋，在AA240FS+240Z原子吸收分光光度計上利用火焰原子吸收法來測量其吸收 譜線，隨之根據稀釋被數來確定樣品中各種離子的含量。利用水母發光蛋白測定植株細胞內鈣離子變化atncl-Ι植株和轉水母發光蛋白基因的擬南芥植株(Knight MR, et al.，1987 ； Knight H,et al. ,1998)做雜交，並篩選純合體，用於測定植株細胞內鈣離子變化。測定方 法參考 Knight MR 方法(Knight MR, et al.，1991)。擬南芥種子消毒後鋪在MS平板上，4°C避光放置3天後，置22°C光照培養箱中以 16h光照，8h黑暗光周期培養。4天後用於測鈣。每10株幼苗為1組，用(^+measurement buffer(0. OlmM KC1,0. ImM CaCl2, ImM MES, ρΗ5· 5)洗滌 3 次後，加入含有 5μΜ coelenterazine-hcp (Promega)的 Ca2+ measurement buffer，室溫避光搖動孵育 5h，然後 用Ca2+ measurement buffer洗滌3次後，將幼苗轉移到測定生物發光的96孔板中，每孔10 株幼苗，加入IOOyL Ca2+ measurement buffer，上機測定鈣信號。Centro LB 960微孔板生物發光檢測儀(Berthold，Germany)開機後，用ddH20衝 洗管道3次，每次10個循環。設定每次測定兩個孔，一個孔為atncl-Ι背景下的水母發光蛋白轉基因株系，另一孔為野生型背景下的水母發光蛋白轉基因株系。每個孔每個循環計 數時間為ls，每個循環2. 5s，約2-10分鐘後鈣信號基本穩定，靜息狀態下的本底信號值記 作 Lbasal，用泵以緩慢速度泵入 IOOmMNaCl (in Ca2+ measurement buffer) 100 μ L，使 NaCl 終濃度為50mM，繼續監測發光信號約lOmin，實時信號值記作Lrt。發光信號用公式計算實驗數據並歸一化處理AL/L = (Lrt-Lbasal)/Lbasal。Δ L/L表示在NaCl處理前後胞質鈣信號的相對變化。離子選擇性微電極技術SIET測定植株根尖生長點處鈣離子流動SIET (ion-Selective Electrode Technique)是一種可以在不接觸實驗材料的情 況下測定特定離子的濃度和流動狀況的技術。本發明中SIET實驗部分在旭月(北京)科 技有限公司完成。以Ca2+濃度梯度和Ca2+微電極為例說明非損傷微測技術離子選擇性微電極的工作 原理。Ca2+離子選擇性微電極通過前端灌充液態離子交換劑實現選擇性。該微電極在待測 離子濃度梯度中以已知距離dx進行兩點測量，並分別獲得電壓Vl和V2。兩點間的濃度差 dc則可以從V1、V2及已知的該微電極的電壓/濃度校正曲線計算獲得。D是離子特異的擴 散常數(單位cm_2. sec"1)，將它們代入Fick第一擴散定律公式=Jtl = D (dc/dx)，可獲得該 離子的移動速率(picomol. cnT2· sec-1)。鈣選擇性電極製備1.5mm玻璃毛細管拉製成2μπι尖端的玻璃電極，內部灌充 100mMCaC12,電極尖端灌充鈣離子選擇性cocktail (Fluka)。電極用含有lmM，0. ImM和 0. OlmMCaCl2的校正液校正後，Nernstian斜率大於25mV方可使用。氫選擇性電極製備1.5mm玻璃毛細管拉製成2μπι尖端的玻璃電極，內部灌充 15mMNaCl和40mM KH2PO4,電極尖端灌充氫離子選擇性cocktail (Fluka)。電極用含有pH分 別為5. 5，6. 0，6. 5的校正液校正後方可使用。Nernstian斜率大於50mV方可使用。測定緩衝液按如下配置0. ImM KCl,0. ImM CaCl2,0. ImM MgCl2,0. 5mM NaCl,0. 3mM MES，0. 2mM Na2SO4, and 6% sucrose, pH 6. 0.校正液分別增減相應離子，pH用HCl或NaOH調整。擬南芥種子消毒後，點種在MS平板上鋪設的濾紙條上，豎直培養，4天後取下，在 測定緩衝液中平衡30min後，用於SIET測定。監測離子流動相對穩定後，加入4M NaCl至 終濃度50mM，繼續檢測離子流動大約35min。測定時電極運動距離dX = 30 μ m。數據利用旭月公司在線分析工具(http://xuyue.net/maReflux)計算得到離子 移動速率，然後用Prism4軟體統計數據。
權利要求
一種植物鈉鈣交換蛋白基因(AtNCL)的應用，其特徵在於其編碼的蛋白具有反向轉運鈉離子與鈣離子的生化活性，在鹽等逆境脅迫引起的植物細胞內鈣信號的消除中發揮作用，用於耐鹽植物的品種的基因改良及農作物耐鹽品種選育。
全文摘要
本發明公開了一種植物鈉鈣交換蛋白基因(AtNCL)及其編碼蛋白的鈉鈣轉運活性在農作物耐鹽品種選育中的應用。模式植物擬南芥鈉鈣交換蛋白基因(AtNCL)在擬南芥基因組資料庫(TAIR)中編號為Atlg53210，該基因開放閱讀框全長1758bp，編碼585個胺基酸殘基組成的蛋白質。本發明經實驗證明，AtNCL參與到植株響應鹽脅迫的鈣信號消除過程，同時證實了植物中存在一種新的離子轉運機制。利用AtNCL上述特性，通過農作物轉基因技術，調節植物鈉鈣交換蛋白基因的表達，可以獲得耐鹽性提高的農作物新品種。
文檔編號A01H5/00GK101955947SQ20101024587
公開日2011年1月26日 申請日期2010年8月5日 優先權日2010年8月5日
發明者孫大業, 崔素娟, 李朝煒, 王鵬 申請人:河北師範大學