富硒蟲草菌及其培養方法、富硒黃酒及其製備方法與流程
2023-10-18 01:46:39 4
本發明涉及富硒技術領域，特別涉及一種富硒蟲草菌，以及該富硒蟲草菌的培養方法，同時，還涉及由該富硒蟲草菌製得的富硒黃酒及製備方法。
背景技術：
硒(Se)是人和動物生命活動所必需的微量元素之一，多存在於人體的肝、腎、胰、心、脾、牙釉質和指甲中，硒在自然界中以無機硒和有機硒兩種形式存在，無機硒毒性較大，對動植物及微生物細胞有一定的毒害作用，因此通常在食物中補充的硒以有機硒形式存在，目前，有機硒多是利用生物轉化的方法獲得。
冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)，又名中華蟲草，主產於四川、西藏、雲南等海拔在4000～5000米的高山草甸土中。現代藥理學研究結果證實，青海冬蟲夏草中含有蟲草酸約7％，碳水化合物約28.9％，脂肪約8.4％，蛋白質約25％，脂肪中82.2％為不飽和脂肪酸，此外還含有蟲草多糖、多種胺基酸、核苷及多種鹼基、麥角甾醇及其氧化物、甘露醇、硬脂酸、揮髮油以及多種礦物質元素。蟲草性甘溫平，是著名的滋補強壯藥，適用於治療肺氣虛和肺腎兩虛、改善心肌缺血、擴張支氣管、祛痰平喘，另外對中樞神經系統能起鎮靜、抗驚厥、降溫作用，是一味不可多得的珍貴藥材。然而，由於蟲草藥源緊張，價格昂貴，遠不能滿足國內外市場的需要，近年來，人們採用以天然蟲草真菌發酵法獲得人工蟲草菌，並研究證明，人工蟲草菌與天然冬蟲夏草具有相似的化學成分、藥理作用和臨床療效，且毒性比天然者小，因此蟲草菌及相關產品得到不斷發展，如蟲草菌發酵製劑、蟲草菌發酵酒等。
利用蟲草菌發酵液進行硒的生物轉化、富集獲得富硒蟲草菌，對於開發蟲草功能性食品、藥品具有重要意義，但由於無機硒的毒性，在蟲草菌發酵培養過程，無機硒的加量會受到限制，無機硒量超出則會對菌絲體產生抑制或毒害作用，使菌絲生長緩慢或停止，因此限制了菌絲體中有機硒的含量，影響硒的功能性發揮。
技術實現要素：
為解決現有技術中存在的不足，本發明提供了一種富硒蟲草菌的培養方法，可以顯著提高無機硒的加入量，以獲得高有機硒含量的富硒蟲草菌。
為實現上述目的，本發明的富硒蟲草菌的培養方法，是在蟲草菌的發酵培養過程採用兩次加入無機硒的方式進行富硒培養，第一次加入無機硒的時間為蟲草菌進入對數生長期初期，加入量為140～150μg/mL；第二次加入無機硒的時間為蟲草菌處於對數生長期旺盛期，加入量為50～60μg/mL。
本發明通過將無機硒加入到蟲草菌的深層液態發酵培養基中，利用蟲草菌的高效生物轉化作用對微量元素硒進行富集，以獲得富含有機硒的蟲草菌。根據蟲草菌菌絲體在不同生長階段對硒的耐受性能、吸收性能及轉化性能等影響，確定在蟲草菌的發酵培養過程採用兩次加入無機硒的方式進行富硒培養，其中第一次加入無機硒是在蟲草菌進入對數生長期初期，利用此生長階段的蟲草菌菌絲體基本適應了發酵環境，對無機硒具有較強的抗性，以及菌體的富硒能力得到較好馴化的基礎上，加入140～150μg/mL的無機硒，使第一次獲得較大的富硒量，同時避免無機硒過量造成的毒性影響；繼續發酵培養，在蟲草菌菌絲體進入對數生長期旺盛期，菌體生長較快，富硒能力較佳，此時第一次加入的無機硒已基本轉化、消耗完全，可以繼續吸收、轉化無機硒，再加入50～60μg/mL的無機硒，使蟲草菌進一步富硒，大大促進有機硒的生成，從而獲得高有機硒含量的富硒蟲草菌。通過本發明的富硒培養方式，可以顯著提高富硒量，解決了無機硒的毒性對富硒量的限制瓶頸，進而提高蟲草菌的功能性。該富硒培養方法中，無機硒的加入時間與加入量是與蟲草菌菌絲體的生長性能相互關聯、相互對應的，從而進行高效富硒。
作為對上述方式的限定，所述第一次加入無機硒的時間為發酵培養7～8h，所述第二次加入無機硒的時間為發酵培養48～50h。
明確無機硒加入操作對應的發酵時間，確定更優的富硒培養過程。
作為對上述方式的限定，所述富硒蟲草菌的培養方法包括以下步驟：
a、斜面培養蟲草菌；
b、培養蟲草菌種子液；
c、將蟲草菌種子液進行發酵培養，發酵進行到7～8h加入無機硒140～150μg/mL，攪拌均勻後繼續發酵培養，進行到48～50h再加入無機硒50～60μg/mL，攪拌均勻後繼續發酵到結束，分離得到富硒蟲草菌的菌絲體。
作為對上述方式的限定，所述步驟a中斜面培養基為馬鈴薯瓊脂培養基；所述步驟b中種子培養基包括葡萄糖40g/L，蛋白腖10.0～12.0g/L，磷酸二氫鉀0.5～0.7g/L，硫酸鎂0.5～0.7g/L；所述步驟c中發酵培養基包括葡萄糖53.0～54.0g/L，蛋白腖26.0～27.0g/L，硫酸鎂2.0～3.0g/L，磷酸二氫鉀0.5～0.7g/L；蟲草菌種子液的接種量為每1L發酵培養基接種1.25～1.50mL蟲草菌種子液；所述步驟a、b、c中蟲草菌的培養溫度均為32～35℃。
按常規真菌培養方法，對蟲草菌依次進行斜面培養、種子培養和發酵培養，在發酵培養過程中進行富硒，通過兩次加硒培養，顯著提高富硒量。在蟲草菌的培養中，優化各培養階段的培養基組成，利於蟲草菌的生長繁殖、及對硒的生物轉化。富硒蟲草菌菌絲體的分離可通過常規分離手段實現，其中採用離心機分離操作效果較優，以離心轉速3000～5000r/min，離心時間10～15min，重複3次進行分離，得到菌絲體。
同時，本發明還提供了一種富硒蟲草菌，由如上所述的富硒蟲草菌的培養方法獲得，所述富硒蟲草菌的菌絲體中硒含量為0.150～0.159mg/g。
通過本發明的培養方法獲得的富硒蟲草菌中硒含量達到0.150～0.159mg/g，相較於常規有機硒含量0.061～0.094mg/g，得到顯著提高。
此外，本發明還提供了一種富硒黃酒的製備方法，包括以下步驟：
(一)、將由如上所述的富硒蟲草菌的培養方法獲得的富硒蟲草菌菌絲體進行細胞壁破碎處理，得到富硒蟲草菌菌漿；
(二)、配製複合蟲草菌營養液，所述複合蟲草菌營養液包括以下重量份組分：富硒蟲草菌菌漿5份、枸杞乾粉1～2份、大棗乾粉2～3份、水1份。
(三)、將熟黍米、複合蟲草菌營養液與水混合，接種酒麴，進行糖化發酵，得到富硒黃酒。
黃酒(Chinese rice wine)又稱老酒，是以稻米、黍米、玉米、小米、小麥等穀物為主要原料，經蒸煮、加曲、糖化發酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌而成的釀造酒，釀造中以麥曲或小曲做糖化發酵劑。將本發明的富硒蟲草菌，與黃酒相結合，經傳統製作工藝，釀造出一款色澤呈橙黃色、清亮透明、有光澤，且香氣協調的富硒蟲草保健酒，其酒體豐滿協調、醇和爽口，具有黃酒和蟲草菌的典型香氣，同時兼具了蟲草菌抗菌、抑制腫瘤細胞生長、降低血壓、擴張氣管等作用和有機硒的抗腫瘤、提高機體免疫力、具有抗衰老和預防心血管疾病、克山病和骨節病等功效，是一款具有保健功能的新型富硒蟲草黃酒。在富硒蟲草黃酒的釀造過程，將複合蟲草菌營養液與熟黍米混合後進行糖化發酵，一方面利用複合蟲草菌營養液有效掩蓋蟲草菌帶來的特殊味道，另一方面通過加入枸杞、大棗得到的複合蟲草菌營養液可以增加蟲草菌營養與有機硒之間的相須、相配伍的關係，再一方面利用枸杞、大棗還可改善酒的口感和營養價值。由於紅棗味甘性溫、歸脾胃經，有補中益氣、養血安神、緩和藥性的功能，還能提高體內吞噬細胞系統的吞噬功能，有保護肝臟、增強體力的作用；枸杞性平和，味甘甜，有滋補肝腎，強壯筋骨，養血明目之功效，尤其適宜於中老年人服用，有延年益壽的效果；將大棗和枸杞與富硒蟲草菌菌漿複合製成富硒蟲草菌營養液，添加到黃酒中以增強黃酒的固本功效。
作為對上述方式的限定，所述步驟(一)中細胞壁破碎處理包括以下步驟：將富硒蟲草菌菌絲體以1kg量加入到1L水的比例進行調漿，然後進行生物酶酶解，最後進行超聲波細胞破碎；所述生物酶包括纖維素酶和蛋白酶，纖維素酶加入量為0.1～0.2g/L，蛋白酶加入量為0.1～0.2g/L，酶解時間為0.4～0.5h；超聲波細胞破碎的頻率為20KH，功率為150W，破碎時間為2.0～2.5h。
採用生物酶酶解與超聲波細胞破碎相結合的方法對蟲草菌菌絲體進行破壁，彌補單一破碎法可能帶來的破碎不完全、菌絲細胞內有效成分不能完全釋放出來的缺點，以儘量完全獲得菌絲體內營養組分。
作為對上述方式的限定，所述步驟(三)中熟黍米、複合蟲草菌營養液與水的混合比例為20～25kg:1kg:18～20kg；酒麴接種量為每10kg熟黍米加入1～1.2kg酒麴；糖化發酵溫度為30～32℃；糖化發酵至糖分含量降至16.0～18.0g/L，停止發酵。
進一步限定熟黍米與複合蟲草菌營養液混合釀酒的釀造條件，獲得性能最優的富硒黃酒。
同時，本發明還提供了一種富硒黃酒，由如上所述的富硒黃酒的製備方法製得，所述富硒黃酒的理化指標為酒精度(20℃)/(％Vol)16.0～18.0，胺基酸態氮2.0～3.0g/L，18種胺基酸總含量8900～9500μg/L，有機酸含量28.0～30.0g/L，硒含量10.0～11.0μg/L，蟲草酸2.0～3.0mg/L，蟲草素0.5～1.0mg/L。
採用本發明的釀造方法獲得的富硒黃酒，硒含量及其它功能性有效成分均得到顯著提高，從而使該富硒黃酒具有顯著的保健功效。
綜上所述，採用本發明的技術方案，在蟲草菌發酵培養過程採用兩次加入無機硒的方式進行蟲草菌的富硒培養，通過限定兩次加入無機硒的時間和加入量，解決了無機硒的毒性對富硒量的限制瓶頸，顯著提高蟲草菌的富硒量，以獲得富含有機硒的蟲草菌。另外，本發明還將富含有機硒的蟲草菌與大棗、枸杞復配成複合蟲草菌營養液，與熟黍米混合，通過傳統的黃酒釀造工藝，釀造出一款色澤呈橙黃色、清亮透明、有光澤，且香氣協調的富硒蟲草保健酒，其酒體豐滿協調、醇和爽口，具有黃酒和蟲草菌的典型香氣，同時兼具了蟲草菌和有機硒的營養、功效，是一款具有保健功能的新型富硒黃酒。
具體實施方式
實施例一
本實施例涉及富硒蟲草菌及其培養方法。
實施例1.1
本實施例涉及一種富硒蟲草菌的培養，包括以下步驟：
a、斜面培養蟲草菌：配製馬鈴薯瓊脂培養基作為蟲草菌的斜面培養基，斜面培養基組分為馬鈴薯粉6.0g/L、葡萄糖20.0g/L和瓊脂20.0g/L；無菌操作下將蟲草菌菌種接種到斜面培養基上，在32～35℃下培養48h，然後放入4℃冰箱內保存，得到蟲草菌斜面；
b、培養蟲草菌種子液：配製種子培養基，組分為葡萄糖40g/L，蛋白腖10.0g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L；無菌操作下取蟲草菌斜面以0.5cm3/L的接種量接種到種子培養基內，在32～35℃下靜置培養3天，得到蟲草菌種子液；
c、將蟲草菌種子液進行發酵培養：配製發酵培養基，組分為葡萄糖53.0g/L，蛋白腖26.0g/L，硫酸鎂2.0g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L；無菌操作下將蟲草菌種子液接種到發酵培養基中，接種量為每1L發酵培養基接種1.25mL蟲草菌種子液，在32～35℃下進行搖床發酵培養，搖床轉速為100r/min，當發酵進行到8h時向發酵液加入無機硒140μg/mL，攪拌均勻後繼續在32～35℃下發酵，進行到48h時向發酵液再加入無機硒60μg/mL，攪拌均勻後在32～35℃下仍繼續發酵，發酵8天結束，得到富硒蟲草菌的發酵液，用離心機進行分離，離心機轉速3500r/min，每次離心時間15min，用清水清洗後再次離心，重複3次，得到富硒蟲草菌菌絲體，測定該富硒蟲草菌菌絲體中硒含量為0.150mg/g。
實施例1.2
本實施例涉及一種富硒蟲草菌的培養，包括以下步驟：
a、斜面培養蟲草菌：配製馬鈴薯瓊脂培養基作為蟲草菌的斜面培養基，斜面培養基組分為馬鈴薯粉6.0g/L、葡萄糖20.0g/L和瓊脂20.0g/L；無菌操作下將蟲草菌的菌種接種斜面培養基上，在32～35℃下培養48h，然後放入4℃冰箱內保存，得到蟲草菌斜面；
b、培養蟲草菌種子液：配製種子培養基，組分為葡萄糖40g/L，蛋白腖12.0g/L，磷酸二氫鉀0.7g/L，硫酸鎂0.7g/L；無菌操作下取蟲草菌斜面以0.5cm3/L的接種量接種到種子培養基內，在32～35℃下靜置培養3天，得到蟲草菌種子液；
c、將蟲草菌種子液進行發酵培養：配製發酵培養基，組分為葡萄糖54.0g/L，蛋白腖27.0g/L，硫酸鎂3.0g/L，磷酸二氫鉀0.7g/L；無菌操作下將蟲草菌種子液接種到發酵培養基中，接種量為每1L發酵培養基接種1.5mL蟲草菌種子液，在32～35℃下進行搖床發酵培養，搖床轉速為100r/min，當發酵進行到7h時向發酵液加入無機硒150μg/mL，攪拌均勻後繼續在32～35℃下發酵，進行到50h時向發酵液再加入無機硒50μg/mL，攪拌均勻後在32～35℃下仍繼續發酵，發酵9天結束，得到富硒蟲草菌的發酵液，用離心機進行分離，離心機轉速5000r/min，每次離心時間10min，用清水清洗後再次離心，重複3次，得到富硒蟲草菌菌絲體，測定該富硒蟲草菌菌絲體中硒含量為0.159mg/g。
採用本發明富硒蟲草菌的培養方法，得到的富硒蟲草菌菌絲體中硒含量為0.150～0.159mg/g，富硒蟲草菌發酵液中蟲草菌菌絲體含量為3.91g/L。
實施例二
本實施例涉及富硒黃酒及其製備方法。
實施例2.1
本實施例涉及一種富硒黃酒的釀造，包括以下步驟：
(一)、將實施例1.1得到的富硒蟲草菌菌絲體按1kg菌絲體加入1L水的比例進行調漿，然後加入纖維素酶0.2g/L和蛋白酶0.1g/L進行酶解，酶解時間為0.5h，之後使用超聲波細胞粉碎機進行細胞壁破碎處理，超聲破碎頻率20KH，功率150W，破碎時間2.5h，得到富硒蟲草菌菌漿；
(二)、按質量份數取富硒蟲草菌菌漿5份、枸杞乾粉1份、大棗乾粉3份、水1份，混合均勻，配製複合蟲草菌營養液；
(三)、取熟黍米、複合蟲草菌營養液與水按20kg:1kg:18kg的質量配比混合均勻，接種酒麴，進行糖化發酵，所述酒麴接種量為每10kg熟黍米接種1kg酒麴，發酵溫度為30～32℃，待發酵酒中總糖含量降至17g/L時停止發酵，進行壓榨、過濾，得到富硒黃酒的發酵原酒，再經陳釀、勾兌、包裝，得到富硒黃酒產品。
對富硒黃酒的發酵原酒進行檢測，其各項理化指標為總糖(以葡萄糖計)16.0g/L，非糖類固形物26.2g/L，總酸(以乳酸計)6.5g/L，酒精度(20℃)/(％Vol)17.5，胺基酸態氮2.1g/L，同時18種胺基酸總含量為8999μg/L，有機酸含量為28.3g/L，硒含量為10.1μg/L，蟲草酸2.2mg/L，蟲草素0.5mg/L。
實施例2.2
本實施例涉及一種富硒黃酒的釀造，包括以下步驟：
(一)、將實施例1.2得到的富硒蟲草菌菌絲體按1kg菌絲體加入1L水的比例進行調漿，然後加入纖維素酶0.1g/L和蛋白酶0.2g/L進行酶解，酶解時間為0.4h，之後使用超聲波細胞粉碎機進行細胞壁破碎處理，超聲破碎頻率20KH，功率150W，破碎時間2.0h，得到富硒蟲草菌菌漿；
(二)、按質量份數取富硒蟲草菌菌漿5份、枸杞乾粉2份、大棗乾粉2份、水1份，混合均勻，配製複合蟲草菌營養液；
(三)、取熟黍米、複合蟲草菌營養液與水按25kg:1kg:20kg的質量配比混合均勻，接種酒麴，進行糖化發酵，所述酒麴接種量為每10kg熟黍米接種1kg酒麴，發酵溫度為30～32℃，待發酵液中總糖含量降至17g/L時停止發酵，進行壓榨、過濾，得到富硒黃酒的發酵原酒，再經陳釀、勾兌、包裝，得到富硒黃酒產品。
對富硒黃酒的發酵原酒進行檢測，其各項理化指標為總糖(以葡萄糖計)17.1g/L，非糖類固形物28.2g/L，總酸(以乳酸計)7.0g/L，酒精度(20℃)/(％Vol)18.5，胺基酸態氮2.5g/L，同時18種胺基酸總含量為9002μg/L，有機酸含量為28.8g/L，硒含量為11.0μg/L，蟲草酸2.9mg/L，蟲草素0.8mg/L。
採用本發明富硒黃酒的製備方法得到的富硒黃酒，其發酵原酒的各項理化指標為總糖(以葡萄糖計)16.0～18.0g/L，非糖類固形物26.0～28.0g/L，總酸(以乳酸計)6.0～8.0g/L，酒精度(20℃)/(％Vol)16.0～18.0，胺基酸態氮2.0～3.0g/L，同時18種胺基酸總含量為8900～9500μg/L，有機酸含量為28.0～30.0g/L，硒含量為10.0～11.0μg/L，蟲草酸2.0～3.0mg/L，蟲草素0.5～1.0mg/L。
實施例三
本實施例涉及富硒蟲草菌培養過程無機硒加入方式對富硒蟲草菌及富硒黃酒質量的影響，以及富硒黃酒釀造條件對產品質量的影響。
對比例1
本實施例與實施例1.1大致相同，唯一不同之處在於無機硒的加入方式，採用在蟲草菌種子液發酵培養開始時向發酵液加入200μg/L無機硒，得到富硒蟲草菌，其菌絲體中硒含量為0.088mg/g；將該富硒蟲草菌用於製備富硒黃酒，釀造過程與實施例2.1相同，得到富硒黃酒的發酵原酒，其各項理化指標為總糖(以葡萄糖計)16.1g/L，非糖類固形物26.5g/L，總酸(以乳酸計)6.1g/L，酒精度(20℃)/(％Vol)17.5，胺基酸態氮2.0g/L，同時18種胺基酸總含量為7985μg/L，有機酸含量為28.4g/L，硒含量為4.1μg/L，蟲草酸1.5mg/L，蟲草素0.2mg/L。
將對比例1與實施例1.1、2.1的結果比較可見，對比例1得到的蟲草菌菌絲體的富硒量遠遠低於實施例1.1，進一步得到的黃酒的有機硒、蟲草酸和蟲草素等有效物質含量也都顯著低於實施例2.1。
對比例2
本實施例與實施例1.1大致相同，唯一不同之處在於無機硒的加入方式，採用在蟲草菌種子液發酵培養開始時向發酵液加入60μg/L無機硒，在發酵進行到48h時再次加入140μg/L的無機硒，得到富硒蟲草菌，其菌絲體中硒含量為0.112mg/g；將該富硒蟲草菌用於製備富硒黃酒，釀造過程與實施例2.1相同，得到富硒黃酒的發酵原酒，其各項理化指標為總糖(以葡萄糖計)17.2g/L，非糖類固形物24.3g/L，總酸(以乳酸計)6.1g/L，酒精度(20℃)/(％Vol)18.1，胺基酸態氮2.1g/L，同時18種胺基酸總含量為8985μg/L，有機酸含量為28.1g/L，硒含量為6.1μg/L，蟲草酸1.7mg/L，蟲草素0.3mg/L。
將對比例2與對比例1、實施例1.1、2.1的結果比較可見，對比例1得到的蟲草菌菌絲體的富硒量雖然較對比例1有所提高，但仍遠低於實施例1.1，進一步得到的黃酒的有機硒、蟲草酸和蟲草素等有效物質含量也都顯著低於實施例2.1。
綜上所述，富硒過程無機硒的加入方式直接影響富硒效果及後續富硒產品的保健功效，採用本發明的富硒方法，獲得的富硒蟲草菌能顯著提高富硒量，打破目前富硒技術的瓶頸，採用本發明的釀造方法，獲得的富硒黃酒不僅具有高富硒量，而且能獲得更多的蟲草營養物質，顯著提高該黃酒的保健功效。
對比例3
本實施例與實施例2.1大致相同，唯一不同之處在於直接將蟲草菌菌絲體與熟黍米、水混合後，接種酒麴，糖化發酵，而不是採用複合蟲草菌營養液，得到富硒黃酒的發酵原酒，該發酵原酒具有濃重的泥土氣味，黃酒香氣典型性不足，其各項理化指標為總糖(以葡萄糖計)17.8g/L，非糖類固形物23.35g/L，總酸(以乳酸計)6.38g/L，酒精度(20℃)/(％Vol)17.2，胺基酸態氮1.98g/L，同時18種胺基酸總含量為8256μg/L，有機酸含量為24.52g/L，硒含量為3.25μg/L，蟲草酸1.02mg/L，蟲草素0.152mg/L。
將對比例3與實施例2.1的結果比較可見，對比例3得到的黃酒具有濃重的泥土氣味，其有機硒、蟲草酸和蟲草素等有效物質含量也都顯著低於實施例2.1。
對比例4
本實施例與實施例2.1大致相同，唯一不同之處在於蟲草菌菌絲體的細胞壁破碎處理方式，僅採用超聲波細胞粉碎機進行細胞壁破碎，超聲破碎條件同實施例2.1，得到富硒黃酒的發酵原酒，其各項理化指標為總糖(以葡萄糖計)17.3g/L，非糖類固形物24.2g/L，總酸(以乳酸計)5.8g/L，酒精度(20℃)/(％Vol)17.6，胺基酸態氮1.9g/L，同時18種胺基酸總含量為7986μg/L，有機酸含量為24.4g/L，硒含量為5.1μg/L，蟲草酸1.2mg/L，蟲草素0.1mg/L。
將對比例4與實施例2.1的結果比較可見，對比例4得到的黃酒的有機硒、蟲草酸和蟲草素等有效物質含量也都顯著低於實施例2.1。
本發明富硒黃酒的製備方法中，使用複合蟲草菌營養液與熟黍米發酵，能夠有效改善黃酒的品質，採用生物酶與超聲破碎的方式相結合進行菌絲體的破壁，能夠顯著提高黃酒的保健功效。