包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製子載體和副粘病毒蛋白抗原的免疫原性組合物的製作方法

2023-10-05 09:10:54 3

專利名稱：包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製子載體和副粘病毒蛋白抗原的免疫原性組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於治療或預防由副粘病毒(paramyxoviruses)如3型副流感病毒(parainfluenza virus type 3)所致傳染病的免疫原性組合物領域。本發明還涉及重組DNA領域和在宿主細胞中表達外源基因的方法。
背景技術：
副粘病毒是有囊膜、負極性、不分節段的單股RNA病毒，其成員可以是傳染性極強、高度流行及高致病性的。例子包括麻疹(measles)病毒、腮腺炎(mumps)病毒、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytialvirus)和副流感病毒。在世界衛生組織(WHO)的組織協調下簽署了協議，共同努力，試圖根除副粘病毒如麻疹病毒。其他的副粘病毒，例如新城疫(Newcastledisease)病毒給畜牧動物群體造成了極大破壞。
在美國，呼吸道合胞病毒(RSV)和1、2、3、4型副流感病毒(PIV)是少年兒童和成年人因呼吸性疾病而住院治療的主要原因。例如在兒童支氣管炎和義膜性喉炎(croup)病例中，由RSV和PIV引起的佔大多數。同樣，兒童肺炎和類似流感的疾病病例中，由RSV和PIV引起的有將近一半。另外，兩種病毒均可通過氣霧滴(aerosol droplets)傳播，因此導致醫院感染。
減輕RSV和PIV對人類健康的影響和對世界經濟的衝擊的努力進行了超過30年，但成效甚微。例如，用福馬林滅活的全病毒RSV疫苗所得到的令人失望的結果阻礙了RSV疫苗早期的發展。在此研究中，用福馬林滅活的全病毒免疫的對象在免疫後感染了更為嚴重的疾病。見Kim等，Am.J.Epidemiol.89422-434(1969)。早期製造有效的甲醛滅活PIV和RSV疫苗的嘗試未能提供適當的感染保護。參見，Chin，J.等，Am.J.Epidemiol.89449-463(1969)。
目前已在臨床試驗中評價了兩株減毒候選疫苗，PIV3(JS株系)的cold-passage衍生物(cp45)和牛3型副流感病毒(bovineparainfluenza virus type 3)。參見，Jones，T.，Curfent Opinionin Investigational Drugs，2(7)890-892(2001)。結果，cp45被認為是有前景的PIV3疫苗。
RSV和PIV研究的另外一個重要方面仍然是預防年紀較大的或者存在醫學病症如肺炎和下呼吸道感染的患者的疾病併發症。鑑於這種考慮，曾經嘗試開發基於載體的純化蛋白質抗原以施用於受感染的患者群體。參見，Crowe，J.E.等，Virus Genes 13(3)26-273(1996)。
已經測試了多種用於整合併表達副粘病毒科病毒異源基因的載體的能力。這些包括，例如，野生型牛痘或減毒的改造安卡拉牛痘(Modified Ankara vaccinia，MVA)(Durbin等，Vaccine 161234-1330(1998)；Elango，N.，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA831906-1910(1986))有複製能力的人腺病毒(adenovirus)載體(Mittal S.K.，等，Intervirology 41(6)253-260(1998))，水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis virus，VSV)(Kahn S.J.，J.Virol 75(22)11079-87(2001))，Semliki森林病毒(SemlikiForest virus，SFV)((Peroulis，1.，等，Archives of Virology，144107-116(1999)，作為攜帶PIV1/2或者麻疹病毒基因組的潛在載體的人PIV3本身(Skiadopoulos M.H.，等，Virology 29(1)136-152(2002))和攜帶人PIV3基因組的牛PIV3(HallerA.A.，等，J.Virology 74(24)11626-35(2000))。對所有上述載體的潛伏期研究顯示了針對相應病原體的有前景的保護功效。
儘管RSV和PIV疾病很流行很嚴重，並且進行了無數的早期嘗試來生產疫苗，但當前仍然不存在預防這些感染的免疫原性組合物。因此，需要免疫原性組合物和誘導針對RSV、PIV和其他副粘病毒的保護性免疫的方法。
發明概述本發明涉及用於免疫哺乳動物以抵禦副粘病毒如RSV和PIV的免疫原性組合物。更特別地，本發明涉及包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)的免疫原性組合物，委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白基因。在特定實施方案中，當用於感染BHK培養細胞單層時，委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒誘導細胞病變效應。在另一實施方案中，當轉移至未感染的細胞單層時，用複製子顆粒感染的細胞所得的上清液，在不存在複製子顆粒的情況下誘導細胞病變效應。在特定實施方案中，BHK培養細胞中的細胞病變效應是合胞體形成(syncytia formation)、單層細胞瓦解或細胞凋亡。在另一實施方案中，委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒。在一個實施方案中，委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒在哺乳動物宿主中引發保護性免疫反應。在特定實施方案中，所述保護性免疫反應防止3型副流感病毒對哺乳動物宿主下呼吸道的感染。在另一實施方案中，所述保護性免疫反應降低3型副流感病毒對哺乳動物宿主上呼吸道感染的嚴重程度。在特定實施方案中，所述免疫原性組合物進一步包含藥學上可接受的載體和/或佐劑。
在一個實施方案中，本發明提供了包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒群體的免疫原性組合物，所述委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、和至少一種副粘病毒糖蛋白基因。在特定實施方案中，副粘病毒選自1型副流感病毒、2型副流感病毒、3型副流感病毒、4型副流感病毒和呼吸道合胞病毒。在另一實施方案中，副粘病毒糖蛋白選自1型副流感病毒HN、1型副流感病毒F、2型副流感病毒HN、2型副流感病毒F、3型副流感病毒HN、3型副流感病毒F、4型副流感病毒HN、4型副流感病毒F糖蛋白。在另一實施方案中，特定副流感病毒的HN和F糖蛋白組合，且選自1型副流感病毒F糖蛋白基因和1型副流感病毒HN糖蛋白基因；2型副流感病毒F糖蛋白基因和2型副流感病毒HN糖蛋白基因；3型副流感病毒F糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白基因；4型副流感病毒F糖蛋白基因和4型副流感病毒HN糖蛋白基因。在可選實施方案中，副粘病毒是呼吸道合胞病毒，糖蛋白是呼吸道合胞病毒附著(G)糖蛋白，和/或呼吸道合胞病毒融合(F)糖蛋白。在本發明的一個實施方案中，當用於感染BHK培養細胞的單層時，委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒誘導細胞病變效應。在另一實施方案中，當轉移至未感染的細胞單層時，用複製子顆粒感染的細胞所得的上清液，在不存在複製子顆粒的情況下誘導細胞病變效應。在本發明的特定實施方案中，細胞病變效應選自合胞體形成、單層細胞瓦解和細胞凋亡。
在一個實施方案中，本發明提供了編碼委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶、3型副流感病毒F糖蛋白和3型副流感病毒HN糖蛋白的分離的重組核酸分子。在另一個實施方案中，本發明提供了具有SEQ ID NO4所示核酸序列的編碼委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶、3型副流感病毒F糖蛋白和3型副流感病毒HN糖蛋白的分離的重組核酸分子。在可選實施方案中，委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶、3型副流感病毒F糖蛋白和3型副流感病毒HN糖蛋白由SEQ ID NO1所示的核酸編碼。在特定實施方案中，委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶、3型副流感病毒F糖蛋白和3型副流感病毒HN糖蛋白包含SEQ ID NO2；SEQ ID NO3，和SEQ IDNO4中所列出的胺基酸序列。在另一實施方案中，所述免疫原性組合物進一步包含藥學上可接受的載體和/或佐劑。
在一個實施方案中，本發明提供了免疫哺乳動物對象以抵禦副粘病毒感染呼吸道的方法，該方法包括給予對象免疫學上有效量的(a)包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體的免疫原性組合物，委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白，委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白，和至少一種副粘病毒糖蛋白基因；和(b)藥學上可接受的載體，以足以引起免疫反應的量施用。在特定實施方案中，副粘病毒是3型副流感病毒，糖蛋白是3型副流感病毒紅細胞凝集素-神經氨酸酶(HN)糖蛋白或者3型副流感病毒融合(F)糖蛋白。在另一實施方案中，糖蛋白同時包括3型副流感病毒F糖蛋白和HN糖蛋白。在另一實施方案中，當轉移至未感染的細胞單層時，來自用複製子顆粒感染的細胞的上清液，在不存在複製子顆粒的情況下誘導細胞病變效應。在特定實施方案中，細胞病變效應是合胞體形成、單層細胞瓦解或細胞凋亡。在特定實施方案中，委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒。在另一實施方案中，副粘病毒是呼吸道合胞病毒，糖蛋白是呼吸道合胞病毒附著(G)糖蛋白，或呼吸道合胞病毒融合(F)糖蛋白。在可選實施方案中，糖蛋白同時包括呼吸道合胞病毒G糖蛋白和F糖蛋白。在特定實施方案中，感染在下呼吸道中。而在另一實施方案中，感染在上呼吸道中。
本發明還提供了包含自增殖小泡(self-propagating blebs)群體的免疫原性組合物，所述小泡(blebs)包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒F糖蛋白、3型副流感病毒HN糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白。在特定實施方案中，所述小泡是促融合劑(fusogenic)。在另一實施方案中，自增殖小泡從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞上清液獲得，所述複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、副流感病毒F糖蛋白基因和副流感病毒HN糖蛋白基因。在另一實施方案中，當用於感染BHK培養細胞單層時，自增殖小泡誘導細胞病變。更特別地，當轉移至未感染的細胞單層時，用自增殖小泡感染的細胞所得的上清液，在不存在複製子顆粒的情況下誘導細胞病變效應。在本發明的特定實施方案中，小泡在BHK培養細胞中誘導下述細胞病變效應中的一種或多種合胞體形成、單層細胞瓦解和細胞凋亡。在另一實施方案中，小泡群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒。在特定實施方案中，自增殖小泡在哺乳動物宿主中引發保護性免疫反應。在特定實施方案中，所述保護性免疫反應阻止3型副流感病毒對哺乳動物宿主下呼吸道的感染。在另一實施方案中，所述保護性免疫反應防止感染或者降低3型副流感病毒對哺乳動物宿主上呼吸道感染的嚴重程度。
本發明的實施方案提供了免疫哺乳動物對象以抵禦副粘病毒感染的方法。例如，一種這樣的方法包括給予對象免疫學有效量的包含自增殖小泡群體的免疫原性組合物，所述自增殖小泡包含(a)委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、至少一種副粘病毒糖蛋白基因和至少一種副粘病毒糖蛋白，(b)藥學上可接受的載體，以及以足以引發免疫反應的量施用所述的免疫原性組合物。在特定實施方案中，自增殖小泡從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞的上清液獲得，所述複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、和至少一種副粘病毒糖蛋白基因。在特定實施方案中，副粘病毒選自下組1型副流感病毒、2型副流感病毒、3型副流感病毒、4型副流感病毒和呼吸道合胞病毒。在另一實施方案中，副粘病毒糖蛋白選自下組1型副流感病毒HN、1型副流感病毒F、2型副流感病毒HN、2型副流感病毒F、3型副流感病毒HN、3型副流感病毒F、4型副流感病毒HN、4型副流感病毒F。在特定實施方案中，特定副流感病毒的HN和F糖蛋白組合，且選自1型副流感病毒F糖蛋白基因和1型副流感病毒HN糖蛋白基因；2型副流感病毒F糖蛋白基因和2型副流感病毒HN糖蛋白基因；3型副流感病毒F糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白基因；4型副流感病毒F糖蛋白基因和4型副流感病毒HN糖蛋白基因。在另一實施方案中，副粘病毒是呼吸道合胞病毒，糖蛋白是呼吸道合胞病毒附著(G)糖蛋白，和/或呼吸道合胞病毒融合(F)糖蛋白。在另一實施方案中，所述小泡是促融合劑。在本發明的一個實施方案中，當用於感染BHK培養細胞的單層時，所述小泡誘導細胞病變效應。在另一實施方案中，當轉移至未感染的細胞單層時，用小泡感染的細胞所得的上清液，在不存在複製子顆粒的情況下誘導細胞病變效應。在本發明的特定實施方案中，細胞病變效應選自下組合胞體形成、單層細胞瓦解和細胞凋亡。
在可選實施方案中，包含自增殖性促融合小泡的所述免疫原性組合物進一步包含藥學上可接受載體。在另一實施方案中，包含自增殖性促融合小泡的所述免疫原性組合物進一步包含佐劑。
本發明還提供免疫哺乳動物對象以抵禦副粘病毒感染呼吸道的方法，該方法包含給予所述對象免疫學有效量的(a)包含自增殖小泡群體的免疫原性組合物，所述小泡包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、副流感病毒F糖蛋白基因、副流感病毒F糖蛋白、副流感病毒HN糖蛋白基因和副流感病毒HN糖蛋白；(b)藥學上可接受的載體，以足以引發免疫反應的量施用。在一個實施方案中，自增殖小泡從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞的上清液獲得，所述複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、副流感病毒F糖蛋白基因和副流感病毒HN糖蛋白基因。在特定實施方案中，所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒，並且當轉移至未感染的細胞單層時，用自增殖小泡感染的細胞所得的上清液，在不存在複製子顆粒的情況下誘導細胞病變效應。在另一實施方案中，副流感病毒選自下組1型副流感病毒、2型副流感病毒、3型副流感病毒、和4型副流感病毒。在另一實施方案中，HN糖蛋白是3型副流感病毒紅細胞凝集素-神經氨酸酶(HN)糖蛋白，F糖蛋白是3型副流感病毒融合(F)糖蛋白。在特定實施方案中，所述糖蛋白同時包括3型副流感病毒F糖蛋白和HN糖蛋白。
在一個實施方案中，本發明提供了免疫哺乳動物對象以抵禦3型副流感病毒感染的方法，該方法包含給予所述對象免疫學有效量的(a)包含自增殖小泡群體的免疫原性組合物，所述小泡包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒F糖蛋白、3型副流感病毒HN糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白；(b)藥學上可接受的載體，以足以引發免疫反應的量施用。在另一實施方案中，委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白和3型副流感病毒HN糖蛋白具有SEQID NO2；SEQ ID NO3，和SEQ ID NO4中所示的胺基酸序列。在特定實施方案中，自增殖小泡從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞的上清液獲得，所述複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白基因；以足以引發免疫反應的量施用。在另一實施方案中，所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒。在特定實施方案中，當轉移至未感染的細胞單層時，用自增殖小泡感染的細胞所得的上清液，在不存在複製子顆粒的情況下誘導所述的細胞病變效應。
附圖簡述

圖1是對顯示VEE複製酶基因、PIV3 F基因和PIV3 HN基因的VRP-F/HN複製子質粒的描述。
發明詳述已將甲病毒(Alphaviruses)進行遺傳工程處理以用於哺乳動物和昆蟲細胞基因的體內和體外傳輸系統用途。甲病毒基因由單股正鏈RNA組成，其分為兩個區域，5｀為非結構蛋白(NSP)基因，緊接著是調控結構基因轉錄的亞基因組啟動子。NSP基因在病毒核心(viral core)釋放到細胞質之後立刻被翻譯。NSP複合體作為複製酶發揮作用，合成全長抗基因組和基因組，以及作為轉錄酶合成編碼結構基因的亞基因組轉錄本。例示性甲病毒包括委內瑞拉馬腦炎(VEE)病毒，Sindbis病毒和Semiliki森林病毒。
甲病毒的複製獨立於結構基因；因此，可以將其去除，將外源基因置於其所在位置。這樣的重組RNA導入細胞導致外源基因產物的一輪複製與表達。同樣地，這些基因組被稱為「自殺」載體或者「複製子」。用甲病毒運輸外源基因的兩個主要優點是1)獲得了高水平的表達，和2)感染細胞的凋亡(或者程序性細胞死亡)，其產生「危險」信號，警示免疫系統並引起強烈的免疫反應。
可以以裸露RNA、將其作為cDNA結合到基於真核生物pol 11啟動子的質粒運輸載體中、或者可選地將其包裝至感染性病毒樣的複製子顆粒中的形式來使用複製子載體。複製子載體的有效運輸獲得很強的外源基因表達和程序性細胞死亡。在所有實施中，與活病毒不同，載體只進行一輪複製，而終止從細胞到細胞的傳播。
以下的U.S.專利中詳述地描述了所述的複製子系統N.L.Davis等名稱為″cDNA clohe coding for Venezuelan equine encephalitisvirus and attenuating mutations there of″的US專利No.5,185,440；R.E.Johnston等名稱為″Attenuating mutations inVenezuelan equine encephalitis virus″的US專利No.5,505,947；R.E.Johnston等名稱為″Alphavirus RNA replicon systems″的US.專利No.6,156,558；和R.E.Johnston等名稱為″AlphavirusRNA replicon systems″的US.專利No.6,531,135，此處將其全部內容一併作為參考。
本發明描述了用於傳輸複製子表達載體的新的方法。對委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)複製子載體進行了遺傳工程處理，使其同時表達副粘病毒的紅細胞凝集素(HN)和融合(F)蛋白，所述副粘病毒為3型副流感病毒(PIV3)。鑑定VEE複製子顆粒(VRP)期間發現，與對複製子已知的了解相反，VRP-F/HN複製子感染時，該系統在組織培養物中產生感染性顆粒。這些感染性顆粒1)表達PIV3 HN、F、和VEE NSP複合體，2)能夠自增殖性，3)在其表面包含HN和F蛋白，4)在重複的冷凍-解凍循環過程中始終是穩定的，5)在大小上是雜合的，且其中一部分能夠通過0.2微米過濾器，6)是高度免疫原性的以及7)在敘利亞倉鼠模型(Syrian Hamster model)中可用作有效的免疫原性組合物以抵禦PIV3感染。下面詳細描述本發明。
在這些研究過程中，將PIV3HN和F基因克隆至複製子載體。所得的載體(VRP-F/HN)具有高度的免疫原性，以低至1×104感染單位(IU)通過鼻內或肌肉途徑施用時，保護倉鼠不被PIV3所感染。HN和F在VRP包裝期間的共表達產生大的合胞體；因此，發現此特定VRP的滴度在每個包裝反應中從未超過1×105VRP，滴度為104-5，低於其他的VRP載體。
可以用VRP-F/HN感染細胞以製備感染性或「自增殖」小泡，或者可選地單獨用VEE-F/HN複製子載體RNA轉染細胞來製備。「感染性小泡」或「自增殖小泡」指在其表面具有PIV3 HN和F基因或其他一些病毒融合蛋白或蛋白的外膜促融合囊泡(vesicle)或促融合顆粒，其能夠自我增殖。術語「感染性小泡」、「自增殖小泡」、小泡、和「促融合顆粒」有時候將互換使用。當作為免疫原性組合物以低至104的合胞體形成單位(SFU)施用時，小泡能夠保護敘利亞倉鼠的上和下呼吸道不受PIV3感染。這些潛伏期研究顯示感染性顆粒可以用作針對PIV3的免疫原性組合物。
本發明有幾個直接用途。第一，VEE複製子顆粒用於同時表達PIV3的HN和F基因的用途。第二，VEE複製子顆粒用於製備表面具有PIV或其他促融合蛋白/糖蛋白的自增殖小泡的用途。第三，促融合自增殖小泡作為免疫原的用途。
在本發明的一個實施方案中，顯示了在敘利亞倉鼠模型中產生針對PIV3的免疫性方面，HN和F基因的共表達比任何一個基因的單獨表達，或者單獨表達後組合[HN+F]都更為有效。排除理論的束縛，該載體的免疫原性可能與F/HN複合體升高的存在水平和/或更長的半衰期有關。可選地，從感染的細胞釋放的促融合顆粒或小泡可能延長了表達的時間和/或增加了被感染細胞的數目。
在本發明的另一實施方案中，表面含有HN和F蛋白的促融合顆粒或小泡在敘利亞倉鼠模型中也是抵禦PIV3感染的有效的免疫原性組合物。在體外，每個感染細胞產生大約10-100個小泡，使該系統適合於大規模生產。小泡在冷凍-解凍循環中始終是穩定的。可以通過用VRP-F/HN或用小泡感染細胞來生產自增殖小泡，或者可選地通過對VEE複製子-F/HN RNA的電穿孔(electroporation)來生產。
本發明的一個特定的實施方案將包括額外的一個或多個基因，所述基因能夠賦予針對異源病原體的保護能力。促融合顆粒自增殖的事實提供了相對於體外產生的免疫原性組合物的優勢。例如，也可以利用來自其他病毒(麻疹病毒、SV5、或者HIV)的其他促融合蛋白替代PIV3HN和F，以增強免疫原性組合物的整體性能(repertoire)。
來自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的複製子代表了用於免疫原性組合物設計的可選載體系統。已經顯示VEE複製子能夠感染多種動物細胞類型。VEE複製子已被用於病毒以及細菌抗原的抗原遞送[Davis N.L.，等，J.Virology 70(6)3781-3787(1996)；Lee J.S.，等，J.Infect.Dis.，185(8)1192-6(2002)]，並通過靶向樹突狀細胞，成功地誘導了體液及細胞介導的免疫[MacDonald G.H.，等，J.Virology，74(2)914-922(2000)]。
VEE複製子利用了親本委內瑞拉馬腦炎病毒的某些特性。委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)是披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬的成員。其病毒基因組是單股、正鏈RNA，5｀端有甲基化帽子修飾，3｀端有長度可變的poly(A)片段。結構亞單位包含二十面體核衣殼中與RNA基因組結合的單一病毒衣殼蛋白(c)。在病毒粒子中，衣殼被脂質包膜所包被，脂質包膜由規則的跨膜蛋白陣列所覆蓋，每個衣殼由兩個糖蛋白E1和E2的異二聚複合體組成。參見，Pedersen，C.E.和Eddy，G.A.，J.Mol.Biol.1681-15(1974)。VEE基因組的組織和VEE基因表達的所有策略均與原型甲病毒(prototype alphaviruses)、Sindbis病毒和Semliki森林病毒類似。(綜述可參見Schlesinger，S.和Schlesinger，M.J.，The Togaviridae and Flaviviridae.Plenum Publishing Corp.，New York(1986)。例如，VEE TrinidadDonkey株系的部分基因組序列的詳細情況揭示了VEE結構蛋白是從26S亞基因組mRNA以多蛋白的方式轉譯的，26S亞基因組mRNA對應於病毒基因組的3｀端三分之一。參見Kinney等，Virology 152400(1986)。蛋白水解過程產生了成熟病毒顆粒中發現的蛋白。甲病毒非結構蛋白基因位於基因組的5｀端三分之二，順序為NSP1，NSP2，NSP3和NSP4。蛋白質起初作為多蛋白前體表達，然後經蛋白水解處理成為其成熟形式。成熟的非結構蛋白是基因組RNA複製和26S亞基因組mRNA合成所需的。
VEE基因組由正鏈單股RNA分子組成。長約11kb，具有5｀端帽子結構和3｀端多聚A尾巴。複製過程中產生負鏈RNA中間體，其作為模板用於額外病毒基因組的合成和亞基因組mRNA的轉錄。當作為載體用於基因傳輸時，編碼病毒結構蛋白的基因組3｀端的三分之一被刪除，並由編碼感興趣的抗原的基因所代替，基因組3｀端的三分之一對病毒RNA複製來說是可有可無的。這些複製子的包裝通過共轉染編碼VEE結構蛋白的缺陷型輔助RNA來完成。所得的複製子顆粒結合了編碼感興趣的抗原的基因，但不再能夠產生感染性病毒顆粒。然而，複製子能夠引導大量異源基因產物的表達，因此用作傳輸抗原的有效工具。
為了評估VEE複製子是否可作為載體用於抵禦副粘病毒科病毒的免疫原性組合物設計中，選擇PIV3病毒作為實驗病毒用於抵禦副粘病毒的免疫組合物的研究中，因為PIV3病毒具有廣泛的用途。由於缺乏對單個病毒蛋白本身的抗原性和免疫原性的詳細了解，因而PIV和RSV亞單位疫苗的開發受到了阻礙。例如PIV3基因組包含6個開始閱讀框(ORF)，其編碼下述的非結構性內在蛋白核衣殼(NP)、基質蛋白(M)、磷蛋白(P)、高分子量聚合酶(L)蛋白和兩種表面糖蛋白、紅細胞凝集素神經氨酸酶(HN)和融合蛋白(F)。ORF也編碼兩個其他的蛋白C和V，其表達分別歸因於RNA的編輯和選擇性翻譯起始。可能還表達第三種蛋白D，但該蛋白的功能目前尚未確定。到目前為止，有關這些內在蛋白在保護不受PIV3感染中的角色幾乎沒有可用信息。已經顯示，與PIV3的NP具有85％同源性的PIV1的核蛋白(NP)編碼顯性MHC I類結合肽，其誘導非常強烈的MHC I類限制性反應，能夠保護鼠免受PIV1感染。還有，HN和F是兩種主要的中和抗原，HN蛋白包含至少6個中和位點，F蛋白至少包含8個。
HN是II型糖蛋白，其具有內在的紅細胞凝集素和神經氨酸酶活性。HN介導病毒與細胞的粘附並促進融合進程。其清除唾液酸以釋放病毒顆粒，並阻止凝集。F蛋白為I型糖蛋白，其對病毒滲透及合胞體形成至關重要。Fo的蛋白水解裂解產生兩個二硫鍵連接的亞單位，F1和F2，並且是融合活性所必需的。HN和F共存於病毒表面上看起來具有重要的生物學意義，因為F的體外融合活性需要HN蛋白的存在。對包含PIV3亞單位的免疫原性組合物的潛伏期研究已經獲得了有關將HN和F用作保護性抗原的重要性的數據。
大體上，針對副粘病毒如副流感病毒(PIV)和呼吸道合胞病毒(RSV)的免疫原性組合物的設計著眼於防止下呼吸道(LRT)感染。例如在動物模型中，佐劑輔助的純化或載體表達的PIV3 HN蛋白提供了對LRT的保護，而純化的或者載體表達的F蛋白提供了部分的保護或者未提供保護。使用重組HN和F的組合或嵌合蛋白F/HN的方法顯示了對LRT感染的保護。此處所述的研究已經啟動，以構建同時表達HN和F蛋白的VRP。此處描述了基於VEE的有效的PIV亞單位免疫原性組合物，有可能由於其強大的潛力而使其具備新的特點。
本文所用術語「感染性小泡」，或者「自增殖小泡」或者「小泡」指在其表面具有PIV3 HN和F基因(或者其他一些病毒融合蛋白或蛋白)的外膜促融合囊泡，其能夠自我增殖。術語「感染性小泡」、「自增殖小泡」、小泡、和「促融合顆粒」有時將互換使用。自增殖是由小泡表面上的融合蛋白所驅動的。然而，小泡也包含複製子RNA，這樣，與新的細胞融合時，複製子RNA被轉錄，融合蛋白或蛋白表達於細胞表面，進程再次開始。本發明的自增殖小泡顯示其作為抵禦PIV3的免疫原性組合物是有效的。在體外，每個感染細胞產生約10-100個自增殖小泡，使該系統適合於大規模生產。自增殖小泡在冷凍-解凍循環過程中始終是穩定的。通過用VRP-F/HN或用促融合顆粒感染細胞來製備自增殖小泡，或者可選地通過對VEE複製子-F/HN RNA的電穿孔(electroporation)來製備。感染性小泡自增殖的事實提供了相對於體外產生的亞單位蛋白的優勢。
術語「甲病毒」具有其本領域的傳統意義，並包括甲病毒中的不同種，例如東方馬腦炎病毒(Eastern Equine Encephalitis virus，EEE)、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)、西方馬腦炎病毒(Eastern EquineEncephalitis virus，WEE)、Sindbis病毒、南非蟲媒病毒(SouthAfrican Arbovirus)No.86、Semliki森林病毒，以及其他病毒。有關綜述參見Griffin，D.E.，Field′s Virology，4thEdition，Chapter 30Alphaviruses pp.917-962，出版商LippincottWilliams Wilkins，New York(2001)，其全部內容此處一併作為參考。用於本發明的優選甲病毒RNA轉錄本(transcript)包括VEE、Sindbis病毒和Semliki森林病毒。
本發明的方法中使用的甲病毒容許的細胞是，當用病毒RNA轉錄本轉染時，能夠產生病毒顆粒的細胞。甲病毒具有廣泛的宿主範圍。適當的哺乳動物宿主細胞的例子包括但不限於Vero細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、雞胚成纖維(CEF)細胞和猴腎細胞(LLC-MK2)。
VRP在來自BHK-21系的細胞中增殖。該實施例中，從CCL-10克隆獲取BHK細胞，以將其與不共享隱蔽表型特徵的其他的BHK克隆群體區分開。如此處所定義的，細胞可以稱為BHK21或者簡單地稱為BNK細胞。
本文中所用的術語「非結構蛋白」或者「NSP」指複製子中具有多聚酶功能的蛋白。例如，在委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)中，由作為單一多蛋白翻譯的NSP1、NSP2、NSP3和NSP4蛋白提供多聚酶功能。非結構蛋白基因是一部分複製子RNA自主複製所必需的。
此處所用短語「結構蛋白」或者「甲病毒結構蛋白」指編碼的蛋白，其是RNA複製子複製所需的，包括衣殼蛋白，E1糖蛋白和E2糖蛋白。如本文所述，甲病毒的結構蛋白編碼於一個或多個輔助RNA上(例如第一輔助RNA和第二輔助RNA)。此外，一個或多個結構蛋白可以編碼於作為複製子RNA的同一RNA分子上，倘若編碼至少一個結構蛋白的區域從複製子RNA上刪除，則複製子和所得的甲病毒顆粒就是複製缺陷性的。此處所用的術語「刪除的(deleted)」或者「刪除(deletion)」意思或者是特定核酸片段的全部刪除，或者是刪除足夠長的一部分特定片段，使之與標準用途相比成為不起作用的或者失去功能的片段。參見，例如，Temin等的U.S.專利No.4,650,764。此處所用術語「複製缺陷性的」意思是缺乏輔助RNA時，複製子RNA不能在宿主細胞中形成新的病毒顆粒。複製子RNA為複製缺陷性的是因為複製子RNA不編碼複製所需的所有甲病毒結構蛋白，所需的結構蛋白中至少有一種從其中刪除了。
如上所述，表達感染性、複製缺陷性甲病毒顆粒的輔助細胞包含一系列的RNA。這一系列的RNA包括第一輔助RNA和第二輔助RNA。第一輔助RNA包括編碼至少一種甲病毒結構蛋白而不編碼所有甲病毒結構蛋白的RNA。換句話說，第一輔助RNA至少不編碼一種甲病毒結構蛋白；所述的至少一種不編碼的甲病毒結構蛋白從第一輔助RNA中刪除了。在一個實施方案中，第一輔助RNA包括編碼甲病毒E1糖蛋白的RNA，甲病毒衣殼蛋白和甲病毒E2糖蛋白從第一輔助RNA中刪除了。在另一個實施方案中，第一輔助RNA包括編碼甲病毒E2糖蛋白的RNA，甲病毒衣殼蛋白和甲病毒E1糖蛋白從第一輔助RNA中刪除了。在第三個實施方案中，第一輔助RNA包括編碼甲病毒E1糖蛋白和甲病毒E2糖蛋白的RNA，甲病毒衣殼蛋白從第一輔助RNA中刪除了。
第二輔助RNA包括編碼至少一種甲病毒結構蛋白的RNA，該甲病毒結構蛋白與第一輔助RNA編碼的所述至少一種結構蛋白不同。如此，第二輔助RNA編碼至少一種甲病毒結構蛋白，該甲病毒結構蛋白不由編碼至少一種甲病毒結構蛋白的第一輔助RNA所編碼。第二輔助RNA不編碼由第一輔助RNA所編碼的至少一種甲病毒結構蛋白，這樣第一輔助RNA和第二輔助RNA不編碼相同的結構蛋白。第二輔助RNA編碼不同於第一輔助RNA編碼的結構蛋白的結構蛋白。在第一輔助RNA包括只編碼甲病毒E1糖蛋白的RNA的實施方案中，第二輔助RNA可以包括編碼甲病毒衣殼蛋白和甲病毒E2糖蛋白中其中一個的RNA或者同時包括編碼兩者的RNA，編碼甲病毒衣殼蛋白和甲病毒E2糖蛋白的RNA從第一輔助RNA中刪除了。在第一輔助RNA包括只編碼甲病毒E2糖蛋白的RNA的實施方案中，第二輔助RNA可以包括編碼甲病毒衣殼蛋白和甲病毒E1糖蛋白中其中一個的RNA或者同時包括編碼兩者的RNA，編碼甲病毒衣殼蛋白和甲病毒E1糖蛋白的RNA從第一輔助RNA中刪除了。在第一輔助RNA同時包括編碼甲病毒E1糖蛋白和甲病毒E2糖蛋白的RNA的實施方案中，第二輔助RNA可能包括編碼甲病毒衣殼蛋白RNA，編碼甲病毒衣殼蛋白的RNA從第一輔助RNA中刪除了。
在一個實施方案中，包裝片段或「殼體化序列(encapsidationsequence)」至少從第一輔助RNA中刪除了。在另一實施方案中，第一輔助RNA和第二輔助RNA中的包裝片段均被刪除。
在第一輔助RNA和第二輔助RNA中的包裝片段均被刪除的一個實施方案中，除了包含第一輔助RNA和第二輔助RNA外，輔助細胞優選還包含複製子RNA。複製子RNA編碼包裝片段和插入的異源RNA。插入的異源RNA可以是編碼病毒融合蛋白的RNA、或者是編碼產生融合活性所必需的蛋白的RNA、或者是編碼能夠介導融合活性的肽的RNA。典型地，插入的異源RNA編碼宿主、甲病毒容許的細胞或自增殖小泡融合伴侶急於表達的蛋白質或肽，並且在所述細胞中包括所述蛋白質或肽表達所必需的啟動子和調控片段。插入的異源RNA的合適的例子包括來自很大範圍病毒的病毒RNA，包括但不限於1型副流感病毒、2型副流感病毒、3型副流感病毒、4型副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人免疫缺陷病毒、水泡性口炎病毒和流感病毒。
可以用於提供插入的異源RNA的合適的病毒RNA基因的例子包括但不限於1至4型副流感病毒的HN和F基因，尤其是3型副流感病毒的HN和F，流感紅細胞凝集素基因、流感神經氨酸酶基因、慢病毒(Lentivirus)糖蛋白包膜基因、HIV包膜gp160基因、和HIV基質衣殼融合基因。在本發明的另一實施方案中，插入的異源RNA編碼呼吸道合胞病毒融合(F)糖蛋白、呼吸道合胞病毒附著(G)糖蛋白或者同時編碼呼吸道合胞病毒融合F和呼吸道合胞病毒G蛋白。
在一個實施方案中，複製子RNA、第一輔助RNA和第二輔助RNA提供於各自獨立的分子上，這樣，第一個分子，例如複製子RNA包括編碼包裝片段的RNA和編碼融合活性的插入的異源RNA，第二個分子，例如第一輔助RNA包括編碼至少一種但不是所有需要的甲病毒結構蛋白的RNA，以及第三個分子，例如第二輔助RNA包括編碼至少一個但不是所有需要的結構蛋白的RNA。例如，在本發明的另一實施方案中，輔助細胞包括一系列RNA，其中包括(a)複製子RNA，包括編碼甲病毒包裝序列的RNA和編碼融合活性的插入的異源RNA，(b)第一輔助RNA，包括編碼甲病毒E1糖蛋白和甲病毒E2糖蛋白的RNA，和(c)第二輔助RNA，包括編碼甲病毒衣殼蛋白的RNA，以使甲病毒E1糖蛋白、甲病毒E2糖蛋白和衣殼蛋白一起在宿主細胞中組裝為甲病毒複製子顆粒。
在可選實施方案中，複製子RNA和第一輔助RNA在各自獨立的分子上，複製子RNA和第二輔助RNA一起位於同一分子上，這樣，第一個分子，例如第一輔助RNA包括編碼至少一種但不是所有需要的甲病毒結構蛋白的RNA，第二個分子，例如複製子RNA和第二輔助RNA包括編碼包裝片段、插入的異源DNA和衣殼蛋白的RNA。這樣，衣殼蛋白由第二輔助RAN所編碼，但第二輔助RNA與複製子RNA一起共同位於第二分子上。例如，在本發明的一個實施方案中，輔助細胞包括一系列的RNA，包括(a)複製子RNA，包括編碼甲病毒包裝序列的RNA、插入的異源RNA、和編碼甲病毒衣殼蛋白的RNA，和(b)第一輔助RNA，包括編碼甲病毒E1糖蛋白和甲病毒E2糖蛋白的RNA，以使甲病毒E1糖蛋白、甲病毒E2糖蛋白和衣殼蛋白一起在宿主細胞中組裝為甲病毒顆粒。
此處所用術語「細胞病變效應」(CPE)指在被病毒感染的單個培養細胞或多個細胞中，經誘導出現的顯著形態學變化。通常，CPE在光學顯微鏡下很容易看見。CPE包括但不限於以下的細胞現象合胞體形成、單層細胞瓦解、圓形化、收縮、折射性增強、融合、聚集、粘附性喪失或者裂解。這些現象可以單個發生或者以不同的組合發生，其依賴於特定的病毒、細胞類型和條件。
本發明的免疫原性組合物可以包含佐劑。佐劑是當與免疫原或抗原一起施用時增強免疫反應的物質。一些細胞因子或淋巴因子顯示了免疫調控活性，因此可以用作佐劑，包括但不限於白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(例如參見，U.S.專利No.5,723,127)、13、14、15、16、17和18(及其突變形式)，幹擾素-α、β和γ，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(例如參見U.S.專利No.5,078,996)，巨噬細胞集落刺激因子，粒細胞集落刺激因子，GSF和腫瘤壞死因子α和β。還有其他的可用於本發明的佐劑包括化學激動劑(chemokine)，包括但不限於MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。粘附分子例如選擇素(selectin)，如L-選擇素、P-選擇素和E-選擇素也可以用作佐劑。其他可用的佐劑包括但不限於粘液素(mucin)樣分子，例如，CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1，整聯蛋白家族成員如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95，免疫球蛋白超家族成員如PECAM、ICAMs，例如，ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3、CD2和LFA-3，共刺激分子例如CD40和CD40L，生長因子包括血管生長因子、神經生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、B7.2、PDGF、BL-1、和血管內皮生長因子、受體分子包括Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、和DR6。還包括另外一種佐劑分子Caspase(ICE)。也參見國際專利公開No.WO98/17799和No.WO99143839，這裡一併作為參考。
用於增強免疫反應的合適的佐劑包括但不限於MPLTM(3-O-脫醯單磷醯脂質A；Corixa，Hamilton，MT)，U.S.專利No.4,912,094中描述了該佐劑，其一併作為參考。同樣適合於作為佐劑的是合成的脂質A類似物或者氨烷基葡糖胺磷酸鹽化合物(AGP)，或其衍生物或類似物，可從Corixa(Hamilton，MT)獲得，其描述於美國專利No.6,113,918，此處一併作為參考。一種此類AGP是2-[(R)-3-十四烷醯氧十四烷醯氨基]-乙基-2-脫氧-4-O-磷醯基-3-O-[(R)-3-十四烷醯氧十四烷醯基]-2-[(R)-3-十四烷醯氧十四烷醯-氨基]-b-D-吡喃葡糖苷，其也稱為529(早期稱為RC529)。此529佐劑調配為水合物或者穩定的乳劑。
其他的佐劑包括礦物油和水乳劑、鋁鹽(明礬)如氫氧化鋁、磷酸鋁等、Amphigen、Avridine、L121/鯊烯、D-丙交酯-聚交酯/糖苷、普盧尼克多元醇(pluronic polyols)、胞壁醯二肽(muramyldipeptide)、滅活的博德特氏菌(Bordetella)、皂角苷如StimulonTMQS-21(Antigenics，Framingham，MA)，U.S.專利No.5,057,540描述了這些佐劑，此處將其一併作為參考，還包括由此產生的顆粒如ISCOMS(免疫刺激複合體)、結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、細菌脂多糖、合成多核苷酸如含CpG基序的寡核苷酸(U.S.專利No.6,207,646，此處一併作為參考)、百日咳毒素(PT)、或大腸桿菌熱不穩定毒素(LT)，尤其是LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；例如參見國際專利公開文本WO 93/13302和WO 92/19265，此處一併作為參考。
還可作為佐劑的是霍亂毒素及其突變體，包括公開的國際專利申請WO 00/18434(其胺基酸位置29的穀氨酸被另一種胺基酸(非天冬氨酸)優選組氨酸所取代)中所描述的。類似的CT毒素或者突變體描述於國際專利申請WO 02/098368(其胺基酸位置16的異亮氨酸被另一種胺基酸所取代，或者單獨被取代，或者胺基酸位置68的絲氨酸同時也被另一種胺基酸所取代；和/或其胺基酸位置72的纈氨酸被另一種胺基酸所取代)。其他的CT毒素描述於公開的國際專利申請WO 02/098369(其胺基酸位置25的精氨酸被另一種胺基酸取代；和/或在胺基酸位置49插入一個胺基酸；和/或在胺基酸位置35和36插入兩個胺基酸)。
實施例以下述實施例的方式描述本發明。然而說明書中任何地方對這些或其他實施例的使用只是說明性的，而不是以任何方式限制本發明的範圍和意義或任何例示性的術語。同樣，本發明不限於此處的任何特定實施方案。事實上，閱讀了此說明書，本發明的許多修改和變化對本領域技術人員來說都是很顯然的，這些修改和變化也沒有脫離本發明的精神和範圍。
實施例1表達PIV蛋白的VRP質粒的構建本發明將人PIV-3用作模式副流感病毒。按照先前描述的方法製備人PIV3病毒儲備物(stock)(Washington 47885/57株系)。參見，Stokes，A.等，Virus Research 2591-103(1992)。通過聚乙二醇(PEG)沉澱來純化病毒儲備物。用Trizol-LS(Life Technologies)提取RNA，將其作為模板用Titan One Tube RT-PCR系統(Roche)實施反轉錄PCR。用引物擴增覆蓋N、P、M、C、HN和F的整個開放閱讀框(ORF)的片段，包括5′Kozak共有序列。然後用下述限制性內切酶消化所得片段Cla1和HindIII用於F，EcoR1和BamH1用於HN，Pst1和EcoR1用於NP，Acc1和Xba1用於P和C，HindI11和Xba1用於M。將所得片段克隆至改組(shuttle)質粒pKSR1。隨後，將來自改組質粒的Apa1-ORF-Not1盒亞克隆至pVR200中VEEV 26S亞基因組啟動子下遊，置於VEEV 26S亞基因組啟動子的控制之下，得到複製子表達質粒pVR(NP)、pVR(P)、pVR(M)、pVR(C)、pVR(F)和pVR(HN)。
為了製備包含兩個PIV基因的複製子，將第二個Apa1-ORF(HN)-Not1盒亞克隆至pVR(F)質粒中F基因的下遊，得到複製子質粒pVR-F/HN，其包含兩個外源基因。參見圖1。此外，兩個能夠表達VEE衣殼蛋白(pV3014delta520-7505delta8495-11229)或者表面糖蛋白gp E1/E2(pV3014delta520-7505delta7565-8386)的輔助質粒用於複製子包裝。參見Pushko等，Virology 239389-401(1997)，此處將其全部內容一併作為參考。採用染料終止循環測序法和377 ABI DNA測序儀(Applied Biosystems，Foster City，CA)，對所得質粒測序。
實施例2VRP製備本實施例描述如何通過從實施例1構建的質粒中將RNA電穿孔至BHK21細胞來製備VRP，所述VRP表達PIV3的每個抗原。最初的VEE質粒pVR100、和兩個輔助質粒pHC(衣殼)與pHC(gp E1/E2)從AlphaVax(Durham，NC)獲得。參見，Pushko等Virology 239389-401(1997)，此處將其全部內容一併作為參考。將PIV3糖蛋白基因RT-PCR片段逐個克隆至pVR200或者克隆至pVR100(HN與F一起)。然後使所得質粒在體外轉錄，產生RNA。隨後將所述RNA電穿孔至BHK21細胞中，分別得到編碼NP、M、P、C、F和/或HN基因的VRP(VRP-NP，-M，P，-C，-HN，-F，-F/HN)。
得到單個的PIV基因並將其克隆至合適的表達載體中後，使用Not1線性化質粒模板和mMessage MACHI NE T7 RNA聚合酶試劑盒(Ambion，Austin，TX)體外製備帶帽子的RNA轉錄本。依照廠商的說明實施反應。通過將50μg來自pVR(NP)，pVR(M)，pVR(P)，pVR(C)，pVR(HN)，pVR(F)，pVR(HN)plus pVR(F)，或pVR-F/HN的每種RNA與50μg來自輔助質粒的RNA一起電穿孔至BHK21細胞來製備生產複製子顆粒的細胞。Pushko等Virology 239389-401(1997)，此處將其全部內容一併作為參考。將處理過的BHK細胞置於含5％CO2的T-175瓶子中37℃溫育。培養基由Dulbecco′s Modification of Eagle′sMedium(DMEM)、高含量葡萄糖、10％牛胎血清和1％丙酮酸鈉組成。接下來，電穿孔48小時後收穫培養物上清液並以3,200rpm離心澄清。將VRP重懸於PBS，通過感染BHK21細胞以及用適合的PIV特異性抗體免疫染色來測定滴度(titers)。
實施例3VRP和PIV的病毒滴度用免疫組化方法測量表達PIV蛋白和糖蛋白的VEE複製子(VRP)的滴度。在BHK-21細胞系中增殖VRP。該實例中，從CCL-10克隆獲取BHK細胞，以將其與不共享隱蔽表型特徵的其他的BHK克隆群體區分開。如本文所定義的，細胞可以稱為BHK21或者簡單地稱為BHK細胞。用系列稀釋的VEE複製子VRPNP；VRP-P；VRP-M；VRP-C；VRP-HN；VRP-F；VRP-F/HN和VRP-GFP感染BHK21單層細胞，並於37℃溫育16-20小時。然後將單層細胞與1∶1的丙酮/甲醇混合5分鐘，用由細菌表達的兔抗-VEE NSP1蛋白、多克隆抗體r835或者馬抗-PIV3血清中的任何一種染色。用cyTM3接合的羊抗-兔抗體(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)或者辣根過氧化物酶(HOURP)接合的抗-馬抗體(Kirkegaard Perry，Maryland，MD)和氨乙基咔唑(AEC)過氧化物酶底物試劑盒(Enzo LifeSciences，Farmingdale，NY)檢測空斑(Plaques)。在顯微鏡下統計空斑數，記錄為VEE複製子的每ml感染單位(iu/ml)，或者作為由VRP-F/HN複製子感染產生的次級感染性顆粒的每ml合胞體形成單位(sfu/ml)。
用所述改進的血細胞吸附測試(HAD)方案測定PIV3 Wash47885/57病毒儲備物或者組織勻漿的滴度。參見Durbin等，Virology 235323-332(1997)；Durbin等，Vaccine 161234-1330(1998)。簡言之，在LLC-MK2單層細胞的96孔板上37℃下滴定10倍系列稀釋的樣品。6-7天後在培養物中收集上清液，用0.5％豚鼠紅細胞進行HA測試。計算每ml樣品的平均Log10TCID50值。
實施例4動物免疫與攻擊用表達特定PIV蛋白質的VRP複製子免疫非免疫的倉鼠，隨後的PIV感染引發了保護性免疫。用VEE複製子VRP-NP；VRP-P；VRP-M；VRP-C，以鼻內(i.n.)或肌肉(i.m.)途徑免疫五至八周齡的金色敘利亞倉鼠，所述的金色敘利亞倉鼠對PIV3呈陰性血清反應，所表達的PIV3蛋白NP，P，M，C或者GFP作為對照。劑量列於表1。在最初免疫後3周和5周時用同樣劑量(表1)對動物加強免疫。七周後用1×106LogTCID50的PIV3(Wash47885/57病毒株)攻擊倉鼠。攻擊四天後，收集鼻甲和肺組織並勻漿化。參見Durbin等，Virology 235323-332(1997)；Durbin等，Vaccine 161234-1330(1998)。用以上實施例3中所述的HAD測試方法分析這些勻漿中的PIV3複製。所有的金色敘利亞倉鼠和BALB/c均購自Charles River實驗室(Wilmington，MA)，並按照最新NIH″Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals″、聯邦和州法律、以及Wyeth Research′s BioResources提供的最新操作程序飼養。
在本發明的一個實施方案中，當用於感染BHK培養細胞單層時，委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒誘導細胞病變效應。在另一實施方案中，當轉移到未感染的細胞單層時，來自複製子顆粒感染的細胞的上清液，在不存在複製子顆粒的情況下誘導細胞病變效應。在本發明的另一實施方案中，細胞病變效應選自下組合胞體形成、單層細胞瓦解和細胞凋亡。
表1具有作為候選疫苗的最小功效的PIV-3內在蛋白

將倉鼠用作試驗模型研究了PIV3的內在蛋白在動物中提供抵禦PIV3感染的能力，因為倉鼠是支持PIV3複製和VBE感染的最小動物模型。參見Durbin等，Vaccine 161234-1330(1999)。表1列出了免疫和攻擊後獲得的LRT和URT病毒滴度。與VRP-GFP和PBS組相對，所有以1×106至1×107i.u的劑量範圍通過i.n.或i.m.途徑施用的表達NP、P、M或者C的VRP均未顯示出明顯的保護作用(表1)。只有活體減毒PIV3病毒cp45能夠保護倉鼠免受PIV3感染。因此推斷，內在蛋白NP、P、M和C作為候選物包含於抵禦PIV3的免疫組合物中時只具有非常小的功效或者根本沒有功效。
然後研究了VRP表達的HN和/或F提供保護的能力。按照同樣的方案以及表2所示的劑量免疫倉鼠。結果列於表2，此結果顯示，只有用VRP-F/HN免疫的動物其URT幾乎得到完全的保護。只用VRP-HN免疫的倉鼠URT中病毒滴度減小了約100倍。用VRP-HN+VRP-F而非VRP-F以i.n.途徑免疫的倉鼠其URT中的病毒複製只減少了10倍。另外，VRP-F免疫沒有引發血清中和滴度，也沒有在URT中引發保護，LRT中的病毒複製只減少了10倍(表2，試驗1)。因此，通過i.n.途徑免疫，包含VRP-F/HN的免疫組合物誘導出顯著的滴度中和水平，LRT得到完全保護，避免被PIV3所感染，且URT的PIV3感染嚴重程度得到降低。
表2HN和F在同一VRP中的同時共表達提供了很好的針對PIV3感染的保護

大體上，在引發針對PIV3的保護性免疫中，肌肉免疫的有效性要低於鼻內免疫。例如，用VRP-HN和VRP-HN+VRP-F以肌肉途徑(i.m.)免疫的動物顯示LRT中病毒滴度降低了約3 log10(表2，試驗1)，而與其相對照，用這些複製子進行鼻內免疫時，在LRT中產生了完全的保護而不被隨後的攻擊所感染。
用VRP-F/HN再次獲得了最有效的免疫原性，對於i.m.和i.n.途徑，LRT均得到了完全的保護而不被隨後的攻擊所感染。用除VRP-F/HN之外的其他VRP以i.m.途徑進行免疫沒有得到完全保護的例子(表2)。
數據顯示，在URT中，以i.m.途徑免疫來獲得降低病毒滴度和降低感染嚴重程度形式的保護是可能的。特別地，與PBS對照相比，用VRP-HN、VRP-F、VRP-HN+VRP-F進行肌肉免疫使病毒滴度降低約10倍至約100倍(表2，試驗1和2)。儘管有效性比i.n.免疫差，但i.m.施用時，VRP-F/HN仍然是保護LRT不受感染的最佳候選。
實施例4針對PIV的體液反應A.PIV3-特異性B細胞ELISPOT採用B細胞ELISPOT測試檢測了鼠淋巴結中PIV3特異的Ig分泌細胞。簡言之，將來自免疫鼠淋巴結的單細胞懸浮物置於96孔ImmulonII板上(Millipore，Bedford，Mass.)，37℃，5％ CO2條件下溫育過夜，Immulon II板由100ng去垢劑破壞的PIV3病毒所包被。然後衝去細胞，分別用鹼性磷脂酶接合的羊抗-鼠IgM+IgG+IgA混合物或只用IgA檢測結合到板上的PIV3特異的全部Ig或者IgA。然後用鹼性磷脂酶底物試劑盒(Bio-Rad)顯斑，在Olympus解剖顯微鏡(LeedsPrecision Instruments，Inc.，Minneapolis，Minn.)下計數量化。記錄的結果作為每1×106個細胞中斑點形成細胞(SFC)的數目。
B.病毒中和測試用血凝抑制測試(HI)測定倉鼠血清中和PIV3病毒顆粒的能力。簡言之，37℃下，用受體破壞酶(RDE)(Denka Seiken Co.Ltd.，Tokyo，Japan)處理加熱滅活的血清18-20小時，以去除非特異性抑制物，此後進一步用0.4％豚鼠RBC(gpRBC)4℃下溫育1小時，去除非特異性凝集素。然後測定連續稀釋處理的血清的終點，該血清終點抑制4 HA單位PIV3病毒凝集0.5％ gpRBC。
所顯示的VRP-F/HN的保護功效引起了對其保護效果的研究。針對呼吸性病原體的保護通常與黏膜免疫的誘導相關。因此，評估了縱隔淋巴結(MLN)和頸淋巴結(CLN)中IgA產生細胞的誘導，所述淋巴結來自肺或鼻子。在此研究中使用了鼠模型，因為得不到針對倉鼠的合適的檢測試劑。按照與倉鼠相同的免疫方案，用VRP-HN、或者VRP-F/HN(i.n.)免疫BALB/c鼠。收集單獨的CLN，混合MLN。由LN製備單細胞懸浮物，用B細胞ELISPOT技術分析全部Ig分泌細胞或者IgA分泌細胞。
與其他VRP的免疫相比，用VRP-F/HN免疫誘導了更高水平的抗原特異性IgA。例如，在CLN中，每1×106個PIV3-特異性Ig分泌細胞中，用VRP-HN免疫誘導了約800個SFC。其中只有10％的這種Ig分泌細胞是PIV-3特異性IgA分泌細胞(低於每1×106個細胞100個SFC)。與此相比，在CLN中，每1×106個PIV3-特異性Ig-SFC中，用VRP-F/HN免疫誘導了約400個SFC。重要的是，抗原特異性IgA SFC的數目在百分比上遠大於用VRP-HN免疫所得的數目(每1×106個細胞約250個SFC)。在此實例中，VRP-F/HN免疫組的分泌細胞所分泌的Ig中60％以上是IgA。因此，在URT中，VRP-F/HN優先誘導抗原特異性IgA的產生，這與更好的保護功效相關聯(Table 2)。
在MLN中，對VRP-HN免疫和VRP-F/HN免疫來說，總的PIV3-特異性Ig分泌細胞數或者IgA分泌細胞數是相似的，這與兩種免疫均完全清除了倉鼠LRT中的病毒複製的事實一致(Table 2)。
研究了病毒攻擊之後中和抗體在保護性免疫中的作用。PIV3攻擊前兩天收集血清樣品，測定PIV3中和滴度。表2顯示，在PBS對照組沒有檢測到中和滴度，LRT和URT中的病毒複製分別達到5.8±0.4和5.2±0.2的水平。在所有試驗組中，VRP-HN、VRP-F/HN或者VRP-HN和VRP-F組合(VRP-HN+VRP-F)免疫誘導產生了顯著的HI滴度水平，分別為6.3、7.1和7.5，可與cp45免疫組(數據未顯示)相比，在LRT中顯示了完全保護。
實施例5用於PIV保護的最小劑量評估了有效保護所需的VRP-F/HN免疫最小劑量。以2×104iu的劑量施用VRP-F/HN，使病毒複製降低了100倍，仍然能夠保護LRT不受感染且對URT的感染提供部分保護(表3，試驗1)。另外，第三次注射看起來是不必要的，1×104iu劑量的兩次注射足以防止LRT感染。1×104iu VRP-F/HN的一次劑量是不夠的(表3，試驗2)。因此，在倉鼠模型中，VRP-F/HN是防止在上下呼吸道中建立PIV3複製的最有效的組。有效抗擊LRT感染的VRP-F/HN劑量可以是低至兩次1×104iu免疫的劑量。
數據顯示，兩次劑量為1×104iu的VRP-F/HN的免疫足以將LRT中的病毒複製降至探測不到的水平，將URT中的病毒複製水平降低約100倍(表3)。這是具有重要意義的成就，因為其提示了製備亞單位組合物的方法，該組合物能夠預防特定的疾病併發症如PIV和RSV相關肺炎。數據顯示，對PIV3亞單位疫苗設計來講，HN和F是兩個重要的抗原。
表3VRP-F/HN I.N免疫在LRT保護中是非常有潛力的

實施例6源於VRP-F/HN感染的細胞病變效應A.細胞凋亡與VRP-HN、VRP-F、或VRP-HN+VRP-F相比，VRP-F/HN作為免疫原性組合物的潛在功效引起了對其作用機制的研究。發現與其他的VRP感染相比，VRP-F/HN感染在培養物中引發獨特的CPE。研究了這些VRP在培養物中增殖時引發細胞凋亡的能力。MOI＝0.5時，用VRP-F/HN或VRP-HN感染BHK21單層細胞，或者不感染(作為對照)。見表4。感染後24、48和72小時，在相位對比顯微鏡下放大100倍觀察單層細胞的形態。見表4。通過觀察BHK單層細胞是否被打亂(被打亂顯示輕微CPE(+))、單層細胞是否被嚴重破壞和是否形成膜泡(membraneblebs)(++)、單層細胞是否被完全去除且上清液中只剩下小泡和碎片(+++)，鑑定了CPE數據。見表4。
如表4所示，與VRP-HN或其他VRP(未顯示數據)感染相比，當用VRP-F/HN感染BHK細胞24小時後，BHK單層細胞被打亂。48小時後，VRP-F/HN感染誘導了單層細胞瓦解，形成明顯的合胞體和膜泡。72小時時，單層細胞被完全清除，上清液中只剩下小泡和碎片，而VRP-HN感染組中顯示完整的單層細胞，同時由於貫穿始終的細胞凋亡而出現細胞圓形化。見表4。
表4複製子感染細胞中的CPE程度

B.空斑形態先前的研究顯示F蛋白的融合特性需要HN蛋白的存在(Ebata，S.N.等，Virology 183437-441(1991))，而只靠自身HN和F都不能誘導合胞體形成。接下來檢測了通過VRP-F/HN感染而產生獨特CPE的可能性，獨特的CPE起因於合胞體形成。
用不同的VRP例如VRP-HN、VRP-F、VRP-HN+VRP-F或者VRP-F/HN感染BHK21細胞單層15-18小時，然後用馬抗-PIV3多克隆抗體，以及此後作為第二抗體的辣根過氧化物酶接合的抗-馬抗體，加上作為底物的氨乙基咔唑過氧化物酶，將單層細胞固定並染色；或者使用兔抗-VEE NSP1多克隆抗體r835和cyTM3接合的羊抗-兔抗體進行。在亮域或螢光顯微鏡下放大100倍拍照。
正如預期，VRP-HN或者VRP-F自身通過單一VRP感染清楚地顯示了HN-或F-表達空斑的形成。然而，VRP-F/HN感染組中的「空斑」尺寸大得多，可以很容易看到。這些大型「空斑」事實上代表了合胞體的形成，因為在這些「空斑」內部可以清楚地看見多核細胞[以合胞體形成為基礎的滴度此後稱為合胞體形成單位(sfu)，以代替感染單位(iu)，因為其是以單一複製子和多細胞為基礎的]。當用VRP-HN和VRP-F同時共感染細胞時，顯示合胞體形態的「空斑」很少(少於1％)。然而，空斑與單獨通過VRP-HN或VRP-F感染所形成的空斑相似。當用抗-VEE NSP1抗體對空斑染色時，看到相同的空斑圖譜。合胞體的形成也進一步證實了VRP-F/HN共表達HN和F蛋白。據推斷，VRP-F/HN感染事實上導致了兩個不同的CPE進程，細胞凋亡和合胞體形成。
實施例7HN和F共表達產生的感染性顆粒注意到VRP-F/HN誘導的CPE極具「傳染性」，因為細胞單層(「單層細胞(monolayers)」)將被非常低的感染多樣性(MOI)(＜0.001，數據未顯示)所破壞。因此猜測，由獨特CPE產生了某些形式的次級複製子或者感染性顆粒。這些次級複製子或感染性顆粒看起來是自增殖的，並通過膜結合HN和F糖蛋白誘導的融合進程感染其他細胞。
為了評估是否產生了非複製子感染媒介，設計了試驗，在該試驗中，用VRP-F/HN或其他VRP以0.5的MOI感染BHK單層細胞30分鐘。然後衝洗單層細胞3次，以除去任何的殘餘VRP，補充新鮮培養基培養48小時。接下來單層細胞用馬抗-PIV3血清染色以評估HN和F表達，或者用兔抗-VEE NSP1抗體檢測複製子NSP1蛋白的存在。在48小時時間的終點，從單層細胞中取出一部分來自細胞的上清液，「感染」新鮮BHK單層細胞30分鐘。30分鐘後衝洗細胞，補充新鮮培養基溫育48小時。然後評估單層細胞CPE，用抗-HN和F表達的馬抗-PIV3血清染色，或者用兔抗-VEE NSP1抗體檢測複製子蛋白的存在。在第一次轉移(1st轉移)、第二次轉移(2nd轉移)和第三次轉移(3rd轉移)中均實施該程序。所有細胞均用抗HN和F表達的抗-PIV3抗體或抗VEE NSP1表達的抗-VEE NSP1抗體染色。在亮域顯微鏡下放大100倍對抗-PIV抗體拍照，或者用螢光顯微鏡對抗-VEE NSP1抗體拍照。用(-)或(+)直至(+++++)表示免疫染色所顯示的表達量。結果列於表5。
表5來自複製子感染細胞的上清液的傳染性

在VRP複製子的第一輪感染中，用下述複製子感染細胞系48小時後，在細胞系中可看見空斑VRP-HN、VRP-F和VRPHN+VRP-F。見表5。此輪感染中，源於輔助質粒的VEE糖蛋白促進了細胞進入。
對於最初的複製子感染中的CPE，由於HN和F的機會性共表達，VRP-HN+VRP-F感染細胞偶爾出現合胞體形成。相比之下，VRP-F/HN感染48小時後誘導細胞單層的破壞，並出現明顯的合胞體。見表5。所有這些組還表達VEE NSP1蛋白，顯示活躍的複製子活性。見表5。
在第二輪感染中，當上述的上清液轉至新的單層細胞時，在VRP-HN和VRP-F處理組沒有新的感染活性。見表5。類似地，沒有進一步表達PIV3 HN和F，也沒有產生任何的VEE NSP1。見表5。在這些組中，證實VEE輔助蛋白輸入的缺失對感染進程是致命的，這在本發明之前是可以預期的。
然而令人驚訝的是，在輔助質粒上不存在VEE蛋白的情況下，在VRP-F/HN處理細胞的上清液中產生了感染性顆粒。例如，我們發現，將上清液從VRP-F/HN處理的細胞轉移至未感染的細胞單層後，產生了大量的PIV3糖蛋白HN和F。見表5。在該進程的這個時期，認為源於細胞的小泡表面上的PIV HN和F蛋白的表面表達融合活性驅動了感染進程。
此外，探測到轉移後在VRP-F/HN處理組產生了NSP1蛋白，顯示在VRP-F/HN感染細胞的上清液中有強烈的感染活性。見表5。用抗-VEE多克隆血清染色不能探測到VEE表面糖蛋白的表達，這顯示，由於潛在的重組事件，沒有產生VEE病毒。因此，感染媒介由最初的VEE複製子RNA組成，其帶有VEE複製酶包含NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、和PIV3 HN和F基因。此外，我們將在此演示這些相同蛋白的表達。
在接下來的轉移中，感染活性顯示是由PIV3 HN和F的共表達所驅動的。在VRP-HN+VRP-F組中，有有限量的PIV3糖蛋白HN和F抗原染色，沒有可探測到的NSP1表達。見表5。其原因可能是一些具有合胞體誘導活性的複製子從最初的VRP感染得到延續。見表5。對此的支持是，發現此殘餘活性不能由第二次轉移所延續，探測不到更多的PIV3抗原。見表5。
與所看到的VRP-HN+VRP-F處理的細胞缺乏感染活性相對照，當用於未感染細胞時，由接受VRP-F/HN第一次感染轉移的細胞所得到的上清液能夠誘導另一輪的「感染」現象，包括合胞體形成、單層細胞瓦解、PIV3 HN和F抗原染色以及VEE NSP1抗原染色。作為這些感染活性的結果，這一次仍然沒有可探測到的VEE表面糖蛋白表達，進一步排除了VEE病毒的汙染。
當由VRP-F/HN感染細胞得到的上清液轉移至另外的BHK單層細胞時，產生了又一輪的「感染」現象。見表5。BHK單層細胞也被抗-VEE多克隆血清所染色，並且沒有出現VEE表面蛋白表達，顯示沒有VEE病毒產生。
上述的觀測進一步證實了此假說由VRP-F/HN感染細胞產生了「感染」蛋白驅動的促融合活性，並且這些活性能夠被連續轉移。
實施例8感染性顆粒是小泡而非複製子用電子顯微鏡檢測了感染性顆粒的形態學特徵以確定其屬性。最近的檢測排除了感染性顆粒是VRP-F/HN複製子，而證實感染媒介為源於感染細胞的小泡，其共表達PIV3 HN和F。
首先將VRP-F/HN小泡在PBS中以1∶20的比例稀釋，由此製得的VRP-F/HN小泡用於電子顯微鏡觀測。完整小泡的負染、免疫金標記用Slot和Geuze於1984年開發的經改進的方法實施。參見，Immunolabeling for Electron Microscopy，by Slot and Geuze，Pollack and Varndell eds.Elsevier Science Publishers，BV，Amsterdam。小泡滴置於parafilm上，聚乙烯醇縮甲醛樹脂-碳-包被的(formvar-carbon-coated)金柵格朝下置於每個小泡滴上。以毛細作用除去多餘的液體，用PBS和1％ BSA(5ml)，接下來用含1％冷水魚膠(cold water fish gelatin)(10ml)的PBS，在兩個階段完成阻斷(blocking)。帶小泡的柵格反轉置於潮溼小室中的抗-F mAb克隆B-102或抗-HN mAb克隆68/2A上，mAb克隆在PBS BSA(1h)中1∶50稀釋。柵格在PBS BSA中衝洗5×1ml。通過與連接於6nm膠體金上的羊抗-鼠IgC+M一起溫育來探測抗原(Jackson ImmunoResearchLabs，W.Grove，PA)。在PBS(4×1ml)中衝洗。用1％戊二醛在PBS(3ml)中穩定帶細胞的柵格。然後在蒸餾水(5×1ml)中衝洗每個樣品。最後用pH6.5的1％ PTA負染(30s)帶囊泡的柵格。在無第一抗體存在的情況下溫育對照樣品。80kV下，在Zeiss 10C傳輸電子顯微鏡上檢測。
對來自上清液的感染性顆粒樣品進行電子顯微研究顯示，感染性顆粒不是VRP-F/HN複製子。VEE複製子為70nm病毒顆粒，非常接近VEE病毒的大小。參見，Paredes等，J.Virol. 759532(2001)。負染顯示出大量的大小異質(heterogeneity)成分。與此相反，已知VEE複製子是大小同質(homogenous)的。
感染性顆粒顯示了PIV3 HN和F糖蛋白的表面表達，與VRP-F/HN複製子作為感染材料時不同。用抗-HN單克隆抗體「克隆68/2」和抗-F單克隆抗體「克隆B-102」免疫金標記純化的感染性顆粒。結果顯示，與用鼠同型Ig染色的對照相比，感染性顆粒被抗-HN和抗-F明顯染色。此結果進一步證實感染材料不是基於複製子的，因為只有VEE糖蛋白是要表達於複製子表面上的。根據VEE複製子的包裝特性，PIV3-HN和F糖蛋白將從複製子顆粒排除。參見，Straus，J.H.Strauss E.G.，The AlphavirusesGene Expression，Replication and Evolution.Microbiological Reviews 58(3)491-562(1994)，此處將其全部內容一併作為參考。
實施例9由HN和F介導的感染性小泡的傳染性通過評估特定蛋白的抗體是否能夠抑制傳染性，鑑定了介導這些感染性小泡進入細胞的表面蛋白的身份。首先，將編碼GFP的感染性小泡或VEE複製子與不同的抗體如抗-PIV3血清；抗-HN mAb；抗-F mAb；抗-HN mAb+抗-F mAb；正常血清和同型對照鼠Ig一起預溫育兩個小時。接下來，用這些預溫育的感染性小泡或VEE複製子感染BHK單層細胞1小時。然後衝洗單層細胞並將其重新置於生長培養基。通過固定所述細胞並用兔抗-VEE NSP1和cyTM3接合的羊抗-兔抗體染色過夜以測定小泡所致的感染。培養5小時後，通過綠色螢光蛋白的表達來觀察VEE複製子所引起的感染。在螢光顯微鏡下放大100倍拍照。將感染跡象的強度於表6中記錄為(+)或(++)。沒有感染跡象的記錄為(-)。
表6用抗PIV抗體抑制小泡的傳染性

表6中的數據顯示，感染性小泡與抗-PIV3多克隆抗血清或抗PIV3HN單克隆抗體一起預溫育完全阻斷了小泡自增殖或感染新細胞的能力。當將小泡與單個的抗PIV3融合蛋白的單克隆抗體一起溫育時，傳染性減小少許，但沒有被完全抑制。小泡與抗VEE蛋白的單克隆抗體預溫育對小泡的傳染性沒有影響。
當使用複製子而非小泡時，抗體預溫育對以後的傳染性的影響差異極大。例如，抗PIV3的多克隆抗血清和抗PIV3糖蛋白HN和F的單克隆抗體都不能抑制VRP-HN/P的傳染性。見表6。相比較而言，只有與抗VEE表面糖蛋白的單克隆抗體一起預溫育才能夠抑制VRP-F/HN傳染性。
從這些傳染性的抗體抑制研究可以得出幾個要點。第一，傳染性抑制結果顯示HN和F蛋白位於自增殖小泡的表面。該結果進一步顯示，看起來具有傳染性的自增殖活性是由位於自增殖小泡表面的促融合糖蛋白PIV3 HN和F所驅動的。相比較而言，這些結果證實，當用複製子感染細胞時，是VEE結構蛋白E1和E2結合於受體並驅動第一輪感染。
實施例10感染性小泡與複製子的擴增對比接下來研究了這些感染性自增殖小泡是否能夠像病毒一樣擴增，以及這樣的擴增與最初的複製子的生長特性相比情況如何。進行此研究，首先如下擴增VRP-F/HN複製子(i)用約1×105iu(sfu)的VRP-F/HN感染T-175瓶的亞融合(subconfluent)BHK細胞1小時；(ii)衝洗細胞並重新放置於新鮮培養基；和(iii)採用與測定VRP-F/HN滴度相同的方案，隨時間的推移監測合胞體形成活性。發現在最初的16個小時，存在低滴度的感染活性(~300sfu)。在滴度測定過程中形成了合胞體，其顯示了與VRP-F/HN形成的合胞體類似的形態。大約40個小時後，合胞體形成活性急劇上升幾乎2500倍，並且在接下來的72小時中保持不變。因此，所計算的複製子顆粒的釋放量約為0.1。
作為對照，檢測了由VRP-F/HN感染細胞產生的「感染性小泡顆粒」像複製子一樣擴增的能力。再次使用T-175瓶的BHK細胞，其融合度(confluency)約為80％的，用約1×104sfu自增殖小泡感染T-175瓶BHK細胞1個小時，以VRP-F/HN感染細胞的培養物上清液的形式使用所述自增殖小泡。然後衝洗細胞並重新放置於新鮮培養基，隨時間的推移監測合胞體形成活性。通過測量合胞體形成活性測得的自增殖小泡的擴增優於VRP-F/HN複製子的擴增。自增殖小泡的生長曲線在最初的16個小時顯示低的滴度，之後在第一個40小時時，合胞體形成活性急劇提高560倍。隨後，在起初的感染後112個小時時，合胞體形成活性已經上升至約15,000倍。這個數據進一步支持VRP-F/HN感染產生感染性顆粒的觀點，所述感染性顆粒稱為自增殖小泡，其可以進一步自主增殖。這些次級「感染性小泡」顆粒只能由VRP-F/HN感染產生，而不能由VRP-HN、VRP-F、或者VRP-HN+VRP-F感染產生。這個現象可能進一步說明VRP-F/HN是適當的保護性免疫的有效啟動器，同時表明了VRP-F/HN作為免疫原性組合物的候選物的潛力，所述免疫原性組合物用於抵禦PIV3感染。
實施例11感染性小泡的鑑定檢測了自增殖小泡對典型物理現象如冷凍-解凍、渦旋、冷凍至-80℃ 7天、2500rpm離心20分鐘、用0.2μm，0.45μm，和0.8μm過濾器過濾所反應出來的可能的脆性。在用每種物理試驗處理小泡前後，測定小泡的滴度，結果列於下面的表7。
這些結果從物理學上顯示，當所述小泡每天面對例如冷凍、渦旋和離心這些現象時，其傳染性仍然是強烈的。有趣的是，渦旋後傳染性顯著提高，或許是因為一些小泡的粘團或結塊由於渦旋而被打碎。傳染性的濾過性支持小泡具有某些結塊傾向的觀點。
表7小泡傳染性的脆性

實施例12用感染性小泡免疫A.自增殖、感染性小泡保護倉鼠不受PIV3感染圖8顯示用VRP-F/HN或來自VRP-F/HN感染的BHK細胞(小泡)的上清液預防接種倉鼠的試驗的結果。用VRP-F/HN給予1、2或3次接種。見表8。鼻內施用小泡1、2或3次。劑量列於表8，第一次劑量為2.8×104；第二次劑量為2.6×103；第三次劑量1×105sfu。最初免疫後的第7周時均用1×106LogTCID50的PIV3病毒攻擊動物，分析呼吸道中的病毒複製。以平均值±SEM(n＝4-6)方式記錄數據。
表8的結果顯示，引發相同的HI滴度，用VRP-F/HN感染的BHK細胞(小泡)免疫的倉鼠只需要兩個劑量，與之相比，用VRP-F/HN複製子免疫的倉鼠需要三個劑量。另外，兩個劑量的小泡足以清除LRT和URT中的病毒，然而，用兩個劑量的VRP-F/HN複製子免疫的倉鼠只清除了LRT中的病毒。(見表8)。
表8用小泡接種以保護不受PIV感染

由於用VRP-F/HN(小泡)保護動物時，兩個劑量看起來是最佳劑量，因而評估了對倉鼠實施完全保護的最佳途徑。如表9所示，在這組研究中，用兩個劑量的含有相同HN蛋白含量(0.58ng)(對於VRP-HN-，或者VRP-F/HN-感染的上清液)和/或相同F(0.21ng)含量(對於VRP-F-或者VRP-F/HN-感染的上清液)的小泡通過鼻內途徑(IN)或肌肉途徑(IM)免疫倉鼠。除了來自VRP-F/HN感染的培養物的上清液包含每個劑量7000sfu的感染性小泡活性外，所有的接種均顯示0sfu。見表9。然後在最後一次免疫7周後用1×105LogTCID50的PIV3病毒以鼻內途徑攻擊動物，分析呼吸道中的病毒複製和中和滴度。以平均值±SEM(n＝4-6)方式記錄數據。
表9用不同施用途徑保護的小泡

結果顯示，通過鼻內途徑給予VRP-F/HN感染的BHK細胞(小泡)，清除了上下呼吸道中的病毒，而當以肌肉途徑給予時，只清除了下呼吸道(LRT)中的病毒。用含有VRP-HN或VRP-F或VRP-HN+VRP-F的上清液免疫動物，未能從LRT和URT中清除病毒，所述上清液來自複製予感染的細胞。
等價形式本領域技術人員僅僅用常規的試驗即可識別出或者能夠確定本文所述的特定實施方案的許多等價形式。這些等價形式將包含於以下的權利要求中。
序列表110WyethKovacs，Gerald R.
Mo，Xiaoyan″Annie″Vasilakis，NikolaosBhargava，SangeetaZamb，Timothy JosephUdem，Stephen Alexander120人3型副流感病毒(PIV3)免疫原性組合物130AM101287L1140待定1412003-06-051604170PatentIn version 3.1210121113453
212DNA213人工序列220
223該序列為委內瑞拉馬腦炎病毒序列與3型副流感病毒序列的嵌合序列4001ggtcgactct agaggatccc taatacgact cactatagat gggcggcgca tgagagaagc 60ccagaccaat tacctaccca aaatggagaa agttcacgtt gacatcgagg aagacagccc 120attcctcaga gctttgcagc ggagcttccc gcagtttgag gtagaagcca agcaggtcac 180tgataatgac catgctaatg ccagagcgtt ttcgcatctg gcttcaaaac tgatcgaaac 240ggaggtggac ccatccgaca cgatccttga cattggaagt gcgcccgccc gcagaatgta 300ttctaagcac aagtatcatt gtatctgtcc gatgagatgt gcggaagatc cggacagatt 360gtataagtat gcaactaagc tgaagaaaaa ctgtaaggaa ataactgata aggaattgga 420caagaaaatg aaggagctcg ccgccgtcat gagcgaccct gacctggaaa ctgagactat 480gtgcctccac gacgacgagt cgtgtcgcta cgaagggcaa gtcgctgttt accaggatgt 540atacgcggtt gacggaccga caagtctcta tcaccaagcc aataagggag ttagagtcgc 600ctactggata ggctttgaca ccaccccttt tatgtttaag aacttggctg gagcatatcc 660atcatactct accaactggg ccgacgaaac cgtgttaacg gctcgtaaca taggcctatg 720cagctctgac gttatggagc ggtcacgtag agggatgtcc attcttagaa agaagtattt 780gaaaccatcc aacaatgttc tattctctgt tggctcgacc atctaccacg agaagaggga 840cttactgagg agctggcacc tgccgtctgt atttcactta cgtggcaagc aaaattacac 900atgtcggtgt gagactatag ttagttgcga cgggtacgtc gttaaaagaa tagctatcag 960tccaggcctg tatgggaagc cttcaggcta tgctgctacg atgcaccgcg agggattctt1020gtgctgcaaa gtgacagaca cattgaacgg ggagagggtc tcttttcccg tgtgcacgta1080
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21022112492212PRT213委內瑞拉馬腦炎病毒非結構蛋白4002Met Glu Lys Val His Val Asp Ile Glu Glu Asp Ser Pro Phe Leu Arg15 10 15Ala Leu Gln Arg Ser Phe Pro Gln Phe Glu Val Glu Ala Lys Gln Val2025 30Thr Asp Asn Asp His Ala Asn Ala Arg Ala Phe Ser His Leu Ala Ser35 40 45Lys Leu Ile Glu Thr Glu Val Asp Pro Ser Asp Thr Ile Leu Asp Ile5055 60Gly Ser Ala Pro Ala Arg Arg Met Tyr Ser Lys His Lys Tyr His Cys65 70 7580Ile Cys Pro Met Arg Cys Ala Glu Asp Pro Asp Arg Leu Tyr Lys Tyr85 90 95Ala Thr Lys Leu Lys Lys Asn Cys Lys Glu Ile Thr Asp Lys Glu Leu100 105 110Asp Lys Lys Met Lys Glu Leu Ala Ala Val Met Ser Asp Pro Asp Leu115 120 125
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權利要求
1.編碼委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶、3型副流感病毒F糖蛋白和3型副流感病毒HN糖蛋白的分離的重組核酸分子。
2.編碼委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶、3型副流感病毒F糖蛋白和3型副流感病毒HN糖蛋白的分離的重組核酸分子，其具有SEQ ID NO1所示的核酸序列。
3.包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體的免疫原性組合物，所述委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白基因。
4.權利要求3的免疫原性組合物，其中，當用於感染BHK培養細胞單層時，所述的委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒誘導細胞病變效應。
5.權利要求4的免疫原性組合物，其中，當轉移至未感染的細胞單層時，來自用所述複製子顆粒感染的細胞的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導所述的細胞病變效應。
6.權利要求4的免疫原性組合物，其中，所述的BHK培養細胞中的細胞病變效應是合胞體形成。
7.權利要求4的免疫原性組合物，其中，所述的BHK培養細胞中的細胞病變效應是單層細胞瓦解。
8.權利要求4的免疫原性組合物，其中所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒。
9.包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體的免疫原性組合物，所述委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白基因；其中所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；其中，當用於感染培養的BHK細胞單層時，所述複製子顆粒誘導細胞病變效應；和，其中當轉移至未感染的細胞單層時，來自用所述複製子顆粒感染的細胞的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導所述的細胞病變效應。
10.包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體的免疫原性組合物，所述委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白基因；其中所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；其中，當用於感染培養的BHK細胞單層時，所述複製子顆粒誘導細胞病變效應；其中，當轉移至未感染的細胞單層時，來自用所述複製子顆粒感染的細胞的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導所述的細胞病變效應；和，其中所述的委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒在哺乳動物宿主中引發保護性免疫反應。
11.包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體的免疫原性組合物，所述委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白基因，並且在複製子的核酸部分具有SEQ ID NO1所示的核酸序列；其中所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；和，其中當轉移至未感染的細胞單層時，來自用所述複製子顆粒感染的細胞的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導所述的細胞病變效應。
12.包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體的免疫原性組合物，所述委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白基因，並且在複製子的核酸部分具有SEQ ID NO1所示的核酸序列；其中所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；其中，當轉移至未感染的細胞單層時，來自用所述複製子顆粒感染的細胞的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導所述的細胞病變效應；和，其中所述的委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒在哺乳動物宿主中引發保護性免疫反應。
13.包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)的免疫原性組合物，所述委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白基因，並且在複製子的核酸部分具有SEQID NO1所示的核酸序列；其中所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；其中所述的委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒在哺乳動物宿主中引發保護性免疫反應；其中，當用於感染培養的BHK細胞單層時，所述複製子顆粒誘導細胞病變效應；和，其中當轉移至未感染的細胞單層時，來自用所述複製子顆粒感染的細胞的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導所述的細胞病變效應。
14.包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體的免疫原性組合物，所述委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白基因；其中所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；其中，當轉移至未感染的細胞單層時，來自用所述複製子顆粒感染的細胞的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導所述的細胞病變效應；和，其中所述的委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒在哺乳動物宿主中引發保護性免疫反應。
15.權利要求14的免疫原性組合物，其中所述的保護性免疫反應防止3型副流感病毒對哺乳動物宿主下呼吸道的感染。
16.權利要求14的免疫原性組合物，其中所述的保護性免疫反應降低3型副流感病毒對哺乳動物宿主上呼吸道感染的嚴重程度。
17.權利要求14的免疫原性組合物，其進一步包含藥學上可接受的載體。
18.權利要求14的免疫原性組合物，其中所述的委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶、所述的3型副流感病毒F糖蛋白和所述3型副流感病毒HN糖蛋白由SEQ ID NO1所示的核酸所編碼。
19.權利要求14的免疫原性組合物，其中所述的委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶、所述的3型副流感病毒F糖蛋白和所述3型副流感病毒HN糖蛋白包含SEQ ID NO2；SEQ ID NO3，和SEQ ID NO4中所列出的胺基酸序列。
20.權利要求14的免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。
21.免疫哺乳動物對象以抵禦副粘病毒感染呼吸道的方法，該方法包含給所述對象施用免疫學上有效量的(a)包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體的免疫原性組合物，所述委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、和至少一種副粘病毒糖蛋白基因；和(b)藥學上可接受的載體，以足以引發免疫反應的量施用；其中所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；和，其中當轉移至未感染的細胞單層時，來自用所述複製子顆粒感染的細胞的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導所述的細胞病變效應。
22.權利要求21的方法，其中所述的副粘病毒是3型副流感病毒。
23.權利要求22的方法，其中所述的糖蛋白是3型副流感病毒紅細胞凝集素-神經氨酸酶(HN)糖蛋白。
24.權利要求22的方法，其中所述的糖蛋白是3型副流感病毒融合(F)糖蛋白。
25.權利要求21的方法，其中所述的糖蛋白同時包括3型副流感病毒F糖蛋白和HN糖蛋白。
26.權利要求21的方法，其中所述的副粘病毒是呼吸道合胞病毒。
27.權利要求21的方法，其中所述的糖蛋白是呼吸道合胞病毒附著(G)糖蛋白。
28.權利要求21的方法，其中所述的糖蛋白是呼吸道合胞病毒融合(F)糖蛋白。
29.權利要求21的方法，其中所述的糖蛋白同時包括呼吸道合胞病毒G糖蛋白和F糖蛋白。
30.權利要求21的方法，其中所述感染在下呼吸道中。
31.權利要求21的方法，其中所述感染在上呼吸道中。
32.免疫哺乳動物對象以抵禦3型副流感病毒感染的方法，該方法包含給所述對象施用免疫學上有效量的(a)包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體的免疫原性組合物，所述委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒HN糖蛋白基因；和(b)藥學上可接受的載體，以足以引發免疫反應的量施用；其中所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；和，其中當轉移至未感染的細胞單層時，來自用所述複製子顆粒感染的細胞的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導所述的細胞病變效應。
33.權利要求32的方法，其中所述感染在下呼吸道中。
34.利要求32的方法，其中所述感染在上呼吸道中。
35.權利要求32的方法，其中施用兩次所述的免疫原性組合物。
36.權利要求32的方法，其中施用三次所述的免疫原性組合物。
37.包含自增殖小泡群體的免疫原性組合物，所述自增殖小泡包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒F糖蛋白、3型副流感病毒HN糖蛋白基因、3型副流感病毒HN糖蛋白。
38.權利要求37的免疫原性組合物，其中，當用於感染BHK培養細胞的單層時，所述自增殖小泡誘導細胞病變效應。
39.權利要求38的免疫原性組合物，其中，當轉移至未感染的細胞單層時，用所述自增殖小泡感染的細胞所得的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導細胞病變效應。
40.權利要求38的免疫原性組合物，其中，所述的BHK培養細胞中的細胞病變效應是合胞體形成。
41.權利要求38的免疫原性組合物，其中，所述的BHK培養細胞中的細胞病變效應是單層細胞瓦解。
42.權利要求38的免疫原性組合物，其中所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒。
43.權利要求38的免疫原性組合物，其中所述的自增殖小泡從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞的上清液獲得，所述的複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒HN糖蛋白基因。
44.包含自增殖小泡群體的免疫原性組合物，所述自增殖小泡包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒F糖蛋白、3型副流感病毒HN糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白；其中所述自增殖小泡從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞的上清液獲得，所述的複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、副流感病毒F糖蛋白基因、和副流感病毒HN糖蛋白基因；和，其中所述自增殖小泡群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒。
45.包含自增殖小泡群體的免疫原性組合物，所述自增殖小泡包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒F糖蛋白、3型副流感病毒HN糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白；其中所述自增殖小泡從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞的上清液獲得，所述的複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、副流感病毒F糖蛋白基因、和副流感病毒HN糖蛋白基因；其中所述自增殖小泡群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；和，其中當用於感染培養的BHK細胞的單層時，所述自增殖小泡群體誘導細胞病變效應。
46.包含自增殖小泡群體的免疫原性組合物，所述自增殖小泡包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒F糖蛋白、3型副流感病毒HN糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白；其中所述自增殖小泡從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞的上清液獲得，所述的複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒HN糖蛋白基因；其中所述自增殖小泡群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；其中，當用於感染培養的BHK細胞單層時，所述自增殖小泡群體誘導細胞病變效應；和，其中當轉移至未感染的細胞單層時，用所述自增殖小泡群體感染的細胞所得的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導細胞病變效應。
47.包含自增殖小泡群體的免疫原性組合物，所述自增殖小泡包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒F糖蛋白、3型副流感病毒HN糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白；其中所述自增殖小泡從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞的上清液獲得，所述的複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒HN糖蛋白基因；其中所述自增殖小泡群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；其中，當用於感染培養的BHK細胞單層時，所述自增殖小泡群體誘導細胞病變效應；其中，當轉移至未感染的細胞單層時，用所述自增殖小泡群體感染的細胞所得的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導細胞病變效應；和，其中所述的自增殖小泡群體在哺乳動物宿主中引發保護性免疫反應。
48.包含自增殖小泡群體的免疫原性組合物，所述自增殖小泡包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒F糖蛋白、3型副流感病毒HN糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白；其中所述自增殖小泡從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞的上清液獲得，所述的複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒HN糖蛋白基因；其中所述自增殖小泡群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；其中，當用於感染培養的BHK細胞單層時，所述自增殖小泡群體誘導細胞病變效應；其中，當轉移至未感染的細胞單層時，用所述自增殖小泡群體感染的細胞所得的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導細胞病變效應；和，其中所述的自增殖小泡群體在哺乳動物宿主中引發保護性免疫反應。
49.權利要求48的免疫原性組合物，其中所述的保護性免疫反應防止3型副流感病毒對哺乳動物宿主下呼吸道的感染。
50.權利要求48的免疫原性組合物，其中所述的保護性免疫反應降低3型副流感病毒對哺乳動物宿主上呼吸道感染的嚴重程度。
51.權利要求48的免疫原性組合物，其進一步包含藥學上可接受的載體。
52.權利要求48的免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。
53.包含自增殖小泡群體的免疫原性組合物，所述自增殖小泡包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒F糖蛋白、3型副流感病毒HN糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白；其中所述的委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白和3型副流感病毒HN糖蛋白具有SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中所示的胺基酸序列；其中所述自增殖小泡從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞的上清液獲得，所述的複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒HN糖蛋白基因；其中所述自增殖小泡群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；其中，當用於感染培養的BHK細胞單層時，所述自增殖小泡群體誘導細胞病變效應；其中，當轉移至未感染的細胞單層時，用所述自增殖小泡群體感染的細胞所得的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導細胞病變效應；和，其中所述的自增殖小泡群體在哺乳動物宿主中引發保護性免疫反應。
54.免疫哺乳動物對象以抵禦副粘病毒感染呼吸道的方法，該方法包含給所述對象施用免疫學上有效量的(a)包含自增殖小泡群體的免疫原性組合物，所述自增殖小泡包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、副流感病毒F糖蛋白基因、副流感病毒F糖蛋白、副流感病毒HN糖蛋白基因和副流感病毒HN糖蛋白；(b)藥學上可接受的載體，以足以引發免疫反應的量施用；其中所述自增殖小泡從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞的上清液獲得，所述的複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、副流感病毒F糖蛋白基因、副流感病毒HN糖蛋白基因；其中所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；和，其中當轉移至未感染的細胞單層時，來自用所述自增殖小泡感染的細胞的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導所述的細胞病變效應。
55.權利要求54的方法，其中所述的副流感病毒選自下組1型副流感病毒、2型副流感病毒、3型副流感病毒、和4型副流感病毒。
56.權利要求55的方法，其中所述的HN糖蛋白是3型副流感病毒紅細胞凝集素-神經氨酸酶(HN)糖蛋白。
57.權利要求55的方法，其中所述的F糖蛋白是3型副流感病毒融合(F)糖蛋白。
58.權利要求54的方法，其中所述的糖蛋白同時包括3型副流感病毒F糖蛋白和HN糖蛋白。
59.權利要求54的方法，其中所述感染在下呼吸道中。
60.權利要求54的方法，其中所述感染在上呼吸道中。
61.免疫哺乳動物對象以抵禦3型副流感病毒感染的方法，該方法包含給所述對象施用免疫學上有效量的(a)包含自增殖小泡群體的免疫原性組合物，所述自增殖小泡包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒F糖蛋白、3型副流感病毒HN糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白；(b)藥學上可接受的載體，以足以引發免疫反應的量施用；其中所述自增殖小泡從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞的上清液獲得，所述的複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒HN糖蛋白基因；以足以引發免疫反應的量施用；其中所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；和，其中當轉移至未感染的細胞單層時，來自用所述自增殖小泡感染的細胞的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導所述的細胞病變效應。
62.權利要求61的方法，其中所述感染在下呼吸道中。
63.權利要求61的方法，其中所述感染在上呼吸道中。
64.權利要求32的方法，其中施用兩次所述的免疫原性組合物。
65.權利要求32的方法，其中施用三次所述的免疫原性組合物。
66.免疫哺乳動物對象以抵禦3型副流感病毒感染的方法，該方法包含給所述對象施用免疫學上有效量的(a)包含自增殖小泡群體的免疫原性組合物，所述自增殖小泡包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒F糖蛋白、3型副流感病毒HN糖蛋白基因和3型副流感病毒HN糖蛋白；其中所述的委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白、和3型副流感病毒HN糖蛋白具有SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中所示的胺基酸序列；(b)藥學上可接受的載體，以足以引發免疫反應的量施用；其中所述自增殖小泡從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞的上清液獲得，所述的複製子顆粒包含委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶基因、委內瑞拉馬腦炎病毒複製酶蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E1糖蛋白、委內瑞拉馬腦炎病毒E2糖蛋白、3型副流感病毒F糖蛋白基因、3型副流感病毒HN糖蛋白基因；以足以引發免疫反應的量施用；其中所述群體不包含可探測的具有複製能力的委內瑞拉馬腦炎病毒；和，其中當轉移至未感染的細胞單層時，來自用所述自增殖小泡感染的細胞的上清液，在不存在所述複製子顆粒的情況下誘導所述的細胞病變效應。
全文摘要
從被委內瑞拉馬腦炎病毒複製子顆粒(VRP)群體感染的細胞生產了自增殖性促融合小泡。小泡的所述的自增殖、促融合屬性源於編碼病毒融合蛋白的異源基因的表達，所述異源基因整合至複製缺陷性的複製子顆粒中。可以從顯示嚴重細胞病變效應的細胞的上清液中收穫所得小泡。所述小泡用於製備免疫原性組合物，並用於設計免疫哺乳動物的方法，該方法用於抵禦副粘病毒例如3型副流感病毒。
文檔編號A61K39/155GK1798760SQ200480015007
公開日2006年7月5日 申請日期2004年6月2日 優先權日2003年6月5日
發明者G·R·科瓦克斯, X·莫, N·瓦西拉基斯, S·巴加瓦, T·J·贊布, S·A·烏德姆 申請人:惠氏控股公司