測定骨吸收速率的方法
2023-10-05 09:12:04
專利名稱：測定骨吸收速率的方法
技術領域：
本發明涉及測定骨吸收速率的方法，特別是其免疫分析方法。本發明進一步涉及診斷與骨吸收速率改變有關疾病(例如骨質疏鬆症)的方法以及該方法所採用的測試盒(test-kit)。本發明還涉及檢驗藥物治療與骨吸收速率增加有關疾病效果的方法以及對所述疾病具有易感性對象的篩選方法。本文中公開了骨吸收速率特異性指標的用途。
現存在幾種與骨吸收速率改變有關的疾病，最普遍的是骨質疏鬆症，它多發生在絕經後的婦女身上。骨質疏鬆症是由骨質丟失引起的，其導致骨架脆弱，很容易骨折。骨折及其它與骨質疏鬆所引起的疾病治療對社會來說尚需要很高的耗費，更不用說治療對象本人。因此需要對患有骨質疏鬆的人群進行診斷以防止嚴重後果的發生。目前已能成功地治療骨質疏鬆症，例如採用雌三醇替代方法或雙膦酸酯治療方法。
測定骨密度有幾種儀器和方法。然而，所用的儀器和操作均非常昂貴，因為其需要較大的空間和較多的人員，同時測定非常緩慢需要有耐心。由於就骨質疏鬆症而言，人口的年齡分布愈發不容樂觀，因此開發特異、迅速、簡單和經濟的體外骨密度測定方法尤為重要。
實質上，骨中含有兩種主要的細胞類型，骨形成成骨細胞以及骨吸收破骨細胞。正常情況下，這兩種細胞處於平衡狀態，破骨細胞吸收的骨細胞數量與成骨細胞形成的骨細胞數量相同。骨質疏鬆是由於破骨細胞的活性增加，破骨細胞吸收的骨細胞數量比成骨細胞所產生的骨細胞數量要多，從而導致了失調。
根據其電泳流動性，抗酒石酸磷酸酯酶(TRAP，EC3.1.3.2.)屬於5型酸性磷酸酯酶，因此，又稱為5型酸性磷酸酯酶。藉助酸性聚丙烯醯胺凝膠電泳至少可以鑑別出7種酸性磷酸酯酶。這些酶之中酸性最強的是位於帶5處的酸性磷酸酯酶(Acp5)，它是唯一可以抵抗酒石酸抑制的酶，因此又稱為TRAP。此酶為鹼性糖蛋白，其在分子的活性部位含有旋轉-偶合的鐵單位。TRAP的雙核鐵單位含有兩個鐵(Ⅲ)離子，其使得蛋白變紫，因此又叫作紫色酸性磷酸酯酶。此蛋白的分子量為32kd。當用β-巰基乙醇還原該酶時，其中的一個鐵(Ⅲ)離子被還原，酶變成粉色。TRAP可以在體外用作蛋白酪氨酸磷酸酯酶，它的胺基酸序列含有與磷酸蛋白磷酸酯酶相類似的部位。然而尚不知道它的天然底物。
酪氨酸磷醯化對於許多細胞的功能和鑑別來說是一種重要的調節機制。一般認為TRAP在破骨細胞的功能調節方面起著重要作用。已知TRAP能夠產生羥基基團，後者能夠與天然的化學物質進行反應並使之破壞掉。在骨吸收過程中，破骨細胞產生游離的氧基團，很顯然在骨吸收過程中它們是很顯著的。它們的來源尚屬未知，但似乎至少部分的羥基基團是由TRAP產生的。正常情況下，含有TRAP的兩種類型細胞(即破骨細胞和小泡巨噬細胞)吸收化合物並使之降解。這一共同的特徵有利地支持了TRAP參與骨吸收過程的假設。
Hayman，A.R.等人(進展1223151-3162，1996)通過小鼠體內TRAP基因的靶破壞調查了TRAP的作用。他們發現，缺乏基因的小鼠的軟骨內骨化作用被破壞並有輕度的骨硬化。他們的結論是在骨生長過程中需要TRAP進行正常的軟骨礦化，TRAP還可以通過對骨基質吸收的關鍵貢獻保持成人骨骼的完整性和靈活性(turnover)。
在正常的人體中，含有明顯量TRAP的細胞僅有破骨細胞和活性巨噬細胞。在某些病理情況下，在其它細胞中也能發現TRAP。現已發現，TRAP是在骨吸收過程中從破骨細胞分泌到血液循環中的，因此建議血清中的TRAP的濃度可以作為骨吸收的指標。人們還發現血清中TRAP的濃度與骨吸收的速率相關(Kraenzlin M.E.等人，臨床內分泌和代謝雜誌71(2)442-451，1990；Cheung C.K.等人，臨床化學，41(5)679-686，1995；Chamberlain P.等人，臨床化學，41(10)1495-1499，1995以及Halleen J.等人，骨和礦物研究雜誌，11(10)1444-1452，1996)。
1978年，Lam W.K.等人，臨床化學，24(7)1105-1108，1978)報告了成人和兒童血清中TRAP生化性質的研究結果。通過改進的電泳方法，他們發現有兩個明顯的TRAP帶，並將它們指定為5a和5b。TRAP 5a比TRAP 5b更適宜較低的pH環境。在人類的血清中，兩種酶形式TRAP 5a和TRAP 5b均可找到。成人和兒童體內TRAP 5a的量是恆定的，但TRAP 5b的量在兒童體內有所提高。
在另一篇論文中(Chen等人，臨床化學，25，719-722，1979)，同一個研究小組進行了正常兒童血清中高酸性磷酸酯酶活性顯著性的研究。他們發現在巨細胞腫瘤中存在相應於帶5 TRAP的血清TRAP活性，但在成骨細胞和肉瘤中則不存在，這一結果表明，TRAP是從破骨細胞中衍生出來的。
W.K.W.Lam等人(臨床生物化學，14，177-181，1981)從患有Gaucher疾病的病人的血清和脾臟中分離TRAP。他們指出Gaucher疾病的血清中含有帶5b，而Gaucher疾病的脾臟中含有帶5a。帶5a和帶5b含有可以識別的蛋白結構。藉助唾液酶從5a上除去碳水化物可以將其轉化為5b，這一結果表明，5a和5b結構上唯一有區別的是在5a上存在唾液酸殘基，而5b中不存在。兩種形式適宜的pH環境不同，5a為5.0，5b為5.5-6.0。
W.K.W.Lam和R.J.Desnick(臨床和生物研究進展95，267-278，1982)對Gaucher疾病中的帶5形式進行了進一步研究。他們還總結了正常和病理狀態標本中酸性磷酸酯酶的電泳特徵。結果顯示，在正常的血清中，存在痕量的帶5a和5b，在任何病理血清中均未發現帶5a的水平有所提高。代之出現的是破骨細胞骨腫瘤中、發生骨惡性轉移的治療對象血清中以及患有Gaucher疾病的病人血清中帶5b的量有所提高。基於這些結果，研究者得出以下結論血清酸性磷酸酯酶(特別是其5b形式)的水平依賴於破骨細胞的生理活性。然而他們也指出還需要進一步的證據來支持這一假設。從論文中可以看到的另一個重要發現是這兩種酶(帶5a和5b)是密切相關的並具有抗原一致性。根據這一陳述，無法找一種既能測定5a又能測定5b的特異性免疫分析方法。1982年之後，沒有人再對TRAP 5a和5b的來源進行進一步的研究，所提出的5b破骨細胞的來源尚未證實。
藉助分光光度法可以測定TRAP的活性，例如在酒石酸存在下，加入對硝基苯基磷酸酯(pNPP)作為底物(酒石酸可以抑制其它大多數酸性磷酸酯酶)。但是這個方法的特異性不是很好，因此發展了一些更具特異性的測定TRAP方法，例如免疫分析方法。
Stepan J.J.等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.1651027-1034，1989)以及Kraenzlin M.E.等人(臨床內分泌和代謝雜誌71(2)442-451，1990)發展了TRAP免疫分析方法，其採用的是針對TRAP而得到的多細胞系抗體，上述TRAP是從患有多毛細胞白血病治療對象的脾臟中純化得到的。他們提出這種分析方法對於檢測患有礦物質代謝失調的治療對象是很有用的。
Cheung C.K.等人(臨床化學，41(5)679-686，1995)公開了TRAP的免疫分析方法，其採用的是針對TRAP而製備得到的多細胞系抗體，上述TRAP是從索血漿(cord plasma)中分離得到的。他們發現兒童體內TRAP濃度顯著高於絕經後的婦女，並討論了將TRAP作為評價骨骼靈活性(turnover)的可能性。
還有針對人類骨頭中分離並純化得到的TRAP製得的多細胞系抗體。其再一次被證明兒童和絕經後婦女的血清中TRAP濃度有所提高(Halleen J等人，骨和礦物研究雜誌，11(10)1444-1452，1996)。
Chamberlain P.等人(臨床化學，41(10)1495-1499，1995)公開了使用一對單克隆抗體進行的兩步血清免疫分析方法，其由重組生成的TRAP而得。這些單克隆抗體可以識別TRAP不同的表位，從而使得分析較為敏感。
迄今為止所有公開的免疫分析方法均是測定血清中的總TRAP濃度。然而，本發明是基於以下這樣一個發現對於骨吸收來說，TRAP5b比起總TRAP來說是一個特異性更高的生化指標。在這一點上應該指出的是儘管均被指定為5a和5b，上文中Stepan等人和Kraenzlin所報導的TRAP異構體不應與上文中Lam等人所報導的TRAP異構體相混淆。
因此本發明的一個目標是利用TRAP 5b作為骨吸收的特異性指標。
本發明的另一個目標是提供特異並簡單的測定骨吸收速率的方法，特別是提供能夠診斷與骨吸收速率明顯改變有關的疾病，例如骨質疏鬆症或其它骨代謝疾病、骨損傷或骨轉移。
本發明進一步的目標是能為易感或患有這些疾病的對象提供骨吸收的檢測的方法，並且能夠追蹤他們的治療效果。
本發明還有一個目標是提供所述方法中使用的試劑盒。
在免疫分析方法中使用耐酒石酸酸性磷酸酯酶5b(TRAP 5b)作為骨吸收速率的指標可以實現本發明的目的。
因此本發明提供了用於測定治療對象骨吸收速率的免疫分析方法，其特徵在於對來自所述治療對象體液中的耐酒石酸酸性磷酸酯酶5b(TRAP 5b)進行測定，TRAP 5b的量可以反映出骨吸收的速率。
特別地，其提供了測定治療對象骨吸收速率的免疫分析方法，該方法包括以下步驟(a)通過使存在於體液樣品中的TRAP與抗體(其可以和總TRAP結合，包括TRAP 5a和TRAP 5b)結合，測定治療對象體液中的耐酒石酸酸性磷酸酯酶5b(TRAP 5b)。
(b)在pH5.7-6.3下，測定結合的TRAP的活性，TRAP活性的量(其主要是TRAP 5b)可以反映骨吸收的速率。
本發明還提供了能夠診斷與骨吸收速率改變有關的疾病的方法，其特徵在於藉助免疫分析方法測定所述治療對象體液中的耐酒石酸酸性磷酸酯酶5b(TRAP 5b)，TRAP 5b的異常量可以反映與骨吸收速率改變有關的疾病。
本發明進一步提供了檢測藥物治療患者體內與骨吸收速率增加有關疾病的效果的方法，其特徵在於通過免疫分析方法對所述治療對象體液樣品中的耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)進行測定，通過TRAP5b量的降低可以反映出所述藥物的作用。
本發明還提供了對與骨吸收速率增加有關疾病具有易感性的治療對象的篩選方法，特徵在於通過免疫分析方法對所述治療對象體液樣品中的耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)進行測定，TRAP 5b水平提高即表示對所述疾病具有易感性。
本發明還提供了含有能夠區分耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)和耐酒石酸磷酸酯酶(TRAP 5a)抗體的測試盒(test-kit)，該試劑盒在實施本發明方法時是有用的。
圖表的簡述
圖1顯示了雌三醇治療對於血清中總TRAP和TRAP 5b量所產生的作用。
圖2顯示了血清TRAP 5b和骨礦物密度(BMD)之間呈現負相關。
當TRAP 5b取代治療對象體液樣品中的總TRAP被特異性地進行測定時，在TRAP濃度和骨吸收速率之間獲得了顯著良好的相關。出乎意料的發現是利用針對TRAP的抗體在免疫分析中有可能對TRAP 5b進行特異性的測定。另外還令人吃驚地發現抗體可以區分TRAP 5a和TRAP 5b。然而，並不需要本發明中使用的抗體對TRAP 5a或TRAP 5b具有特異性，只要是可以識別總TRAP的抗體就可使用。在這種情況下，兩種形式酶之間的區分將在與非特異性的抗體反應後通過其它手段獲得。例如發現可在一個pH範圍內測定TRAP的活性，在這個範圍下總TRAP的活性實際上來自TRAP 5b。這些發現可為診斷初級及次級與骨吸收速率改變有關的骨疾病(例如代謝骨疾病、骨損傷或骨轉移，尤其是骨質疏鬆)提供改進的方法。測定TRAP 5b量的方法也可用於檢測對骨疾病的治療效果，例如雌三醇雙膦酸酯治療骨質疏鬆的效果。其還可用來篩選對骨吸收增加具有易感性的人群，對他們進行治療從而防止骨折發生。
這裡所用的『治療對象』是指哺乳動物，優選的是人類。
本申請中使用的『TRAP』是指耐酒石酸磷酸酯酶(TRAP，EC3.1.3.2.)，屬於5型酸性磷酸酯酶，包括酶的5a和5b兩種形式。
『TRAP 5b』是指TRAP酶的b形式，在其烴鏈上缺乏唾液酸，適宜的pH環境約為5.7-6.0。
『TRAP 5a』是指TRAP酶的a形式，在其碳水合物(糖)鏈上含有唾液酸，適宜的pH環境約為4.9。
Lam W.K.W.等人(臨床化學，24(7)，1105-1108，1978)以及Lam W.K.W.等人(臨床生物化學，14，177-181，1981)還對所述的酶作過進一步的描述。
優選的(但不必需)體液樣品為血液，例如血漿或特別是血清。
在本發明的免疫分析中，採用了針對TRAP的抗體。這裡的『免疫分析』是指任何通過抗原-抗體反應進行化合物測定的分析。免疫分析可以是直接的或間接的，競爭性的或非競爭性的分析。其可以是複合技術也可以是單一的技術。可以對抗原或抗體進行標記以提高檢測的靈敏度。這些方法的原則在本領域內是已知的。
本發明中所用的『針對TRAP的抗體』包括5a和5b非特異性和特異性抗-TRAP抗體。
優選的針對TRAP的抗體是單克隆抗體。所述的單克隆抗體可以是抗體，其可以區分TRAP 5b和TRAP 5a。『可以區分TRAP 5b和TRAP 5a』的抗體既可是TRAP 5b和TRAP 5a特異性的，或者它們可由所述的特異性抗體與可以識別總TRAP的抗體的任意組合構成，例如TRAP 5b和TRAP 5a。
可以通過幾種途徑利用能夠區分TRAP 5a和TRAP 5b的抗體來測定體液中TRAP 5b的濃度。如果採用TRAP 5b特異性的抗體，當然可以直接測定TRAP 5b。但是，優選的是將TRAP 5b特異性的抗體與能夠識別兩種酶(即總TRAP)的抗體結合使用。在這種情況下，體液的總TRAP首先與能識別兩種酶的抗體進行結合，然後用對TRAP5b具有特異性(但不與TRAP 5a反應)的標記抗體檢測結合的TRAP5b。
進一步可能的是使用對TRAP 5a具有特異性的抗體與可以識別總TRAP的抗體的組合。在這種情況下，首先使TRAP 5a與對TRAP5a具有特異性的抗體進行結合，然後用能夠識別兩種酶的抗體對餘下的未結合的TRAP活性(其必定來自TRAP 5b)進行測定。
本發明方法中所用的抗體可以用任意常規的方法進行標記，例如放射標記、酶標記、化學發光標記或螢光標記，目的是提高它們的檢測靈敏度。抗生蛋白鏈菌素-生物素基(biotinyl)系統提供了敏感的檢測。採用Delfia系統獲得了尤其好的結果，其為時間-分辨的螢光免疫分析方法，Halleen J等人(骨和礦物研究雜誌，111165-1175，1996)以及Hemmila等人(Anal.Biochem.137335-343，1984)曾對該方法進行過描述。進一步優選的是使用至少兩種不同的抗體，它們可以識別TRAP不同的表位。此舉可以獲得高度敏感並具有重現性的雙部位(two-site)螢光免疫分析。
本發明的試劑盒包含能夠區分TRAP 5b和TRAP 5a的抗體。根據本發明，在評價骨吸收速率和診斷與骨吸收速率改變有關的疾病時，上述試劑盒是很有用的。試劑盒包含可以特異識別TRAP 5b的抗體，任意地還可以含有識別總TRAP的抗體。兩外，試劑盒還可以含有可以特異識別TRAP 5a及總TRAP的抗體，或者其可以包含TRAP 5b特異性抗體或TRAP 5a特異性抗體。優選的抗體為單克隆抗體。
根據本發明，另一個可以測定TRAP 5b活性的方法是在一定的pH範圍內於酒石酸存在下，對酸性磷酸酯進行常規的分光光度測定(參見Halleen J等人，骨和礦物研究雜誌，11(10)1444-1452，1996)，上述pH範圍位於TRAP 5b的酶活性峰範圍內，但位於TRAP5a的範圍之外。根據本發明者測定，TRAP 5a的pH適宜範圍約為4.9，TRAP 5b約為5.7-6.0。總TRAP在pH5.5處進行測定。然而現已發現，在TRAP 5a的存在下，測定TRAP 5b的適宜的pH範圍是5.7-6.3，優選的是5.8-6.2，特別優選的是6.0-6.2，6.1是最適宜的pH值。儘管分光光度法不能區分TRAP 5a和TRAP 5b，但在所述的pH範圍下，所測得的活性實質上均來自TRAP 5b。pH6.1下TRAP 5a的活性僅為pH4.9下活性的20-30％。(如果在沒有TRAP 5a存在下測定時，在pH5.9下獲得的TRAP 5b的活性稍高一些)。在pH6.1下，5a活性佔總TRAP活性的比例小於10％。因此在pH6.1下，大於90％測定得到的TRAP的活性來自5b。
在免疫分析中，TRAP 5b和TRAP 5a具有不同的適宜pH值這一優勢可以提供經濟和簡單的TRAP 5b測定方法。此過程使得非特異性的TRAP抗體(既與5a又與5b結合)得以利用，即它們首先與體液中總TRAP進行結合。然後用分光光度法等方法在pH範圍5.7-6.3下測定TRAP的活性，其主要來自TRAP 5b的活性。
碳水合物含量上的不同也可以用來區別TRAP 5b和TRAP 5a。例如首先使總TRAP與能夠識別5a和5b的抗體結合。結合的總TRAP與標記的Galanthus Nivalis凝集素(GNA)或拌刀豆球蛋白A(ConA)植物血凝素，這些物質能與具有終端果糖的糖類(例如TRAP5b)結合，但其不與TRAP 5a結合，原因是TRAP 5a的糖鏈上具有終端唾液酸。
當然在本發明方法中，可以使用上述過程的任意組合測定TRAP5b。下列實施例將進一步說明本發明但並不限制本發明。
實施例1採用標準的實驗方案進行單克隆抗體的製備。將提純的並用Freund’s輔助劑進行過乳化的人類骨TRAP(Halleen J等人，骨和礦物研究雜誌，11(10)1444-1452，1996)以兩周的間隔給予BALB/c小鼠4次注射，每次20μg/小鼠。之後將動物殺死。將脾細胞與骨髓瘤細胞系P3-X-63-Ag8.653進行雜交，將雜交瘤在HAT介質中培養。在抗鼠LgG-包裹的微滴培養皿中培養100μl上清夜，篩選克隆，接著培養人類的骨TRAP。最後，在培養皿中，通過培養200μl反應混合物(0.1M乙酸鈉，pH6.0，8mM pNPP以及40mM酒石酸鈉)對結合酶的活性進行1小時測定。加入16μl 0.5M氫氧化鈉終止反應。在405nm處用ELISA平皿讀數儀測定吸收。獲得了兩種TRAP單克隆抗體，O1A和JIB。這兩種抗體既可以識別TRAP 5a也可以識別TRAP 5b，但是不同的表位。
人們發現，利用作為抗原的重組TRAP(Chamberlain P.等人，臨床化學，41(10)1495-1499，1995)開發出來的單克隆抗體4E6不與從骨中分離純化得到的TRAP反應。代之出現的是它可以特異性識別含有唾液酸的TRAP的5a形式。使400ng 4E6在抗鼠IgG-包裹的微滴培養皿中培養1小時。然後在這些平皿中使血清樣品(200μl)培養1小時。作為對照，將同樣來源的血清樣品按照相似的方法在空的抗鼠IgG-包裹的微滴培養皿中進行培養。從這些平皿中取3份等份樣品(各50μl)，與100μl含有400ng銪標記O1A和生物素化J1B的Delfia分析緩衝液進行混合。混合物於Delfia平皿振蕩器的不斷振搖下，在抗生蛋白鏈菌素包裹的微滴培養皿中培養2小時(1296-001Delfia平皿振蕩器，Wallac Oy，Turku，Finland)，然後用Delfia洗滌緩衝液進行洗滌。最後用Delfia增強溶液填充平皿，振搖5分鐘，測定結合的螢光。Halleen J等人(骨和礦物研究雜誌，111165-1175，1996)以及Hemmila等人(Anal.Biochem.137335-343，1984)曾對此方法進行了進一步的描述。
結果列於表1。可以發現在絕經前和絕經後的婦女身上TRAP 5a的量幾乎相同，但兩組之間的TRAP 5b量的差異是非常顯著。與採用總的TRAP相比，特異性的測定TRAP 5b使得TRAP作為骨吸收指標的用途有了顯著的改進。另外還證實兒童體內TRAP 5b的量水平要高於成人，而TRAP 5a的量在成人和兒童之間幾乎是恆定的。
表1．血清中TRAP的量(μg/l) 1後/前=絕經前婦女與絕經後婦女的TRAP酶比例。
2兒童/前=兒童與絕經前婦女的TRAP酶比例。
實施例2對抗鼠IgG-包裹的微滴培養皿進行預洗滌，在不斷振搖下，在這些培養皿中使單克隆TRAP-抗體O1A(400ng抗體/平皿)培養1小時。洗滌這些平皿，在不斷振搖下，使來自40位健康成人的血清樣品在這些培養皿培養1小時。洗滌平皿，通過培養200ml反應混合物(0.1M乙酸鈉，pH5.9，8mM pNPP以及40mM酒石酸鈉)對培養皿中結合的TRAP活性測定1小時。加入25ml 0.32M氫氧化鈉終止反應，在405nm處用ELISA平皿讀數儀測定吸收。
基於這些實驗結果，得到了兩組數據「高」組，其含有8個具有最高總TRAP活性的樣品以及「低」組，其含有8個具有最低總TRAP活性的樣品。在兩組中，分別特異地測定TRAP 5a和TRAP 5b，首先使5a和抗體4E6結合，然後按照上述方法，用抗體O1A測定未結合的活性，即TRAP 5b的活性。在pH5.0下測定TRAP 5a的活性，在pH5.9下測定TRAP 5b的活性。結果(405nm處的吸收)列於表2。可以看到，兩組中TRAP 5a的含量基本相同，而高組中TRAP 5b的含量則顯著較高。
表2．在高和低活性血清下TRAP的活性
最後，通過與抗體O1A的結合，對來自兩組的總TRAP進行測定，按照上述方法，在不同的pH值下測定結合的TRAP活性。結果(405nm處的吸收)列於表3。該結果清楚地顯示當pH增加時，兩組之間的差異也在增加。在pH6.1下，可以獲得最大的差異。
表3．在不同pH值下TRAP的活性
實施例3對不同pH值下的血清TRAP 5a和TRAP 5b的活性進行了研究。具體作法是使血清樣品中的TRAP 5a與抗體4E6結合，然後用抗體O1A與剩餘的TRAP 5b進行結合。按照實施例2第一段中所述方法測定結合的TRAP活性，除了乙酸鹽緩衝液的pH如所示的變化。表4列出了不同pH值下，以pNPP作為底物時得到的TRAP 5a和TRAP 5b的吸收值(A405)。「％5」一欄表示每一個pH下，5a活性與總TRAP活性(5a+5b)的比例，例如在pH4.7下，「％5」為0.256/0.354=72％。
表4 由表4可見，對於特異性地測定TRAP 5b來說，pH6.1最為適宜，此時，TRAP 5a的幹擾最低(9.3％)，而TRAP 5b在適宜的pH範圍內(5.7-5.9)最為活躍。通常，在pH5.5處測定血清TRAP活性，這是在測定總血清TRAP時所觀察到的最適宜的pH值(由於在pH5.5處，TRAP 5a和TRAP 5b的結合活性最大，參見上表中「5a+5b」一欄)。
實施例4將實施例3中所述的測定TRAP的特異方法(其中在pH6.1處測定與O1A結合的血清TRAP5b的活性)與雙部位分析方法(其中通過使TRAP與O1A結合，測定總血清TRAP，並且採用Delfia系統，利用銪標記的J1B，檢測總TRAP)進行比較。採集絕經後婦女(年齡大於70歲)的血清樣品，用以研究6個月的雌三醇替代治療(HRT)對血清TRAP含量的作用。根據測定TRAP 5b的特異方法，經過6個月的HRT(p=0.001)，TRAP 5b的活性下降了48％，而在對照組中(其用安慰劑代替雌三醇)，經過6個月的HRT，TRAP 5b的活性增加了2％。6個月後，兩個組用雙部位分析法得到的總TRAP的量下降了15-20％。這些結果顯示，經過6個月的HRT，測定總TRAP的雙部位分析方法在檢測骨吸收速率變化方面不夠敏感，而特異性測定TRAP 5b的方法則可以檢測到經過6個月的HRT後，TRAP 5b幾乎達到50％的降低。這些結果表明，在檢測骨質疏鬆患者的HRT治療時，上述方法是非常有用的。因此在雌三醇替代治療檢測骨吸收速率變化時，TRAP 5b比起用雙部位分析方法檢測總TRAP來說是一項更好的指標。結果列於圖1。
實施例5最後，採用一系列絕經後婦女的血清樣品，對血清TRAP 5b量及總血清TRAP與骨礦物密度(BMD)的相關關係進行了研究。結果顯示，TRAP 5b與BMD的負相關性(r=-0.540，p=0.001***)比總TRAP與BMD的負相關性(r=-0.156，p=0.1488，沒有顯著的相關性)更為顯著。圖2顯示了TRAP 5b與BMD的相關曲線。
這些數據令人信服地說明在骨吸收速率檢測方面，TRAP 5b比起總血清TRAP來說，是一個更為特異和敏感的指標。
權利要求
1．在治療對象身上測定骨吸收速率的免疫分析方法，其特徵在於在所述治療對象的體液樣品中測定耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)，通過TRAP 5b的量可以反映出骨吸收的速率。
2．權利要求1中所述的方法，其中採用了耐抗酒石酸磷酸酯酶(TRAP)的單克隆抗體。
3．權利要求1或2中所述的方法，其中存在於體液樣品中的TRAP首先與抗體結合，該抗體與全部的TRAP(TRAP 5a和TRAP 5b)結合，在pH5.7-6.3之間測定結合的TRAP的活性。
4．權利要求3中所述的方法，其中在pH約為6.1時用分光光度法測定TRAP的活性。
5．權利要求2中所述的方法，其中的單克隆抗體能夠區分所使用的TRAP 5b和TRAP 5a。
6．權利要求5中所述的方法，其中存在於體液樣品中的TRAP首先與TRAP 5a特異性抗體結合，之後可以測定未結合的TRAP的活性。
7．權利要求6中所述的方法，其中可以通過分光光度法或免疫分析方法測定未結合的TRAP的活性。
8．權利要求1，6或7中所述的方法，其中在pH5.7-6.3之間進行TRAP的活性測定。
9．權利要求8中所述的方法，其中在pH約為6.1時測定TRAP的活性。
10．權利要求1或5中所述的方法，其中至少使用了兩種不同的單克隆抗體，它們可以識別TRAP的不同表位。
11．權利要求10中所述的方法，其中採用了時間-分辨螢光免疫分析。
12．前述任意權利要求中所述的方法，其中的體液樣品為血清。
13．診斷治療對象體內與骨吸收速率改變有關疾病的方法，其特徵在於在所述治療對象的體液樣品中測定耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)，通過TRAP 5b的異常量可以反映出與骨吸收速率改變有關的疾病。
14．權利要求13中所述的方法，其中所述的失調為骨質疏鬆症。
15．含有能夠區分耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)和耐酒石酸磷酸酯酶(TRAP 5a)抗體的測試盒(test-kit)。
16．檢測藥物治療治療對象體內與骨吸收速率增加有關疾病的效果的方法，其特徵在於通過免疫分析方法對所述治療對象體液樣品中的耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)進行測定，通過TRAP 5b量的降低可以反映出所述藥物的作用。
17．權利要求16中所述的方法，其中的疾病為骨質疏鬆症。
18．對與骨吸收速率增加有關疾病具有易感性的治療對象的篩選方法，特徵在於通過免疫分析方法對所述治療對象體液樣品中的耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)進行測定，TRAP 5b水平提高即表示對所述疾病具有易感性。
19．權利要求18中所述的方法，其所述的疾病為骨質疏鬆症。
全文摘要
現已將耐酒石酸磷酸酯酶(TRAP)作為骨吸收的指標。然而,所述的酶在體內有兩種形式:TRAP5a和TRAP5b,其中TRAP5b是更具特異性的指標。本發明提供了用於測定骨吸收速率的免疫分析方法,該方法能夠進行TRAP5b的特異性測定,通過TRAP5b的量可以反映出骨吸收的速率。該方法可以用於診斷與骨吸收速率改變有關的疾病,例如骨質疏鬆症。本發明還提供了對這些疾病具有易感性對象的篩選方法以及檢驗治療效果的方法。
文檔編號G01N33/68GK1295667SQ99804628
公開日2001年5月16日 申請日期1999年3月30日 優先權日1998年4月1日
發明者尤西·哈勒恩, 卡萊爾沃·韋內寧 申請人:尤西·哈勒恩, 卡萊爾沃·韋內寧