中藥綿萆薢的新醫藥用途及其提取物的製備方法
2023-10-05 00:09:49 1
專利名稱：中藥綿萆薢的新醫藥用途及其提取物的製備方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，確切地說它是中藥綿萆用於預防和治療骨質疏鬆症的新醫藥用途及其提取物的製備方法。
背景技術：
骨質疏鬆症(Osteoporosis簡稱OP)是以骨量減少，骨組織微細結構破壞導致骨脆性增加和骨折危險性增加為特徵的一種系統性、全身性骨骼疾病。也是一種以骨密度低下為主要症狀的一種骨代謝失調的全身性疾病。骨質疏鬆症是一種中老年人的常見病、多發病。國際醫學界已將骨質疏鬆症與糖尿病、心血管病等並列為嚴重危害老年人健康的重大疾病。世界衛生組織已將每年10月20日定為全世界的＂骨質疏鬆＂日，並於1998年7月成立了世界衛生組織骨質疏鬆專題小組。據有關部門統計[高素強等，淫羊藿及其複方防治骨質疏鬆的研究；中國中藥雜誌，1999，24(4)]，1997年中國骨質疏鬆症的患者人數約為8390萬人，發生率佔全國總人口數的6.6％，到2010年約為1140萬人，佔8.2％。上海調查資料顯示，老年人骨質疏鬆患病率男性為60.7％，女性為90.5％。我國的骨質疏鬆症及其骨質疏鬆性骨折的發病率已呈明顯的遞增趨勢。骨質疏鬆症所造成的影響相當嚴重，骨質疏鬆症每年會導致150萬例骨折，有50％的婦女會因骨質疏鬆症而骨折。現代醫學對骨質疏鬆的病因尚不十分清楚，但目前研究認為與雌激素缺乏，鈣攝入不足，體力活動減少、陽光照射不足、維生素D缺乏及不良嗜好有關。是多種病因、多個環節共同作用的結果，且與人體的衰老密切相關。其主要症狀為腰膝酸軟、胸背疼痛、肢體麻木、疼痛、頭暈、乏力等。目前尚無特效藥物能夠治癒此病，用於防治骨質疏鬆症的藥物目前主要有三類，第一類是抗骨吸收藥物，包括雌激素、降鈣素、二磷酸鹽等；第二類是促進骨形成藥物，如氟化物、促進合成代謝的類固醇等；第三類是礦化作用藥物，如鈣製劑和維生素D等〔朱建民。骨質疏鬆症的發病原因及防治。中華內科雜誌1992；11(31)714〕。雖然激素類、生化類藥物在治療骨質疏鬆症上已取得了很大進展，但由於副作用的存在及治療費用過高限制了它的長期使用[Christiansen C.，Fertil Steril..，1994，62(6)1528-1531]。治療骨質疏鬆症需要很高的費用，如僅1995年，美國45歲以上婦女花在骨質疏鬆性骨折上的醫療費用就高達110億美元。
中醫中藥立足於辯證施治，整體調節，在骨質疏鬆的治療方面取得了不少成就[李潤德《中國骨傷》1992，5，6，31-34梁立《中醫雜誌》1992，33(11)36吳林生，張雲岐，郭如意《中國骨質疏鬆雜誌》1995，1，2]。《素問·五藏生成篇》中說「腎之合骨也，其榮發。」《素問·六節藏象論》中說「腎者主蟄，封藏之本，精之所處也，其充在骨。」按中醫基礎理論，「腎之在體為骨、主骨生髓，其華在發」，「齒為骨之餘」，也明確指出腎中精氣盛衰在齒、骨、發的生長中的作用。而這種腎氣盛衰的規律與現代生理中骨的代謝極其吻合。即，骨骼的生長在20歲最為迅速，24歲進入持平期；40歲後骨代謝異常，骨質日漸疏鬆；50歲後骨總量可減少30％，因而腎的盛衰史其實亦是骨的盛衰史。中醫理論認為腎藏精，精氣得到較好的閉藏才能在人體內充分發揮其應有的生理效應，達到強筋健骨的作用。所以中醫認為，補腎治療可以強骨壯筋，防治骨質疏鬆。流行病學調查表明經中醫辨證為腎虛者的尺、橈骨的骨礦含量，明顯低於健康人。現代生理的研究也表明，補腎能增加腎臟對活性維生素D的轉化，促進機體對鈣的吸收；避免鈣在細胞內沉積，維持血鈣的穩定。補腎還能增強生成骨細胞的作用，阻遏鈣的脫失，從而達到控制骨質丟失，預防和治療骨質疏鬆。近年來大量的研究證實和臨床應用補腎壯骨中藥治療骨質疏鬆取得了滿意的效果，且毒副作用少，價格適中，可長期服用。然而，目前用於骨質疏鬆症治療的中藥也明顯存在著用藥量大，有效成分不明確，難以進行必要的質量控制以及無法用現代醫學理論進行解釋等問題。因此開發抗骨質疏鬆的現代中藥以及對具有抗骨質疏鬆作用的中藥進行中藥現代化的研究，尋找其中的活性成分並研究其作用機理就顯得非常迫切和必要。
由於骨質疏鬆是成骨與破骨不平衡的結果，破骨細胞的作用遠遠大於成骨細胞的作用，從而造成骨量下降，骨質疏鬆及脫鈣。因此，在尋找抗骨質疏鬆中藥中的活性成分及其作用機理時，需要同時關注其對成骨細胞、破骨細胞及礦化的影響情況，採用多指標方法，包括促進成骨細胞的活性，抑制破骨細胞的活性以及對骨礦化的影響，才有可能篩選出有效的抗骨質疏鬆活性成分。為了尋找這些抗骨質疏鬆中藥中的活性成分及其作用機理，我們運用了較先進的細胞、組織器官培養模型篩選方法及機制研究手段，動物體內實驗為驗證方法，並運用較先進的實驗設備如Liquid sicillition counter，PQCT等，篩選具有抗骨質疏鬆作用的中藥活性成分並研究其作用機理，具有非常重要的理論與現實意義的。可用於指導同類中藥的開發以及開發具有療效高、副作用小、針對性強、目標專一的現代中藥製劑。
綿萆又名白萆、川萆、棉萆。為植物綿萆的乾燥根莖。綿萆的植物來源為薯蕷科綿萆Dioscorea spongiosa J.Q.Xi，M.Mizuno et W.L.Zhao、福州薯蕷Dioscorea futschauensis Uline exR.Knuth和七裂葉萆Dioscorea septemloba Thunb.。其化學成分包含薯蕷皂甙(dioscin)、纖細薯蕷皂甙(gracillin)，另含有原薯蕷皂甙(protodioscin)、原纖細薯蕷皂甙(protogracillin，kikubasaponin)及甲基原纖細薯蕷皂甙。性平、味苦。功能主治利溼去濁，祛風通痺。用於淋病白濁、白帶過多、溼熱瘡毒、腰膝痺痛。目前對萆的藥理研究文獻較少，近二十年來僅有的一篇關於棉萆總皂苷的文獻(張克錦等，棉萆總皂甙對實驗性鵪鶉動脈粥樣硬化的預防作用，中草藥1990，Vol.21(11)25-27)其總皂苷的植物來為纖細薯蕷Dioscoreagracillima，與本發明的植物來源不同。本發明開發了綿萆治療和預防骨質疏鬆症的新醫藥用途及提取物的製備方法。
發明內容
本發明的目的是提供中藥綿萆的新醫藥用途及其提取物的製備方法。綿萆經適當的工藝處理得到的提取物，可作為製備治療和預防骨質疏鬆症的藥物，也可作為製備提高椎骨骨密度、抑制骨吸收活性、抑制破骨細胞形成和促成骨細胞增殖活性的藥物。綿萆其植物來源為下列植物中的一種或多種薯蕷科綿萆Dioscorea spongiosa J.Q.Xi，M.Mizuno et W.L.Zhao、福州薯蕷Dioscorea futschauensis Uline ex R.Knuth和Dioscorea septemlobaThunb.。所述提取物為綿萆水或醇的簡單提取物、綿萆的水或醇的簡單提取物通過吸附樹脂經水-醇混合溶劑洗脫得到的不同比例水-醇混合溶劑洗脫物、綿萆總皂苷以及從綿萆中提取得到的用於製備抗骨質疏鬆症的藥物的其它提取物。所述的醇通常具有以下通式的飽合一元醇或不飽合一元醇CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜5)；在混合洗脫溶劑中，醇在所佔的百分含量在40-95％之間。所列綿萆的其它提取物，指含有下列中的一種或多種化合物，並用於製備治療骨質疏鬆症的藥物的提取物化合物2綿萆素B(spongiosinB)；3綿萆素C(spongiosin C)；4piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G；8薯蕷皂甙(dioscin)；11纖細薯蕷皂甙(gracilin)14pregna-5，16-diene-1β-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside；20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3β，22，26-triol26-O-β-D-glucopyranoside；22(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyrano-syl-(1→2)]-D-glucopyranosylfu-rost-5-ene-3，22，26-triol26-O--D-gl-ucopyranoside；26(R)-3-hydro-xyoct-1-ene3-O-[-L-arabinopy-ranosyl-(1→6)]--D-glucopyranoside等11個化合物。以中藥綿萆或者新鮮採集的綿萆的乾燥塊莖為原料，採用溶劑提取法、溶劑萃取法、樹脂吸附法、正相柱層析法、反相柱層析法等工藝中的一種或者多種工藝，並結合濃縮乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥等常用乾燥方法可製備成以上所述的11種化合物中的一種或多種成分的提取物，使之作為抗骨質疏鬆活性成分與賦形劑相結合，按照常規方法製成的口服給藥的內用劑型及非口服給藥的注射劑和外用劑型。所列的溶劑為下列溶劑中的一種或幾種不多於10個碳原子的滷代烷、醇、酮、酯或其混合溶劑等，其中滷代烷具有以下通式CnH2n+1R、CnH2nR2或CnH2n-1R3(n＜10；R＝Cl，Br，I)，醇類溶劑具有以下通式CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜10)，酮類溶劑具有以下通式CnH2nO或CnH2n-2O(n＜10)，酯類溶劑具有以下通式CnH2nO2或CnH2n-2O2(n＜10)，溶劑洗脫方式包括單一或混合溶劑的正相、反相或梯度洗脫。所列的吸附樹脂為苯乙烯類、丙烯酸酯類、丙烯醯胺類或氧化氮類大孔吸附樹脂中的一種或多種；柱層析填料為下列種的一種或多種矽膠、氧化鋁、聚醯胺、吸附樹脂、葡萄糖凝膠、硅藻土。
1.綿萆治療和預防骨質疏鬆症的新醫藥用途。
本發明中的綿萆經適當工藝製備的提取物包括綿萆水或醇的簡單提取物、綿萆水或醇的簡單提取物通過吸附樹脂經水-醇混合溶劑洗脫得到的不同比例水-醇混合溶劑洗脫物、綿萆總皂苷以及化合物2、3、4、5、7、8、11、14、20、22、26等11種化合物。我們將綿萆經水或醇簡單處理過的提取物與成骨細胞株UMR106共同培養，證實綿萆呈明顯的促成骨細胞增殖活性，在隨後進行的抑制破骨細胞形成實驗中，綿萆也顯示了較強的活性。隨之將綿萆以OVX大鼠為模型，進行的體內活性實驗結果也表明它具有提高椎骨骨密度的作用。又將綿萆的提取物進行促成骨細胞增殖活性，抑制破骨細胞形成，抑制骨吸收模型45Ca釋放等實驗的活性篩選後，證實綿萆的水或醇提取物通過吸附樹脂經水-醇混合溶劑洗脫得到的不同比例水-醇混合溶劑洗脫物為主要活性部位。隨後對其主要活性部位及總皂甙進行的體內試驗中，它們也顯示了較強的活性，並呈良好的量效關係。對其活性部位進行的化學成分研究共分離得到了近30種化合物，對所有的化合物進行了抑制以PTH誘導的45Ca釋放的骨吸收模型的活性實驗，證實化合物2綿萆素B(spongiosinB)；3綿萆素C(spongiosin C)；4piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G；8薯蕷皂甙(dioscin)；11纖細薯蕷皂甙(gracilin)14pregna-5，16-diene-1-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)].-D-glucopyranoside；20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O--D-glucop-yranoside；22(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]--D-glucopyranosyffurost-5-ene-3，22，26-triol26-O--glucopyranoside；26(R)-3-hydroxyoct-1-ene3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11個化合物顯現了較強的抑制骨吸收活性。
以下公開其體內、體外活性研究方法與結果1.1.體外活性實驗1.1.1.以成骨細胞UMR106為模型促成骨細胞增殖活性按文獻方法對綿萆水或醇的簡單提取物進行了促成骨細胞UMR106增殖活性實驗[5]。綿萆的水或醇的簡單提取物顯示了非常強的促成骨樣細胞增殖活性(濃度為400μg/ml時，細胞增殖率為55～68.9％)。結果見表1，表1.綿萆提取物對成骨細胞株UMR106的增殖促進作用增殖率(％)*NaF 37.2綿萆水或醇的簡單提取物 55～68.9*與對照組的百分比NaF陽性對照組，濃度1μM.「-」細胞存活率小於對照組.
1.1.2.抑制破骨細胞形成活性按文獻方法進行抑制破骨細胞形成實驗，首先，我們從乳鼠的頭蓋骨中消化得到成骨細胞，然後與小鼠脛骨髓細胞及樣品，1□，25(OH)2VD3共同培養[7]，考察樣品抑制破骨細胞的誘導形成。綿萆的水或醇簡單提取物在高濃度時完全抑制了破骨細胞的形成(濃度為200μg/ml時，抑制率為100％，並呈明顯的量效關係)，結果見表2。
表2.對破骨細胞的形成抑制作用濃度g/mL 抑制率(％)綿萆水或醇的簡單 200100.0提取物20 20～39.61,25(OH)2VD3(-)100.01,25(OH)2VD3(+) 0.10Elcitonin(陽性對照 2U/ml 70.8藥)1.1.3.綿萆水或醇簡單提取物中活性部位的體外實驗確定結果為了進一步確定綿萆水或醇簡單提取物中的活性部位及活性成分，將萆的乾燥根莖10kg經水或醇回流提取，提取物經非極性吸附大孔樹脂柱，用不同比例的水及醇的混合溶劑洗脫，得到不同比例的水-醇混合溶劑洗脫部位(見表3)，將其洗脫部位分別進行促成骨細胞株UMR106增殖作用、抑制破骨細胞形成作用及骨吸收器官培養模型PTH誘導的45Ca釋放抑制的實驗[8]，發現含40～95％醇部位在200μg/ml的濃度下促成骨細胞株UMR106增殖作用可達66.7～90.6％，並完全抑制了破骨細胞的形成；抑制PTH誘導的45Ca釋放達15.9～85.8％(濃度為440μg/ml)。因而含40～95％醇洗脫部位被認定為抗骨質疏鬆的主要活性部位，隨之對它進行了體內活性確定實驗。
表3綿萆經非極性大孔樹脂以水-醇混合溶劑的洗脫物用體外實驗篩選抗骨質疏鬆活性的數據含0～35％醇部含40～95％醇部位位刺激成骨細胞株UMR106增11.2～14.766.7～90.6殖率(％)對破骨細胞的形成的抑制率 96.1～100.0 100.0(％)對PTH誘導的45Ca釋放的抑 - 15.9～88.8制率(％)1.1.4.以骨吸收模型45Ca釋放抑制對化合物的抗骨質疏鬆活性進行評價結果對含40～95％醇的大孔吸附樹脂洗脫部位進行了一系列的分離提取工作。將80g的洗脫物，分別利用大孔吸附樹脂、矽膠、ODS等柱層析方法進行分離，並運用薄層層析，高效液相，重結晶等方法純化，得到了近30個化合物，運用核磁共振(NMR)，質譜(MS)，紅外(IR)，氣相(GC)等光譜、色譜手段，確定了它們的結構。對所有的化合物進行了抑制PTH誘導的45Ca釋放的實驗。由J.J.Reynold等在1969年建立的骨吸收亢進器官培養法是利用45Ca同位素對乳鼠進行標記後，取其顱骨進行體外培養，在培養過程中加入甲狀腺旁素(PTH)，PTH可誘導體外培養的骨組織中45Ca大量釋放，使之發生骨吸收亢進現象[19]。這個模型綜合考了骨吸收過程中成骨細胞，破骨細胞的協同作用，可較真實地反映骨吸收的過程。表16示部分化合物對PTH誘導的45Ca釋放的抑制作用，從數據中可發現，2、3、4、5、7、8、11、14、20、22、26等化合物對PTH誘導的45Ca釋放的具有顯著的抑制作用。見表4。
表4.所有化合物對由PTH誘導的45Ca釋放的抑制作用45Ca release(％)45Ca release(％)Comp. Comp.
200□M 20□M200□M 20□M2 30.5±0.4 18.2±3.1*1419.6±1.9 20.3±7.53 19.1±1.6*18.2±3.2*2017.4±1.6**24.9±1.24 15.1±1.5**14.7 2216.4±18.5±0.2±0.8**1.3**5 13.6±1.0**22.6±2.52625.6±1.1 17.7±1.67 19.2±2.1 22.8±7.9PTH 25.3±2.68 20.7±4.0 18.8±7.0Control 15.4±1.311 30.9±4.5 17.1±2.5Elcitoni 18.4±n 0.7**PTH乳鼠頭蓋骨在含PTH(2×10-9M)中的培養液中培養。
Control乳鼠頭蓋骨在沒有PTH和化合物的培養液中培養。
Elcitonin乳鼠頭蓋骨在含PTH和elcitonin (2U/ml)的培養液中培養。
Sample乳鼠頭蓋骨在含PTH和化合物的培養液中培養。數值用均值±方差表示。*p＜0.05，**p＜0.001.與PTH對照，顯著地抑制了鈣的釋放。所有化合物的名稱見下2綿萆素B(spongiosin B)；3綿萆素C(spongiosin C)；4piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G[(25ξ)3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-□-D-glucopy ranosyl-20，22-seco-furost-5-ene-3□，26-diol 20，22-dione26-O-□-D-glucopyranoside；]8薯蕷皂甙(dioscin)[(25R)-spirost-5-ene-3□-ol3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-□-D-glucopyranoside]11纖細薯蕷皂甙(gracilin)[(25R)-spirost-5-ene-3□-ol3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[□-D-glucopyranosyl-(1→3)]-□-D-glucopyranoside]14 pregna-5，16-diene-1□-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[□L-rhamnopyranosyl-(1→4)].-□-D-glucopyranoside20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-□-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3□，22，26-triol26-O-□-D-glucopyranoside22(22S，25R)-3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-□-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3□，22，26-triol 26-O-□-D-glucopyranoside26(R)-3-hydroxyoct-1-ene3-O-[□-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-□-D-glucopyranoside1.2.體內實驗1.2.1.以OVX大鼠為模型，以DXA為測量手段，對萆水提取物進行的體內實驗確定結果不論是促成骨樣細胞增殖活性，還是抑制破骨細胞形成活性，都是體外活性，不能真正地反映骨質疏鬆機體內的生理病理變化，因此用雙側卵巢摘出所致雌性骨質疏鬆大鼠骨質疏鬆模型，以DXA(雙能X射線吸收儀)為測量手段，考察了綿萆水或醇的簡單提取物對骨質疏鬆大鼠椎骨的骨密度的影響，實驗結果表明，綿萆水或醇的簡單提取物可顯著改善骨質疏鬆發生時引起的椎骨骨密度(BMD)降低，結果見Fig.1。模型組雌性大鼠的骨密度(BMD)較正常組明顯下降(p＜0.01)，椎骨骨密度降至正常組的86.3％。綿萆水或醇的簡單提取物高，低劑量組骨密度分別增加了8.6～13.3％(p＜0.05)，其BMD恢復了95.6～99.4％，可見綿萆水或醇的簡單提取物可顯著提高骨質疏鬆大鼠的椎骨骨密度。結果見圖1。
1.2.2.以OVX大鼠為模型，PQCT為測量手段的體內試驗上述我們已經證實綿萆水或醇的簡單提取物、其水或醇的簡單提取物的不同濃度的水-醇洗脫物具有抗骨質疏鬆活性。為進一步證實這些提取物的抗骨質疏鬆活性，我們以綿萆的水或醇的簡單提取物、水或醇的簡單提取物通過大孔吸附樹脂經含40～95％不同醇濃度的水-醇混合溶劑洗脫物、總皂苷為例，詳細說明其動物實驗中對骨質疏鬆症的改善效果。
將90隻6月齡的健康未交配Wister大鼠，經適應性餵養3周後，進行雙卵巢切除術或假手術，隨機分成9組(1)卵巢切除14周組(control組)卵巢切除術後14周處死。(2)假手術組(sham組)進行手術，但不摘出卵巢，14周後處死。(3)陽性對照組(positive control組)卵巢切除術後8周經胃腸道給藥灌注0.1mg/kg/d 17β-estradiol(購於日本東京化成工業株式會社)，用藥6周後處死。(4)綿萆水或醇的簡單提物組(D.s water)卵巢切除術後8周經胃腸道給藥灌注萆水或醇的簡單提物100mg/kg/d，用藥6周後處死。(5)綿萆40～95％不同醇濃度的洗脫部位組(40～90％EtOH)卵巢切除術後8周經胃腸道給藥灌注綿萆40～95％不同醇濃度的洗脫部位100mg/kg/d，用藥6周後處死。(7)綿萆總皂甙部位組(T.saponin)卵巢切除術後8周經胃腸道給藥灌注綿萆總皂甙100mg/kg/d，用藥6周後處死。所有的動物處死前，麻醉狀態下用外周肢體定量計算機斷層掃(PQCT)描測量大鼠左側脛骨近端幹骺端生長板下1-5mm範圍內的松質骨、皮質骨和全骨，掃描4個斷面，數據取自3-4mm處斷面[9]。測量指標全骨礦量(total bone mineralcontent，TOT-CNT，mg/mm)、全骨密度(total bone mineraldensity，TOT-DEN，mg/cm3)、全骨斷面積(total bonearea，TOT-A，mm2)、松質骨礦量(trabecular mineralcontent，TRAB-CNT，mg/mm)、松質骨密度(trabecular mineraldensity，TRAB-DEN，mg/cm3)、皮質骨外周周長(periderm ofcortical membrance，PERI-C mm)、內周周長(endoderm ofcortical membrance，ENDO-C mm)、皮質骨礦量(cortical mineralcontent，CRT-CNT，mg/mm)、皮質骨密度(cortical mineral density，CRT-DEN，mg/cm3)、皮質骨厚(cortical thickness，CRT-THK-C，mm)、抗壓力(X-axis strength strain index，XSSI)、抗折力(Y-axisstrength strain index，YSSI)、抗扭力(polar-axis strength strainindex，Polar SSI)等。
測量後所有的大鼠被從主動脈中取血，離心後分離血清，-80℃冷凍保存備用。將所有大鼠的子宮取出、稱重。
大鼠體重及子宮重量的變化如表5所示，術後14周與術前相比，除陽性對照組外，各組的體重均有增高，尤其對照組，增高近20％，同時子宮的重量明顯下降，說明對照組已呈明顯的雌激素缺乏症狀，造型成功。而其他各組體重雖然也有增加作用，但與對照組相比，有顯著性差異。因而各給藥組可能都具有抗雌激素缺乏後造成的體重升高。各給藥組與對照組相比雖然子宮重量有增加，但增量很小，並沒有顯著性差異。而陽性對照組則顯著提高了子宮的重量。說明與雌激素類化合物各給藥組相比抗雌激素缺乏後造成子宮萎縮作用極微，因而各給藥組的作用機制可能與雌激素類化合物不相同。
表5各實驗組對大鼠體重及子宮重量的影響實驗組體重(a)(g) 體重(b)(g)子宮重量(g)對照組296.6±16.7351.7±32.6#0.12±0.01#假手術組290.3±8.5 303.5±16.30.50±0.10陽性對照組 294.4±7.2 265.3±19.6□0.36±0.11□D.sp.Water 290.1±10.3296.6～317.6#0.14～0.1740～299.6±15.3314.4～338.5#0.14～0.1895％EtOH總皂甙 292.1±22.5303.4～334.8#0.14～0.21#p＜0.001與偽手術組對照□p＜0.001與對照組對照對全骨的影響從表6可發現，control組大鼠脛骨近端全骨的骨礦含量、骨密度都較sham組有明顯的降低，並具有顯著性差異。雖然全骨斷面面積也有微小下降，但不具有顯著性差異，說明OVX對全骨斷面面積沒有明顯地影響。陽性對照組組與對照組相比較，較大程度地提高了全骨的骨礦含量、骨密度。40～90％EtOH組也能較大程度地提高了全骨的骨礦含量和骨密度，並且在提高全骨的骨礦含量上，作用強於陽性對照組。雖然各給約組都明顯提高了全骨斷面面積，但不具顯著性差異。
表6各實驗組對大鼠脛骨近端全骨的骨礦含量、骨密度及骨面積的影響實驗組 鼠 全骨礦量 全骨密度 全骨斷面積數對照組 10 8.13±0.75#638.32 ±12.77±1.3835.05假手術組 10 9.77±1.34760.25 ±12.85±1.7120.29#陽性對照組 10 8.94±1.12709.39 ±12.58±1.2031.08D.sp.Water 10 8.39～9.17639.78 ～13.04～14.04684.7940～95％EtOH 10 8.45～10.03 655.01 ～12.93～14.97745.76總皂甙 10 8.57～9.42636.37 ～13.01～14.53700.49#p＜0.01與偽手術組對照□p＜0.01與對照組對照對松質骨的影響脛骨近端松質骨骨礦含量及骨密度的改變對照組TRAB-CNT比sham組略有升高，但沒有顯著性差異，說明OVX對TRAB-CNT沒有明顯地影響。。而水提物組、40～95％EtOH組及總皂甙量組的TRAB-CNT都有顯著增加。但是陽性對照組不能提高TRAB-CNT。對照組TRAB-DEN與sham組相比，有顯著性差異，所有給藥組的TRAB-DEN都有所提高。其中提高最顯著的在40～95％EtOH部位組。由此說明陽性對照組與給藥組對脛骨近端松質骨的作用機理也可能是不同的。陽性對照組只對TRAB-DEN有作用，而一些給藥組既對TRAB-DEN也對TRAB-CNT有提高作用。
表7各實驗組對大鼠脛骨近端松質骨的骨礦含量、骨密度影響
#p＜0.05.與偽手術組對照□p＜0.05，□□p＜0.01，□□□p＜0.001與對照組對照對皮質骨的影響1)對皮質骨內、外周周長的影響由表7所示數據可知，除陽性對照組外，其餘各組外周周長均增大，在內周周長組，sham和陽性對照組與control組比下降，而各給藥組的內周周長均增大，但都沒有顯著性差異。
表8各實驗組對大鼠脛骨近端皮質骨的內、外膜周長的影響實驗組 外膜周長 內膜周長對照組 12.65±0.68 9.59±0.70#假手術組 12.68±0.84 8.92±0.80陽性對照組 12.56±0.59 9.14±0.46*D.sp.Water 12.80～12.85 9.63～9.7640～95％EtOH 12.69～12.88 9.62～9.64總皂甙 12.81～13.07 9.73～9.96#p＜0.05與偽手術組對照□p＜0.05與對照組對照2)脛骨近端密質骨骨礦含量、骨密度及皮質骨厚度的變化對照組中的大鼠脛骨近端，皮質骨骨礦含量CRT-CNT及皮質骨厚度CRT-THK-C較sham組有顯著下降，所以OVX也可影響皮質骨。各給藥組均提高了CRT-CNT，其中陽性對照組及在40～95％EtOH組中效果最為明顯。並且只有這兩組提高了CRT-THK-C。因而在對皮質骨的作用上，陽性對照組及40～95％EtOH組作用相似。
表9 各實驗組對大鼠脛骨近端皮質骨的骨礦含量、骨密度及皮質骨厚度的影響實驗組 皮質骨骨礦含 皮質骨骨密度 皮質骨厚度量對照組 5.34±0.41##1251.58±13.82 0.49±0.03##假手術組 6.09±0.24 1257.85±10.13 0.60±0.02陽性對照組 6.86±0.67**1291.97±15.76 0.54±0.04**D.sp.Water 6.24～6.78**1273.78 ～ 0.49～0.531314.0340～95％EtOH 6.32～7.06**1268.60 ～ 0.49～0.55*1313.06總皂甙 6.25～6.79**1254.27 ～ 0.49～0.521267.03##p＜0.01與偽手術組對照*p＜0.05，**p＜0.01與對照組對照骨強度的改變PQCT能用來測定骨力學指標(與材料力學及構造學的力學特性相關)，是由於材料力學的特性指標彈性係數與皮質骨密度有關，雖然PQCT不能直接用於測定彈性係數，但可以測出皮質骨密度，並且可以用測出的斷面二次動量力矩乘以骨斷面半徑得出構造學的力學特性，從而計算出骨強度(SSI).其中XSSI示抗壓力、YSSI示抗折力、Polar SSI示抗扭力。其中XSSI及YSSI受檢體測定位置的影響很大，有一定的誤差，但Polar SSI幾乎不受此影響，有良好的重現度及精度。
由表10可發現，OVX後大鼠脛骨近端的抗壓力和抗扭力都顯著下降，但抗折力基本不變。說明OVX對抗折力沒有明顯地影響。在所有的給藥組中，陽性對照組顯著提高了脛骨的抗壓能力，40～95％EtOH組中顯著提高了抗扭力。其他各組雖然也提高了抗壓力及抗扭力，但沒有顯著性差異。因而陽性對照組與在49～95％EtOH組中對骨強度的作用機制上也存在不同。
表10各實驗組對大鼠脛骨近端骨強度的影響實驗組X軸抗壓力 Y軸抗折力 極軸抗扭力對照組3.51±0.51##4.47±0.66 7.17±1.25#假手術組 4.87±0.86 4.44±0.97 8.71±1.69陽性對照組4.15±0.94*4.26±0.57 7.87±1.27D.sp.Water3.50～4.18 4.24～5.22 7.40～8.4940～95％EtOH 3.76～4.42 4.54～5.55 7.43～9.41*總皂甙3.67～4.34 4.40～5.21 7.38～8.53
#p＜0.05，##p＜0.01.與偽手術組對照*p＜0.05，**p＜0.01與對照組對照結論上述數據以綿萆的水或醇簡單提取物、水或醇的簡單提取物通過大孔吸附樹脂經含40～95％的不同濃度醇的水-醇混合溶劑洗脫物、總皂苷為例，證實綿萆水或醇的簡單提取物、其水或醇的簡單提取物經含40～95％醇的水-醇洗脫物以及綿萆總皂苷無論是在提高OVX大鼠脛骨近端全骨的骨礦含量和骨密度、松質骨的骨礦含量和骨密度、皮質骨的骨礦含量和厚度，還是在改善骨強度方面，都顯示了較強的活性。尤其是在提高全骨的骨礦含量和骨密度、松質骨的骨礦含量和骨密度及骨的抗扭力方面，作用強於陽性對照組雌激素類化合物，並且作用機制不同。且含40～95％不同濃度醇的水-醇洗脫物組中存在可顯著提高脛骨的抗扭力強度的組分，這是許多抗骨質疏鬆藥物所達不到的[10]。
2.綿萆提取物的製備綿萆的化學成分及藥理研究鮮有報導，其提取物的製備方法研究也是空白。我們以中藥綿萆或者新鮮採集的綿萆的乾燥塊莖為原料，採用溶劑提取法、溶劑萃取法、樹脂吸附法、正相柱層析法、反相柱層析法等工藝中的一種或者多種工藝，並結合濃縮乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥等常用乾燥方法可製備成含有化合物2綿萆素B(spongiosin B)；3綿萆素C(spongiosin C)；4piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G；8薯蕷皂甙(dioscin)；11纖細薯蕷皂甙(gracilin)14pregna-5，16-diene-1-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranoside；20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；22(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyra-nosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O-D-glucopyranoside；26(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabin-opyranosyl-(1→6)]--D-glucopyranoside等11個具有抗骨質疏鬆活性有效成分中的一種或多種成分的提取物。
2.1.綿萆水或醇的簡單提取物的製備方法綿萆水或醇的簡單提取物系經過溶劑提取法或溶劑萃取法得到的提取物，其特徵在於含有上述經實驗證實具有抗骨質疏鬆活性的6種活性成分中的一種或多種。醇通常具有以下通式的飽合一元醇或不飽合一元醇CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜5)；溫度在10-100℃範圍之內經過一次或多次提取或萃取得到的簡單提取物。使用混合溶劑時，醇在混合溶劑中的所佔的百分含量在1-95％之間。
2.2.綿萆的水或醇的簡單提取物通過大孔吸附樹脂經水-醇混合溶劑洗脫得到的不同比例水-醇混合溶劑洗脫物的製備方法綿萆水或醇的簡單提取物通過大孔吸附樹脂經水-醇混合溶劑洗脫得到的不同比例水-醇混合溶劑洗脫物係指將經過溶劑提取法或溶劑萃取法得到的提取物，裝入徑高比為1∶3-1∶7之間的大孔吸附樹脂柱，經含不同比列的水-醇混合溶劑洗脫而得到的洗脫物。其特徵在於含有化合物2綿萆素B(spongiosin B)；3綿萆素C(spongiosin C)；4piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G；8薯蕷皂甙(dioscin)；11纖細薯蕷皂甙(gracilin)；14pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranoside；20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O-D-glucopyranoside；22(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-enc-3，22，26-triol 26-O--D-glucopyranoside；26(R)-3-hydroxyoct-1-ene3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11個具有抗骨質疏鬆活性有效成分中的一種或多種成分的提取物。醇通常具有以下通式的飽合一元醇或不飽合一元醇CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜5)；在洗脫溶劑中，醇在所佔的百分含量在40-95％之間。其洗脫物已在動物實驗中證實具有抗骨質疏鬆活性。
2.3.綿萆總皂苷及綿萆素B(spongiosin B)；綿萆素C(spongiosin C)；piperitol；sesaminone；hypoglaucin G；薯蕷皂甙(dioscin)；纖細薯蕷皂甙(gracilin)；pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)].-D-glucopyranoside；(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O--D-glucopyranoside；(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O--D-glucopyranoside；(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]--D-glucopyranoside等11個具有抗骨質疏鬆活性有效成分以中藥綿萆或者新鮮採集的綿萆的乾燥塊莖為原料，採用溶劑提取法、溶劑萃取法、樹脂吸附法、正相柱層析法、反相柱層析法等工藝中的一種或者多種工藝，並結合濃縮乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥等常用乾燥方法可製備。
其中的溶劑包括不多於10個碳原子的滷代烷、醇、酮、酯或其混合溶劑等，其中滷代烷具有以下通式CnH2n+1R、CnH2nR2或CnH2n-1R3(n＜10；R＝Cl，Br，I)，醇類溶劑具有以下通式CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜10)，酮類溶劑具有以下通式CnH2nO或CnH2n-2O(n＜10)，酯類溶劑具有以下通式CnH2nO2或CnH2n-2O2(n＜10)。溶劑洗脫方式包括單一或混合溶劑的正相、反相或梯度洗脫。
樹脂括非極性大孔吸附樹脂、極性大孔吸附樹脂、強極性大孔吸附樹脂；柱層析中的填料包括聚醯胺、矽膠、葡萄糖凝膠及改性的葡萄糖凝膠如羥丙基葡萄糖凝膠等。
圖1為綿萆水或醇的簡單提取物對骨質疏鬆大鼠椎骨骨密度的影響。
圖中Sham偽手術組；OVX卵巢摘除組；D.s100，D.s50分別表示卵巢摘除5周後分別灌胃給綿萆水或醇的簡單提取物100和50mg/kg/day，給5周。椎骨密度用DXA測量。#p＜0.01，與偽手術組相比有顯著性差異；*p＜0.05，與對照組相比有顯著性差異。圖2為化合物2名稱與結構式spongiosin B C19H20O3(3R，5R，7R)-1，7-diphenyl-3，7-epoxy-5-hydroxy-heptanone圖3為化合物3名稱與結構式spongiosin C C19H24O4(1S，3R，5S，7S)-1，7-diphenyl-1，3，5，7-tetrahydroxyheptane圖4為化合物4名稱與結構式piperitol圖5為化合物5名稱與結構式sesaminone圖6為化合物7名稱與結構式hypoglaucin G or (25ξ)3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosyl-20，22-seco-furost-5-ene-3，26-diol 20，22-dione 26-O-D-glucopyranoside圖7為化合物8與化合物11名稱與結構式化合物8dioscin or(25R)-spirost-5-ene-3-ol-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyramoside11gracilin or(25R)-spirost-5-ene-3-ol 3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-D-glucopyranosyl-(1→3)]-D-glucopyranoside纖細薯蕷皂甙圖8為化合物14名稱與結構式pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4]-D-glucopyranoside圖9為化合物20與22的名稱與結構式
化合物20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)[-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside化合物22(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside圖10為化合物26的名稱與結構式(R)-3-hydroxyoct-1-ene3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside
表11.綿萆提取物對成骨細胞株UMR106的增殖促進作用增殖率(％)*NaF37.2綿萆水提取物 66.9*與對照組的百分比NaF陽性對照組，濃度1μM. 「-」細胞存活率小於對照組.
2、綿萆水或醇的簡單提取物通過吸附樹脂經水-醇混合溶劑洗脫得到的含40～95％醇的水-醇混合溶劑洗脫物製備方法的實列與活性實驗綿萆水提取物中含90％乙醇洗脫物活性部位的製備方法與活性實驗將萆的乾燥根莖100g經1000ml水回流提取3次，每次1小時，經減壓或凍幹得水提取物36克，經Diaion 101柱，用90％乙的醇的混合溶劑洗脫，得到90％乙醇部位1.05克，將這部位進行促成骨細胞株UMR106增殖作用、抑制破骨細胞形成作用及骨吸收器官培養模型PTH誘導的45Ca釋放抑制的實驗，90％乙醇部位在200μg/ml的濃度下促成骨細胞株UMR106增殖作用可達89.6％，並完全抑制了破骨細胞的形成；抑制PTH誘導的45Ca釋放達82.8％(濃度為440μg/ml)，結果見表10。以OVX大鼠為模型，PQCT為測量手段的體內試驗表明，含90％乙醇的水醇混合溶劑洗脫部位在提高OVX大鼠脛骨近端全骨的骨礦含量和骨密度、松質骨的骨礦含量和骨密度、皮質骨的骨礦含量和厚度，還是在改善骨強度方面，都顯示了較強的活性。尤其是在提高全骨的骨礦含量和骨密度、松質骨的骨礦含量和骨密度及骨的抗扭力方面，作用強於陽性對照組雌激素類化合物，並且作用機制不同結果見表11-表16，實驗方法見體內實驗部分1.2.2節。從而體內體外實驗均證實含90％乙醇水-醇混合溶劑洗脫部位為抗骨質疏鬆的活性部位之一。
表12萆水提取物的90％乙醇部位體外實驗篩選抗骨質疏鬆活性的數據90％乙醇部位刺激成骨細胞株UMR106增 89.5殖率(％)對破骨細胞的形成的抑制率 100.0(％)對PTH誘導的45Ca釋放的抑 82.8制率(％)表1390％乙醇部位對大鼠體重及子宮重量的影響實驗組 體重(a)(g) 體重(b)(g) 子宮重量(g)對照組 296.6±16.7 351.7±32.6#0.12±0.01#假手術組290.3±8.5 303.5±16.3 0.50±0.10陽性對照組 294.4±7.2 265.3±19.6□0.36±0.11□90％EtOH304.4±8.5 319.4±20.1□0.14±0.03#p＜0.001與偽手術組對照□p＜0.001與對照組對照，給藥劑量100mg/kg/d表1490％乙醇部位對大鼠脛骨近端全骨的骨礦含量、骨密度及骨面積的影響實驗組 鼠 全骨礦量 全骨密度全骨斷面積數對照組 10 8.13±0.75#638.32 ±12.77±1.3835.05假手術組8 9.77±1.34 760.25 ±12.85±1.7120.29#陽性對照組 9 8.94±1.12 709.39 ±12.58±1.2031.0890％EtOH9 9.17±0.86 695.36 ±13.26±1.7150.40#P＜0.01與偽手術組對照□P＜0.01與對照組對照，給藥劑量100mg/kg/d
表1590％乙醇部位對大鼠脛骨近端松質骨的骨礦含量、骨密度影響
#p＜0.05.與偽手術組對照□p＜0.05，□□p＜0.01，□□□p＜0.001與對照組對照，給藥劑量100mg/kg/d表1690％乙醇部位對大鼠脛骨近端皮質骨的內、外膜周長的影響實驗組 外膜周長 內膜周長對照組 12.65±0.68 9.59±0.70#假手術組12.68±0.84 8.92±0.80陽性對照組 12.56±0.59 9.14±0.46*90％EtOH12.88±0.85 9.62±0.98#p＜0.05與偽手術組對照□p＜0.05與對照組對照，給藥劑量100mg/kg/d表1790％乙醇部位對大鼠脛骨近端皮質骨的骨礦含量、骨密度及皮質骨厚度的影響實驗組 皮質骨骨礦含 皮質骨骨密度 皮質骨厚度量對照組 5.34±0.41##1251.58±13.820.49±0.03##假手術組 6.09±0.241257.85±10.130.60±0.02陽性對照組 6.86±0.67**1291.97±15.760.54±0.04**90％EtOH 6.62±0.44**1294.43±18.930.52±0.03*##p＜0.01與偽手術組對照*p＜0.05，**p＜0.01與對照組對照，給藥劑量100mg/kg/d表18 90％乙醇部位對大鼠脛骨近端骨強度的影響實驗組 X軸抗壓力Y軸抗折力極軸抗扭力對照組 3.51±0.51##4.47±0.66 7.17±1.25#假手術組4.87±0.86 4.44±0.97 8.71±1.69陽性對照組 4.15±0.94*4.26±0.57 7.87±1.2790％EtOH3.85±0.57 4.87±0.68 8.06±1.35*
#p＜0.05，##p＜0.01.與偽手術組對照*p＜0.05，**p＜0.01與對照組對照，給藥劑量100mg/kg/d3、綿萆總皂苷及綿萆素B(spongiosin B)；綿萆素C(spongiosin C)；piperitol；sesaminone；hypoglaucin G；薯蕷皂甙(dioscin)；纖細薯蕷皂甙(gracilin)；pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranoside；(22S，25R)-22-O-methy[-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyrmosylfurost-5-enc-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11個具有抗骨質疏鬆活性有效成分的製備方法的實列與活性實驗。
1.綿萆總皂苷的製備方法的實列與活性實驗(總皂苷的體內活性實驗已列在體內實驗部分)製備方法實例一綿萆根莖粗粉100克經600毫升的水回流提取2次每次2小時，減壓濃縮提取物至小體積，先經氯仿萃取除去脂溶性成分，後經正丁醇萃取，得綿萆總皂苷36.9克。
製備方法實例二綿萆根莖粗粉100克經600毫升的95％乙醇回流提取2次每次2小時，提取物經減壓回收乙醇，得提取物經少量水分散，先經氯仿萃取除去脂溶性成分，後經正丁醇萃取，得綿萆總皂苷36.9克。
製備方法實例三綿萆根莖粗粉100克經600毫升的95％乙醇回流提取2次每次2小時，提取物經減壓回收乙醇，得提取物。將提取物通過非極性大孔吸附樹脂，以50％的含水乙醇洗脫，洗脫物經減壓回收溶劑，得綿萆總皂苷16.2克。
2.化合物2綿萆素B(spongiosin B)；3綿萆素C(spongiosin C)；4Piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G；8薯蕷皂甙(dioscin)；11纖細薯蕷皂甙(gracilin)14pregna-5，16-diene-1-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranoside；20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-]-L-rhamno pyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyran osylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；22(22S，25R)-3-O-]-L-rhamnopyranosyl-(1→2]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；26(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11個具有抗骨質疏鬆活性有效成分的製備方法的與活性實驗(活性實驗已列在體外活性實驗中)製備方法實例綿萆的乾燥根莖10kg水回流提取，水提取物經Diaion 101柱，用90％的乙醇洗脫，得到將104g 90％乙醇部位，矽膠柱，以氯仿∶甲醇混合溶劑(99∶1～1∶99)梯度洗脫，合併相同組分洗脫物，再經ODS柱、高效液相(HPLC)、重結晶等方法純化，得到了近30個化合物，其中的11個經實驗證實具有抗骨質疏鬆活性，分別為化合物2綿萆素B(spongiosin B)；3綿萆素C(spongiosin C)；4piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G；8薯蕷皂甙(dioscin)；11纖細薯蕷皂甙(gracilin)；14pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)].-D-glucopyranoside；20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O--D-glu-copyranoside；22(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O-D-glucopyranosid-e；26(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11等，並運用核磁共振(NMR)，質譜(MS)，紅外(IR)，氣相(GC)等光譜、色譜手段，確定了它們的結構、相對及絕對構型。
權利要求
1.中藥綿萆的新醫藥用途及其提取物的製備方法，其特徵在於綿萆經適當的工藝處理得到的提取物，可作為製備治療和預防骨質疏鬆症的藥物，也可作為製備提高椎骨骨密度、抑制骨吸收活性、抑制破骨細胞形成和促成骨細胞增殖活性的藥物。
2.根據權利要求1所述的中藥綿萆的新醫藥用途及其提取物的製備方法，其特徵在於綿萆其植物來源為下列植物中的一種或多種薯蕷科綿萆Dioscorea spongiosa J.Q.Xi，M.Mizuno et W.L.Zhao、福州薯蕷Dioscorea futschauensis Uline ex R.Knuth和Dioscorea septemloba Thunb.。
3.根據權利要求1所述的中藥綿萆的新醫藥用途及其提取物的製備方法，其特徵在於所述提取物為綿萆水或醇的簡單提取物、綿萆的水或醇的簡單提取物通過吸附樹脂經水-醇混合溶劑洗脫得到的不同比例水-醇混合溶劑洗脫物、綿萆總皂苷以及從綿萆中提取得到的用於製備抗骨質疏鬆症的藥物的其它提取物。
4.根據權利要求3所述的中藥綿萆的新醫藥用途及其提取物的製備方法，其特徵在於所述的醇通常具有以下通式的飽合一元醇或不飽合一元醇CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜5)；在混合洗脫溶劑中，醇在所佔的百分含量在40-95％之間。
5.根據權利要求3所述的中藥綿萆的新醫藥用途及其提取物的製備方法，其特徵在於所列綿萆的其它提取物，指含有下列中的一種或多種化合物，並用於製備治療骨質疏鬆症的藥物的提取物化合物2綿萆素B(spongiosin B)；3綿萆素C(spongiosin C)；4piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G；8薯蕷皂甙(dioscin)；11纖細薯蕷皂甙(gracilin)14pregna-5，16-diene-1β-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside；20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3β，22，26-triol 26-O-β-D-glucopyranoside；22(22S，25R)-3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-□-D-glucopyranosylfu-rost-5-ene-3□，22，26-triol26-O-□-D-glucopy ranoside；26(R)-3-hydro-xyoct-1-ene3-O-[□-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-□-D-glucopyranoside等11個化合物。
6.一種如權利要求1所述的中藥綿萆提取物的製備方法，其特徵在於以中藥綿萆或者新鮮採集的綿萆的乾燥塊莖為原料，採用溶劑提取法、溶劑萃取法、樹脂吸附法、正相柱層析法、反相柱層析法等工藝中的一種或者多種工藝，並結合濃縮乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥等常用乾燥方法可製備成權利要求5所述的11種化合物中的一種或多種成分的提取物，使之作為抗骨質疏鬆活性成分與賦形劑相結合，按照常規方法製成的口服給藥的內用劑型及非口服給藥的注射劑和外用劑型。
7.根據權利要求6所述的中藥綿萆提取物的製備方法，其特徵在於所列的溶劑為下列溶劑中的一種或幾種不多於10個碳原子的滷代烷、醇、酮、酯或其混合溶劑等，其中滷代烷具有以下通式CnH2n+1R、CnH2nR2或CnH2n-1R3(n＜10；R＝Cl，Br，I)，醇類溶劑具有以下通式CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜10)，酮類溶劑具有以下通式CnH2nO或CnH2n-2O(n＜10)，酯類溶劑具有以下通式CnH2nO2或CnH2n-2O2(n＜10)，溶劑洗脫方式包括單一或混合溶劑的正相、反相或梯度洗脫。
8.根據權利要求6所述的中藥綿萆提取物的製備方法，其特徵在於所列的吸附樹脂為苯乙烯類、丙烯酸酯類、丙烯醯胺類或氧化氮類大孔吸附樹脂中的一種或多種；柱層析填料為下列種的一種或多種矽膠、氧化鋁、聚醯胺、吸附樹脂、葡萄糖凝膠、硅藻土。
全文摘要
本發明是中藥綿萆薢的新醫藥用途及其提取物的製備方法，綿萆薢經適當的工藝處理得到的提取物，可作為製備治療和預防骨質疏鬆症的藥物，也可作為製備提高椎骨骨密度、抑制骨吸收活性、抑制破骨細胞形成和促成骨細胞增殖活性的藥物。以中藥綿萆薢或者新鮮採集的綿萆薢的乾燥塊莖為原料，採用溶劑提取法、溶劑萃取法、樹脂吸附法、正相柱層析法、反相柱層析法等工藝中的一種或者多種工藝，並結合濃縮乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥等常用乾燥方法可製備成含有一種或多種有效成分的提取物。
文檔編號C07H1/00GK1415364SQ02144850
公開日2003年5月7日 申請日期2002年11月18日 優先權日2002年11月18日
發明者陳英傑, 殷軍, 付文衛, 裴玉萍, 竇德強 申請人:瀋陽藥科大學