一種桂花組織的培養方法

2023-10-04 19:18:59 2

一種桂花組織的培養方法
【專利摘要】本發明屬於植物的組織培養方法【技術領域】，尤其涉及一種桂花組織的培養方法，包括以下步驟：選取健壯桂花嫩枝莖尖，對其進行消毒滅菌處理；用解剖刀將莖尖截成1～2mm，接種於含有初代培養基的三角瓶中；等莖尖長成2～3cm的無菌苗，將其切成0.5～1cm帶腋芽的莖段，轉入含繼代培養基的三角瓶中使其增殖；將繼代培養後得到的3cm以上的無菌苗轉入生根培養基中；移栽，得到生根苗。相對於現有技術，本發明至少具有如下優點：經統計，採用本發明的方法，桂花從一個莖尖到成苗移栽，只需要四個月左右的時間，這一時間優勢是其它繁殖手段不能比擬的。另外本發明用到的藥品價格相對低廉，從而在很大程度上縮減了生產成本。
【專利說明】一種桂花組織的培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物的組織培養方法【技術領域】，尤其涉及一種桂花組織的培養方法。【背景技術】
[0002]桂花又名木犀、九裡香，其系木犀科木犀屬植物。桂花既是園林綠化的優良樹種及名貴香料，也是傳統的中藥材，在很多方面具有重要的價值。例如，桂花可食用，在食品、制茶和釀酒工業中，人們將桂花做為糕點、燻茶、糖果和釀酒的配料，來提高食品的質量。再如，桂花作為一種著名的天然芳香植物，其香味異常，是提煉桂花浸膏、桂花香精和香水的重要原料。還如，桂花具有重要的藥用價值。桂花的根或根皮、枝葉、花和果實均可藥用。現代醫學表明，桂花中含有豐富的黃酮類化合物，具有良好的抗腫瘤、抗氧化、抗病毒和鎮痛等功效，對人類腫瘤、衰老、心血管疾病的預防和治療有著重要意義。
[0003]植物組織培養也叫離體培養，是指在無菌條件下，通過將離體的植物細胞、器官、原生質體以及胚胎等，在人工配製的培養基裡進行培養，來獲得完整的再生植株的技術過程。它是20世紀發展起來的一門新興技術，它具有效率高、生長周期短、繁殖率高、培養條件可控、方便管理和利於工廠生產等優點，被廣泛應用於農業、林業、醫藥業等多種行業，產生了巨大的經濟效益和社會效益。
[0004]目前，木犀科植物的組織培養仍處在開始時期，開展研究的植物還不多，而對於屬於木犀科植物的的桂花的組織培養方法的研究更是少之又少。
[0005]因此，確有必要提供一種桂花組織的培養方法，其不僅可以在較短的時間內成功獲得桂花生根苗，而且成本較低。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在於:針對現有技術的不足，而提供一種桂花組織的培養方法，其不僅可以在較短的時間內成功獲得桂花生根苗，而且成本較低。
[0007]為了達到上述要求，本發明採用如下的技術方案:
一種桂花組織的培養方法，包括以下步驟:
第一步，消毒滅菌，選取健壯桂花嫩枝莖尖，對其進行消毒滅菌處理；
第二步，初代培養，取消毒後的桂花嫩枝莖尖，先用消毒後的鑷子除去芽體外部的鱗片及嫩葉，再用解剖刀將該莖尖截成I~2mm，接種於含有初代培養基的三角瓶中，所述初代培養基為基本的B5培養基加上2~4%的蔗糖、5~9g/L的瓊脂粉、1.0~5.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.01~0.lmg/L的生長素NAA，所述初代培養基的pH為5.8，培養溫度為25±2°C，光照強度為1500~20001x，光照時間為12~14h/d，培養25~35d。
[0008]第三步，繼代培養，等莖尖長成2~3cm的無菌苗，將其切成0.5~Icm帶腋芽的莖段，轉入含繼代培養基的三角瓶中使其增殖，所述繼代培養基為基本的B5培養基加上2~4%的蔗糖、1.0~3.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.01~0.lmg/L的生長素NAA，所述繼代培養基的PH為5.8，培養溫度為25±2°C，光照強度為2000~25001x，光照時間為12~14h/d，培養25~35d ；
第四步，將繼代培養後得到的3cm以上的無菌苗轉入生根培養基中，所述生根培養基為基本的1/2MS培養基加上1.0~3.0mg/L的生長素NAA，培養溫度為25±2°C，光照強度為1000~15001x，光照時間為O~4h/d，培養35~45d ;生根培養時，隨著光照時間的縮短，黑暗時間的延長，桂花幼苗的生根率逐漸上升，全黑暗處理的生根率高達88%。這可能是因為黑暗條件抑制了材料本身酚類物質的氧化，減少了醌類物質產生的毒害以及對外植體內源激素的破壞。
[0009]第五步，移栽，將裝有生根無菌苗的三角瓶在室內散射光下打開，加入5~15mL蒸餾水，煉苗3~5d後除去培養基，將幼苗移栽到溫室的營養土中，澆水，得到生根苗。
[0010]其中，蔗糖的濃度不能太高，也不能太低，過高或過低都不利於桂花莖尖的萌發。在培養基中，通過使用不同組合植物激素進行處理，可以調節培養物的生長發育進程、分化方向和器官發生。本發明中，若不使用植物激素，莖尖在體外是不可能萌發的。但是，莖尖的萌發率與植物激素的濃度之間存在一個拋物線關係，即植物激素在某個濃度下時莖尖的萌發率最高，大於或等於這個濃度萌發率都小於該最高的萌發率。這說明細胞分裂素和生長素只有達到一定的濃度比才能起到良好的效果。本發明中，初代培養最適合的培養基是B5+ 2.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3%蔗糖+7g/L的瓊脂粉，莖尖的萌發率可達到86.7%。
[0011]作為本發明桂花組織的培養方法的一種改進，第一步所述消毒滅菌處理是指先用洗潔精清洗桂花嫩枝莖尖2~4遍，再在自來水下衝洗I~2h，然後移入超淨工作檯，用
0.1%的HgCl2進行消毒處理2~3min (優選為2.5min,時間低於2.5min時汙染率增加，高於2.5min時存活率減小)，最後用無菌水衝洗4_6次。
[0012]作為本發明桂花組織的培養方法的一種改進，第二步中，鑷子採用I~1.lkg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15~20min。
[0013]作為本發明桂花組織的培養方法的一種改進，第二步中，接種前，先對含有初代培養基的三角瓶採用I~1.lkg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15~20min。
[0014]相對於現有技術，本發明至少具有如下優點:經統計，採用本發明的方法，桂花從一個莖尖到成苗移栽，只需要四個月左右的時間，這一時間優勢是其它繁殖手段不能比擬的。另外本發明用到的藥品價格相對低廉，從而在很大程度上縮減了生產成本。
【具體實施方式】
[0015]以下結合具體的實施例來對本發明的內容進一步說明，但是本發明的保護範圍並不僅僅局限於實施例所描述的內容。
[0016]實施例1
本實施例提供的一種桂花組織的培養方法，包括以下步驟:
第一步，消毒滅菌，選取健壯桂花嫩枝莖尖，對其進行消毒滅菌處理:先用洗潔精清洗桂花嫩枝莖尖3遍，再在自來水下衝洗1.5h，然後移入超淨工作檯，用0.1%的HgCl2進行消毒處理2min,最後用無菌水衝洗5次。
[0017]第二步,初代培養,取消毒後的桂花嫩枝莖尖,先用消毒後的鑷子除去芽體外部的鱗片及嫩葉，其中的鑷子採用1.lkg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15min。再用解剖刀將該莖尖截成I~2mm，接種前，先對含有初代培養基的三角瓶採用1.lkg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15min，然後將該I~2mm的莖尖接種於含有初代培養基的三角瓶中，所述初代培養基為基本的B5培養基加上3%的蔗糖、7g/L的瓊脂粉、3.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.05mg/L的生長素NAA，所述初代培養基的pH為5.8，培養溫度為25±2°C，光照強度為18001x，光照時間為13h/d，培養30d ；15d時檢查存活率和汙染率，分別為88.9%和11.1%。30d時檢查萌發率，為86.7%。
[0018]第三步，繼代培養，等莖尖長成2~3cm的無菌苗，將其切成0.5~Icm帶腋芽的莖段，轉入含繼代培養基的三角瓶中使其增殖，所述繼代培養基為基本的B5培養基加上3%的蔗糖、2.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.05mg/L的生長素NAA，所述繼代培養基的pH為
5.8，培養溫度為25±2°C，光照強度為20001x，光照時間為13h/d，培養30d，統計增殖係數，為 2.08。
[0019]第四步，將繼代培養後得到的3cm以上的無菌苗轉入生根培養基中，所述生根培養基為基本的1/2MS培養基加上2.0mg/L的生長素NAA，培養溫度為25 ±2°C，光照強度為12001x，光照時間為Oh/d，即進行全黑處理，培養40d，統計生根率，為88%。
[0020]第五步，移栽，將裝有生根無菌苗的三角瓶在室內散射光下打開，加入IOmL蒸餾水，煉苗4d後除去培養基，將幼苗移栽到溫室的營養土中，第一澆透水，前3天每天向葉片上噴水5次，後幾天逐漸減少噴水次數，並觀察生長情況，15d後統計，成活率為82%。
[0021]實施例2
本實施例提供的 一種桂花組織的培養方法，包括以下步驟:
第一步，消毒滅菌，選取 健壯桂花嫩枝莖尖，對其進行消毒滅菌處理:先用洗潔精清洗桂花嫩枝莖尖2遍，再在自來水下衝洗2h，然後移入超淨工作檯，用0.1%的HgCl2進行消毒處理2.5min,最後用無菌水衝洗4次。
[0022]第二步,初代培養,取消毒後的桂花嫩枝莖尖,先用消毒後的鑷子除去芽體外部的鱗片及嫩葉，其中的鑷子採用lkg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15min。再用解剖刀將該莖尖截成I~2mm,接種前,先對含有初代培養基的三角瓶採用lkg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15min，然後將該I~2mm的莖尖接種於含有初代培養基的三角瓶中，所述初代培養基為基本的B5培養基加上2%的蔗糖、9g/L的瓊脂粉、2.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.03mg/L的生長素NAA，所述初代培養基的pH為5.8，培養溫度為25±2°C，光照強度為20001x，光照時間為12h/d，培養28d ；15d時檢查存活率和汙染率，分別為95.6%和O。28d時檢查萌發率，為 71.1%。
[0023]第三步，繼代培養，等莖尖長成2~3cm的無菌苗，將其切成0.5~Icm帶腋芽的莖段，轉入含繼代培養基的三角瓶中使其增殖，所述繼代培養基為基本的B5培養基加上2%的蔗糖、3.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.03mg/L的生長素NAA，所述繼代培養基的pH為
5.8，培養溫度為25±2°C，光照強度為25001x，光照時間為12h/d，培養35d，統計增殖係數，為 2.01。
[0024]第四步，將繼代培養後得到的3cm以上的無菌苗轉入生根培養基中，所述生根培養基為基本的1/2MS培養基加上3.0mg/L的生長素NAA，培養溫度為25 ±2°C，光照強度為ΙΟΟΟΙχ，光照時間為2h/d，培養45d，統計生根率，為50%。
[0025]第五步，移栽，將裝有生根無菌苗的三角瓶在室內散射光下打開，加入15mL蒸餾水，煉苗3d後除去培養基，將幼苗移栽到溫室的營養土中，第一澆透水，前3天每天向葉片上噴水5次，後幾天逐漸減少噴水次數，並觀察生長情況，15d後統計，成活率為78%。
[0026]實施例3
本實施例提供的一種桂花組織的培養方法，包括以下步驟:
第一步，消毒滅菌，選取健壯桂花嫩枝莖尖，對其進行消毒滅菌處理:先用洗潔精清洗桂花嫩枝莖尖4遍，再在自來水下衝洗lh，然後移入超淨工作檯，用0.1%的HgCl2進行消毒處理3min,最後用無菌水衝洗6次。
[0027]第二步,初代培養,取消毒後的桂花嫩枝莖尖,先用消毒後的鑷子除去芽體外部的鱗片及嫩葉，其中的鑷子採用1.05kg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌17min。再用解剖刀將該莖尖截成I~2mm，接種前，先對含有初代培養基的三角瓶採用1.05kg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌17min，然後將該I~2mm的莖尖接種於含有初代培養基的三角瓶中，所述初代培養基為基本的B5培養基加上4%的蔗糖、9g/L的瓊脂粉、4.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.1mg/L的生長素NAA，所述初代培養基的pH為5.8，培養溫度為25±2°C，光照強度為15001x，光照時間為14h/d，培養32d ；15d時檢查存活率和汙染率，分別為68.9%和O。32d時檢查萌發率，為72.5%。
[0028]第三步，繼代培養，等莖尖長成2~3cm的無菌苗，將其切成0.5~Icm帶腋芽的莖段，轉入含繼代培養基的三角瓶中使其增殖，所述繼代培養基為基本的B5培養基加上4%的蔗糖、1.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.lmg/L的生長素NAA，所述繼代培養基的pH為5.8，培養溫度為25±2°C，光照強度為22001x，光照時間為14h/d，培養25d，統計增殖係數，為 1.92。
[0029]第四步，將繼代培養後得到的3cm以上的無菌苗轉入生根培養基中，所述生根培養基為基本的1/2MS培養基加上1.0mg/L的生長素NAA，培養溫度為25 ±2°C，光照強度為15001x，光照時間為4h/d，培養35d，統計生根率，為44%。
[0030]第五步，移栽，將裝有生根無菌苗的三角瓶在室內散射光下打開，加入15mL蒸餾水，煉苗6d後除去培養基，將幼苗移栽到溫室的營養土中，第一澆透水，前3天每天向葉片上噴水5次，後幾天逐漸減少噴水次數，並觀察生長情況，15d後統計，成活率為75%。
[0031]需要說明的是，根據上述說明書的揭示和闡述，本發明所屬領域的技術人員還可以對上述實施方式進行變更和修改。因此，本發明並不局限於上面揭示和描述的【具體實施方式】，對本發明的一些等同修改和變更也應當在本發明的權利要求的保護範圍內。此外，儘管本說明書中使用了一些特定的術語，但這些術語只是為了方便說明，並不對本發明構成任何限制。
【權利要求】
1.一種桂花組織的培養方法，其特徵在於，包括以下步驟: 第一步，消毒滅菌，選取健壯桂花嫩枝莖尖，對其進行消毒滅菌處理； 第二步，初代培養，取消毒後的桂花嫩枝莖尖，先用消毒後的鑷子除去芽體外部的鱗片及嫩葉，再用解剖刀將該莖尖截成1~2mm，接種於含有初代培養基的三角瓶中，所述初代培養基為基本的B5培養基加上2~4%的蔗糖、5~9g/L的瓊脂粉、1.0~5.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.01~0.lmg/L的生長素NAA，所述初代培養基的pH為5.8，培養溫度為25±2°C，光照強度為1500~20001x，光照時間為12~14h/d，培養25~35d ； 第三步，繼代培養，等莖尖長成2~3cm的無菌苗，將其切成0.5~1cm帶腋芽的莖段，轉入含繼代培養基的三角瓶中使其增殖，所述繼代培養基為基本的B5培養基加上2~4%的鹿糖、1.0~3.0mg/L的細胞分裂素6-BA和0.01~0.lmg/L的生長素NAA,所述繼代培養基的pH為5.8，培養溫度為25±2°C，光照強度為2000~25001x，光照時間為12~14h/d，培養25~35d ； 第四步，將繼代培養後得到的3cm以上的無菌苗轉入生根培養基中，所述生根培養基為基本的1/2MS培養基加上1.0~3.0mg/L的生長素NAA，培養溫度為25±2°C，光照強度為1000~15001x，光照時間為O~4h/d，培養35~45d ； 第五步，移栽，將裝有生根無菌苗的三角瓶在室內散射光下打開，加入5~15mL蒸餾水，煉苗3~5d後除去培養基，將幼苗移栽到溫室的營養土中，澆水，得到生根苗。
2.根據權利要求1所述的桂花組織的培養方法，其特徵在於:第一步所述消毒滅菌處理是指先用洗潔精清洗桂花嫩枝莖尖2~4遍，再在自來水下衝洗1~2h，然後移入超淨工作檯，用0.1%的HgCl2進行消毒處理2~3min,最後用無菌水衝洗4_6次。
3.根據權利要求1所述的桂花組織的培養方法，其特徵在於:第二步中，鑷子採用I~1.1 kg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15~20min。
4.根據權利要求3所述的桂花組織的培養方法，其特徵在於:第二步中，接種前，先對含有初代培養基的三角瓶採用1~1.lkg/cm2的大氣壓熱壓消毒滅菌15~20min。
【文檔編號】A01H4/00GK103798147SQ201410079651
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月6日 優先權日:2014年3月6日
【發明者】劉秀紅 申請人:梅州市狀元紅生態發展有限公司